專利名稱：制備寡肽－醛的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一個(gè)可運(yùn)用于清潔劑的寡肽醛的制造方法寡肽醛及其在液狀清潔劑中的運(yùn)用已被普遍熟知。如WO 94/04651所說明的寡肽醛的優(yōu)點(diǎn)在于能夠以極小的濃度加入使用卻又能夠作為敏感的蛋白酶抑制劑發(fā)揮很大的效應(yīng)。這一特性又附加另一優(yōu)點(diǎn)，即在清潔劑中還可加入本身對蛋白分解敏感的酶。
根據(jù)US-A-4,339,065(DE-A-32 00 812)可以制備寡肽醛，這里以三肽為例按標(biāo)準(zhǔn)步驟由內(nèi)酰胺與氫化鋰鋁在四氫呋喃(THF)中還原生成醛。該方法也應(yīng)用于EP-A-0 185 390中。
根據(jù)WO 94/04651制備四肽醛分二個(gè)階段首先由四肽的酯借助于NaBH4在乙醇和四氫呋喃中獲得相應(yīng)的醇，該醇緊接著在CH2Cl2內(nèi)″Dess-Martin″的作用下在NaHCO3/Na2S2O3內(nèi)進(jìn)一步反應(yīng)后完全氧化成醛。
最后所述的方法有某些亟待于改進(jìn)的缺點(diǎn)?？傊€(gè)階段方法較之可能的一個(gè)階段方法有較小的空間/時(shí)間收率。此外所使用的化學(xué)劑本身有其缺點(diǎn)，一方面是因其自身另一方面是在方法實(shí)施時(shí)其效應(yīng)中利用CH2Cl2的指定方法毫不具備優(yōu)點(diǎn)。因?yàn)榛诎踩慕嵌?，NaBH4和″Dess-Martin″的利用根本不可能套用這樣的一個(gè)反應(yīng)作為技術(shù)尺度標(biāo)準(zhǔn)(較小的利用率，價(jià)格，放熱反應(yīng)，反應(yīng)進(jìn)行的可靠性)。因其在水中的溶解度小，NaHCO3的應(yīng)用也具有缺點(diǎn)。在應(yīng)用保護(hù)基丁氧羰基(BOC)的情況下在寡肽的氨基終末端進(jìn)行所說的反應(yīng)步驟(還原/氧化)。這里所希望的是創(chuàng)造較易釋放保護(hù)基的條件。
所以本發(fā)明的目的是研究出一種新的方法將寡肽在C-終末端轉(zhuǎn)化成寡肽醛。該方法應(yīng)不再有以上所述現(xiàn)有技術(shù)下的缺點(diǎn)。本發(fā)明的方法應(yīng)該在技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)下也能施用。
通過制備可逆性被保護(hù)的寡肽醛的方法而達(dá)到了上述目的，其特征為，在N-終末端可逆性被保護(hù)的寡肽醇在緩沖過的溶劑混合劑(它含有不可氧化的，極性的和不與水相混的溶劑和溶解少量的水)中與一個(gè)化學(xué)量的溴化鈉相混合，其醇在冷卻下用一個(gè)催化量的2，2，6，6-四甲基-哌啶-N-氧基(TEMPO)或者其衍生物氧化，反應(yīng)混懸液與次氯酸鈉的水溶液混合，然后加入還原劑結(jié)束反應(yīng)。
反應(yīng)混合物按照如下方法處理，即分隔開這二個(gè)相，水相用一個(gè)不可氧化的、極性的和不與水相混的溶劑萃取，最后由合并的有機(jī)相獲得N-終末端被保護(hù)的寡肽醛。
醋酸乙酯作為不可氧化的、極性的和不與水相混的溶劑尤為適合。
按照本發(fā)明，溶劑混合劑中的水含量必須盡可能地少，尤其是≤10％，優(yōu)選≤5％。
尤其是使用碳酸氫鈉或者碳酸氫鉀作為溶劑混合劑的緩沖劑。特別優(yōu)選1-10％、特別是3-5％的碳酸氫鈉溶液。
利用2，2，6，6-四甲基-哌啶-N-氧基(TEMPO)或者其衍生物之一作為生成醛的氧化反應(yīng)的催化劑。作為該衍生物的可考慮4-羥基-衍生物或更值得推薦的是4-乙酰胺-衍生物。特別優(yōu)選的當(dāng)然是未被取代的TEMPO(未衍生的)。
次氯酸鉀溶液的濃度為10-20％，優(yōu)選12-15％。
按照本發(fā)明，相分離前在混懸液中加入還原劑而結(jié)束反應(yīng)。還原劑優(yōu)選是能溶于水者。特別優(yōu)選的是連二亞硫酸鹽，亞硫酸鹽和/或硫代硫酸鹽，尤其是堿金屬硫代硫酸鹽，特別是硫代硫酸鈉-(五水合)。
