專(zhuān)利名稱(chēng)：：制備7α－羧基9,11－環(huán)氧甾族化合物的方法和其中使用的中間體以及烯雙鍵環(huán)氧化作用...的制作方法
背景技術(shù)：
：本發(fā)明涉及制備9，11-環(huán)氧甾族化合物，特別是20-螺環(huán)氧乙烷類(lèi)及其類(lèi)似物那些化合物的新的方法，在該甾族化合物制備中有用的新的中間體，以及這些新的中間體的制備方法。更特別地，本發(fā)明涉及制備9，11α-環(huán)氧-17α-羥基-3-氧代孕甾-4-烯-7α，21-二羧酸氫甲酯，γ-內(nèi)酯(eplerenone；epoxymexrenone)的新的且有優(yōu)點(diǎn)的方法。美國(guó)專(zhuān)利4559332公開(kāi)了20-螺環(huán)氧乙烷類(lèi)化合物的制備方法。根據(jù)’332專(zhuān)利的方法制備的化合物具有下面通式的包含一個(gè)可打開(kāi)的氧的E環(huán)其中-A-A-代表基團(tuán)-CH2-CH2-或-CH＝CH-，R1代表α-取向的低級(jí)烷氧羰基或羥基羰基殘基。-B-B-代表基團(tuán)-CH2-CH2-或α-取向或β-取向的基團(tuán)R6和R7是氫，X代表兩個(gè)氫原子或氧代基團(tuán)，Y1和Y2一起代表氧橋-O-，或Y1代表羥基，和Y2代表羥基，低級(jí)烷氧基，或者，如果X代表H2，則也可以代表低級(jí)烷酰氧基，以及其中X代表氧代基團(tuán)且Y2代表羥基的這些化合物的鹽，即相應(yīng)的17β-羥基-21-羧酸的鹽。美國(guó)專(zhuān)利4559332描述了一些制備epoxymexrenone和相關(guān)的式IA化合物的方法。epoxymexrenone的新的和擴(kuò)大的臨床應(yīng)用的出現(xiàn)，產(chǎn)生了制備這些和其它相關(guān)的甾族化合物的改進(jìn)的方法的需要。發(fā)明概述本發(fā)明首要目的是提供制備具有共同結(jié)構(gòu)特征的epoxymexrenone，其它的20-螺環(huán)氧乙烷和其它甾族化合物的改進(jìn)的方法。本發(fā)明的具體目的是以高產(chǎn)率提供生產(chǎn)式IA產(chǎn)品和其它相關(guān)化合物的改進(jìn)的方法；提供包括最少分離步驟的這樣的方法；提供實(shí)現(xiàn)合理基本投資和在合理轉(zhuǎn)化成本下操作的這樣的方法。因此，本發(fā)明涉及一系列epoxymexrenone的合成方法；制備eplerenone中有用的中間體；和這些新的中間體的合成。在優(yōu)選的實(shí)施方案的描述中詳細(xì)說(shuō)明了新的合成方法。本發(fā)明新的中間體是下面緊接著描述的那些化合物。式IV化合物相應(yīng)于下面的結(jié)構(gòu)式其中-A-A-代表基團(tuán)-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，R3，R4和R5各自獨(dú)立地選自氫，鹵素，羥基，低級(jí)烷基，低級(jí)烷氧基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，氰基，芳基氧基，R1代表α-取向的低級(jí)烷氧羰基或羥基羰基殘基，R2是11α-離去基團(tuán)，它的除去可有效地在9-和11-碳原子之間產(chǎn)生雙鍵；-B-B-代表基團(tuán)-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基團(tuán)其中R6和R7各自獨(dú)立地選自氫，鹵素，低級(jí)烷氧基，酰基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，酰氧基烷基，氰基，芳基氧基，和R8和R9各自獨(dú)立地選自氫，鹵素，低級(jí)烷氧基，?；u基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，酰氧基烷基，氰基，芳基氧基，或者R8和R9一起構(gòu)成一個(gè)碳環(huán)或雜環(huán)結(jié)構(gòu)，或者R8或R9與R6或R7一起構(gòu)成一個(gè)與五元環(huán)D環(huán)稠合的碳環(huán)或雜環(huán)結(jié)構(gòu)。式IVA化合物相應(yīng)于這樣一種式IV化合物，其中R8和R9與它們所連接的成環(huán)碳原子一起形成下面的結(jié)構(gòu)其中X，Y1，Y2和C(17)如上定義。式IVB化合物相應(yīng)于這樣一種式IVA化合物，其中R8和R9一起形成式XXXIII結(jié)構(gòu)式IVC，IVD和IVE化合物分別相應(yīng)于式IV，IVA，或IVB，其中-A-A-和-B-B-各自是-CH2-CH2-，R3是氫，和R1是烷氧羰基，優(yōu)選甲氧羰基。式IV范圍內(nèi)的化合物可以通過(guò)使一種低級(jí)烷基磺?；噭┗蝓；噭?，或一種產(chǎn)生鹵素離子的試劑，與式V范圍內(nèi)的一種相應(yīng)的化合物反應(yīng)來(lái)制備。式V化合物相應(yīng)于下面的結(jié)構(gòu)其中-A-A-，-B-B-，R1，R3，R8和R9如式IV所定義。式VA化合物相應(yīng)于這樣一種式V化合物，其中R8和R9與它們所連接的成環(huán)碳原子一起形成下面的結(jié)構(gòu)其中X，Y1，Y2和C(17)如上定義。式VB化合物相應(yīng)于這樣一種式VA化合物，其中R8和R9一起形成式XXXIII結(jié)構(gòu)式VC，VD和VE化合物分別相應(yīng)于式V，VA，或VB中任一個(gè)，其中-A-A-和-B-B-各自是-CH2-CH2-，R3是氫，和R1是烷氧羰基，優(yōu)選甲氧羰基。式V范圍內(nèi)的化合物可以通過(guò)使一種堿金屬烷氧化物與式VI的一種相應(yīng)的化合物反應(yīng)來(lái)制備。式VI化合物相應(yīng)于下面的結(jié)構(gòu)其中-A-A-，-B-B-，R3，R8和R9如式IV所定義。式VIA化合物相應(yīng)于這樣一種式VI化合物，其中R8和R9與它們所連接的成環(huán)碳原子一起形成下面的結(jié)構(gòu)其中X，Y1，Y2和C(17)如上定義。式VIB化合物相應(yīng)于這樣一種式VIA化合物，其中R8和R9一起形成式XXXIII結(jié)構(gòu)式VIC，VID和VIE化合物分別相應(yīng)于式VI，VIA，或VIB中任一個(gè)，其中-A-A-和-B-B-各自是-CH2-CH2-，R3是氫。式VI，VIA，VIB和VIC化合物分別通過(guò)水解相應(yīng)于式VII，VIIA，VIIB或VIIC的化合物來(lái)制備。式VII化合物相應(yīng)于下面的結(jié)構(gòu)其中-A-A-，-B-B-，R3，R8和R9如式IV所定義。式VIIA化合物相應(yīng)于這樣一種式VII化合物，其中R8和R9與它們所連接的成環(huán)碳原子一起形成下面的結(jié)構(gòu)其中X，Y1，Y2和C(17)如上定義。式VIIB化合物相應(yīng)于這樣一種式VIIA化合物，其中R8和R9一起形成式XXXIII結(jié)構(gòu)式VIIC，VIID和VIIE化合物分別相應(yīng)于式VII，VIIA，或VIIB中任一個(gè)，其中-A-A-和-B-B-各自是-CH2-CH2-，R3是氫。式VII范圍內(nèi)的化合物可以通過(guò)將式VIII范圍內(nèi)的一種化合物氰化來(lái)制備。式VIII化合物相應(yīng)于下面的結(jié)構(gòu)其中-A-A-，-B-B-，R3，R8和R9如式IV所定義。式VIIIA化合物相應(yīng)于這樣一種式VIII化合物，其中R8和R9與它們所連接的成環(huán)碳原子一起形成下面的結(jié)構(gòu)其中X，Y1，Y2和C(17)如上定義。式VIIIB化合物相應(yīng)于這樣一種式VIIIA化合物，其中R8和R9一起形成式XXXIII結(jié)構(gòu)式VIIIC，VIIID和VIIIE化合物分別相應(yīng)于式VIII，VIIIA，或VIIIB中任一個(gè)，其中-A-A-和-B-B-各自是-CH2-CH2-，R3是氫。式VIII范圍內(nèi)的化合物可以通過(guò)發(fā)酵而有效地以α-取向向底物引入11-羥基來(lái)氧化包括式XXX化合物的一種底物而制備，如下文所述。式XIV化合物相應(yīng)于下面的結(jié)構(gòu)其中-A-A-，-B-B-，R3，R8和R9如式IV所定義。式XIVA化合物相應(yīng)于這樣一種式XIV化合物，其中R8和R9與它們所連接的成環(huán)碳原子一起形成下面的結(jié)構(gòu)其中X，Y1，Y2和C(17)如上定義。式XIV化合物相應(yīng)于這樣一種式XIVA化合物，其中R8和R9一起形成式XXXIII結(jié)構(gòu)式XIVC，XIVD和XIVE化合物分別相應(yīng)于式XIV，XIVA，或XIVB中的任何一個(gè)，其中-A-A-和-B-B-各自是-CH2-CH2-，R3是氫。式XIV范圍內(nèi)的化合物可以通過(guò)將式XV范圍內(nèi)的一種相應(yīng)的化合物水解來(lái)制備。式XV化合物相應(yīng)于下面的結(jié)構(gòu)其中-A-A-，-B-B-，R3，R8和R9如式IV所定義。式XVA化合物相應(yīng)于這樣一種式XV化合物，其中R8和R9與它們所連接的成環(huán)碳原子一起形成下面的結(jié)構(gòu)其中X，Y1，Y2和C(17)如上定義。式XVB化合物相應(yīng)于這樣一種式XVA化合物，其中R8和R9與它們所連接的成環(huán)碳原子一起形成式XXXIII結(jié)構(gòu)式XVC，XVD和XVE化合物分別相應(yīng)于式XV，XVA，或XVB中任一個(gè)，其中-A-A-和-B-B-各自是-CH2-CH2-，R3是氫。式XV范圍內(nèi)的化合物可以通過(guò)將式XVI范圍內(nèi)的一種相應(yīng)的化合物氰化來(lái)制備。式XXI化合物相應(yīng)于下面的結(jié)構(gòu)其中-A-A-，-B-B-，R3，R8和R9如式IV所定義。式XXIA化合物相應(yīng)于這樣一種式XXI化合物，其中R8和R9與它們所連接的成環(huán)碳原子一起形成下面的結(jié)構(gòu)其中X，Y1，Y2和C(17)如上定義。式XXIB化合物相應(yīng)于這樣一種式XXIA化合物，其中R8和R9一起形成式XXXIII結(jié)構(gòu)式XXIC，XXID和XXIE化合物分別相應(yīng)于式XXI，XXIA，或XXIB中任一個(gè)，其中-A-A-和-B-B-各自是-CH2-CH2-，R3是氫。式XXI范圍內(nèi)的化合物可以通過(guò)將式XXII范圍內(nèi)的一種相應(yīng)的化合物水解來(lái)制備。式XXII化合物相應(yīng)于下面的結(jié)構(gòu)其中-A-A-，-B-B-，R3，R8和R9如式IV所定義。式XXIIA化合物相應(yīng)于這樣一種式XXII化合物，其中R8和R9與它們所連接的成環(huán)碳原子一起形成下面的結(jié)構(gòu)其中X，Y1，Y2和C(17)如上定義。式XXIIB化合物相應(yīng)于這樣一種式XXIIA化合物，其中R8和R9一起形成式XXXIII結(jié)構(gòu)式XXIIC，XXIID和XXIIE化合物分別相應(yīng)于式XXII，XXIIA，或XXIIB中任一個(gè)，其中-A-A-和-B-B-各自是-CH2-CH2-，R3是氫。式XXII范圍內(nèi)的化合物可以通過(guò)將式XXIII范圍內(nèi)的一種化合物氰化來(lái)制備。式XXIII化合物相應(yīng)于下面的結(jié)構(gòu)其中-A-A-，-B-B-，R3，R8和R9如式IV所定義。式XXIIIA化合物相應(yīng)于這樣一種式XXIII化合物，其中R8和R9與它們所連接的成環(huán)碳原子一起形成下面的結(jié)構(gòu)其中X，Y1，Y2和C(17)如上定義。式XXIIIB化合物相應(yīng)于這樣一種式XXIIIA化合物，其中R8和R9一起形成式XXXIII結(jié)構(gòu)式XXIIIC，XXIIID和XXIIIE化合物分別相應(yīng)于式XXIII，XXIIIA，或XXIIIB中任一個(gè)，其中-A-A-和-B-B-各自是-CH2-CH2-，R3是氫。式XXIII范圍內(nèi)的化合物可以通過(guò)氧化下文所描述的式XXIV的一種化合物來(lái)制備。式104化合物相應(yīng)于下面的結(jié)構(gòu)其中-A-A-，-B-B-，和R3如式IV所定義，且R11是C1-C4烷基。式104A化合物相應(yīng)于式104，其中-A-A-和-B-B-各自是-CH2-CH2-，R3是氫。式104范圍內(nèi)的化合物可以通過(guò)熱分解式103化合物來(lái)制備。式103化合物相應(yīng)于下面的結(jié)構(gòu)其中-A-A-，-B-B-，R3和R11如式104所定義。式103A化合物相應(yīng)于式103，其中-A-A-和-B-B-各自是-CH2-CH2-，R3是氫。式103范圍內(nèi)的化合物可以通過(guò)在一種堿例如堿金屬烷氧化物的存在下，使式102的一種相應(yīng)的化合物與丙二酸二烷基酯反應(yīng)來(lái)制備。式102化合物相應(yīng)于下面的結(jié)構(gòu)其中-A-A-，-B-B-，和R3和R11如式104所定義。式102A化合物相應(yīng)于式102，其中-A-A-和-B-B-各自是-CH2-CH2-，R3是氫。式102范圍內(nèi)的化合物可以通過(guò)在一種堿的存在下使式101的一種相應(yīng)的的化合物與三烴基硫鎓化合物反應(yīng)來(lái)制備。式101化合物相應(yīng)于下面的結(jié)構(gòu)其中-A-A-，-B-B-，R3和R11如式104所定義。式101A化合物相應(yīng)于式101，其中-A-A-和-B-B-各自是-CH2-CH2-，R3是氫。式101范圍內(nèi)的化合物可以通過(guò)在一種酸的存在下，使11α-羥基雄甾烯-3，17-二酮或其它式XXXVI化合物與一種原甲酸三烷基酯反應(yīng)來(lái)制備。以下面給出的具體反應(yīng)方法的公開(kāi)為基礎(chǔ)，很明顯這些化合物相對(duì)于一種特定反應(yīng)方法來(lái)說(shuō)具有最大的利用度。本發(fā)明化合物的用途是用作epoxymexrenone和其它甾族化合物的中間體。本發(fā)明的其它目的和特征部分將在下文中變得顯而易見(jiàn)，部分將被指出。附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明圖1是6-去氫睪酮-17-α-丙內(nèi)酯(canrenone)或一種6-去氫睪酮-17-α-丙內(nèi)酯衍生物向相應(yīng)的11α-羥基化合物生物轉(zhuǎn)化的方法的流程示意圖；圖2是6-去氫睪酮-17-α-丙內(nèi)酯和6-去氫睪酮-17-α-丙內(nèi)酯衍生物的11α-羥基化生物轉(zhuǎn)化的優(yōu)選方法的流程示意圖；圖3是6-去氫睪酮-17-α-丙內(nèi)酯和6-去氫睪酮-17-α-丙內(nèi)酯衍生物的11α-羥基化生物轉(zhuǎn)化的特別優(yōu)選方法的流程示意圖；圖4是根據(jù)圖2方法制備的6-去氫睪酮-17-α-丙內(nèi)酯的顆粒大小分布；和圖5是根據(jù)圖3的方法在轉(zhuǎn)化發(fā)酵罐中滅菌的6-去氫睪酮-17-α-丙內(nèi)酯的顆粒大小分布。相應(yīng)的參考標(biāo)志指示附圖中相應(yīng)的部分。優(yōu)選實(shí)施方案的描述根據(jù)本發(fā)明，提出了各種新的制備opoxymexrenone和相應(yīng)于式I的其它化合物的方法其中-A-A-代表基團(tuán)-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，R3，R4和R5各自獨(dú)立地選自氫，鹵素，羥基，低級(jí)烷基，低級(jí)烷氧基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，氰基，芳基氧基，R1代表α-取向的低級(jí)烷氧羰基或羥基烷基殘基，-B-B-代表基團(tuán)-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基團(tuán)其中R6和R7各自獨(dú)立地選自氫，鹵素，低級(jí)烷氧基，酰基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，酰氧基烷基，氰基，芳基氧基，和R8和R9各自獨(dú)立地選自氫，鹵素，低級(jí)烷氧基，?；u基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，酰氧基烷基，氰基，芳基氧基，或者R8和R9一起構(gòu)成一個(gè)碳環(huán)或雜環(huán)結(jié)構(gòu)，或者R8或R9與R6或R7一起構(gòu)成一個(gè)與五元環(huán)D環(huán)稠合的碳環(huán)或雜環(huán)結(jié)構(gòu)。除非另有說(shuō)明，本申請(qǐng)公開(kāi)說(shuō)明書(shū)中稱(chēng)之為“低級(jí)”的有機(jī)基團(tuán)包含最多7，優(yōu)選1-4個(gè)碳原子。低級(jí)烷氧羰基優(yōu)選是從具有1-4個(gè)碳原子的烷基例如甲基，乙基，丙基，異丙基，丁基，異丁基，仲丁基和叔丁基衍生的烷氧羰基；特別優(yōu)選的是甲氧基羰基，乙氧基羰基和異丙氧基羰基。低級(jí)烷氧基優(yōu)選是從上述C1-C4烷基，特別是從伯C1-C4烷基衍生的烷氧基；特別優(yōu)選的是甲氧基。低級(jí)烷?；鶅?yōu)選是從具有1-7個(gè)碳原子的直鏈烷基衍生的烷?；?；特別優(yōu)選的是甲?；鸵阴；?。15，16-位的亞甲基橋優(yōu)選是β-取向的。可以根據(jù)本發(fā)明方法制備的一類(lèi)優(yōu)選的化合物是美國(guó)專(zhuān)利4559332中所描述的20-螺環(huán)氧乙烷化合物，即相應(yīng)于式IA的化合物其中-A-A-代表基團(tuán)-CH2-CH2-或-CH＝CH-，-B-B-代表基團(tuán)-CH2-CH2-或α-取向或β-取向的式IIIA基團(tuán)R1代表α-取向的低級(jí)烷氧羰基或羥基羰基殘基，X代表兩個(gè)氫原子或氧代基團(tuán)或＝S，Y1和Y2一起代表氧橋-O-，或Y1代表羥基，和Y2代表羥基，低級(jí)烷氧基，或者，如果X代表H2，則也可以代表低級(jí)烷酰氧基，本發(fā)明新的方法制備的20-螺環(huán)氧乙烷化合物優(yōu)選是其中Y1和Y2一起代表氧橋-O-的式I化合物。特別優(yōu)選的式I化合物是其中X代表氧代基團(tuán)的那些化合物。其中X代表氧代基團(tuán)的式IA20-螺環(huán)氧乙烷化合物中最特別優(yōu)選的是其中Y1和Y2一起代表氧橋-O-的那些化合物。如已經(jīng)提到的，17β-羥基-21-羧酸也可以是其鹽的形式。特別考慮金屬鹽和銨鹽，例如堿金屬和堿土金屬鹽，例如鈉鹽，鈣鹽，鎂鹽，和優(yōu)選的鉀鹽，及從氨或合適的，優(yōu)選的生理耐受的，含氮的有機(jī)堿衍生的銨鹽。作為堿，考慮的不只是胺，例如低級(jí)烷基胺(例如三乙胺)，羥基-低級(jí)烷基胺[例如2-羥基乙胺，二-(2-羥基乙基)-胺或三-(2-羥基乙基)-胺]，環(huán)烷基胺(例如二環(huán)己基胺)或芐基胺類(lèi)(例如芐基胺和N，N’-二芐基乙二胺)，還包括含氮的雜環(huán)化合物，例如那些芳香特征的化合物(例如吡啶或喹啉)或那些具有至少部分飽和的雜環(huán)(例如N-乙基哌啶，嗎啉，哌嗪或N，N’-二甲基哌嗪)。優(yōu)選的化合物也包括式IA化合物的堿金屬鹽，特別是鉀鹽，其中R1代表烷氧羰基，X代表氧代基團(tuán)，以及各Y1和Y2代表羥基。特別優(yōu)選的式I和IA化合物是例如下面的化合物9α，11α-環(huán)氧-7α-甲氧羰基-20-螺氧-4-烯(spirox-4-ene)-3，21-二酮，9α，11α-環(huán)氧-7α-乙氧羰基-20-螺氧-4-烯-3，21-二酮，9α，11α-環(huán)氧-7α-異丙氧羰基-20-螺氧-4-烯-3，21-二酮，和各化合物的1，2-脫氫類(lèi)似物，9α，11α-環(huán)氧-6α，7α-亞甲基-20-螺氧-4-烯-3，21-二酮，9α，11α-環(huán)氧-6β，7β-亞甲基-20-螺氧-4-烯-3，21-二酮，9α，11α-環(huán)氧-6β，7β；15β，16β-雙亞甲基-20-螺氧-4-烯-3，21-二酮，和各化合物的1，2脫氫類(lèi)似物，9α，11α-環(huán)氧-7α-甲氧羰基-17β-羥基-3-氧代-孕甾-4-烯-21-羧酸，9α，11α-環(huán)氧-7α-乙氧羰基-17β-羥基-3-氧代-孕甾-4-烯-21-羧酸，9α，11α-環(huán)氧-7α-異丙氧羰基-17β-羥基-3-氧代-孕甾-4-烯-21-羧酸，9α，11α-環(huán)氧-17β-羥基-6α，7α-亞甲基-3-氧代-孕甾-4-烯-21-羧酸，9α，11α-環(huán)氧-17β-羥基-6β，7β-亞甲基-3-氧代-孕甾-4-烯-21-羧酸，9α，11α-環(huán)氧-17β-羥基-6β，7β；15β，16β-雙亞甲基-3-氧代-孕甾-4-烯-21-羧酸，和這些酸的堿金屬鹽，特別是鉀鹽或銨鹽，以及上面提到的羧酸或其鹽的1，2-脫氫類(lèi)似物。9α，11α-環(huán)氧-15β，16β-亞甲基-3，21-二氧代-20-螺氧-4-烯-7α-羧酸甲酯，乙酯和異丙酯，9α，11α-環(huán)氧-15β，16β-亞甲基-3，21-二氧代-20-螺氧-1，4-二烯-7α-羧酸甲酯，乙酯，和異丙酯，以及9α，11α-環(huán)氧-3-氧代-20-螺氧-4-烯-7α-羧酸甲酯，乙酯，和異丙酯，9α，11α-環(huán)氧-6β，7β-亞甲基-20-螺氧-4-烯-3-酮，9α，11α-環(huán)氧-6β，7β；15β，16β-雙亞甲基-20-螺氧-4-烯-3-酮，以及9α，11α-環(huán)氧，17β-羥基-17α(3-羥基-丙基)-3-氧代-雄甾-4-烯-7α-羧酸甲酯，乙酯，和異丙酯，9α，11α-環(huán)氧，17β-羥基-17α-(3-羥基-丙基)-6α，7α-亞甲基-雄甾-4-烯-3-酮，9α，11α-環(huán)氧-17β-羥基-17α-(3-羥基-丙基)-6β，7β-亞甲基-雄甾-4-烯-3-酮，9α，11α-環(huán)氧-17β-羥基-17α-(3-羥基-丙基)-6β，7β；15β，16β-雙亞甲基-雄甾-4-烯-3-酮，包括上面提到的雄甾烷的17α-(3-乙酰氧基丙基)和17α-(3-甲酰氧基丙基)類(lèi)似物，也包括所有上面提到的雄甾-4-烯-3-酮和20-螺氧-4-烯-3-酮一系列化合物的1，2-脫氫類(lèi)似物。具有相同特征性結(jié)構(gòu)特征的式I和IA以及類(lèi)似化合物的化學(xué)名稱(chēng)是根據(jù)現(xiàn)行命名法以下面的方式命名的對(duì)于其中Y1與Y2一起代表-O-的化合物來(lái)自20-螺環(huán)氧乙烷(例如其中X代表氧代基團(tuán)且Y1與Y2一起代表-O-的式IA化合物來(lái)自20-螺環(huán)氧乙烷-21-酮)；對(duì)于其中Y1與Y2代表羥基且X代表氧代基團(tuán)的那些化合物來(lái)自17β-羥基-17α-孕甾烯-21-羧酸；對(duì)于其中Y1與Y2代表羥基且X代表兩個(gè)氫原子的那些化合物來(lái)自17β-羥基-17α-(3-羥基丙基)-孕甾烷。因?yàn)榄h(huán)和開(kāi)鏈形式，也就是說(shuō)各內(nèi)酯和17β-羥基-21-羧酸及其鹽分別相互之間緊密相關(guān)，后者可以認(rèn)為只是前者的水合形式，除非另有說(shuō)明，在前文和后文中，式I終產(chǎn)物和起始物及類(lèi)似結(jié)構(gòu)中間體中，應(yīng)該理解所有情況下，一起指所有提到的形式。根據(jù)本發(fā)明，對(duì)于高產(chǎn)率和以合理的費(fèi)用制備式I化合物提出了幾種不同的方案。每種合成方法通過(guò)制備一系列中間體來(lái)進(jìn)行。一些中間體是新的化合物，并且制備這些中間體的方法是新的方法。方法1(用烯睪丙內(nèi)酯或相關(guān)的材料起始)制備式I化合物的一種優(yōu)選的方法是有益地用相應(yīng)于式XIII的烯睪丙內(nèi)酯或相關(guān)的起始材料開(kāi)始其中-A-A-代表基團(tuán)-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，R3，R4和R5各自獨(dú)立地選自氫，鹵素，羥基，低級(jí)烷基，低級(jí)烷氧基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，氰基，芳基氧基，-B-B-代表基團(tuán)-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基團(tuán)其中R6和R7各自獨(dú)立地選自氫，鹵素，低級(jí)烷氧基，?；?，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，酰氧基烷基，氰基，芳基氧基，和R8和R9各自獨(dú)立地選自氫，鹵素，低級(jí)烷氧基，?；?，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，酰氧基烷基，氰基，芳基氧基，或者R8和R9一起構(gòu)成一個(gè)碳環(huán)或雜環(huán)結(jié)構(gòu)，或者R8和R9與R6或R7一起構(gòu)成一個(gè)與五元環(huán)D環(huán)稠合的碳環(huán)或雜環(huán)結(jié)構(gòu)。利用圖1和圖2說(shuō)明的生物轉(zhuǎn)化方法類(lèi)型，在式XIII化合物中引入α-取向的11-羥基，從而生成式VIII化合物其中-A-A-，-B-B-，R3，R8和R9如上所定義。優(yōu)選式XIII化合物具有下面的結(jié)構(gòu)11α-羥基產(chǎn)物具有下面的結(jié)構(gòu)兩式中-A-A-代表基團(tuán)-CH2-CH2-或-CH＝CH-，-B-B-代表基團(tuán)-CH2-CH2-或α-取向或β-取向的基團(tuán)X代表兩個(gè)氫原子或氧代基團(tuán)或＝S，Y1和Y2一起代表氧橋-O-，或Y1代表羥基，和Y2代表羥基，低級(jí)烷氧基，或者，如果X代表H2，則也可以代表低級(jí)烷酰氧基，以及其中X代表氧代基團(tuán)且Y2代表羥基的這些化合物的鹽，和在反應(yīng)中產(chǎn)生的式VIII化合物相應(yīng)于式VIIIA其中-A-A-，-B-B-，Y1，Y2和X如式XXXA所定義。更優(yōu)選的是，R8和R9一起形成20-螺環(huán)氧乙烷結(jié)構(gòu)其中-A-A-，-B-B-各自是-CH2-CH2-，R3是氫。在此羥基化步驟中使用的優(yōu)選的微生物是赭色曲霉(Aspergillusochraceus)NRRL405，赭色曲霉ATCC18500，黑色曲霉(Aspergillusniger)ATCC16888和ATCC26693，構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulan)ATCC11267，米根霉(Rhizopusoryzae)ATCC11145，葡枝根霉(Rhizopusstolonifer)ATCC6227b，弗氏鏈霉菌(Streptomycesfradiae)ATCC10745，巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)ATCC14945，克羅斯韋假單孢菌(Pseudomonascruciviae)ATCC13262，和玫瑰單端孢(Trichotheciumroseum)ATCC12543。其它優(yōu)選的微生物包括Fusariumoxysporumf.sp.cepaeATCC11171和無(wú)根根霉(Rhizopusarrhizus)ATCC11145。對(duì)該反應(yīng)有活性的其它微生物包括藍(lán)色犁頭霉(Absidiacoerula)ATCC6647，灰綠犁頭霉(Absidiaglauca)ATCC22752，雅致放射毛菌(Actinomucorelegans)ATCC6476，黃柄曲霉(Aspergillusflavipes)ATCC1030，煙曲霉(Aspergillusfumigatus)ATCC26934，蠶白僵菌(Beauveriabassiana)ATCC7159和ATCC13144，BotryosphaeriaobtusaIMI038560，CalonectriadecoraATCC14767，螺卷毛殼霉(Chaetomiumcochliodes)ATCC10195，山扁豆生棒孢(Corynesporacassiicola)ATCC16718，短刺小克銀漢霉(Cunninghamellablakesleana)ATCC8688a，刺孢小克銀漢霉(Cunninghamellaechinulata)ATCC3655，美麗小克銀漢霉(Cunninghamellaelegans)ATCC9245，CurvulariaclavataATCC22921，新月彎孢(Curvularialunata)ATCC12071，CylindrocarponradicicolaATCC1011，EpicoccumhumicolaATCC12722，卵形孢球托霉(Gongronellabutleri)ATCC22822，Hypomyceschrysospermus，深黃被孢菌(Mortierellaisabellina)ATCC42613，大毛霉(Mucormucedo)ATCC4605，灰藍(lán)毛霉(Mucorgriseo-cyanus)ATCC1207A，疣孢漆斑菌(Myrotheciumverrucaria)ATCC9095，珊瑚色諾卡氏菌(Nocardiacorallina)，PaecilomycescarneusATCC46579，展開(kāi)青霉(Penicillumpatulum)ATCC24550，Pithomycesatro-olivaceusIFO6651，PithomycescynodontisATCC26150，密孔菌屬(Pycnosporiumsp.)ATCC12231，SaccharopolysporaerythraeATCC11635，黃球瘤孢(Sepedoniumchrysospermum)ATCC13378，StachylidiumbicolorATCC12672，吸水鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicus)ATCC27438，StreptomycespurpurascensATCC25489，總狀共頭霉(Syncephalastrumracemosum)ATCC18192，ThamnostylumpiriformeATCC8992，ThielaviaterricolaATCC13807，和可可輪枝孢(Verticilliumtheobromae)ATCC12474。預(yù)期對(duì)11α-羥基化作用顯示活性的另外的微生物包括Cephalosporiumaphidicola(植物化學(xué)(Phytochemistry)(1996)，42(2)，411-415)，Cochlioboluslunatas(生物技術(shù)雜志(J.Biotechnol.)(1995)，42(2)，145-150)，Tieghemellaorchidis(Khim.-Farm.Zh.(1986)，20(7)，871-876)，Tieghemellahyalospora(Khim.-Farm.Zh.(1986)，20(7)，871-876)，Monosporiumolivaceum(ActaMicrobiol.Pol.，Ser.B.(1973)，5(2)，103-110)，焦曲霉(Aspergillusustus)(ActaMicrobiol.Pol.，Ser.B.(1973)，5(2)，103-110)，禾谷鐮孢(Fusariumgraminearum)(ActaMicrobiol.Pol.，Ser.B.(1973)，5(2)，103-110)，灰綠輪枝孢(Verticilliumglaucum)(ActaMicrobiol.Pol.，Ser.B.(1973)，5(2)，103-110)，和變黑色根霉(Rhizopusnigricans)(甾族生物化學(xué)雜志(J.SteroidBiochem.)(1987)，28(2)，197-201)。對(duì)于烯睪丙內(nèi)酯或其它式XIII底物的羥基化作用生產(chǎn)規(guī)模發(fā)酵的制備，在包括一個(gè)種菌發(fā)酵罐，或一系列兩個(gè)或幾個(gè)發(fā)酵罐的種菌發(fā)酵系統(tǒng)中制備種菌。將工作原種孢子懸浮液與細(xì)胞生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)液一起加入到第一個(gè)種菌發(fā)酵罐中。如果生產(chǎn)所期望或需要的種菌的體積超過(guò)在第一個(gè)種菌發(fā)酵罐中產(chǎn)生的體積，則可以通過(guò)在種菌發(fā)酵系列中剩余的發(fā)酵罐的接續(xù)而將種菌體積逐漸地和等比地增大。優(yōu)選的是，在種菌發(fā)酵系統(tǒng)中制備的種菌對(duì)于實(shí)現(xiàn)快速引發(fā)生產(chǎn)發(fā)酵罐中的反應(yīng)，相對(duì)短的生產(chǎn)批量周期和高生產(chǎn)發(fā)酵活性來(lái)說(shuō)具有足夠的體積和活細(xì)胞。不管種菌發(fā)罐系列中容器的數(shù)目是多少，第二個(gè)和下面的種菌發(fā)酵罐大小優(yōu)選是使得系列中各步驟的稀釋程度基本上相同。各種菌發(fā)酵罐中種菌的最初稀釋度可以大約是與生產(chǎn)發(fā)酵罐中的稀釋度相同。烯睪丙內(nèi)酯或其它式XIII底物與種菌及營(yíng)養(yǎng)液一起加入到生產(chǎn)發(fā)酵罐中，羥基化反應(yīng)在那里進(jìn)行。加入到種菌發(fā)酵系統(tǒng)中的孢子懸浮液來(lái)自從眾多試管中取出的一只工作原種孢子懸浮液試管，眾多試管構(gòu)成工作原種細(xì)胞庫(kù)，其在使用前在降溫條件下貯存。工作原種細(xì)胞庫(kù)來(lái)自在下面的方法中制備的主原種細(xì)胞庫(kù)。從合適的來(lái)源例如ATCC獲得的孢子樣品最初懸浮于含水基質(zhì)中，例如鹽水溶液，營(yíng)養(yǎng)液或表面活性劑溶液，(例如濃度大約是0.001％重量的非離子表面活性劑例如吐溫20)，和分布在培養(yǎng)板上的懸浮液，每個(gè)平板擁有固體營(yíng)養(yǎng)混合物，一般是以不可消化的多糖例如瓊脂為基礎(chǔ)，在那里繁殖孢子。固體營(yíng)養(yǎng)混合物優(yōu)選含有大約0.5％-大約5％重量的葡萄糖，大約0.05％-大約5％重量的氮源，例如胨，大約0.05％-大約0.5％重量的磷源，例如磷酸銨鹽或堿金屬鹽，例如磷酸氫二鉀，大約0.25％-大約2.5％重量的酵母溶菌產(chǎn)物或抽提物(或其它氨基酸源例如肉膏或腦心浸液)，大約1％-大約2％重量的瓊脂或其它不可消化的多糖。任選地，該固體營(yíng)養(yǎng)混合物可以進(jìn)一步含有和/或包含大約0.1％-大約5％重量的麥芽汁。固體營(yíng)養(yǎng)混合物的pH優(yōu)選在大約5.0-大約7.0之間，根據(jù)需要用堿金屬氫氧化物或正磷酸調(diào)節(jié)。其中有用的固體生長(zhǎng)培養(yǎng)基如下1.固體培養(yǎng)基#11％葡萄糖，0.25％酵母抽提物，0.3％K2HPO4和2％瓊脂(Bacto)；用20％NaOH調(diào)節(jié)pH為6.5。2.固體培養(yǎng)基#22％胨(Bacto)，1％酵母抽提物(Bacto)，2％葡萄糖和2％瓊脂(Bacto)，用10％H3PO4調(diào)節(jié)pH為5。3.固體培養(yǎng)基#30.1％胨(Bacto)，2％麥芽汁(Bacto)，2％葡萄糖和2％瓊脂(Bacto)；pH為5.3。4.液體培養(yǎng)基5％廢糖蜜，0.5％玉米漿，0.25％葡萄糖，0.25％NaCl和0.5％KH2PO4，調(diào)節(jié)pH為5.8。5.Difco真菌學(xué)瓊脂(低pH)?？梢愿鶕?jù)主原種的未來(lái)要求來(lái)選擇培養(yǎng)主原種細(xì)胞庫(kù)中所使用的瓊脂平板數(shù)目，但是一般制備大約15-30個(gè)平板。適當(dāng)生長(zhǎng)期后，例如7-10天，在含水載體，一般是鹽水或緩沖液的存在下，刮平板收集孢子，得到的主原種懸浮液分裝在小瓶中，例如在許多1.5ml小瓶中裝入1ml。為了制備在研究或生產(chǎn)發(fā)酵操作中使用的工作原種孢子懸浮液，可以以上述制備主原種孢子懸浮液的方法將一個(gè)或幾個(gè)這些第二代主原種小瓶中的內(nèi)含物分布在瓊脂平板上并在瓊脂平板上培養(yǎng)。期望常規(guī)生產(chǎn)操作時(shí)，可以使用100-400這樣多的平板來(lái)產(chǎn)生第二代工作原種。刮每個(gè)平板使原種到分開(kāi)的工作原種小瓶中，每個(gè)小瓶一般含有1ml產(chǎn)生的種菌。為了永久保存，主原種懸浮液和第二代生產(chǎn)種菌兩者有益地保存在含有液氮或其它降溫液的降溫儲(chǔ)存容器的蒸汽空間中。在圖1所示的方法中，制備含水生長(zhǎng)培養(yǎng)基，其含有氮源例如胨，酵母產(chǎn)生物或等價(jià)物，葡萄糖，和磷源例如磷酸鹽。微生物的孢子在該菌種發(fā)酵系統(tǒng)中的該培養(yǎng)基中培養(yǎng)。優(yōu)選的微生物是赭色曲霉(Aspergillusochraceus)NRRL405(ATCC18500)。然后將這樣制備的菌種原種與式XIII底物一起引入到生產(chǎn)發(fā)酵罐中。攪拌發(fā)酵肉湯并通氣，反應(yīng)進(jìn)行足夠的時(shí)間使進(jìn)行到期望的完全程度。用于菌種發(fā)酵罐的培養(yǎng)基優(yōu)選含有含水混合物，該混合物含有大約0.5％-大約5％重量的葡萄糖，大約0.05％-大約5％重量的氮源，例如胨，大約0.05％-大約0.5％重量的磷源，例如磷酸銨鹽或堿金屬鹽，例如磷酸一銨或磷酸氫二鉀，大約0.25％-大約2.5％重量的酵母溶菌產(chǎn)物或抽提物(或其它氨基酸源例如酒糟)，大約1％-大約2％重量的瓊脂或其它不可消化的多糖。特別優(yōu)選的菌種生長(zhǎng)培養(yǎng)基含有大約0.05％-大約5％重量的氮源，例如胨，大約0.25％-大約2.5％重量的自溶酵母或酵母抽提物，大約0.5％-大約5％重量的葡萄糖，大約0.05％-大約0.5％重量的磷源，例如磷酸一銨。特別經(jīng)濟(jì)的處理操作是通過(guò)使用另一種優(yōu)選的菌種培養(yǎng)基而提供的，該培養(yǎng)基含有大約0.5％-大約5％重量的玉米漿，0.25％-大約2.5％重量的自溶酵母或酵母抽提物，大約0.5％-大約5％重量的葡萄糖，大約0.05％-大約0.5％重量的磷酸一銨。玉米漿是特別經(jīng)濟(jì)的蛋白質(zhì)，肽類(lèi)，碳水化合物，有機(jī)酸，維生素，金屬離子，痕量元素和磷酸鹽的來(lái)源。來(lái)自其它谷物的麥芽汁可以代替玉米漿使用或者除玉米漿之外還加入來(lái)自其它谷物的麥芽汁。培養(yǎng)基的pH優(yōu)選通過(guò)例如加入堿金屬氫氧化物或正磷酸而調(diào)節(jié)在大約5.0和大約7.0范圍之間。當(dāng)玉米漿作為氮源和碳源時(shí)，pH優(yōu)選調(diào)節(jié)在大約6.2至大約6.8范圍之間。