作為N-終末端的保護(hù)基團(tuán)可以用所有專業(yè)人員熟知的可再解離(可逆性的)的保護(hù)基團(tuán)。例如芐氧羰基，叔丁氧羰基(BOC)，甲氧羰基(MOC)，乙氧羰基(EtOC)；尤其優(yōu)選甲氧羰基(MOC)和/或乙氧羰基(EtOC)。
形成的反應(yīng)混合液(混懸液)的二個(gè)相被分離，并且其水相尤其用醋酸乙酯萃取。合并的有機(jī)相用水再萃取。
通過將水/醋酸乙酯混合液蒸餾揮發(fā)而離析生成物。緊接著可以由非極化溶劑尤其是由正丙烷或正己烷沉淀(醛)生成物而額外提純之。
加入溴化鉀后應(yīng)必須將反應(yīng)混合物冷卻到-5至+5℃，最好是0℃，并且置于此溫度下直至加入還原劑后結(jié)束反應(yīng)為止。
根據(jù)本發(fā)明的方法，能夠以高到令人驚異的90-100％的收率、優(yōu)選為90-96％的收率制備出寡肽醛。
施用本發(fā)明方法還有一個(gè)優(yōu)點(diǎn)，即明顯降低了副產(chǎn)物的生成?；旧贤耆种屏巳┑倪^度氧化。
根據(jù)四面體簡訊(Tetrahedron Letters)，33卷，35期，5029-5032頁，TEMPO常常只是作為氧化催化劑用于由α-氨基醇和α-烷氧基醇制備相應(yīng)的醛類。此時(shí)，反應(yīng)在甲苯/水的混合液中利用碳酸氫鈉緩沖劑進(jìn)行。相分離后還原劑加入進(jìn)到有機(jī)相中。這個(gè)反應(yīng)過程只有較小的收率。尤其是不能有效地控制反應(yīng)產(chǎn)物的過度氧化。所描述的快速混合反應(yīng)混合物似乎對過度氧化沒有大的影響(5030頁，第二段，第2和3句)。
若將用TEMPO氧化低分子α-氨基醇和α-烷氧基醇的氧化條件套用在高分子而非極性的寡肽醇，則尤其要面臨的是以下所述，即按照這些文獻(xiàn)的實(shí)施例，分子鏈越長，收率越低，并且N終末端只是簡單地被保護(hù)。因此專業(yè)人員一般都不會考慮用僅僅簡單被保護(hù)的N終末端寡肽來氧化長鏈。所以如果套用則應(yīng)將收率比利用低分子化合物時(shí)的收率估計(jì)得更低一些。令人驚異的是按照本發(fā)明方法在本發(fā)明的條件下用TEMPO作為氧化催化劑就可獲得很高的收率。
同如上所述用TEMPO氧化α-氨基醇和α-烷氧基醇相比，本發(fā)明方法除有較高的收率外還有以下驚人的優(yōu)點(diǎn)加入還原劑后，這里是用硫代硫酸鈉，可以省卻加入磷酸鹽以調(diào)節(jié)pH值至7這一步驟。同時(shí)也省去了用飽和NaCl溶液額外萃取這一步驟。最后只是描述了粗產(chǎn)物的制備，但不是怎樣獲得純凈的寡肽。在本發(fā)明方法中由非極化溶劑例如正庚烷或正己烷沉淀可獲得高度純凈的產(chǎn)物，該沉淀方法具有優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明方法所指的可應(yīng)用的寡肽醛為具有2至50個(gè)氨基酸的寡肽或者其混合物。本發(fā)明方法的起點(diǎn)為加入肽鏈，其C-終末端具有醇功能(-OH)，它們在本方法的實(shí)施中自動(dòng)轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的醛功能(-H)。寡肽醛的這些特點(diǎn)及其制備方法由US-A-5 015 627，EP-A-0 185 930和DE-A-32 00 812已被熟知。
本發(fā)明方法優(yōu)選由2-10個(gè)氨基酸、尤其是2-6個(gè)特別、是3-4個(gè)氨基酸所組成的寡肽醛。
根據(jù)使用范圍和清潔劑中存在的蛋白酶，可有下列各種帶有3個(gè)氨基酸的寡肽醛Lys-Ala-LysH，Ile-Phe-LysH，Phe-Pro-ArgH，Phe-Val-ArgH，Lys-Ala-AlaH，Ala-Ala-ProH，Gly-Ala-LeuH，Gly-Ala-LeuH，Gly-Ala-PheH，Leu-Leu-PheH，Ala-Ala-PheH，Leu-Leu-TyrH，Val-Pro-ValH，Ala-Val-LeuH，Lys-Ala-AlaH，Ala-Ala-ProH，Gly-Ala-LeuH和Gly-Ala-PheH.