含有胨和葡萄糖的培養(yǎng)基優(yōu)選調(diào)節(jié)在pH大約5.4和大約6.2之間。在菌種發(fā)酵中使用的有用的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中有下面兩種1.培養(yǎng)基#12％胨，2％自溶酵母(或酵母抽提物)，和2％葡萄糖；用20％NaOH調(diào)節(jié)pH為5.8。2.培養(yǎng)基#23％玉米漿，1.5％酵母抽提物，0.3％磷酸一銨和3％葡萄糖；用20％NaOH調(diào)節(jié)pH為6.5。將微生物孢子從小瓶引入到培養(yǎng)基中，一般情況下小瓶中每毫升懸浮液含有大約109個(gè)孢子。在菌種培養(yǎng)之初用生長(zhǎng)培養(yǎng)基稀釋不將孢子種群密度降低到每毫升含有大約107個(gè)孢子，實(shí)現(xiàn)菌種增殖的最佳生產(chǎn)率。優(yōu)選的是，在菌種發(fā)酵系統(tǒng)中培養(yǎng)孢子，直到菌種發(fā)酵罐中的疊集菌絲體體積(PMV)至少是大約20％，優(yōu)選35％-45％。既然菌種發(fā)酵容器(或組成菌種發(fā)酵系列的許多容器的任何容器)中的周期取決于容器中的初始濃度，因此期望提供兩個(gè)或三個(gè)菌種發(fā)酵階段來(lái)促進(jìn)整個(gè)過(guò)程。但是，優(yōu)選避免使用系列中明顯多于三個(gè)菌種發(fā)酵罐，因?yàn)槿绻N發(fā)酵是通過(guò)過(guò)多階段進(jìn)行的話(huà)，則活性遭到損害。菌種培養(yǎng)發(fā)酵在攪拌下，在大約23℃-37℃范圍內(nèi)的溫度下，優(yōu)選在大約24℃-28℃范圍內(nèi)的溫度下進(jìn)行。來(lái)自菌種發(fā)酵系統(tǒng)的培養(yǎng)物與生產(chǎn)生長(zhǎng)培養(yǎng)基一起加入到生產(chǎn)發(fā)酵罐中。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，沒(méi)有滅菌的烯睪丙內(nèi)酯或其它式XIII底物用作反應(yīng)底物。優(yōu)選的是將底物以在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中10％-30％重量漿狀物的形式加入到生產(chǎn)發(fā)酵罐中。為了增加適于11α-羥基化反應(yīng)的表面積，在加入到發(fā)酵罐之前通過(guò)將底物通過(guò)離機(jī)降低顆粒體積機(jī)(offlinemicronizer)來(lái)減小式XIII底物顆粒大小。也分開(kāi)加入含有葡萄糖的滅菌營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)的原種，和含有酵母產(chǎn)生物例如自溶酵母(或以其它來(lái)源例如酒糟為基礎(chǔ)的等價(jià)物氨基酸混合物)的第二代滅菌營(yíng)養(yǎng)溶液。培養(yǎng)基含有含水混合物，混合物含有大約0.5％-大約5％重量的葡萄糖，大約0.05％-大約5％重量的氮源，例如胨，大約0.05％-大約0.5％重量的磷源，例如磷酸銨鹽或堿金屬鹽，例如磷酸氫二鉀，大約0.25％-大約2.5％重量的酵母溶菌產(chǎn)物或抽提物(或其它氨基酸源例如酒糟)，大約1％-大約2％重量的瓊脂或其它不可消化的多糖。特別優(yōu)選的生產(chǎn)生長(zhǎng)培養(yǎng)基含有大約0.05％-大約5％重量的氮源，例如胨，大約0.25％-大約2.5％重量的自溶酵母或酵母抽提物，大約0.5％-大約5％重量的葡萄糖，大約0.05％-大約0.5％重量的磷源，例如磷酸一銨。另一種優(yōu)選的生產(chǎn)培養(yǎng)基含有大約0.5％-大約5％重量的玉米漿，大約0.25％-大約2.5％重量的自溶酵母或酵母抽提物，大約0.5％-大約5％重量的葡萄糖，大約0.05％-大約0.5％重量的磷酸一銨。生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基的pH優(yōu)選以上述對(duì)菌種發(fā)酵培養(yǎng)基描述的方法，分別調(diào)節(jié)到對(duì)于以胨/葡萄糖為基礎(chǔ)的培養(yǎng)基和以玉米漿為基礎(chǔ)的培養(yǎng)基的pH相同的優(yōu)選的范圍。有用的生物轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基在下面給出1.培養(yǎng)基#12％胨，2％自溶酵母(或酵母抽提物)，和2％葡萄糖；用20％NaOH調(diào)節(jié)pH為5.8。2.培養(yǎng)基#21％胨，1％自溶酵母(或酵母抽提物)，和2％葡萄糖；用20％NaOH調(diào)節(jié)pH為5.8。3.培養(yǎng)基#30.5％胨，0.5％自溶酵母(或酵母抽提物)，和0.5％葡萄糖；用20％NaOH調(diào)節(jié)pH為5.8。4.培養(yǎng)基#43％玉米漿，1.5％酵母抽提物，0.3％磷酸一銨和3％葡萄糖；用20％NaOH調(diào)節(jié)pH為6.5。5.培養(yǎng)基#52.55％玉米漿，1.275％酵母抽提物，0.255％磷酸一銨和3％葡萄糖；用20％NaOH調(diào)節(jié)pH為6.5。6.培養(yǎng)基#62.1％玉米漿，1.05％酵母抽提物，0.21％磷酸一銨和3％葡萄糖；用20％NaOH調(diào)節(jié)pH為6.5。在各生產(chǎn)批量周期中，將沒(méi)有滅菌的烯睪丙內(nèi)酯和滅菌的營(yíng)養(yǎng)液以5-20份，優(yōu)選10-15份，優(yōu)選以基本上相等的等份，依次加入到生產(chǎn)發(fā)酵罐中。有利的是，最初以足夠的量加入底物，使在用菌種發(fā)酵肉湯接種之前濃度達(dá)到大約0.1％重量至大約3％重量之間，優(yōu)選達(dá)到大約0.5％重量至大約2％重量之間，然后周期性加入，一般是每8-24小時(shí)加入一次，使累計(jì)比例達(dá)到大約1％重量至大約8％重量之間。每隔8小時(shí)加入附加的底物的情況下，總的加入量比只是每天加入一次底物的情況稍低一些，例如是0.25％-2.5％重量。在后一種情況下累計(jì)的烯睪丙內(nèi)酯的加入量需要是在2％-大約8％重量范圍內(nèi)。在發(fā)酵反應(yīng)期間加入的補(bǔ)充的營(yíng)養(yǎng)混合物優(yōu)選是提縮物，例如一種含有大約40％-60％重量滅菌葡萄糖，和大約16％-32％重量滅菌酵母抽提物或其它酵母產(chǎn)生物的滅菌源(或其它氨基酸源)。因?yàn)橄驁D1生產(chǎn)發(fā)酵罐中加入的底物是沒(méi)有滅菌的，因此向發(fā)酵肉湯中周期性加入抗生素來(lái)控制不期望的生物體的生長(zhǎng)?？梢约尤肜缈敲顾?，四環(huán)素，和頭孢氨芐的抗生素而不會(huì)對(duì)生長(zhǎng)和生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)生不利的影響。優(yōu)選的是，以例如以肉湯總量為基礎(chǔ)的大約0.0004％至大約0.002％的濃度向發(fā)酵肉湯中加入這些抗生素，包括例如以肉湯總量為基礎(chǔ)的大約0.0002％至大約0.0006％硫酸卡那霉素，大約0.0002％至大約0.006％的四環(huán)素鹽酸鹽和/或大約0.001％至大約0.003％的頭孢氨芐。一般情況下，生產(chǎn)發(fā)酵批量周期是80-160小時(shí)左右。因此各式XIII底物和營(yíng)養(yǎng)液部分一般以每2-10小時(shí)，優(yōu)選每4-6小時(shí)加入。有利的是還將消泡劑摻入到菌種發(fā)酵系統(tǒng)和生產(chǎn)發(fā)酵罐中。優(yōu)選的是，在圖1的方法中，向生產(chǎn)發(fā)酵罐中加入的種菌是發(fā)酵罐中總混合物體積的大約0.5-7％，更優(yōu)選大約1-2％，葡萄糖濃度保持在大約0.01％-1.0％，優(yōu)選大約0.025％-0.5％，更優(yōu)選大約0.05％-0.25％重量，周期性加入，優(yōu)選各部分是總批量填料的大約0.05％-0.25％。發(fā)酵溫度一般控制在大約20℃-37℃范圍內(nèi)，優(yōu)選在大約24℃-28℃，但是可能會(huì)期望在反應(yīng)中逐步降低溫度，例如以2℃的增量，以保持疊集菌絲體體積(PMV)低于大約60％，更優(yōu)選低于大約50％，從而防止發(fā)酵肉湯粘度干擾令人滿(mǎn)意的混合。如果生物質(zhì)生長(zhǎng)超過(guò)了液體表面，生物質(zhì)中保留的底物可以從反應(yīng)帶中去除，使成為對(duì)于羥基化反應(yīng)是不可得的。關(guān)于生產(chǎn)率，期望在發(fā)酵反應(yīng)頭24小時(shí)內(nèi)達(dá)到PMV為30-50％，優(yōu)選35-45％范圍內(nèi)，但此后，優(yōu)選控制條件來(lái)控制進(jìn)一步的生長(zhǎng)在上述限度內(nèi)。在反應(yīng)期間，發(fā)酵培養(yǎng)基的pH控制在大約5.0-6.5之間，優(yōu)選在大約5.2-5.8之間，并且以大約400-800rpm之間的速度攪拌發(fā)酵罐。通過(guò)向批量中通氣大約0.2-1.0vvm，并保持發(fā)酵罐上空壓力在大約1大氣壓和1.0巴表壓之間，更優(yōu)選在大約0.7巴表壓左右，來(lái)實(shí)現(xiàn)溶解的氧氣水平為至少是大約10％飽和。攪拌速度也可以提高，因?yàn)楸仨毐３肿钚〉娜芙獾难鯕獾乃健Ｓ欣氖?，溶解的氧氣保持在大大高?0％，事實(shí)上保持在50％這樣高以促進(jìn)底物的轉(zhuǎn)化。保持pH在5.5±0.2范圍內(nèi)對(duì)于生物轉(zhuǎn)化也是最佳的。根據(jù)需要通過(guò)加入一種普通的消泡劑控制發(fā)泡。所有的底物都加完后，優(yōu)選繼續(xù)反應(yīng)直到式VIII產(chǎn)物與剩余的未反應(yīng)的式XIII底物的摩爾比至少是大約9∶1。這樣的轉(zhuǎn)化作用可以在上述指出的80-160小時(shí)批量周期內(nèi)完成。發(fā)現(xiàn)高轉(zhuǎn)化作用與將初始營(yíng)養(yǎng)水平減少到低于初始加入水平相關(guān)，并且通過(guò)控制通氣速度和攪拌速度來(lái)避免底物從液體肉湯中濺出來(lái)。在圖1的方法中，營(yíng)養(yǎng)水平減小到不大于大約初始加入量的60％，然后保持在不大于大約60％，優(yōu)選大約50％；而在圖2和圖3的方法中，營(yíng)養(yǎng)水平減小到不大于大約初始加入量的80％，然后保持在不大于大約80％，優(yōu)選大約70％。通氣速度優(yōu)選不大于1vvm，更優(yōu)選在大約0.5vvm范圍內(nèi)；而攪拌速度優(yōu)選不大于600rpm。在圖2中詳細(xì)說(shuō)明了制備式VIII化合物的特別優(yōu)選的方法。優(yōu)選的微生物還是赭色曲霉(Aspergillusochraceus)NRRL405(ATCC18500)。在該方法中，生長(zhǎng)培養(yǎng)基優(yōu)選含有大約0.5％-大約5％重量的玉米漿，大約0.5％-大約5％重量的葡萄糖，0.1％-大約3％重量的酵母抽提物，大約0.05％-大約0.5％重量的磷酸銨。但是也可以使用這里所描述的其它生產(chǎn)生長(zhǎng)培養(yǎng)基。菌種培養(yǎng)物基本上以對(duì)于圖1的方法所描述的方法制備，使用這里所描述的任何菌種發(fā)酵培養(yǎng)基。沒(méi)有減低顆粒體積的烯睪丙內(nèi)酯或其它式XIII底物在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的懸浮液在一個(gè)混合器中無(wú)菌制備，優(yōu)選以大約10％和大約30％重量底物之間的相對(duì)高的濃度。優(yōu)選的是無(wú)菌制備可以包括混合后的懸浮液的滅菌或巴氏滅菌法。在一批生產(chǎn)量初始時(shí)向生產(chǎn)發(fā)酵罐加入生產(chǎn)一批生產(chǎn)量所需要的滅菌底物懸浮液的全部量，或者周期性連續(xù)加入。底物顆粒大小通過(guò)在連機(jī)剪切泵中濕研磨而減小，連機(jī)剪切泵將漿狀物轉(zhuǎn)移到生產(chǎn)發(fā)酵罐，從而避免了使用離機(jī)降低顆粒機(jī)的需要。通過(guò)巴氏消毒法而不是滅菌法實(shí)現(xiàn)無(wú)菌條件，團(tuán)聚作用的程度是不明顯的，但是期望使用剪切泵來(lái)提供顆粒大小的正對(duì)照?；旧弦陨鲜龇椒ㄏ嗤姆椒▽缇L(zhǎng)培養(yǎng)基和葡萄糖溶液引入到生產(chǎn)發(fā)酵罐中。在加入之前所有的向生產(chǎn)發(fā)酵罐中加入的成分都滅菌，因此不需要抗生素。優(yōu)選的是，在圖2的操作方法中，以大約0.5％至大約7％的比例向生產(chǎn)發(fā)酵罐中加入種菌，發(fā)酵溫度是大約20℃-大約37℃，優(yōu)選是大約24℃-大約28℃，例如通過(guò)加入氣體氨，氫氧化銨水溶液，堿金屬氫氧化物水溶液，或正磷酸，將pH控制在大約4.4和大約6.5之間，優(yōu)選在大約5.3和大約5.5之間。根據(jù)圖1的方法，優(yōu)選調(diào)節(jié)溫度來(lái)控制生物質(zhì)的生長(zhǎng)，使得PMV不超過(guò)55-60％。初始葡萄糖加入量?jī)?yōu)選在大約1％和大約4％重量之間，更優(yōu)選2.5％-3.5％重量，但是在發(fā)酵過(guò)程中優(yōu)選使其降至低于大約1.0％重量。補(bǔ)充的葡萄糖以總的一批生產(chǎn)量為基礎(chǔ)的大約0.2％和大約1.0％重量之間的份數(shù)周期性加入，從而保持葡萄糖在發(fā)酵帶中的濃度在大約0.1％和大約1.5％重量范圍內(nèi)，優(yōu)選是大約0.25％和大約0.5％重量?？梢匀芜x地與葡萄糖一起補(bǔ)加氮源和磷源。不管怎樣，因?yàn)樵谝慌a(chǎn)量周期開(kāi)始時(shí)確定了總的烯睪丙內(nèi)酯的加入量，所以必須供給的含氮和磷的營(yíng)養(yǎng)物也可以同時(shí)加入，使在反應(yīng)期間補(bǔ)加只使用葡萄糖溶液。攪拌的速度和性質(zhì)是一個(gè)明顯的變數(shù)。中等劇烈的攪拌促進(jìn)質(zhì)在固體底物和水相之間轉(zhuǎn)移。但是，應(yīng)該使用低剪切高速攪拌機(jī)來(lái)防止微生物髓鞘質(zhì)的降解。優(yōu)選的攪拌速度根據(jù)培養(yǎng)基肉湯粘度，氧氣濃度，和容器，折流板和葉輪位型影響的混合條件，在200-800rpm范圍內(nèi)變化。一般情況下，優(yōu)選的攪拌速度在350-600rpm范圍內(nèi)。攪拌葉輪優(yōu)選提供軸向向下的泵動(dòng)作用，這樣有助于發(fā)酵的生物質(zhì)很好地混合。一批生產(chǎn)量?jī)?yōu)選以大約0.3和大約1.0vvm之間的速度，優(yōu)選以0.4-0.8vvm的速度通氣。發(fā)酵罐上空的壓力優(yōu)選在大約0.5和大約1.0巴量之間。優(yōu)選控制溫度，攪拌，通氣和回壓，保持溶解的氧氣在生物轉(zhuǎn)化期間在至少大約10％體積范圍內(nèi)?？偟囊慌a(chǎn)量周期一般在大約100和大約140小時(shí)之間。盡管圖2方法操作原理以早期基本上加入全部烯睪丙內(nèi)酯量為基礎(chǔ)，但是應(yīng)該理解，發(fā)酵肉湯的生長(zhǎng)可能在加入大量烯睪丙內(nèi)酯之前就進(jìn)行了。任選地，在一次生產(chǎn)量后期也可以加入一部分烯睪丙內(nèi)酯。但是，一般情況下，在發(fā)酵開(kāi)始后48小時(shí)內(nèi)應(yīng)該向轉(zhuǎn)化發(fā)酵罐中加入至少大約75％滅菌烯睪丙內(nèi)酯填料。而且，為了促進(jìn)生物轉(zhuǎn)化酶的產(chǎn)生，期望在發(fā)酵開(kāi)始或者至少在頭24小時(shí)內(nèi)加入至少大約25％重量烯睪丙內(nèi)酯。在如圖3說(shuō)明的進(jìn)一步優(yōu)選的方法中，在加入種菌之前，在生產(chǎn)發(fā)酵容器中將全部一批生產(chǎn)量填料和營(yíng)養(yǎng)溶液滅菌。可以使用的營(yíng)養(yǎng)溶液以及其中優(yōu)選條件與圖2的方法基本上相同。在本發(fā)明實(shí)施方案中，攪拌機(jī)葉輪的剪切作用破壞了底物的團(tuán)聚作用，另一方面是要進(jìn)行滅菌。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，如果烯睪丙內(nèi)酯的平均粒度小于大約200μ，并且至少75％重量的顆粒小于240μ，則反應(yīng)進(jìn)行得令人滿(mǎn)意。發(fā)現(xiàn)使用合適的高速攪拌機(jī)，例如圓盤(pán)渦輪高速攪拌機(jī)，以200-800rpm范圍內(nèi)適當(dāng)?shù)乃俣龋┒怂俣戎辽偈谴蠹s400cm/秒，就提供足以保持減輕在生產(chǎn)發(fā)酵罐中滅菌時(shí)往往會(huì)發(fā)生的團(tuán)聚作用的粒度特征剪切速度。圖3方法的其它操作基本上與圖2的方法相同。圖2和圖3的方法提供了幾種優(yōu)于圖1方法的顯著的優(yōu)點(diǎn)。一個(gè)特殊的優(yōu)點(diǎn)是可控制使用低耗費(fèi)營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)例如玉米漿。以及進(jìn)一步的優(yōu)點(diǎn)是不需要抗生素，簡(jiǎn)化了進(jìn)料過(guò)程，使烯睪丙內(nèi)酯或其它式XIII底物一次滅菌。另一個(gè)特別的優(yōu)點(diǎn)是在反應(yīng)周期期間能使用簡(jiǎn)單的葡萄糖溶液用于補(bǔ)充而不用使用復(fù)雜的營(yíng)養(yǎng)溶液。在圖1-3所示的方法中，式VIII產(chǎn)物是結(jié)晶固體，其與生物質(zhì)一起通過(guò)過(guò)濾或者低速離心而從反應(yīng)肉湯中分離出來(lái)?；蛘呖梢杂糜袡C(jī)溶劑將產(chǎn)物從全反應(yīng)肉湯中萃取出來(lái)。通過(guò)溶劑萃取回收式VIII產(chǎn)物。為了最大限度回收，用萃取溶劑處理液相濾液和生物質(zhì)過(guò)濾器或?yàn)V餅，但是通?！?5％的產(chǎn)物與生物質(zhì)相關(guān)。一般情況下，烴，酯，鹵代烴，和酮溶劑可以用于萃取。優(yōu)選的溶劑是乙酸乙酯。其它典型的合適的溶劑包括甲苯和甲基異丁基酮。對(duì)于從液相中萃取，適宜使用與其所接觸的反應(yīng)溶液的體積大約相等的溶劑的體積。為了從生物質(zhì)中回收產(chǎn)物，將后者懸浮于溶劑中，溶劑優(yōu)選相對(duì)于底物初始加入量過(guò)量很多，例如每克初始的烯睪丙內(nèi)酯加入量用50-100ml溶劑，得到的懸浮液優(yōu)選回流20分鐘至幾小時(shí)，以確保產(chǎn)物從生物質(zhì)的凹面和孔隙轉(zhuǎn)移到溶劑相中。此后，過(guò)濾或離心去除生物質(zhì)，濾餅優(yōu)選用新鮮溶劑和去離子水兩者洗滌。然后合并水和溶劑洗液并使各相分離。式VIII產(chǎn)物通過(guò)結(jié)晶從溶液中回收。為了獲得最大產(chǎn)率，用新鮮溶劑處理菌絲體兩次。沉降使水相完全分離后，從溶劑相中回收產(chǎn)物。最優(yōu)選的是真空去除溶劑，直到開(kāi)始結(jié)晶，然后，將濃縮的萃取液冷卻到0-20℃。優(yōu)選大約10℃至大約15℃靜置一段時(shí)間用于結(jié)晶沉降和生長(zhǎng)，一般是8-12小時(shí)。特別優(yōu)選圖2的方法，尤其是圖3的方法。這些方法在低粘度下操作，并且可以變化來(lái)控制反應(yīng)參數(shù)，例如pH，溫度和溶解的氧氣。而且不用借助抗生素可以容易地保持滅菌條件。生物轉(zhuǎn)化過(guò)程是放熱的，所以應(yīng)該使用加套式發(fā)酵罐或冷卻蛇管在生產(chǎn)發(fā)酵罐中去除熱?；蛘叻磻?yīng)肉湯可以通過(guò)外部熱交換器環(huán)流。根據(jù)肉湯中氧氣效能的測(cè)定，通過(guò)調(diào)節(jié)空氣進(jìn)入反應(yīng)器的速度，優(yōu)選將溶解的氧氣保持在至少大約5％體積的水平，優(yōu)選至少在大約10％體積的水平，就足以提供反應(yīng)的能量，并且保證葡萄糖轉(zhuǎn)化成二氧化碳和水。pH優(yōu)選控制在大約4.5和大約6.5之間。在式XIII底物11-羥基化的各種不同的方法中，產(chǎn)率受從固體底物轉(zhuǎn)移到液相或認(rèn)為反應(yīng)所發(fā)生的相界的質(zhì)量的限制。如上述所指出的，產(chǎn)率不明顯受質(zhì)量轉(zhuǎn)移速率限制，只要底物的顆粒平均粒度減小到小于大約300μ，并且至少75％重量的顆粒小于240μ。但是，在一些變化的實(shí)施方案中，這些方法的產(chǎn)率可以進(jìn)一步提高，所述變化的實(shí)施方案中向生產(chǎn)發(fā)酵罐中提供有機(jī)溶劑中的烯睪丙內(nèi)酯或其它式XIII底物的實(shí)際加入量。根據(jù)一項(xiàng)選擇，將底物溶解于一種水不混溶溶劑中，并與含水的生長(zhǎng)培養(yǎng)基接種物和一種表面活性劑混合。有用的水不混溶溶劑包括，例如，DMF，DMSO，C6-C12脂肪酸，C6-C12正鏈烷烴，植物油，脫水山梨糖醇，和含水的表面活性劑溶液。填料的攪拌作用產(chǎn)生一個(gè)乳液反應(yīng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)具有底物從有機(jī)液相向反應(yīng)點(diǎn)質(zhì)量轉(zhuǎn)移的增大的界面面積。第二個(gè)選擇是最初將底物以實(shí)質(zhì)上大于其在水中的溶解度的濃度溶解于水可混溶溶劑中，例如丙酮，甲基乙基酮，甲醇，乙醇，或甘油中。通過(guò)在提高的溫度下制備初始底物溶液，提高了溶解度，從而進(jìn)一步提高了加入到反應(yīng)器中的溶液形式的底物的量，并且最終提高了反應(yīng)器的有效載量。與相對(duì)冷的含有生長(zhǎng)培養(yǎng)基和種菌的含水填料一起向生產(chǎn)發(fā)酵反應(yīng)器中進(jìn)入熱的底物溶液。當(dāng)?shù)孜锶芤号c含水培養(yǎng)基混合時(shí)，發(fā)生底物沉淀。然而，在基本過(guò)飽和中等劇烈攪拌條件下，形成晶核比晶體生長(zhǎng)更有利，并且形成高表面積的非常細(xì)的顆粒。高表面積促進(jìn)液相和固相之間的質(zhì)轉(zhuǎn)移。而且，在水可互溶溶劑的存在下也提高了含水液相中底物的平衡濃度。因此提高了產(chǎn)率。盡管微生物可能不一定耐受含水相中的高濃度有機(jī)溶劑，但是可以使用一定濃度的乙醇，例如大約3％-大約5％重量范圍的乙醇以有利于反應(yīng)。第三種選擇是將底物溶解于含水的環(huán)糊精溶液中。詳細(xì)說(shuō)明的環(huán)糊精包括羥基丙基-β-環(huán)糊精和甲基-β-環(huán)糊精。底物∶環(huán)糊精的摩爾比可以是大約1∶1至大約1∶1.5，底物∶環(huán)糊精。然后可以將底物∶環(huán)糊精混合物無(wú)菌加入生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)器中。11α-羥基烯睪丙內(nèi)酯，以及11α-羥基化過(guò)程中的其它產(chǎn)物(式VIII和VIIIA)是新的化合物，可以通過(guò)過(guò)濾反應(yīng)培養(yǎng)基，并且從過(guò)濾培養(yǎng)基收集的生物質(zhì)中提取產(chǎn)物來(lái)分離。常規(guī)有機(jī)溶劑例如乙酸乙酯，丙酮，甲苯，氯化烴，和甲基異丁基酮可以用于提取。然后式VIII產(chǎn)物可以從相同類(lèi)型有機(jī)溶劑中重結(jié)晶。式VIII化合物具有作為制備式I化合物特別是式IA的中間體的實(shí)際價(jià)值。優(yōu)選的是式VIII化合物相應(yīng)于式VIIIA，其中-A-A-和-B-B-是-CH2-CH2-，R3是氫，低級(jí)烷基或低級(jí)烷氧基，，并且R8和R9一起構(gòu)成20-螺噁烷環(huán)而且，根據(jù)反應(yīng)式1的方法，式VIII化合物在堿性條件下與氰化物離子源反應(yīng)，產(chǎn)生式VII烯胺化合物其中-A-A-，R3，-B-B-，R8和R9如上定義。其中底物相應(yīng)于式VIIIA，產(chǎn)物是式VIIA其中-A-A-，R3，-B-B-，Y1，Y2和X如式XIII所定義。式VIII的11α-羥基底物的氰化作用可以通過(guò)將其與一種氰化物離子源例如酮基氰醇，最優(yōu)選的是丙酮氰醇，在一種堿和一種堿金屬鹽的存在下反應(yīng)來(lái)進(jìn)行，堿金屬鹽最優(yōu)選氯化鋰?；蛘?，氰化作用可以不用氰醇而通過(guò)使用堿金屬氰化物在一種酸的存在下進(jìn)行。在酮基氰醇的方法中，反應(yīng)在溶液中進(jìn)行，優(yōu)選使用質(zhì)子惰性極性溶劑例如二甲基甲酰胺或二甲亞砜。生成烯胺時(shí)每摩爾底物需要至少2摩爾氰化物離子源，并且優(yōu)選使用稍過(guò)量的氰化物源。堿優(yōu)選是含有氮原子的堿例如二烷基胺，三烷基胺，鏈烷醇胺，吡啶或類(lèi)似物。但是，也可以使用無(wú)機(jī)堿例如堿金屬碳酸鹽或堿金屬氫氧化物。優(yōu)選的是，式VIII底物最初存在的比例是大約20-50％重量比例，堿存在的比例是每當(dāng)量底物0.5-2當(dāng)量。反應(yīng)溫度的要求不嚴(yán)格，但是高溫下操作提高產(chǎn)率。例如，使用三乙胺為堿的情況下，反應(yīng)在大約80℃-大約90℃范圍下進(jìn)行是有利的。在這樣的溫度下，反應(yīng)在大約5-大約20小時(shí)內(nèi)進(jìn)行完全。在使用二異丙基乙基胺為堿并且反應(yīng)在105℃進(jìn)行時(shí)，反應(yīng)8小時(shí)進(jìn)行完全。在反應(yīng)完全后，真空去除溶劑，殘留的油狀物溶解于水中，并用稀酸優(yōu)選鹽酸中和到pH7。產(chǎn)物從該溶液中沉淀出來(lái)，然后用蒸餾水洗滌并空氣風(fēng)干。釋放出來(lái)的HCN可以用惰性氣體去除并在堿性溶液中使反應(yīng)停止。將干燥的沉淀溶解于氯仿或其它合適的溶劑中，然后用濃鹽酸例如6NHCl萃取。通過(guò)加入無(wú)機(jī)堿，優(yōu)選堿金屬氫氧化物，將萃取液中和到pH7，然后冷卻到0℃左右。將得到的沉淀洗滌干燥后從合適的溶劑例如丙酮中重結(jié)晶，產(chǎn)生適合于在該方法下一步中使用的式VII產(chǎn)物。另一方面，反應(yīng)可以在含有水可互溶有機(jī)溶劑例如甲醇的含水溶劑體系中進(jìn)行，或者在含有水和有機(jī)溶劑例如乙酸乙酯的兩相體系中進(jìn)行。在該方法中，可以通過(guò)用水稀釋反應(yīng)溶液，然后用有機(jī)溶劑例如二氯甲烷或氯仿萃取該產(chǎn)物，然后用濃的礦物酸，例如2NHCl從有機(jī)萃取液中反萃取來(lái)回收產(chǎn)物。參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利3200113。根據(jù)另一方面，該反應(yīng)可以在一種水可互溶溶劑例如二甲基甲酰胺，二甲基乙酰胺，N-甲基，吡咯烷酮或二甲亞砜中進(jìn)行，然后用水稀釋反應(yīng)產(chǎn)物溶液，并且例如通過(guò)加入一種堿金屬碳酸鹽使變?yōu)閴A性，然后冷卻到0-10℃，從而使產(chǎn)物沉淀。優(yōu)選用堿金屬次鹵酸鹽(hypohalite)或其它有效防止氰化物揮發(fā)的試劑使系統(tǒng)猝止。過(guò)濾并且用水洗滌后，沉淀的產(chǎn)物適用于該方法的下一步反應(yīng)。根據(jù)另一方面，可以通過(guò)使式VIII底物在一種質(zhì)子源存在下，與過(guò)量的堿金屬氰化物，優(yōu)選氰化鈉，在含有質(zhì)子惰性水可互溶的極性溶劑例如二甲基甲酰胺或二甲基乙酰胺的含水溶劑中反應(yīng)，來(lái)制備式VII烯胺產(chǎn)物。質(zhì)子源優(yōu)選是礦物酸或C1-C5羧酸，硫酸是特別優(yōu)選的。相反地，其中氰化作用試劑是商售的氰化鋰DMF溶液情況下，不需要加入分離的質(zhì)子源。氰化物離子優(yōu)選以每當(dāng)量底物大約2.05和大約5摩爾當(dāng)量的比例加入到反應(yīng)器中。相信礦物酸或其它質(zhì)子源促進(jìn)HCN加成到4，5和6，7雙鍵上，并且優(yōu)選以每摩爾當(dāng)量底物至少1摩爾當(dāng)量的比例存在；但是反應(yīng)體系應(yīng)該通過(guò)保持堿金屬氰化物比酸過(guò)量來(lái)保持堿性。反應(yīng)優(yōu)選在至少大約75℃，一般是60-100℃的溫度下，反應(yīng)大約1-大約8小時(shí)，優(yōu)選大約1.5-大約3小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束時(shí)，將反應(yīng)混合物冷卻，優(yōu)選冷卻到室溫左右；優(yōu)選在大約冰浴溫度下通過(guò)酸化反應(yīng)混合物，并且將其與冷水混合，來(lái)沉淀產(chǎn)物烯胺。相信酸化作用閉合17-內(nèi)酯，其在氰化作用中常用的堿性條件下有開(kāi)環(huán)趨勢(shì)。用反應(yīng)過(guò)程中存在的相同的酸，優(yōu)選硫酸，方便地酸化反應(yīng)混合物。優(yōu)選以每摩爾產(chǎn)物大約10-大約50摩爾當(dāng)量的比例加入水。式VII化合物是新的化合物，并且具有作為制備式I特別是式IA的中間體的重要價(jià)值。優(yōu)選的是，式VII化合物相應(yīng)于式VIIA，其中-A-A-和-B-B-是-CH2-CH2-，R3是氫，低級(jí)烷基或低級(jí)烷氧基，，并且R8和R9一起構(gòu)成20-螺噁烷環(huán)最優(yōu)選的式VII化合物是5’R(5’α)，7’β-20’-氨基十六氫-11’β-羥基-10’α，13’α-二甲基-3’，5-二氧螺[呋喃-2(3H)，17’α(5’H)-[7，4]亞甲基(metheno)[4H]環(huán)戊[a]菲]-5’-腈。在反應(yīng)式1合成的下一步中，水解式VII烯胺，產(chǎn)生式VI二酮化合物其中-A-A-，R3，-B-B-，R8和R9如式VIII定義。水解可以使用任何含水有機(jī)或無(wú)機(jī)酸。優(yōu)選鹽酸。為了提高產(chǎn)率，優(yōu)選使用一種水可互溶有機(jī)溶劑，例如低級(jí)鏈烷醇作為輔助溶劑。酸應(yīng)該以每當(dāng)量式VII底物至少1當(dāng)量的比例存在。在含水體系中，在大約80℃在大約5小時(shí)的期間內(nèi)，烯胺底物VII可以基本上轉(zhuǎn)化成式VII的二酮。在高溫下操作提高產(chǎn)率，而溫度的要求不嚴(yán)格。根據(jù)溶劑體系和酸的揮發(fā)性選擇合適的溫度。優(yōu)選的是，式VII烯胺底物相應(yīng)于式VIIA而二酮產(chǎn)物相應(yīng)于式VIA，其中-A-A-，-B-B-，Y1，Y2和X如式VIIIA定義。在反應(yīng)完后，將溶液冷卻到0-25℃，結(jié)晶產(chǎn)物。產(chǎn)物結(jié)晶可以從合適的溶劑中重結(jié)晶，合適的溶劑例如異丙醇或甲醇，產(chǎn)生適用于該方法下一步反應(yīng)的式VI產(chǎn)物；但是通常不必重結(jié)晶。式VI產(chǎn)物是新的化合物，并且具有作為制備式I化合物特別是式IA化合物的中間體的實(shí)際價(jià)值。優(yōu)選的是，式VI化合物相應(yīng)于式VIA，其中-A-A-和-B-B-是-CH2-CH2-，R3是氫，低級(jí)烷基或低級(jí)烷氧基，，并且R8和R9一起構(gòu)成20-螺噁烷環(huán)最優(yōu)選的式VI化合物是4’S(4’α)，7’α-十六氫-11’α-羥基-10’β，13’β-二甲基-3’，5，20’-三氧螺[呋喃-2(3H)，17’β-[4，7]亞甲基[17H]環(huán)戊[a]菲]-5’β(2’H)-腈。在本發(fā)明一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，用上述相同的方法由式VIII化合物產(chǎn)生式VII產(chǎn)物烯胺，并就地轉(zhuǎn)化成式VI二酮。在本發(fā)明的該實(shí)施方案中，式VIII底物與含有質(zhì)子源的含水溶劑中過(guò)量的堿金屬氰化物，或者如上所述任選地一種堿和氯化鋰存在下與過(guò)量酮基氰醇反應(yīng)。然而，代替冷卻反應(yīng)混合物，酸化，并且以計(jì)算引起烯胺沉淀的比例加入水，優(yōu)選避免大量冷卻反應(yīng)混合物。在氰化作用反應(yīng)終止時(shí)需要向反應(yīng)混合物中加入水和一種酸，優(yōu)選一種礦物酸，例如硫酸，加入的酸的比例足以中和過(guò)量的堿金屬氰化物，對(duì)于每摩爾式VIII底物一般需要加入至少1摩爾當(dāng)量的酸，優(yōu)選對(duì)于每摩爾底物加入大約2摩爾和大約5摩爾當(dāng)量之間的酸。而且溫度需要保持足夠高，并且稀釋度足夠大，使得避免大量沉淀，并且使在液相中進(jìn)行由烯胺向二酮的水解。因此，該方法可以以最小干擾和高產(chǎn)率進(jìn)行。水解優(yōu)選在至少80℃的溫度下，更優(yōu)選在大約90-100℃范圍內(nèi)，一般進(jìn)行大約1-10小時(shí)，更優(yōu)選大約2-5小時(shí)。然后將反應(yīng)混合物冷卻，優(yōu)選冷卻到大約0℃和大約15℃之間的溫度，在冰浴中冷到大約5℃至大約10℃對(duì)于沉淀式VI產(chǎn)物二酮是有益的。通過(guò)過(guò)濾可以回收固體產(chǎn)物，并且通過(guò)用水洗滌來(lái)去除雜質(zhì)。在反應(yīng)式1合成的下一步中，式VI二酮化合物與金屬烷氧化物反應(yīng)，將4和7位的酮橋打開(kāi)，裂解羰基和4-碳之間的鍵，在7位形成一個(gè)α-取向的鏈烷?；趸驶〈⑷コ?-碳處的氰基。該反應(yīng)的產(chǎn)物是相應(yīng)于式V的羥基酯化合物其中-A-A-，R3，-B-B-，R8和R9如式VIII定義，R1是低級(jí)烷氧羰基或羥基羰基。反應(yīng)中使用的金屬烷氧化物相應(yīng)于式R10OM，其中M是堿金屬，R10相應(yīng)于R1中的烷氧取代基。當(dāng)金屬烷氧化物是鉀或鈉的甲氧化物時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)率是最為令人滿(mǎn)意的，但是可以使用其它低級(jí)烷氧化物。鉀的烷氧化物是特別優(yōu)選的。也可以使用苯氧化物，其它芳基氧化物，以及芳基硫化物。反應(yīng)一般在相應(yīng)于式R10OH其中R10如上定義的醇的存在下進(jìn)行?？梢允褂闷渌Ｒ?guī)試劑。優(yōu)選的是，式VI底物以大約2％和大約12％重量之間的比例存在，更優(yōu)選至少大約6％重量，R10OM以每摩爾底物大約0.5和大約4摩爾之間的比例存在。溫度的要求不嚴(yán)格，但是提高的溫度提高產(chǎn)率。反應(yīng)時(shí)間一般是大約4-24小時(shí)，優(yōu)選大約4-16小時(shí)。一般情況下，根據(jù)使用的溶劑，反應(yīng)在大氣壓回流溫度下進(jìn)行。在式VI二酮向式VI羥基酯的轉(zhuǎn)化中，副產(chǎn)物氰化物離子可以與產(chǎn)物反應(yīng)生成5-氰基酯。因?yàn)槠胶庠诘蜐舛认赂欣苑磻?yīng)優(yōu)選在高稀釋度下進(jìn)行，例如對(duì)于用鈉甲氧化物的反應(yīng)高達(dá)40∶1。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過(guò)使用鉀的甲氧化物而不是鈉的甲氧化物可以實(shí)現(xiàn)明顯高得多的產(chǎn)率，因?yàn)榇蠹s20∶1范圍的稀釋度一般足以減小其中鉀的甲氧化物作為試劑的反向氰化作用的程度。根據(jù)本發(fā)明，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)反向氰化作用反應(yīng)可以通過(guò)采用適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)或物理方法從反應(yīng)帶中去除副產(chǎn)物氰化物離子來(lái)抑制。因此在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，二酮與堿金屬烷氧化物的反應(yīng)可以在氰離子的沉淀劑的存在下進(jìn)行，氰離子沉淀劑例如含有形成不可溶氰化物的陽(yáng)離子的鹽。這樣的鹽可以例如包括碘化鋅，硫酸鐵，或者基本上所有的比相應(yīng)的氰化物更溶解的堿土金屬或過(guò)渡金屬的鹵化物，硫酸鹽或其它鹽。如果碘化鋅以每當(dāng)量二酮底物大約1當(dāng)量范圍內(nèi)的比例存在，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)產(chǎn)率與沒(méi)有堿金屬鹵化物存在下進(jìn)行的方法相比大大提高。甚至在使用了除去氰離子的沉淀劑的情況下，仍然優(yōu)選在高稀釋度下，但由于使用了沉淀劑，溶劑與二酮底物的摩爾比，與不用該試劑的反應(yīng)相比，可以大大減少。式V羥基酯的回收根據(jù)下面描述的提取或非提取方法進(jìn)行。優(yōu)選的是，式VI二酮底物相應(yīng)于式VIA，而羥基酯產(chǎn)物相應(yīng)于式VA其中-A-A-，-B-B-，Y1，Y2和X如式VIIIA定義，R1如式V中定義。式V產(chǎn)物是新的化合物，并且具有作為制備式I化合物特別是式IA化合物的中間體的實(shí)際價(jià)值。優(yōu)選的是，式V化合物相應(yīng)于式VA，其中-A-A-和-B-B-是-CH2-CH2-，R3是氫，低級(jí)烷基或低級(jí)烷氧基，，并且R8和R9一起構(gòu)成20-螺噁烷環(huán)最優(yōu)選的式V化合物是11α，17α-二羥基-3-氧代孕甾-4-烯-7α，21-二羧酸氫甲酯，γ-內(nèi)酯。式V化合物可以通過(guò)酸化反應(yīng)溶液，例如用濃鹽酸酸化，冷卻到室溫，并用有機(jī)溶劑例如二氯甲烷或乙酸乙酯提取來(lái)分離。提取液用含水堿性洗液洗滌，干燥并過(guò)濾，然后去除溶劑?；蛘呖梢杂脻馑嶂兄购惺絍產(chǎn)物的反應(yīng)溶液。濃縮產(chǎn)物溶液，冷卻到0-25℃，并且過(guò)濾分離固體產(chǎn)物。根據(jù)式V產(chǎn)物回收的一個(gè)優(yōu)選的方法，在反應(yīng)結(jié)束后通過(guò)蒸餾去除甲醇和HCN，在蒸餾之前或期間加入水和酸。在蒸餾之前加入水使操作簡(jiǎn)化，而蒸餾期間行進(jìn)性加入使體積保持基本上不變。在蒸餾進(jìn)行時(shí)式V產(chǎn)物從底部結(jié)晶出來(lái)。該回收方法提供了高質(zhì)量結(jié)晶產(chǎn)物而不需要提取操作。根據(jù)另一方面，含有式V產(chǎn)物的反應(yīng)溶液可以用礦物酸例如4NHCl中止，然后蒸餾去除溶劑。溶劑的去除對(duì)于從反應(yīng)產(chǎn)物中去除殘留的HCN也是有效的。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，若其中式V化合物作為制備epoxymexrenone的方法的中間體，純化式V化合物不一定要多溶劑提取，如本文所述。事實(shí)上，這樣的提取經(jīng)常可以完全避免。