此外還有以下帶有4個(gè)氨基酸的寡肽醛Phe-Gly-Ala-PheH，Phe-Gly-Ala-LeuH。
特別優(yōu)選的是帶有4個(gè)氨基酸的寡肽醛，尤其是由Phe，Gly，Ala和LeuH組成的氨基酸。特別是Phe-Gly-Ala-LeuH。
在本發(fā)明方法中寡肽醛的N-終末端被專業(yè)人員所熟知的保護(hù)基所保護(hù)。優(yōu)選的保護(hù)基為BOC和EtOC，特別是EtOC。(BOC＝丁氧羰基；EtOC＝乙氧羰基)。
制備本發(fā)明方法所需的寡肽醇是專業(yè)人員所熟知的。在此值得一提的是專利文獻(xiàn)(US-A-5 015 627，EP-A-185 930，DE-A-32 00812)以及教科書著者Houben-Weyl《有機(jī)化學(xué)方法》(Methoden der organischenChemie)，斯圖加特市(Stuttgart)，1994年，15/1卷和15/2卷；著者Ullmann的《工業(yè)化學(xué)百科全書》(Encyclo Pdie der technischen Chemie)，魏因海姆市(Weinheim)，1980年，第4版，19卷，542-551頁；還有其它的文獻(xiàn)如著者J.Johanes《氨基酸和肽合成》(Amino Acid and PeptidSynthesis)，牛津科學(xué)研究出版雜志(Oxford Science Publications)，牛津(Oxford)，1992年。
經(jīng)過在溶劑中極好的結(jié)合過程而制備目標(biāo)化合物，即N-終端被保護(hù)的寡肽醇。一種方法是通過系列合成步驟即通過結(jié)合各個(gè)氨基酸組成部分而逐步組成肽；另一種方法是通過聚合合成步驟逐步組成肽而優(yōu)選組合成二個(gè)二肽，在接著的下一步(聚合)中將它們互相結(jié)合。
合成時(shí)可以再將所熟知的保護(hù)基團(tuán)用于N-末端和C-末端。
N-末端芐氧羰基，叔丁氧羰基，甲氧羰基，乙氧羰基。
C-末端甲基酯，乙基酯，芐基酯，硝基芐酯。
肽組成部分(Peptidbinding)的自身結(jié)合也是專業(yè)人員所熟知的。為使明確化，需提及以下方法-經(jīng)由混合酐而結(jié)合，酐例如通過與氯甲酸異丁酯或者丙烷磷酸酐轉(zhuǎn)換而制備，-經(jīng)由O-酰基異脲而結(jié)合，O-酰基異脲通過與雙環(huán)己基碳化二亞胺轉(zhuǎn)化形成(DCC-方法)，-經(jīng)由活化酯而結(jié)合，或-經(jīng)由羧酸疊氮而結(jié)合。
以下的實(shí)施例詳細(xì)說明按本發(fā)明方法制備寡肽醛，這里是EtOC-Phe-Gly-Ala-Leu-H。
3,8g EtOC-Phe-Gly-Ala-亮氨醇(Leu-OH)攪拌下加入到100ml醋酸乙酯，加入10ml水和0,9g溴化鈉后的混合物冷卻至0℃。接著加入4,8g碳酸氫鉀以及0,01g TEMPO(2，2，6，6-四甲基-哌啶-N-氧基)。在冷卻下和劇烈攪拌下將5g次氯酸鈉(13％)與10ml水的混合液在15分鐘內(nèi)滴入生成的混懸液中。0℃下繼續(xù)攪拌10分鐘后通過加入3g五水硫代硫酸鈉將混懸液在27ml水中浸冷。