在溶劑提取用于產(chǎn)物純化的情況下，期望用鹽水和堿洗補(bǔ)充溶劑洗滌。而在免除了溶劑提取的情況下，鹽水和堿洗也免除了。免除了提取和洗滌，明顯提高了該方法的產(chǎn)率，不損失產(chǎn)量或產(chǎn)品質(zhì)量，也免去了用干燥劑例如硫酸鈉干燥洗滌溶液的需要。粗產(chǎn)物11α-羥基-7α-鏈烷酰氧基羰基產(chǎn)物又溶解于溶劑中，用于該方法的下一個(gè)反應(yīng)步驟，該反應(yīng)步驟是11-羥基轉(zhuǎn)化成11-位的好的離去基團(tuán)，從而產(chǎn)生式IV化合物其中-A-A-，R3，-B-B-，R8和R9如式VIII定義，R1是式V中的定義，R2是低級(jí)芳基磺?；趸榛酋；趸；趸螓u素。優(yōu)選的是，通過(guò)與向含有式V中間體產(chǎn)物的溶液中加入的低級(jí)烷基磺酰鹵，酰鹵或酸酐反應(yīng)來(lái)酯化11α-羥基。優(yōu)選低級(jí)烷基磺酰鹵，特別是甲磺酰氯。另一方面，可以通過(guò)適當(dāng)?shù)脑噭┓磻?yīng)例如亞硫酰溴，亞硫酰氯，硫酰氯或草酰氯，將11α-羥基轉(zhuǎn)化成鹵化物。形成11α-磺酸酯的其它試劑包括甲苯磺酰氯，苯磺酰氯和三氟甲磺酸酐。反應(yīng)在含有鹵化氫清除劑例如三乙胺或吡啶的溶劑中進(jìn)行。也可以使用無(wú)機(jī)堿例如鉀或鈉的碳酸鹽。式V羥基酯的初始濃度優(yōu)選在大約5％-大約50％重量之間。優(yōu)選稍微過(guò)量存在酯化試劑。對(duì)于該反應(yīng)，二氯甲烷是特別合適的試劑，但是也可以使用其它試劑例如二氯乙烷，吡啶，氯仿，甲乙酮，二甲氧基乙烷，甲基異丁基酮，丙酮，其它酮類(lèi)，醚類(lèi)，乙腈，甲苯和四氫呋喃。反應(yīng)溫度主要受溶劑的揮發(fā)性限制。在二氯甲烷中，反應(yīng)溫度優(yōu)選在大約-10℃和大約10℃范圍內(nèi)。優(yōu)選的是，式V羥基酯底物相應(yīng)于式VA，而產(chǎn)物相應(yīng)于式IVA其中-A-A-，-B-B-，Y1，Y2和X如式XIII定義，R1是低級(jí)烷酰氧基羰基或羥基羰基，R2在式IV中定義。式IV產(chǎn)物是新的化合物，并且具有作為制備式I化合物特別是式IA的中間體的實(shí)際價(jià)值。優(yōu)選的是，式IV化合物相應(yīng)于式VA，其中-A-A-和-B-B-是-CH2-CH2-，R3是氫，低級(jí)烷基或低級(jí)烷氧基，，并且R8和R9一起構(gòu)成20-螺噁烷環(huán)最優(yōu)選的式IV化合物是17α-羥基-11α--(甲基磺?；?氧基-3-氧代孕甾-4-烯-7α，21-二羧酸氫甲酯，γ-內(nèi)酯。如果需要，可以通過(guò)去除溶劑來(lái)分離式IV化合物。優(yōu)選首先用含水的堿性洗液例如0.5-2N氫氧化鈉洗滌反應(yīng)溶液，接著，用酸洗，例如0.5-2N鹽酸。去除反應(yīng)溶劑后，例如通過(guò)將產(chǎn)物溶解于二氯甲烷，然后加入降低式IV產(chǎn)物溶解度的另一種溶劑例如乙醚，使其以結(jié)晶形式沉淀，使產(chǎn)物重結(jié)晶。根據(jù)下文的進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，在式IV產(chǎn)物的回收中，或者在制備將式IV中間體轉(zhuǎn)化成式II中間體的反應(yīng)溶液中，如果代之以用離子交換樹(shù)脂去除酸性和堿性雜質(zhì)處理溶液，則可以免卻所有的提取和/或洗滌步驟。首先用陰離子交換樹(shù)脂處理溶液，之后用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂。另一方面，可以首先用無(wú)機(jī)吸附劑例如堿性氧化鋁或堿性氧化硅處理反應(yīng)溶液，接著用稀酸洗滌。堿性氧化鋁或堿性氧化硅一般可以以每千克產(chǎn)物大約5-50g的比例，優(yōu)選每千克產(chǎn)物大約15-20g的比例與反應(yīng)溶液混合。不管使用離子交換樹(shù)脂還是無(wú)機(jī)吸附劑，通過(guò)簡(jiǎn)單地在室溫?cái)嚢柘聦?shù)脂或無(wú)機(jī)吸附劑與反應(yīng)溶液攪拌成漿狀物，然后過(guò)濾去除樹(shù)脂或無(wú)機(jī)吸附劑來(lái)進(jìn)行處理。在本發(fā)明一種可選擇和優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)去除部分溶劑，以濃縮溶液粗產(chǎn)物形式回收式IV產(chǎn)物化合物。直接在該方法的下面步驟中使用該濃縮的溶液，從式IV化合物中去除11α-離去基團(tuán)，從而產(chǎn)生式II烯酯其中-A-A-，R3，-B-B-，R8和R9如式VIII定義，R1是式V中的定義。為了該反應(yīng)的目的，式IV化合物的R2取代基可以是任何離去基團(tuán)，其去除有效生成9-和11-碳之間的雙鍵。優(yōu)選離去基團(tuán)是低級(jí)烷基磺酰基氧基或酰氧基取代基，其通過(guò)與一種酸和一種堿金屬鹽反應(yīng)而被去除?？梢允褂玫V物酸，但是優(yōu)選使用低級(jí)鏈烷酸。有益的是用于該反應(yīng)的試劑進(jìn)一步包括使用的鏈烷酸的堿金屬鹽。特別優(yōu)選的是離去基團(tuán)包括甲磺?；趸糜谠摲磻?yīng)的試劑包括甲酸或乙酸和一種這些酸或另一種低級(jí)鏈烷酸的堿金屬鹽。離去基團(tuán)是甲磺?；趸胰コ噭┦羌姿岷图姿徕浀那闆r下，發(fā)現(xiàn)9，11與11，12-烯烴的比例比較高。如果在去除離去基團(tuán)的過(guò)程中存在游離的水，則有生成雜質(zhì)特別是7，9-內(nèi)酯的趨勢(shì)其難于從終產(chǎn)物中去除。因此用乙酸酐或其它干燥劑來(lái)去除甲酸中存在的水。反應(yīng)之前反應(yīng)混合物中存在的游離的水的含量，根據(jù)KarlFischer分析對(duì)于水的測(cè)定，應(yīng)該保持在低于以總反應(yīng)溶液為基礎(chǔ)的大約0.5％重量的水平，優(yōu)選低于大約0.1％重量。盡管優(yōu)選反應(yīng)混合物盡可能保持干燥，但是0.3％重量的水已可實(shí)現(xiàn)令人滿(mǎn)意的結(jié)果。優(yōu)選的是，反應(yīng)加入的混合物含有大約4％和大約50％重量之間的鏈烷酸中式IV底物。優(yōu)選含有大約4-20％重量的酸的堿金屬鹽。乙酸酐用作干燥劑的情況下，其優(yōu)選以每摩爾鏈烷酸大約0.05-0.2摩爾之間的比例存在。發(fā)現(xiàn)在消除試劑包括作為消除離去基團(tuán)并生成烯酯(9，11-烯烴)的試劑的三氟乙酸，三氟乙酸酐和乙酸鉀的混合物時(shí)，反應(yīng)混合物中副產(chǎn)物7，9-內(nèi)酯和11，12-烯烴的比例相對(duì)低。三氟乙酸酐作為干燥劑，應(yīng)該以以三氟乙酸消除劑為基礎(chǔ)至少大約3％重量，更優(yōu)選至少大約15％重量，最優(yōu)選大約20％的比例存在。另一方面，可以通過(guò)在有機(jī)溶劑例如DMSO，DMF，或DMA中加熱式IV的溶液，消除式IV化合物的11α-離去基團(tuán)，產(chǎn)生式II烯酯。進(jìn)一步根據(jù)本發(fā)明，式IV化合物最初在一種酸例如甲苯磺酸或無(wú)水礦物酸例如硫酸的存在下，與鏈烷酸烯酯例如乙酸異丙烯酯反應(yīng)，生成式IV化合物的3-烯醇酯另一方面，通過(guò)用一種酸酐和堿例如乙酸和乙酸鈉處理，可以生成3烯醇酯。進(jìn)一步可選擇的方法包括在一種酸的存在下用烯酮處理，產(chǎn)生IV(Z)。然后式IV(Z)的中間體在甲酸或乙酸存在下與堿金屬甲酸鹽或乙酸鹽反應(yīng)，產(chǎn)生式IV(Y)Δ-9，11烯醇乙酸酯其然后在有機(jī)溶劑中，優(yōu)選在一種醇例如甲醇中，或者通過(guò)乙酸烯醇酯的熱分解，或者通過(guò)其與堿金屬烷氧化物反應(yīng)，被轉(zhuǎn)化成式II烯酯。消除反應(yīng)對(duì)于式II烯酯是高選擇性的，優(yōu)先11，12-烯烴和7，9-內(nèi)酯。在乙酸烯醇酯向烯酮的轉(zhuǎn)化過(guò)程中保持該選擇性。優(yōu)選的是，式IV底物相應(yīng)于式IVA，而烯酯產(chǎn)物相應(yīng)于式IIA其中-A-A-，-B-B-，Y1，Y2和X如式XIIIA定義，R1在式V中定義。如果需要，可以通過(guò)去除溶劑，將固體產(chǎn)物溶解于冷水中，并且用有機(jī)溶劑例如乙酸乙酯萃取，來(lái)分離式II化合物。適當(dāng)?shù)南礈旌透稍锊襟E后，通過(guò)去除萃取溶劑來(lái)回收產(chǎn)物。然后將烯酯溶解于適合于向式I產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的溶劑中。另一方面，可以通過(guò)向濃縮的產(chǎn)物溶液中加入水并過(guò)濾固體產(chǎn)物，從而，優(yōu)選去除7，9-內(nèi)酯來(lái)分離烯酯。式II底物向式IA產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化可以以美國(guó)專(zhuān)利4559332中描述的方法進(jìn)行，該專(zhuān)利在這里引作參考，或者，更優(yōu)選通過(guò)下文描述的使用鹵代乙酰胺促進(jìn)劑的新的反應(yīng)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，不用分離式IV中間體化合物就可以將式V羥基酯轉(zhuǎn)化成式II烯酯。在該方法中，將羥基酯溶解于一種有機(jī)溶劑例如二氯甲烷；或者向該溶液中加入?；瘎?，例如甲磺酰氯，或鹵化劑，例如硫酰氯。攪拌混合物，在涉及鹵化作用的情況下，加入鹽酸清除劑，例如咪唑。堿與溶液的混合是高度放熱的，因此應(yīng)該用完全冷卻以控制速度進(jìn)行。加入堿之后，得到的混合物升至中等溫度，例如0℃至室溫，或稍高，一般反應(yīng)1-4小時(shí)。反應(yīng)完全后，優(yōu)選在高真空(例如24”至28”Hg)條件下在-10至+15℃，更優(yōu)選在大約0-大約5℃下，去除溶劑，濃縮溶液，并且去除過(guò)量的堿。然后將底物再溶解于有機(jī)溶劑優(yōu)選鹵化溶劑例如二氯甲烷中以轉(zhuǎn)化成烯酯。優(yōu)選分別在無(wú)水反應(yīng)器中混合有機(jī)酸，有機(jī)酸鹽和干燥劑，優(yōu)選甲酸，堿金屬甲酸鹽和乙酸酐來(lái)制備離去基團(tuán)消除劑。乙酸酐的加入是放熱的，結(jié)果釋放CO，因此一定要控制加入速度。為了促進(jìn)水的去除，反應(yīng)溫度優(yōu)選保持在60-90℃范圍內(nèi)，更優(yōu)選大約65-大約75℃。然后，向式IV化合物的產(chǎn)物溶液中加入該試劑以促進(jìn)消除反應(yīng)。4-8小時(shí)后，優(yōu)選將反應(yīng)混合物加熱到至少大約85℃的溫度，但是不超過(guò)約95℃，直到去除所有的揮發(fā)蒸餾物質(zhì)，然后一般再保持大約1-4小時(shí)以完成反應(yīng)。冷卻反應(yīng)混合物，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)提取技術(shù)回收后，可以根據(jù)需要通過(guò)蒸發(fā)溶劑來(lái)回收烯酯。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，可以通過(guò)另一種方法從反應(yīng)溶液中回收式II烯酯，該方法避免了消除反應(yīng)后的提取步驟的需要，從而節(jié)省了費(fèi)用，提高了產(chǎn)量和/或提高了產(chǎn)率。在該方法中，通過(guò)在去除甲酸后用水稀釋反應(yīng)混合物來(lái)沉淀烯酯產(chǎn)物。然后過(guò)濾分離產(chǎn)物。不需要提取。根據(jù)不用分離式IV化合物的由式V羥基酯向式II烯酯轉(zhuǎn)化的進(jìn)一步選擇的方法，式V羥基酯的11α-羥基被鹵原子置換，然后通過(guò)熱脫氫鹵化作用就地生成式II烯酯。通過(guò)在低溫下在一種鹵化氫清除劑例如咪唑存在下，與硫酰鹵，優(yōu)選硫酰氯反應(yīng)，有效進(jìn)行鹵素置換羥基作用。羥基酯溶解于溶劑例如四氫呋喃中并冷卻到0至-70℃。加入硫酰鹵，將反應(yīng)混合物加熱到中等溫度，例如室溫，保持足以完成消除反應(yīng)的一段時(shí)間，一般是1-4小時(shí)。該實(shí)施方案的方法不只是將兩步合成為一步，而且也避免了使用鹵化反應(yīng)試劑；酸(例如乙酸)；和干燥劑(乙酸酐或硫酸鈉)。而且，反應(yīng)不需要回流條件，并且避免產(chǎn)生當(dāng)使用乙酸為干燥劑時(shí)產(chǎn)生的副產(chǎn)物CO。在本發(fā)明一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，不用分離任何純化形式的中間體就可以將式VI二酮化合物轉(zhuǎn)化成epoxymexrenone或其它式I化合物。根據(jù)該優(yōu)選方法，用強(qiáng)酸溶液猝滅含有羥基酯的反應(yīng)溶液，冷卻到室溫，然后用合適的萃取溶劑萃取。有利的是，在萃取之前向反應(yīng)混合物中加入無(wú)機(jī)鹽水溶液，例如10％重量鹽水溶液。洗滌萃取液，并通過(guò)共沸蒸餾從酮裂解反應(yīng)中去除殘留的甲醇溶劑來(lái)干燥。然后在低溫下使得到的含有大約5％-50％重量式V化合物的濃溶液與?；瘎┗蛲榛；瘎┙佑|，生成磺酸酯或二羧酸酯。烷基磺?；饔没螋然磻?yīng)完全之后，將反應(yīng)液通過(guò)酸性交換樹(shù)脂柱后通過(guò)堿性交換樹(shù)脂柱，去除堿性和酸性雜質(zhì)。每次通過(guò)后，用合適的溶劑例如二氯甲烷沖洗柱子，從中回收殘留的磺酰酯或二羧酸酯。合并的洗脫液和沖洗液被合并并濃縮，優(yōu)選真空濃縮，產(chǎn)生含有式IV磺酰酯或二羧酸酯的濃溶液。然后該濃縮液與含有有效去除11α-酯離去基團(tuán)，并且去除氫生成9，11雙鍵的試劑的干燥劑接觸。優(yōu)選去除離去基團(tuán)的溶劑含有如上所述的甲酸/堿金屬甲酸鹽/乙酸酐干燥劑溶液。反應(yīng)完全后，冷卻反應(yīng)混合物，并真空去除甲酸和/或其它揮發(fā)性成分。將殘余物冷卻到室溫，進(jìn)行適當(dāng)?shù)南礈觳襟E后干燥，得到含有式II烯酯的濃溶液。該烯酯然后可以用這里所描述的或者是在美國(guó)專(zhuān)利4559332中描述的方法轉(zhuǎn)化成epoxymexrenone或其它式I化合物。在本發(fā)明一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，從反應(yīng)液中真空去除溶劑，式IV產(chǎn)物分配在水和一種合適的有機(jī)溶劑例如乙酸乙酯中。然后用有機(jī)溶劑反萃含水層，用堿性溶液，優(yōu)選含有一種堿金屬鹵化物的堿金屬氫氧化物的溶液洗滌反萃液。濃縮有機(jī)相，優(yōu)選真空濃縮，得到式II烯酯產(chǎn)物。式II產(chǎn)物然后可以溶解于有機(jī)溶劑例如二氯甲烷中，以’332專(zhuān)利中描述的方法進(jìn)一步反應(yīng)，產(chǎn)生式I產(chǎn)物。在環(huán)氧化反應(yīng)中使用三鹵乙腈的情況下，發(fā)現(xiàn)溶劑的選擇是重要的，最優(yōu)選鹵化溶劑，特別優(yōu)選二氯甲烷。例如二氯乙烷和氯苯溶劑給出合理的令人滿(mǎn)意的產(chǎn)率，但是在二氯甲烷反應(yīng)介質(zhì)中一般得到更好的產(chǎn)率。溶劑例如乙腈和乙酸乙酯一般給出不好的產(chǎn)率，而在溶劑例如甲醇或水/四氫呋喃中的反應(yīng)給出極少期望的產(chǎn)物。進(jìn)一步根據(jù)本發(fā)明，發(fā)現(xiàn)通過(guò)使用三鹵乙酰胺而不是三鹵乙腈為環(huán)化反應(yīng)的過(guò)氧化物活化劑，可以實(shí)現(xiàn)epoxymexrenone合成中的很多改進(jìn)。根據(jù)特別優(yōu)選的方法，通過(guò)在三氯乙酰胺和一種合適的緩沖劑的存在下使式IIA底物與過(guò)氧化氫反應(yīng)進(jìn)行環(huán)氧化作用。反應(yīng)優(yōu)選在大約pH3-7范圍內(nèi)，更優(yōu)選在大約5-7的pH下進(jìn)行。然而盡管有這些考慮，在優(yōu)選pH范圍外也可以成功實(shí)現(xiàn)反應(yīng)。用含有磷酸氫二鉀的緩沖液和/或用含有相對(duì)比例在大約1∶4和大約2∶1之間，更優(yōu)選在大約2∶3范圍內(nèi)的磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀混合物的緩沖液獲得特別好的結(jié)果。也可以使用硼酸鹽緩沖液，但是一般給出比磷酸二鉀或K2HPO4或K2HPO4/KH2PO4混合物慢的轉(zhuǎn)化作用。不管緩沖液的組成是什么，其應(yīng)該提供上面指出范圍內(nèi)的pH值。除了緩沖液全部組成或其精確的pH外，發(fā)現(xiàn)如果至少緩沖液的一部分由二元堿性磷酸氫鹽離子組成，則反應(yīng)進(jìn)行得有效得多。相信該離子基本上作為生成包括促進(jìn)劑和過(guò)氧化氫離子的加成物或配合物中的均相催化劑而參與反應(yīng)，該加成物或配合物的產(chǎn)生可能接著對(duì)于總的環(huán)氧化作用反應(yīng)機(jī)理是必需的。因此，對(duì)于二元堿性磷酸氫鹽(優(yōu)選來(lái)自K2HPO4)的定量需要可能只是少的催化劑濃度。一般情況下，優(yōu)選以每當(dāng)量底物至少大約0.1當(dāng)量，例如大約0.1-大約O.3當(dāng)量的比例存在HPO4。反應(yīng)在合適的溶劑優(yōu)選二氯甲烷中進(jìn)行，但是也可以使用其它的鹵化的溶劑，例如氯苯或二氯乙烷。發(fā)現(xiàn)甲苯和甲苯與乙腈的混合物也是令人滿(mǎn)意的。沒(méi)有依據(jù)特定的理論，判斷反應(yīng)在兩相系統(tǒng)中進(jìn)行最有效，其中生成過(guò)氧化氫中間體，并分布在低水含量的有機(jī)相中，并與有機(jī)相中的底物反應(yīng)。因此優(yōu)選的溶劑是其中水溶解度低的溶劑。包括有另一種溶劑例如乙腈會(huì)促進(jìn)從甲苯中有效回收。在式II底物向式I產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化中，甲苯提供了方法優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)榈孜锎罅康厝芙庥诩妆蕉a(chǎn)物不溶解。因此，當(dāng)轉(zhuǎn)化達(dá)到40-50％范圍時(shí)反應(yīng)中沉淀出產(chǎn)物，產(chǎn)生三相混合物，通過(guò)過(guò)濾可以方便地從中分離產(chǎn)物。在進(jìn)行該方法該步驟的轉(zhuǎn)化作用中，甲醇，乙酸乙酯，單獨(dú)的乙腈，THF和THF/水尚未證明和鹵化溶劑或甲苯一樣有效。盡管三氯乙酰胺是最優(yōu)選的，但是也可以使用其它三鹵乙酰胺，例如三氟乙酰胺。三鹵代甲基苯甲酰胺，和在拉電子三鹵代甲基基團(tuán)與酰胺的羰基之間有亞芳基部分的其它化合物也是有用的。也可以使用3，3，3-三鹵代丙酰胺，但是結(jié)果不好。通常，過(guò)氧化物活化劑相應(yīng)于下式R℃(O)NH2其中R0是有拉電子能力(根據(jù)σ常數(shù)測(cè)定)至少與一氯代甲基一樣高的基團(tuán)。更特別地，過(guò)氧化物活化劑相應(yīng)于下式其中X1，X2和X3獨(dú)立地選自鹵原子，氫，烷基，鹵代烷基和氰基和氰基烷基，RP選自亞芳基和-(CX4X5)n-，其中n是0或1，X1，X2，X3，X4，和X5中至少一個(gè)是鹵原子或全鹵代烷基。其中X1，X2，X3，X4，或X5中任何一個(gè)不是鹵原子時(shí)，其優(yōu)選是鹵代烷基，更優(yōu)選是全鹵代烷基。特別優(yōu)選的活化劑包括其中n是0且X1，X2和X3中至少兩個(gè)是鹵原子的化合物；或者其中所有X1，X2，X3，X4，和X5是鹵原子或是全鹵代烷基的化合物。每個(gè)X1，X2，X3，X4，和X5優(yōu)選是氯或氟，雖然混合的鹵化物也是合適的，但最優(yōu)選氯，可以是全氯代烷基或全溴代烷基和其混合物。優(yōu)選的是，過(guò)氧化物活化劑以最初存在的每當(dāng)量底物至少大約1當(dāng)量，更優(yōu)選大約1.5當(dāng)量至2當(dāng)量的比例存在。過(guò)氧化氫應(yīng)該以至少不過(guò)分過(guò)量的量加入到反應(yīng)中，或者隨著環(huán)氧化作用反應(yīng)的進(jìn)行跟進(jìn)性加入。盡管反應(yīng)對(duì)于每摩爾底物只消耗1-2當(dāng)量的過(guò)氧化氫，但是優(yōu)選以相對(duì)于初始存在的底物和活化劑顯著過(guò)量的量加入過(guò)氧化氫。本發(fā)明不限制于特別的理論，相信反應(yīng)機(jī)理涉及生成活化劑與OOH-的加成物，該反應(yīng)的形成是可逆反應(yīng)，平衡有利于反方向反應(yīng)，因此為了使反應(yīng)向正向方向進(jìn)行必需有大量初始過(guò)量的過(guò)氧化氫。反應(yīng)溫度不在窄范圍內(nèi)限制，在0-100℃范圍內(nèi)可以有效進(jìn)行。最佳溫度取決于溶劑的選擇。一般情況下，優(yōu)選的溫度在大約20-30℃之間，但是在某些溶劑中，例如甲苯，反應(yīng)可以在60-70℃范圍內(nèi)有利地進(jìn)行。在25℃時(shí)，反應(yīng)一般需要10小時(shí)以下，一般是3-6小時(shí)。如果需要，可以在反應(yīng)周期末加入另外的活化劑和過(guò)氧化氫，使底物的轉(zhuǎn)化完全。在反應(yīng)周期末，去除水相，優(yōu)選洗滌有機(jī)反應(yīng)液以去除水溶性雜質(zhì)，然后可以通過(guò)去除溶劑來(lái)回收產(chǎn)物。去除溶劑之前，應(yīng)該用至少弱的至中等的堿性洗液，例如碳酸鈉，洗滌反應(yīng)液。優(yōu)選的是，反應(yīng)混合物依次用下面物質(zhì)洗滌弱還原溶液例如弱的亞硫酸鈉水溶液(例如3％重量)；堿溶液，例如氫氧化鈉或氫氧化鉀(優(yōu)選大約0.5N)；酸溶液例如鹽酸(優(yōu)選大約1N)；最終中性洗液含有水或鹽水，優(yōu)選的飽和的鹽水，以減小產(chǎn)物損失。去除反應(yīng)溶劑之前可以有益地加入另一種溶劑例如有機(jī)溶劑，優(yōu)選乙醇，這樣蒸餾去除大多數(shù)揮發(fā)性反應(yīng)溶劑后，通過(guò)結(jié)晶來(lái)回收產(chǎn)物。應(yīng)該明白，除了制備epoxymexrenone的各種方法外，已經(jīng)很好地應(yīng)用了使用三氯乙酰胺或其它新的過(guò)氧化物活化劑的新的環(huán)氧化作用方法，而且事實(shí)上可以用于在多種底物液相反應(yīng)中跨烯烴雙鍵生成環(huán)氧化物。該反應(yīng)在其中烯烴碳原子是四取代和三取代的不飽和的化合物中特別有效，即RaRbC＝CRcRd和RaRbC＝CRcRH，其中Ra至Rd代表不是氫的取代基。其中底物是帶有三取代雙鍵的環(huán)化合物，或者是帶有四取代雙鍵的環(huán)或無(wú)環(huán)化合物的反應(yīng)進(jìn)行得最快而且完全。舉例的該反應(yīng)的底物包括Δ-9，11-烯睪丙內(nèi)酯，和因?yàn)槿〈退娜〈p鍵反應(yīng)進(jìn)行得更快更完全，對(duì)于在包括其中烯烴碳原子是一元取代的或者甚至是二元取代的其它雙鍵的化合物中跨這樣三取代和四取代雙鍵的選擇性環(huán)氧化作用是特別有效的。應(yīng)該進(jìn)一步明白，該反應(yīng)可以用來(lái)有利于一元取代的或者甚至是二元取代的雙鍵的環(huán)氧化作用，例如各種各樣甾類(lèi)底物中的11，12-烯。但是因?yàn)槠鋬?yōu)選以高選擇性環(huán)氧化更高級(jí)取代的雙鍵，例如9，11-烯，所以本發(fā)明方法對(duì)于在這里其他地方所描述的各種反應(yīng)方法的環(huán)氧化步驟中實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)量和高產(chǎn)率是特別有效的。該改進(jìn)的方法顯示，用于制備下面的化合物特別有益其制備方法是將下述化合物環(huán)氧化，已經(jīng)證明本發(fā)明方法中使用三氯乙酰胺代替三氯乙腈作為環(huán)氧化作用反應(yīng)的氧轉(zhuǎn)移劑有多種優(yōu)點(diǎn)。三氯乙酰胺試劑系統(tǒng)對(duì)于在相同分子結(jié)構(gòu)中跨三取代雙鍵與二取代和α，β-酮基烯烴的環(huán)氧化作用提供嚴(yán)格的區(qū)域控制。因此大大提高了反應(yīng)產(chǎn)率，產(chǎn)物曲線(xiàn)和終產(chǎn)物純度。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)使用三鹵乙腈所觀(guān)察到的氧的大大過(guò)量的產(chǎn)生在用三氯乙酰胺時(shí)沒(méi)有出現(xiàn)，這對(duì)環(huán)氧化作用方法賦予更高的安全性。進(jìn)一步與三氯乙腈促進(jìn)的反應(yīng)相反，三氯乙酰胺反應(yīng)具有最小的放熱作用，因此有利于控制反應(yīng)的放熱曲線(xiàn)。發(fā)現(xiàn)攪拌作用最小，反應(yīng)器效能更一致，這是一個(gè)好于三氯乙腈方法的進(jìn)一步的優(yōu)點(diǎn)。與三氯乙腈促進(jìn)的反應(yīng)相比，該反應(yīng)更適合于大規(guī)模生產(chǎn)。產(chǎn)物的分離和純化是簡(jiǎn)單的，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)例如使用間-氯代過(guò)氧苯甲酸或其它過(guò)酸所發(fā)現(xiàn)的羰基官能團(tuán)的Bayer-Villager氧化作用(環(huán)氧化物促進(jìn)的酮向酯的轉(zhuǎn)化作用)，并且該試劑不貴，易得，并且容易操作。本發(fā)明新的環(huán)氧化方法作為方法1合成的關(guān)鍵步驟非常有用。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，如下進(jìn)行方法1的全部過(guò)程方法2本發(fā)明第二種新的反應(yīng)方法(方法2)用烯睪丙內(nèi)酯或其它相應(yīng)于式XIII的底物起始其中-A-A-，R3，-B-B-，R8和R9如式VIII定義。在該方法的第一個(gè)步驟中，式XIII底物轉(zhuǎn)化成式XII產(chǎn)物使用了基本上與上述將式VIII底物轉(zhuǎn)化成式VII中間體的方法相同的氰化反應(yīng)方法。優(yōu)選式XIII底物相應(yīng)于式XIIIA并且烯胺產(chǎn)物相應(yīng)于式XIIA其中-A-A-，-B-B-，Y1，Y2和X如式XIII定義。在該方法2的第二個(gè)步驟中，式XII烯胺水解為式XI中間體二酮產(chǎn)物其中-A-A-，R3，-B-B-，R8和R9如式VIII定義，使用了基本上與上述將式VIII底物轉(zhuǎn)化成式VII中間體的方法相同的反應(yīng)方法。優(yōu)選式XII底物相應(yīng)于式XIIA并且二酮產(chǎn)物相應(yīng)于式XIA其中-A-A-，-B-B-，Y1，Y2和X如式VIIIA中定義。進(jìn)一步根據(jù)反應(yīng)方法2，式XI二酮與一種堿金屬烷氧化物反應(yīng)生成mexrenone或相應(yīng)于式X的其它產(chǎn)物，其中-A-A-，R3，-B-B-，R8和R9如式VIII定義，R1如在式V中定義。該方法使用了基本上與上述將式VI化合物轉(zhuǎn)化成式V化合物的方法相同的反應(yīng)方法來(lái)進(jìn)行。優(yōu)選式XI底物相應(yīng)于式XIA并且中間體產(chǎn)物相應(yīng)于式XA其中-A-A-，-B-B-，Y1，Y2和X如式XIII中定義，R1如在式V中定義。接著通過(guò)新的生物轉(zhuǎn)化方法將烯睪丙內(nèi)酯和其它式X化合物9α-羥基化，得到式IX產(chǎn)物其中-A-A-，R3，-B-B-，R8和R9如式VIII定義，R1如在式V中定義?？梢杂糜谠摿u基化步驟的微生物中的微生物是NocardiaconicruriaATCC31548，NocardiaaurentiaATCC12674，山扁豆生棒孢(Corynesporacassiicola)ATCC16718，StreptomyceshydroscopicusATCC27438，深黃被孢霉(Mortierellaisabellina)ATCC42613，蠶白僵菌(Beauvriabassiana)ATCC7519，產(chǎn)紫青霉(Penicillumpurpurogenum)ATCC46581，HypomyceschrysospermusIMI109891，ThamnostylumpiriformeATCC8992，短刺小克銀漢霉(Cunnignhamellablakesleeana)ATCC8688a，刺孢小克銀漢霉(Cunningnhamellaechinulata)ATCC3655，美麗小克銀漢霉(Cunninghamellaelegans)ATCC9245，玫瑰單端孢(Trichotheciumroseum)ATCC12543，EpicoccumhumicolaATCC12722，SaccharopolysporaeythraeATCC11635，蠶白僵菌(Beauvriabassiana)ATCC13144，簡(jiǎn)單節(jié)桿菌(Arthrobactersimplex)，BacteriumcyclooxydansATCC12673，CylindrocarponradicicolaATCC11011，NocardiaaurentiaATCC12674，犬股諾卡氏菌(Nocardiacanicruria)，限定諾卡氏菌(Norcardiarestrictus)ATCC14887，睪丸酮假單孢菌(Pseudomonastestosteroni)ATCC11996，RhodococcusequiATCC21329，偶發(fā)分枝桿菌(Mycobacteriumfortuitum)ATCC-6842，和玫瑰色紅球菌(Rhodococcusrhodochrous)ATCC19150。反應(yīng)基本上以上述與方法1和2相關(guān)的方法進(jìn)行。特別優(yōu)選方法1的方法。生物轉(zhuǎn)化中使用的生長(zhǎng)培養(yǎng)基優(yōu)選含有大約0.05％至大約5％重量可利用氮；大約0.5％至大約5％重量的葡萄糖；大約0.25％-大約2.5％重量的酵母產(chǎn)生物；大約0.05％至大約0.5％重量可得的磷。特別優(yōu)選的生長(zhǎng)培養(yǎng)基包括下列物質(zhì)大豆粉大約0.5％-大約3％重量的葡萄糖；大約0.1％-大約1％重量的大豆粉；大約0.05％-大約0.5％重量的堿金屬鹵化物；大約0.05％-大約560.5％重量的酵母產(chǎn)生物例如自溶酵母或酵母抽提物；大約0.05％-大約0.5％重量的磷酸鹽例如磷酸氫二鉀；pH＝7；胨-酵母抽提物-葡萄糖大約0.2％-大約2％重量的胨；大約0.05％-大約0.5％重量的酵母抽提物；和大約2％-大約5％重量的葡萄糖；Mueller-Hinton大約10％-大約40％重量的牛肉浸液；大約0.35％-大約8.75％重量的酪蛋白水解物；大約0.15％-大約0.7％重量的淀粉。真菌可以在大豆粉或胨營(yíng)養(yǎng)物中生長(zhǎng)，而放線(xiàn)菌和真桿菌可以在大豆粉(加0.5％-1％重量的羧酸鹽例如甲酸鈉用于生物轉(zhuǎn)化)或在Mueller-Hinton肉湯中生長(zhǎng)。在實(shí)施例19中討論了通過(guò)發(fā)酵從mexrenone產(chǎn)生11β-羥基mexrenone。式IX產(chǎn)物是新的化合物，其通過(guò)過(guò)濾分離，用合適的有機(jī)溶劑例如乙酸乙酯洗滌，并且從相同或相似的溶劑中重結(jié)晶。它們具有作為制備式I特別是式IA化合物的中間體的實(shí)際價(jià)值。優(yōu)選的是，式IX化合物相應(yīng)于式IXA，其中-A-A-和-B-B-是-CH2-CH2-，R3是氫，低級(jí)烷基或低級(jí)烷氧基，，并且R8和R9一起構(gòu)成20-螺噁烷環(huán)在合成方法2的下一步反應(yīng)中，式IX產(chǎn)物與一種脫水劑反應(yīng)生成式II化合物其中-A-A-，R3，-B-B-，R8和R9如式VIII定義，R1如在式V中定義。其中底物相應(yīng)于式IXA，產(chǎn)物是式IIA其中-A-A-，-B-B-，Y1，Y2和X如式XIII中定義，R1如在式V中定義。在該合成方法的最后步驟中，通過(guò)根據(jù)美國(guó)專(zhuān)利4559332中描述的方法的環(huán)氧化作用，或者優(yōu)選通過(guò)上述本發(fā)明新的環(huán)氧化作用方法，將式II產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成式I。在一個(gè)特別優(yōu)選的方案中，如下進(jìn)行方法2的全部過(guò)程方法3這種情況下的合成用相應(yīng)于式XX的底物開(kāi)始其中-A-A-和R3如式VIII定義，-B-B-也如式VIII定義，除了R6和R7都不是在16，17位與D環(huán)稠合的環(huán)的一部分，并且R26是低級(jí)烷基，優(yōu)選甲基。式XX底物與Sulfoniumylide反應(yīng)產(chǎn)生相應(yīng)于式XIX的環(huán)氧化物中間體其中-A-A-，R3，-B-B-和R26如式XX中定義。在合成方法3的下一步反應(yīng)中，式XIX中間體轉(zhuǎn)化成式XVIII另一種中間體其中-A-A-，R3，-B-B-如式XX定義。在該步驟中，式XIX底物通過(guò)在溶劑中在一種堿的存在下與NaCH(COOEt)2反應(yīng)而轉(zhuǎn)化成式XVIII中間體。該式XVIII化合物暴露于熱水和一種堿性鹵化物，產(chǎn)生相應(yīng)于式XVII的脫羧化中間體其中-A-A-，R3，-B-B-如式XX定義。這種式XX化合物轉(zhuǎn)化成式XVII化合物的方法基本上相應(yīng)于美國(guó)專(zhuān)利3897417，3413288和3300489中描述的方法，這些專(zhuān)利在此引作參考。盡管底物不同，但是用于引入17-螺內(nèi)酯部分的試劑，機(jī)理和條件基本上相同。式XVII中間體與脫氫劑的反應(yīng)得到式XVI進(jìn)一步的中間體其中-A-A-，R3，-B-B-如上定義。一般有用的脫氫劑包括二氯二氰基苯并醌(DDQ)和氯醌(2，3，5，6-四氯-對(duì)-苯并醌)。另一方面，脫氫作用可以通過(guò)先后的6-碳處的鹵化作用，接著脫鹵化氫反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)。式XVI中間體接著轉(zhuǎn)化成式XV烯胺其中-A-A-，R3，-B-B-如式XX定義。基本上以上述對(duì)于式VIII的11α-羥基化合物轉(zhuǎn)化成式VII烯胺的方法通過(guò)氰化作用轉(zhuǎn)化。一般情況下，氰離子源可以是堿金屬氰化物。堿優(yōu)選是吡咯烷和/或四甲基胍?？梢允褂眉状既軇?。式XV產(chǎn)物是新的化合物，其可以通過(guò)色譜分離。這些和其它式AXV新的化合物具有作為制備式I特別是式IA化合物的中間體的實(shí)際價(jià)值。式AXV化合物相應(yīng)于下面的結(jié)構(gòu)，其中-A-A-，R3，-B-B-，R8和R9如上定義。在最為優(yōu)選的式XV化合物中，-A-A-和-B-B-是-CH2-CH2-。根據(jù)上述產(chǎn)生式VI二酮化合物的水解作用，式XV烯胺可以轉(zhuǎn)化成式XIV二酮其中-A-A-，R3，-B-B-如式XX中定義。用于合成epoxymexrenone的特別優(yōu)選的是那些式XIV化合物，其也落在式VIA范圍內(nèi)。式XIV產(chǎn)物是新的化合物，其可以通過(guò)沉淀來(lái)分離。這些和其它式AXIV新的化合物具有作為制備式I特別是式IA化合物的中間體的實(shí)際價(jià)值。式AXIV化合物相應(yīng)于下面的結(jié)構(gòu)，其中-A-A-，R3，-B-B-，R8和R9如上定義。在更為優(yōu)選的式AXIV和XIV化合物中，-A-A-和-B-B-是-CH2-CH2-?；旧鲜褂蒙鲜鰧⑹絍I二酮轉(zhuǎn)化成式V羥基酯的方法將式XIV化合物進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成式XXXI化合物。在該例子中，在進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成式XXXII產(chǎn)物之前必需分離中間體XXXI，其中-A-A-，和-B-B-如式XX中定義，優(yōu)選的式XXXI化合物是那些落在式IIA范圍內(nèi)的化合物。用上文或美國(guó)專(zhuān)利4559332中描述的方法，將式XXXI化合物轉(zhuǎn)化成式XXXII化合物。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，如下進(jìn)行方法3的全部過(guò)程方法4方法4的頭三個(gè)步驟與方法3的相同，即用相應(yīng)于式XX的化合物開(kāi)始制備式XVII中間體。此后，例如使用美國(guó)專(zhuān)利4559332的方法將式XVII中間體環(huán)氧化，產(chǎn)生式XXIV化合物其中-A-A-，R3和-B-B-如式XX中定義。但是，在本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)上述方法1中描述的將式II烯酯轉(zhuǎn)化成式I產(chǎn)物的方法，用含有酰胺型過(guò)氧化物活化劑，最優(yōu)選三氯乙酰胺的氧化作用試劑在9，11-雙鍵處將式XVII底物環(huán)氧化。用于該反應(yīng)的條件和試劑的比例基本上與對(duì)于式II烯酯轉(zhuǎn)化成epoxymexrenone描述的相同。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使用一種過(guò)酸例如間-氯過(guò)氧苯甲酸，也能以非常好的產(chǎn)率有效進(jìn)行式XVII底物的環(huán)氧化作用。但是，三氯乙酰胺試劑提供優(yōu)異的結(jié)果，減少了Bayer-Villager氧化副產(chǎn)物的生成。后者副產(chǎn)物能夠去除，但是這需要從溶劑例如乙酸乙酯中研制，接著從另一種溶劑例如二氯甲烷中結(jié)晶。通過(guò)與脫氫化(氧化)試劑例如DDQ或氯醌反應(yīng)，或者使用溴化/脫溴化氫(或其它鹵化/脫鹵化氫)程序，將式XXIV環(huán)氧化物脫氫，產(chǎn)生6-和7-碳之間的雙鍵，來(lái)產(chǎn)生另一種新的式XXIII中間體其中-A-A-和-B-B-如式XX中定義。特別優(yōu)選的式XXIII化合物是其中-A-A-和-B-B-如式XIII中定義的那些化合物。盡管直接氧化對(duì)于形成式XXIII產(chǎn)物是有效的，但是產(chǎn)率一般很低。因此優(yōu)選氧化作用分兩步進(jìn)行，首先在C-6位將式XXIV底物鹵化，然后脫鹵化氫，生成6，7-烯烴。優(yōu)選用一種N-鹵代有機(jī)試劑例如N-溴代琥珀酰胺進(jìn)行鹵化作用。