將反應(yīng)混合物的二個(gè)相相互分離，水相用總共20ml的醋酸乙酯萃取。接著將合并的有機(jī)相用水再萃取。溶劑在真空中濃縮后用正庚烷沉淀便可獲得3,7g純凈醛(96％d.Th.)。


圖1和圖2所示的1H-NMR譜和MS譜顯示了EtOC-Phe-Gly-Ala-Leu-H的特征。
權(quán)利要求
1.可逆性被保護(hù)的寡肽醛的制備方法，其特征為在一個(gè)緩沖過的溶劑混合液中(該混合液包含一個(gè)不可氧化的，極性的和不與水相混的溶劑與少量水相溶解)在N-終末端可逆性被保護(hù)的一個(gè)寡肽醇與一個(gè)化學(xué)量的溴化鈉相混合，在冷卻下該醇與一個(gè)催化量的2，2，6，6-四甲基-哌啶-N-氧基(TEMPO)和/或一個(gè)其衍生物氧化，反應(yīng)混懸液與次氯酸鉀的水溶液混合，最后加入還原劑結(jié)束反應(yīng)。
2.按照權(quán)利要求1的方法，其特征為利用芐氧羰基，叔丁氧羰基，甲氧羰基或乙氧羰基作為N-終末端的保護(hù)基。
3.按照權(quán)利要求1或2的方法，其特征為將醋酸乙酯作為不可氧化的，極性的和不與水相混的溶劑加入使用在溶劑混合液中。
4.按照權(quán)利要求1或3的方法，其特征為該溶劑混合液的水含量可達(dá)10％，優(yōu)選5％以下。
5.按照權(quán)利要求1，3或4的方法，其特征為利用碳酸氫鈉和/或碳酸氫鉀，優(yōu)選碳酸氫鉀，作為溶劑混合液的緩沖劑。
6.按照權(quán)利要求1的方法，其特征為利用2，2，6，6-四甲基-哌啶-N-氧基(TEMPO)和/或其衍生物之一，例如4-羥基-或4-乙酰胺-衍生物，作為催化劑。
7.按照權(quán)利要求1至6的方法，其特征為利用連二亞硫酸鹽，亞硫酸鹽和/或硫代硫酸鹽，尤其硫代硫酸鈉，作為還原劑。
8.按照權(quán)利要求1至7的方法，其特征為所利用的寡肽醇帶有2-10個(gè)氨基酸，優(yōu)選2-6個(gè)，尤其是3-4個(gè)氨基酸。
9.按照權(quán)利要求1至8的方法，其特征為所利用的寡肽醇帶有的氨基酸為Phe，Gly，Ala和Leu，或者Phe，Gly，Ala和Pe，尤其是Phe-Gly-Ala-LeuOH。
10.按照權(quán)利要求1至9的方法，其特征為寡肽醛通過從正庚烷和/或正己烷結(jié)晶而得。
11.按照權(quán)利要求1至10的方法，其特征為寡肽醇由系列合成或聚合合成方法制備，優(yōu)選聚合合成。
12.寡肽醛，它們可以用權(quán)利要求1至11中的一項(xiàng)或多項(xiàng)的方法制備。
全文摘要
本發(fā)明涉及制備寡肽醛的一種方法,其特征為:N－終末端可逆性被保護(hù)的寡肽醇于緩沖過的溶劑混合液中與一個(gè)化學(xué)量的溴化鈉相混合,該溶劑混合液含有不可氧化的,極性的和不與水相混的溶劑并與少量水相溶解,冷卻下醇與一個(gè)催化量的2,2,6,6－四甲基－哌啶－N－氧基(TEMPO)或者其衍生物氧化,反應(yīng)混懸液與次氯酸鈉的水溶液相混合,最后加入還原劑后結(jié)束反應(yīng)。這樣制備的寡肽醛可以運(yùn)用在清潔劑中。
文檔編號C07K1/107GK1169999SQ9710242
公開日1998年1月14日 申請日期1997年2月3日 優(yōu)先權(quán)日1996年2月12日
發(fā)明者W·里伯茨因斯基, K·克塞勒 申請人:赫徹斯特股份公司