在一種合適的溶劑中，例如乙腈，在鹵化促進(jìn)劑例如苯甲酰過(guò)氧化物存在下進(jìn)行溴化作用。反應(yīng)在大約50-大約100℃范圍內(nèi)的溫度下有效進(jìn)行，一般在常壓回流溫度下在一種溶劑例如四氯化碳，乙腈或其混合物中進(jìn)行。然而完成反應(yīng)一般需要4-10小時(shí)。去除反應(yīng)溶劑，殘余物溶解于水不互溶溶劑例如乙酸乙酯中。得到的溶液依次用弱堿性溶液(例如堿金屬碳酸氫鹽)和水，或者優(yōu)選用飽和鹽水洗滌，以減少產(chǎn)物損失，然后去除溶劑，，殘余物溶解于適于脫鹵化氫反應(yīng)的另一種溶劑(例如二甲基甲酰胺)中。合適的脫鹵化氫試劑，例如1，4-二氮雜雙環(huán)[2，2，2]辛烷(DABCO)與堿金屬鹵化物例如溴化鋰一起被加入到溶液中，將溶液加熱到適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)溫度，例如60-80℃，反應(yīng)持續(xù)幾小時(shí)，一般是4-15小時(shí)，以完成脫溴化氫作用?？梢愿鶕?jù)需要在反應(yīng)周期期間加入另外的脫溴化氫試劑，以使反應(yīng)完全。然后，例如通過(guò)加入水以沉淀產(chǎn)物，然后過(guò)濾分離，并且優(yōu)選用另外量的水洗滌，來(lái)回收式XXIII產(chǎn)物。產(chǎn)物優(yōu)選例如從二甲基甲酰胺中重結(jié)晶。式XXIII產(chǎn)物，例如9，11-環(huán)氧烯睪丙內(nèi)酯，是新的化合物，其可以通過(guò)萃取/結(jié)晶來(lái)分離。其具有作為制備式I特別是式IA化合物的中間體的實(shí)際價(jià)值。例如其可以用作制備式XXII的底物。在最優(yōu)選的式XXIII化合物中，-A-A-和-B-B-是-CH2-CH2-?；旧鲜褂蒙鲜鰧?duì)于制備式VII化合物的方法，使式XXIII化合物與氰化物離子反應(yīng)，來(lái)產(chǎn)生相應(yīng)于式XXII的新的環(huán)氧烯胺化合物其中-A-A-，R3和-B-B-如式XX中定義。特別優(yōu)選的式XXII化合物是其中-A-A-和-B-B-如式XIII中定義的那些化合物。式XXII產(chǎn)物是新的化合物，其可以通過(guò)沉淀和過(guò)濾來(lái)分離。其具有作為制備式I特別是式IA化合物的中間體的實(shí)際價(jià)值。在最優(yōu)選的式XXII化合物中，-A-A-和-B-B-是-CH2-CH2-?；旧鲜褂蒙鲜鰧?duì)于制備式VI化合物的方法，使式XXII環(huán)氧烯胺化合物轉(zhuǎn)化成新的式XXI環(huán)氧二酮化合物。式XXI產(chǎn)物是新的化合物，其可以通過(guò)沉淀和過(guò)濾來(lái)分離。其具有作為制備式I特別是式IA化合物的中間體的實(shí)際價(jià)值。特別優(yōu)選的式XXI化合物是其中-A-A-和-B-B-如式XIII中定義的那些化合物，在最為優(yōu)選的式XXI化合物中，-A-A-和-B-B-是-CH2-CH2-。使用上述環(huán)氧化方法或者美國(guó)專(zhuān)利4559332的方法將式XXI化合物轉(zhuǎn)化成式XXXII化合物。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，如下進(jìn)行方法方法5方法5的方法用相應(yīng)于式XXIX的底物開(kāi)始其中-A-A-，和-B-B-如式XX中定義。該底物通過(guò)與原甲酸三甲酯反應(yīng)被轉(zhuǎn)化成式XXVIII產(chǎn)物其中-A-A-，R3和-B-B-如式XX中定義。生成式XXVIII之后，用上述將式XX底物轉(zhuǎn)化成式XVII的方法將式XXIX轉(zhuǎn)化成式XXVII化合物。式XXVII化合物具有下面的結(jié)構(gòu)其中-A-A-，和-B-B-如式XX中定義，且RX是任何一般的羥基保護(hù)基團(tuán)。使用上述制備式XVI化合物的方法，氧化式XXVII化合物，得到相應(yīng)于式XXVI的新的化合物其中-A-A-，和-B-B-如式XX中定義。特別優(yōu)選的式XXIX，XXVIII，XXVII和XXVI化合物是其中-A-A-和-B-B-如式XIII中定義的那些化合物。式XXVI產(chǎn)物是新的化合物，其可以通過(guò)沉淀/過(guò)濾來(lái)分離。其具有作為制備式I特別是式IA化合物的中間體的實(shí)際價(jià)值。特別優(yōu)選的式XXVI化合物是其中-A-A-和-B-B-如式XIII中定義的那些化合物。在最為優(yōu)選的式XXVI化合物中，-A-A-和-B-B-是-CH2-CH2-。使用上面對(duì)于式VIII化合物的氰化作用定義的方法，將式XXVI新的中間體轉(zhuǎn)化成式XXV新的9-羥基烯胺中間體其中-A-A-，R3和-B-B-如式XX中定義。式XXV產(chǎn)物是新的化合物，其可以通過(guò)沉淀/過(guò)濾來(lái)分離。其具有作為制備式I特別是式IA化合物的中間體的實(shí)際價(jià)值。特別優(yōu)選的式XXV化合物是其中-A-A-和-B-B-如式XIII中定義的那些化合物。在最為優(yōu)選的式XXVI化合物中，-A-A-和-B-B-是-CH2-CH2-。基本上使用上述對(duì)于制備式VI二酮化合物描述的條件，將式XXV9-羥基烯胺中間體轉(zhuǎn)化成式XIV二酮化合物。注意在該例子中，反應(yīng)有效地同時(shí)進(jìn)行烯胺結(jié)構(gòu)的水解和9，11位的脫水，產(chǎn)生9，11雙鍵。然后使用上述方法3中描述的相同步驟，將式XIV化合物轉(zhuǎn)化成式XXXI化合物，然后生成式XIII化合物。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，如下進(jìn)行方法5的全部過(guò)程方法6方法6提供了制備epoxymexrenone和其它相應(yīng)于式I的化合物的好的方法，用11α-羥基化的雄烯二酮或其它式XXXV化合物開(kāi)始其中-A-A-，R3和-B-B-如式XIII中定義，產(chǎn)生相應(yīng)于式XXXVI的中間體其中-A-A-，R3和-B-B-如式XIII中定義。除了底物的選擇，進(jìn)行11α-羥基化的方法基本上根據(jù)上述方法1的說(shuō)明。下面的微生物適于進(jìn)行雄烯二酮或其它式XXXV化合物的11α-羥基化作用赭色曲霉(Aspergillusochraceus)NRRL405(ATCC18500)；黑色曲霉(Aspergillusniger)ATCC11394；構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)ATCC11267；米根霉(Rhizopusorvzae)ATCC11145；葡技根霉(Rhizopusstolonifer)ATCC6227b；玫瑰單端孢(Trichotheciumroseum)ATCC12519和ATCC8685.接著11α-羥基雄甾-4-烯-3，17-二酮，或其它式XXXVI化合物通過(guò)在一種酸催化劑存在下與一種醚化劑例如原甲酸三烷基酯反應(yīng)而轉(zhuǎn)化成式(101)11α-羥基-3，4-烯醇醚其中-A-A-，R3和-B-B-如式XIII中定義，R11是甲基或其它低級(jí)烷基(C1-C4)。為了進(jìn)行該轉(zhuǎn)化作用，通過(guò)與一種酸，例如苯磺酸水合物或甲苯磺酸水合物混合，來(lái)酸化11α-羥基底物，并且溶解于低級(jí)醇溶劑優(yōu)選乙醇中。在保持混合物冷卻的同時(shí)，優(yōu)選保持在大約0℃-大約15℃，在5-40分鐘期間內(nèi)，逐漸加入原甲酸三烷基酯，優(yōu)選原甲酸三乙酯。然后將混合物升溫，反應(yīng)在大約20℃-大約60℃之間的溫度下進(jìn)行。優(yōu)選反應(yīng)在30℃-50℃進(jìn)行1-3小時(shí)后加熱到回流反應(yīng)一段時(shí)間，一般是2-6小時(shí)，來(lái)完成反應(yīng)。將反應(yīng)混合物冷卻，優(yōu)選冷卻到0℃-15℃，優(yōu)選冷卻到大約5℃，并且真空去除溶劑。使用上述方法3中式XX化合物轉(zhuǎn)化成式XVII化合物的相同反應(yīng)方法，向式101化合物引入式XXXIII17-螺內(nèi)酯部分。例如，式101底物可以在合適的溶劑例如DMSO中在一種堿例如堿金屬氫氧化物存在下與一種Sulfoniumylide反應(yīng)，產(chǎn)生相應(yīng)于式102的中間體其中-A-A-，R3，R11和-B-B-如式101中定義。然后式102中間體在一種堿金屬烷氧化物存在下與一種丙二酸二酯反應(yīng)，形成5元螺內(nèi)酯環(huán)，并且產(chǎn)生式103中間體其中-A-A-，R3，R11，R12和-B-B-如式XIII中定義。最后在一種堿金屬鹵化物存在下將合適的溶劑例如二甲基甲酰胺中的式103化合物加熱，去除烷氧羰基部分，產(chǎn)生式104中間體其中-A-A-，R3，R11和-B-B-如式XIII中定義。接著3，4-烯醇醚化合物104被轉(zhuǎn)化成式XXIII化合物，即其中R8和R9一起形成式XXXIII部分的式VIII化合物。該氧化步驟基本上以方法4合成中式XXIV化合物轉(zhuǎn)化成式XXIII中間體的氧化步驟相同的方法進(jìn)行。直接氧化可以使用一種試劑例如2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯并醌(DDQ)或四氯苯并醌(氯醌)進(jìn)行，或者優(yōu)選進(jìn)行兩個(gè)階段的氧化作用，首先溴化，例如用N-鹵代溴化劑例如N-溴代琥珀酰胺或1，3-二溴-5，5-二甲基乙內(nèi)酰脲(DBDMH)，然后用一種堿，例如用DABCO，在溴化鋰存在下并且加熱，進(jìn)行脫溴化氫。使用NBS進(jìn)行溴化的情況下也必須使用酸，以便將3-烯醇醚轉(zhuǎn)化成烯酮。對(duì)于溴化和烯醇醚向烯酮的轉(zhuǎn)化，一種離子型的、而不是游離基溴化劑的DBDMH自身是有效的。然后通過(guò)方法1中描述的步驟將式VIII化合物轉(zhuǎn)化成epoxymexrenone或其它式I化合物。各式101，102，103和104中間體是新的化合物，具有作為epoxymexrenone或其它式IA和I化合物的中間體的實(shí)際價(jià)值。在各式101，102，103和104化合物中-A-A-和-B-B-優(yōu)選是-CH2-CH2-，R3是氫，低級(jí)烷基或低級(jí)烷氧基。更優(yōu)選的是，式101化合物是3-乙氧基-11α-羥基雄甾-3，5-二烯-17-酮，式102化合物是3-乙氧基螺[雄甾-3，5-二烯-17β，2’-環(huán)氧]-11α-醇，式103化合物是3-乙氧基-11α-17α-二羥基孕甾-3，5-二烯-21，21-二羧酸氫乙酯，γ-內(nèi)酯，式104化合物是3-乙氧基-11α-17α-二羥基孕甾-3，5-二烯-21-羧酸，γ-內(nèi)酯。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，如下進(jìn)行方法6的全部過(guò)程方法7方法7提供了制備epoxymexrenone和其它式I化合物的方法，用包括β-谷甾醇，膽甾醇，豆甾醇或其它式XXXVII化合物的起始底物其中-A-A-，R3和-B-B-如式XIII中定義，D-D是-CH2-CH2-或-CH＝CH-，并且各R13，R14，R15和R16獨(dú)立地選自氫或C1-C4烷基。在合成的第一個(gè)步驟中，通過(guò)式XXXVII化合物的生物轉(zhuǎn)化來(lái)制備11α-羥基雄甾烯二酮或其它式XXXV化合物。生物轉(zhuǎn)化過(guò)程基本上根據(jù)上述對(duì)于烯睪丙內(nèi)酯(或者其它式XIII底物)的11α-羥基化作用描述的方法進(jìn)行。在制備11α-羥基雄甾烯二酮中，最初通過(guò)式XXXVII化合物的生物轉(zhuǎn)化來(lái)制備4-雄甾烯-3，17-二酮。最初的生物轉(zhuǎn)化可以用美國(guó)專(zhuān)利3759791中描述的方法進(jìn)行，該專(zhuān)利引作參考。然后，基本上根據(jù)上文對(duì)于烯睪丙內(nèi)酯(或者其它式XIII底物)的11α-羥基化作用描述的方法將4-雄甾烯-3，17-二酮轉(zhuǎn)化成11α-羥基雄甾烯二酮。方法7合成的其它部分與方法6相同。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，如下進(jìn)行方法7的全部過(guò)程在下面的實(shí)施例中進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明方法，步驟和組分，以及這里所使用的條件和試劑。實(shí)施例1用表1列出的生長(zhǎng)培養(yǎng)基制備斜面培養(yǎng)物(Slants)為了制備第一代培養(yǎng)基，將赭色曲霉懸浮于試管中的蒸餾水中(2ml)；將這種懸浮液0.15ml等份加到如上述已經(jīng)制備的斜面上。這些斜面在25℃溫育7天，其后表面培養(yǎng)物的外觀(guān)是白色棉毛狀菌絲體。反向下部染成橙色，下部染成橘黃色。第一代斜面培養(yǎng)物懸浮于含有吐溫80非離子表面活性劑(3％重量)的滅菌溶液中(4ml)，該懸浮液的0.15ml等份用來(lái)接種第二代斜面，第二代斜面用表2列出的生長(zhǎng)培養(yǎng)基制備第二代斜面培養(yǎng)物在25℃保溫10天，產(chǎn)生大量金黃色孢子；反向染成棕橙色。制備具有表3列出組成的保護(hù)培養(yǎng)基。來(lái)自5個(gè)第二代斜面培養(yǎng)的培養(yǎng)物懸浮于100ml燒瓶中的保護(hù)溶液(15ml)中該懸浮液分布在100×10mm試管中的等份中(每份0.5ml)，用于凍干。這些在-70℃至-80℃在丙酮/干冰浴中預(yù)冷凍20分鐘，然后立即轉(zhuǎn)移到預(yù)先冷卻到-40℃至-50℃的干燥的室內(nèi)。這些預(yù)冷凍等份在50μHg余壓和≤-30℃時(shí)凍干。凍干后向每個(gè)帶有溫度計(jì)的試管加入2-3粒滅菌硅膠，并火焰密封。為了獲得適于工業(yè)規(guī)模發(fā)酵的母代斜面培養(yǎng)物，將己經(jīng)在上述方法中制備的單一等份的凍干培養(yǎng)物懸浮于蒸餾水(1ml)中，并用0.15ml等份接種提供有表2列出的組成的生長(zhǎng)培養(yǎng)基的斜面。母代斜面在25℃保溫7天，保溫后，在斜面上生長(zhǎng)的培養(yǎng)物在4℃下貯存。為了制備常規(guī)培養(yǎng)物，將來(lái)自母代斜面的培養(yǎng)物懸浮于含有吐溫80(3％重量)的滅菌溶液中，得到的懸浮液的0.15ml等份分布在包被有表2描述的生長(zhǎng)培養(yǎng)基的斜面上。常規(guī)斜面培養(yǎng)物可以用來(lái)接種用于實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵的第一代菌種瓶。為了制備第一代接種瓶，將根據(jù)上述制備的來(lái)自常規(guī)斜面的培養(yǎng)物移出并懸浮于含有吐溫80(3％重量)的溶液(10ml)中。將0.1等份得到的懸浮液加入到含有表4列出組成的生長(zhǎng)培養(yǎng)基的500ml帶有隔板的燒瓶中。菌種瓶在旋轉(zhuǎn)振蕩器(200rpm，5cm移動(dòng)度)中在28℃保溫24小時(shí)，結(jié)果得到具有直徑3-4mm類(lèi)小丸狀的菌絲體。顯微鏡觀(guān)察下，發(fā)現(xiàn)菌種培養(yǎng)物是純的培養(yǎng)物，聯(lián)絲生長(zhǎng)，有大的菌絲，并且很好地扭曲。懸浮液的pH是5.4-5.6。根據(jù)通過(guò)離心(3000rpm×5分鐘)測(cè)定，PMV是5-8％。通過(guò)用來(lái)自菌種培養(yǎng)瓶的生物質(zhì)(1ml)的第二代500ml振蕩瓶中接種具有表4列出組成的生長(zhǎng)培養(yǎng)基(100ml)來(lái)制備轉(zhuǎn)化瓶培養(yǎng)物。得到的混合物在旋轉(zhuǎn)振蕩器(200rpm，5cm移動(dòng)度)中在28℃保溫18小時(shí)。檢查培養(yǎng)物，發(fā)現(xiàn)含有直徑3-4mm類(lèi)小丸狀的菌絲體。顯微鏡檢查下，測(cè)定出培養(yǎng)物是純的培養(yǎng)物，聯(lián)絲絲狀生長(zhǎng)，其中頂端細(xì)胞滿(mǎn)是細(xì)胞質(zhì)，并且老化的細(xì)胞幾乎沒(méi)有液泡化。培養(yǎng)物懸浮液的pH是5-5.2。通過(guò)離心測(cè)定PMV是10-15％之間。因此認(rèn)為該培養(yǎng)物適于烯睪丙內(nèi)酯向11α-羥基烯睪丙內(nèi)酯的轉(zhuǎn)化。將烯睪丙內(nèi)酯(1g)微?；纱蠹s5μ并懸浮于滅菌水中(20ml)。向該反應(yīng)液加入40％(w/v)滅菌葡萄糖溶液；16％(w/v)自溶酵母滅菌溶液；和滅菌抗生素溶液；所有比例在表5中0反應(yīng)時(shí)間一行里給出。將硫酸卡那霉素(40mg)，四環(huán)素鹽酸鹽(40mg)和頭孢氨芐(200mg)溶解于水(100ml)來(lái)制備抗生素溶液。逐漸向振蕩瓶中的培養(yǎng)物加入甾類(lèi)化合物懸浮液，葡萄糖溶液，和自溶酵母溶液隨著反應(yīng)的進(jìn)行，定期分析反應(yīng)混合物以測(cè)定葡萄糖含量。用薄層色譜測(cè)定向11α-羥基烯睪丙內(nèi)酯的轉(zhuǎn)化作用。以控制保持葡萄糖含量在大約0.1％重量范圍內(nèi)的速度在反應(yīng)期間向發(fā)酵反應(yīng)混合物中加入另外的烯睪丙內(nèi)酯底物和培養(yǎng)物。甾類(lèi)懸浮液，葡萄糖溶液，自溶酵母溶液和抗生素溶液的添加方案在表5中列出。轉(zhuǎn)化反應(yīng)在旋轉(zhuǎn)振蕩器(200rpm，5cm移動(dòng)度)上在25℃持續(xù)96小時(shí)。發(fā)酵期間pH范圍在4.5和6之間。無(wú)論什么時(shí)候PMV升至或高于60％時(shí)，從中取出10ml肉湯培養(yǎng)物并代之以10ml蒸餾水。在發(fā)酵周期開(kāi)始以后在反應(yīng)期間在4，7，23，31，47，55，71，80，和96小時(shí)時(shí)間間隔處通過(guò)從肉湯中取樣并且用TLC分析，來(lái)監(jiān)測(cè)烯睪丙內(nèi)酯的消失和11α-羥基烯睪丙內(nèi)酯的出現(xiàn)。根據(jù)對(duì)這些樣品測(cè)定，該反應(yīng)進(jìn)程在表6中列出。實(shí)施例2根據(jù)實(shí)施例1描述的方法制備第一代菌種瓶培養(yǎng)物。制備具有表7列出的組成的培養(yǎng)混合物。向10L幾何體積的轉(zhuǎn)化發(fā)酵罐中最初加入這樣的營(yíng)養(yǎng)化合物(4L)。發(fā)酵罐為圓筒型，高度與直徑比是2.58。每個(gè)發(fā)酵罐帶有一個(gè)400rpm汽輪式攪拌器，其帶有兩個(gè)2號(hào)圓輪，6個(gè)葉片。葉輪的外徑是80mm，每個(gè)葉片的半徑大小是25mm，高30mm，上輪位于容器頂部以下280mm處，下輪位于頂部以下365mm處，容器的擋板高210mm，并且從容器內(nèi)垂直壁半徑向內(nèi)延伸25mm。菌種培養(yǎng)物(40ml)與發(fā)酵罐中的營(yíng)養(yǎng)物混合，并且通過(guò)在28℃，通氣速度是0.5l/分鐘，壓力是0.5kg/cm2下培養(yǎng)22小時(shí)，得到轉(zhuǎn)化培養(yǎng)物。在22小時(shí)時(shí)，培養(yǎng)物的PMV是20-25％，并且pH是5-5.2。制備含有烯睪丙內(nèi)酯(80g)的滅菌水(400ml)懸浮液，向轉(zhuǎn)化發(fā)酵罐中的混合物加入10ml。同時(shí)以表8中0小時(shí)反應(yīng)時(shí)間處給出的比例加入40％(w/v)滅菌葡萄糖溶液；16％(w/v)自溶酵母滅菌溶液；和滅菌抗生素溶液?？股厝芤河脤?shí)施例1描述的方法制備。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，定期對(duì)反應(yīng)混合物進(jìn)行分析來(lái)測(cè)定葡萄糖含量，并且通過(guò)薄層色譜測(cè)定向11α-烯睪丙內(nèi)酯的轉(zhuǎn)化作用。以根據(jù)下文所述的對(duì)反應(yīng)肉湯樣品的TLC分析為基礎(chǔ)，因?yàn)橄┎G丙內(nèi)酯底物被消耗，所以向反應(yīng)混合物加入另外的烯睪丙內(nèi)酯。也監(jiān)測(cè)葡萄糖水平，而且不管什么時(shí)候葡萄糖濃度降到大約0.05％重量或更低，要加入補(bǔ)充的葡萄糖溶液，將濃度提高到大約0.25％重量。在反應(yīng)周期期間在不連續(xù)的時(shí)間也加入營(yíng)養(yǎng)和抗生素。甾類(lèi)懸浮液，葡萄糖溶液，自溶酵母溶液和抗生素溶液的添加方案在表8中列出。轉(zhuǎn)化反應(yīng)以每分鐘每體積液體0.5體積，正壓頭是0.3kg/cm2的通空氣速度持續(xù)90分鐘。溫度保持在28℃，直到PVM達(dá)到45％，然后降到26℃，并且保持在該溫度，PMV從45％升至60％，之后控制在24℃。初始攪拌速度是400rpm，40小時(shí)后升至700rpm。根據(jù)指出的，通過(guò)加入2M正磷酸或2M氫氧化鈉，將pH保持在4.7和5.3之間。隨著泡沫的產(chǎn)生，通過(guò)加入幾滴消泡劑SAG471來(lái)控制發(fā)泡。反應(yīng)期間以4小時(shí)的間隔通過(guò)對(duì)肉湯樣品的TLC分析來(lái)監(jiān)測(cè)烯睪丙內(nèi)酯的消失和11α-羥基烯睪丙內(nèi)酯的出現(xiàn)。當(dāng)大部分烯睪丙內(nèi)酯從肉湯中消失時(shí)加入另外的增量數(shù)。加入所有的烯睪丙內(nèi)酯之后，當(dāng)TLC分析顯示烯睪丙內(nèi)酯底物相對(duì)于11α-羥基烯睪丙內(nèi)酯產(chǎn)物的濃度降低到大約5％時(shí)中止反應(yīng)。反應(yīng)周期結(jié)束時(shí)，發(fā)酵肉湯通過(guò)干酪衣過(guò)濾，以從液體肉湯中分離菌絲體。將菌絲體級(jí)分重新懸浮于乙酸乙酯中，每克反應(yīng)過(guò)程中加入的烯睪丙內(nèi)酯用大約65體積(5.2升)。菌絲體的乙酸乙酯懸浮液在攪拌下回流1小時(shí)，冷卻到大約20℃，在Buchner上過(guò)濾。依次用乙酸乙酯(每克烯睪丙內(nèi)酯加量5體積；0.4L)和去離子水(500ml)洗滌菌絲體濾餅，從濾餅上去除乙酸乙酯提取液。棄除濾餅。將富集的提取液，洗滌液和水洗液收集在分離器中，然后靜置2小時(shí)以相分離。然后棄除含水相，并且將有機(jī)相真空濃縮，使殘留體積達(dá)350ml。將靜止的底部冷卻到15℃，并在攪拌下保持大約1小時(shí)。過(guò)濾得到的懸浮液，取出結(jié)晶產(chǎn)物，并用乙酸乙酯(40ml)洗滌過(guò)濾濾餅。干燥后測(cè)定11α-羥基烯睪丙內(nèi)酯產(chǎn)量是60g。實(shí)施例3用實(shí)施例1描述的方法由常規(guī)斜面制備孢子懸浮液。在2000ml有隔板的圓底燒瓶中(3個(gè)隔板，每個(gè)隔板50mm×30mm)，向具有表4組成的營(yíng)養(yǎng)溶液(500ml)中加入1等份(0.5ml)孢子懸浮液。得到的混合物在燒瓶中在交替振蕩器上(每分鐘振蕩120次；5cm移動(dòng)度)在25℃溫育24小時(shí)，得到培養(yǎng)物，在顯微鏡下觀(guān)察，發(fā)現(xiàn)是純的培養(yǎng)物，菌絲很好地扭曲。培養(yǎng)物的pH在大約5.3和5.5之間，PMV(根據(jù)通過(guò)在3000rpm離心5分鐘測(cè)定)是8-10％。使用這樣制備的培養(yǎng)物，在垂直圓筒狀不銹鋼發(fā)酵罐中制備菌種培養(yǎng)物，發(fā)酵罐幾何體積是160L，縱橫尺寸比是2.31(高＝985mm；直徑＝425mm)。每個(gè)發(fā)酵罐帶有一個(gè)汽輪式攪拌器，其帶有兩個(gè)圓輪，每個(gè)圓輪有6個(gè)葉片，葉輪的外徑是240mm，每個(gè)葉片的半徑大小是80mm，高50mm，上輪位于發(fā)酵罐頂部以下780mm處，第二個(gè)輪位于995mm深度處，垂直的擋板高890mm，并且從發(fā)酵罐內(nèi)垂直壁半徑向內(nèi)延伸40mm。攪拌在170rpm下操作。向發(fā)酵罐加入表9列出組成的營(yíng)養(yǎng)混合物(100L)，接著加入一部分如上制備的pH為5.7的原種菌(1L)。接種的混合物在通氣速度是0.5L/L-min，壓頭是0.5kg/cm2下培養(yǎng)22小時(shí)。溫度控制在28℃，直到PMV達(dá)到25％，然后降到25℃。pH控制在5.1-5.3之間。菌絲體體積的生長(zhǎng)見(jiàn)表10，還有pH和菌種培養(yǎng)反應(yīng)的溶解的氧氣的曲線(xiàn)。使用這樣制備的菌種培養(yǎng)物，在圓筒狀不銹鋼發(fā)酵罐中進(jìn)行轉(zhuǎn)化發(fā)酵，發(fā)酵罐直徑是1.02m，高1.5m，幾何體積是1.4m3。每個(gè)發(fā)酵罐帶有一個(gè)汽輪式攪拌器，其帶有兩個(gè)葉輪，一個(gè)輪位于發(fā)酵罐頂部以下867cm處，另一個(gè)輪位于頂部以下1435cm處，每個(gè)圓輪有6個(gè)葉片，葉片半徑95cm，高75cm，垂直的擋板高1440cm，并且從發(fā)酵罐內(nèi)垂直壁半徑向內(nèi)延伸100cm。制備具有表11列出組成的營(yíng)養(yǎng)混合物向發(fā)酵罐中加入初始量(170L)的該營(yíng)養(yǎng)混合物(pH＝5.7)，接著加入如上制備的該實(shí)施例的菌種接種物(7L)。含有接種物的營(yíng)養(yǎng)混合物在通氣速度是0.5L/L-min，壓頭0.5kg/cm2下培養(yǎng)24小時(shí)，溫度保持在28℃，攪拌速度是110rpm。表12中給出了菌絲體體積的生長(zhǎng)，還有pH和菌種培養(yǎng)反應(yīng)的溶解的氧氣的曲線(xiàn)。<>培養(yǎng)結(jié)束后，發(fā)現(xiàn)菌絲體呈小丸狀，但是這些小丸一般較小并且相對(duì)疏松地聚集。分散的菌絲體懸浮于肉湯中。最終pH是5.1-5.3。向這樣制備的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)物中加入烯睪丙內(nèi)酯(1.250kg；顆粒化為5μ)的滅菌水(5L)的懸浮液。以表14中0反應(yīng)時(shí)間指出的比例加入滅菌的添加物溶液和抗生素溶液。附加溶液的組成在表13中列出。<在通氣速度是0.5L/L-min，壓頭0.5kg/cm2下將生物轉(zhuǎn)化進(jìn)行大約96小時(shí)，如果需要，通過(guò)加入7.5M氫氧化鈉或4M磷酸調(diào)節(jié)pH范圍是4.7-5.3。攪拌速度最初是100rpm，在40小時(shí)時(shí)提高到165rpm，在64小時(shí)時(shí)是250rpm。初始溫度是28℃，當(dāng)PMV達(dá)到45％時(shí)降到26℃，PMV升至60％時(shí)降到24℃。根據(jù)需要加入細(xì)滴中的SAG471來(lái)控制發(fā)泡。以4小時(shí)間隔監(jiān)測(cè)發(fā)酵中葡萄糖水平，不管什么時(shí)候葡萄糖濃度降至1gpl以下時(shí)向體系中加入增量的滅菌添加物溶液(10L)。反應(yīng)期間用HPLC監(jiān)測(cè)烯睪丙內(nèi)酯的消失和11α-羥基烯睪丙內(nèi)酯的出現(xiàn)。當(dāng)至少最初烯睪丙內(nèi)酯加入量的90％轉(zhuǎn)化成11α-羥基烯睪丙內(nèi)酯時(shí)，加入1.250kg增量的烯睪丙內(nèi)酯。當(dāng)增量中90％烯睪丙內(nèi)酯已經(jīng)轉(zhuǎn)化時(shí)，加入另一份1.250kg增量。使用相同的標(biāo)準(zhǔn)加入進(jìn)一步的增量(一份1.250kg)，直到加入反應(yīng)器的總量(20kg)。向反應(yīng)器加入全部的烯睪丙內(nèi)酯量后，當(dāng)未反應(yīng)的烯睪丙內(nèi)酯相對(duì)于產(chǎn)生的11α-羥基烯睪丙內(nèi)酯的量的濃度是5％時(shí)中止反應(yīng)。表14中給出了加入烯睪丙內(nèi)酯，滅菌附加溶液，和抗生素溶液的方案。當(dāng)生物轉(zhuǎn)化完全時(shí)，通過(guò)在籃狀離心機(jī)中離心從肉湯中分離菌絲體。對(duì)濾液進(jìn)行HPLC測(cè)定，只含有肉湯中11α-羥基烯睪丙內(nèi)酯總量的2％，因此省去濾液。將菌絲體懸浮于2m3容積提取罐中的乙酸乙酯中(1000L)。攪拌和乙酸乙酯回流條件下將懸浮液加熱1小時(shí)后冷卻，并在籃狀離心機(jī)中離心。菌絲體濾餅用乙酸乙酯(200L)洗滌后出料。使富集甾類(lèi)的溶劑提取液靜置1小時(shí)以分離水相。水相用又一些量的乙酸乙酯(200L)萃取后棄除。離心澄清合并的溶劑相并置于濃縮器中(500L幾何體積)，并真空濃縮，得到100L殘余體積。在進(jìn)行蒸發(fā)時(shí)，加入到濃縮器中的合并的提取液和洗液溶液的初始量是100L，隨著溶劑的去除，通過(guò)連續(xù)或周期性加入合并的溶液來(lái)保持該體積不變。蒸發(fā)步驟完全后，蒸發(fā)器的底部冷卻到20℃，并且攪拌2小時(shí)，之后在Buchner過(guò)濾器上過(guò)濾。濃縮器釜用乙酸乙酯(20L)洗滌，然后用該洗滌溶液來(lái)洗滌過(guò)濾器上的濾餅。產(chǎn)物在50℃真空下干燥16小時(shí)，11α-羥基烯睪丙內(nèi)酯產(chǎn)量14千克。實(shí)施例4赭色曲霉NRRL405的凍干的孢子懸浮于具有表15給出組成的玉米漿生長(zhǎng)培養(yǎng)基(2ml)中在用于瓊脂平板上孢子繁殖的接種物中使用得到的懸浮液。制備10個(gè)瓊脂平板，每個(gè)平板含有表16給出組成的固體葡萄糖/酵母抽提物/磷酸鹽/瓊脂生長(zhǎng)培養(yǎng)基0.2ml等份懸浮液轉(zhuǎn)移到每個(gè)平板的表面。平板在25℃溫育10天，然后將孢子從所有的平板收集到具有表17給出組成的滅菌冷保護(hù)培養(yǎng)基中得到的懸浮液分裝在20個(gè)小瓶中，每個(gè)小瓶轉(zhuǎn)移1ml。這些小瓶構(gòu)成主細(xì)胞庫(kù)，其可以用來(lái)產(chǎn)生在用于烯睪丙內(nèi)酯向11α-羥基烯睪丙內(nèi)酯生物轉(zhuǎn)化的接種物的傳代中使用的工作細(xì)胞庫(kù)。在-130℃在液氮冷凍器的氣相中貯存含有主細(xì)胞庫(kù)的小瓶。為了開(kāi)始制備工作細(xì)胞庫(kù)，將來(lái)自單個(gè)主細(xì)胞庫(kù)小瓶的孢子再懸浮于具有表15列出組成的滅菌生長(zhǎng)培養(yǎng)基(1ml)中。懸浮液分作10個(gè)0.2ml等份，每一等份用來(lái)接種具有表16列出組成的固體生長(zhǎng)培養(yǎng)基的瓊脂平板。這些平板在25℃溫育10天。在溫育的第3天，生長(zhǎng)培養(yǎng)基的下部變?yōu)樽?橙色。溫育后，大量產(chǎn)生金黃色孢子。通過(guò)上述用來(lái)制備主細(xì)胞庫(kù)的方法收集各平板的孢子?？偣仓苽淞?00個(gè)小瓶，每個(gè)小瓶含有1ml懸浮液。這些小瓶構(gòu)成工作細(xì)胞庫(kù)。小瓶也在-130℃在液氮冷凍器的氣相中貯存。向250mlErlenmeyer燒瓶中加入具有表15列出組成的生長(zhǎng)培養(yǎng)基(50ml)。向燒瓶中加入一等份(0.5ml)工作細(xì)胞懸浮液，并與生長(zhǎng)培養(yǎng)基混合。接種的混合物在25℃保溫24小時(shí)，產(chǎn)生合并的菌絲體體積百分?jǐn)?shù)大約是45％的第一代菌種培養(yǎng)物。目測(cè)培養(yǎng)物，發(fā)現(xiàn)含有直徑1-2mm的類(lèi)小丸狀菌絲體；顯微鏡觀(guān)察發(fā)現(xiàn)其是純的培養(yǎng)物。通過(guò)向2.8LFernbach燒瓶中加入具有表15列出組成的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，然后用一部分(10ml)該實(shí)施例第一代菌種培養(yǎng)物接種該培養(yǎng)基，開(kāi)始第二代菌種培養(yǎng)物的培養(yǎng)，第一代菌種培養(yǎng)物的繁殖如上所述。接種的混合物在旋轉(zhuǎn)振蕩器上(200rpm，5cm移動(dòng)度)在25℃保溫24小時(shí)。保溫后，該培養(yǎng)物具有如上對(duì)于第一代菌種培養(yǎng)物描述的相同的性質(zhì)，并且適用于其中烯睪丙內(nèi)酯生物轉(zhuǎn)化成11α-烯睪丙內(nèi)酯的轉(zhuǎn)化發(fā)酵。在BraunEBiostat發(fā)酵罐中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，發(fā)酵罐指標(biāo)如下容積15L，圓底高度53cm直徑20cmH/D2.65葉輪直徑7.46cm，6個(gè)葉片每個(gè)2.2×1.4cm葉輪間距自罐底部65.5，14.5和25.5cm擋板4個(gè)，1.9×48cm分布器直徑10.1cm，21個(gè)孔-1mm直徑溫度控制通過(guò)外部容器套方法提供將烯睪丙內(nèi)酯以20g/L的濃度懸浮于去離子水(4L)中，并且在發(fā)酵罐中的混合物在300rpm下攪拌時(shí)加入一部分(2L)具有表18列出組成的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。得到的懸浮液攪拌15分鐘，之后用附加的去離子水將體積增加到7.5L。在這時(shí)，懸浮液的pH通過(guò)加入20％重量氫氧化鈉溶液而調(diào)至5.2-6.5，然后將懸浮液在BraunE發(fā)酵罐中通過(guò)在121℃加熱30分鐘來(lái)滅菌。滅菌后的pH是6.3±0.2，終體積是7.0L。用一部分(0.5L)上述制備的該實(shí)施例的第二代菌種培養(yǎng)物接種滅菌的懸浮液，通過(guò)加入50％滅菌葡萄糖溶液將體積增加到8.0L。使發(fā)酵在28℃的溫度下進(jìn)行，直到PMV達(dá)到50％，然后降溫到26℃，當(dāng)PMV超過(guò)50％時(shí)，為了保持恒定的PMV低于大約60％，進(jìn)一步降溫到24℃?？諝馔ㄟ^(guò)分布器按以初始液體體積為基礎(chǔ)0.5vvm的速度通入，發(fā)酵罐中的壓力保持在700毫巴規(guī)量。攪拌開(kāi)始是600rpm，根據(jù)要保持溶解的氧氣的濃度高于30％體積的需要，逐步增加到1000rpm。監(jiān)測(cè)葡萄糖濃度。因?yàn)榘l(fā)酵反應(yīng)消耗葡萄糖，在初始的高葡萄糖濃度降至低于1％時(shí)，用50％重量滅菌葡萄糖溶液提供補(bǔ)充的葡萄糖，來(lái)保持一批生產(chǎn)周期剩余時(shí)間內(nèi)具有0.05％-1％范圍內(nèi)的濃度。接種前pH是6.3±0.2。在最初發(fā)酵周期期間pH降至大約5.3后，通過(guò)加入氫氧化銨來(lái)保持周期的剩余時(shí)間內(nèi)的pH在5.5±0.2范圍內(nèi)。通過(guò)加入聚乙二醇消泡劑控制發(fā)泡，該消泡劑由OSISpecialties，Inc以商品名SAG471出售。培養(yǎng)物的生長(zhǎng)主要發(fā)生在周期的頭24小時(shí)，此時(shí)PMV是大約40％，pH是大約5.6，并且溶解的氧氣的量是大約50％體積。隨著培養(yǎng)物的生長(zhǎng)開(kāi)始烯睪丙內(nèi)酯的轉(zhuǎn)化。在生物轉(zhuǎn)化期間通過(guò)每天進(jìn)行分析監(jiān)測(cè)烯睪丙內(nèi)酯和11α-羥基烯睪丙內(nèi)酯的濃度。用熱的乙酸乙酯萃取樣品，并且用TLC和HPLC分析得到的樣品溶液。當(dāng)殘留的烯睪丙內(nèi)酯濃度大約是初始濃度的10％時(shí)，認(rèn)為生物轉(zhuǎn)化完全。大約的轉(zhuǎn)化時(shí)間是110-130小時(shí)。當(dāng)生物轉(zhuǎn)化完全時(shí)，通過(guò)離心從肉湯中分離菌絲體生物質(zhì)。用等體積乙酸乙酯萃取上清液，棄除水相。將菌絲體級(jí)分重新懸浮于乙酸乙酯，每克加入到發(fā)酵反應(yīng)器中的烯睪丙內(nèi)酯大約使用65體積。攪拌下菌絲體懸浮液回流1小時(shí)，冷卻到大約20℃，在Buchher漏斗中過(guò)濾。菌絲體濾餅用5體積的乙酸乙酯洗滌兩次然后用去離子水(1L)洗滌，取代殘留的乙酸乙酯。合并含水的萃取液，富集的溶劑，溶劑洗液和水洗液。根據(jù)對(duì)殘留的甾類(lèi)化合物的分析決定殘留的沒(méi)用的菌絲體濾餅是棄除或者再萃取。使合并的液相放置2小時(shí)。然后，分離水相并棄除，真空下濃縮有機(jī)相，直到殘留體積是大約500ml。然后將靜止的瓶冷卻到大約15℃，緩慢攪拌大約1小時(shí)。通過(guò)蒸發(fā)從結(jié)晶中棄除溶劑，結(jié)晶產(chǎn)物在50℃真空下干燥。實(shí)施例5赭色曲霉ATCC18500的凍干的孢子懸浮于實(shí)施例4描述的玉米漿生長(zhǎng)培養(yǎng)基(2ml)中。制備10個(gè)瓊脂平板，也是實(shí)施例4的方法。根據(jù)實(shí)施例4的描述培養(yǎng)并收集平板，含有主細(xì)胞庫(kù)的小瓶在-130℃在液氮冷凍器的氣相中貯存。由一個(gè)主細(xì)胞庫(kù)的小瓶制備工作細(xì)胞庫(kù)，根據(jù)實(shí)施例4的描述制備工作細(xì)胞庫(kù)。在-130℃在液氮冷凍器中貯存。向一個(gè)有擋板的2L燒瓶中加入具有表19列出組成的生長(zhǎng)培養(yǎng)基(300ml)。向燒瓶中加入一等份(3ml)工作細(xì)胞懸浮液。接種的混合物在28℃在旋轉(zhuǎn)振蕩器上(200rpm，5cm移動(dòng)度)保溫20-24小時(shí)，產(chǎn)生合并的菌絲體體積百分?jǐn)?shù)大約是45％的第一代菌種培養(yǎng)物。目測(cè)培養(yǎng)物，發(fā)現(xiàn)含有直徑1-2mm的類(lèi)小丸狀菌絲體；顯微鏡觀(guān)察發(fā)現(xiàn)其是純的培養(yǎng)物。通過(guò)向14L玻璃發(fā)酵罐中加入具有表19列出組成的8L生長(zhǎng)培養(yǎng)基開(kāi)始第二代菌種培養(yǎng)物的培養(yǎng)，用160-200ml該實(shí)施例的第一代菌種培養(yǎng)物接種發(fā)酵罐，第一代菌種培養(yǎng)物的制備如上所述。接種的混合物在28℃培養(yǎng)18-20小時(shí)，200rpm攪拌，通氣速度是0.5vvm。繁殖后，該培養(yǎng)物具有如上對(duì)于第一代菌種培養(yǎng)物描述的相同的性質(zhì)?；旧细鶕?jù)實(shí)施例4說(shuō)明的方法在一個(gè)60L發(fā)酵罐中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，除了生長(zhǎng)培養(yǎng)基具有表20列出組成，并且第二代菌種培養(yǎng)物的初始量是350ml至700ml。攪拌速度開(kāi)始是200rpm，根據(jù)要保持溶解的氧氣高于10％體積的需要增加到500rpm。對(duì)于20g/L烯睪丙內(nèi)酯，大約的生物轉(zhuǎn)化時(shí)間是80-160小時(shí)。實(shí)施例6使用根據(jù)實(shí)施例4描述的方法產(chǎn)生的工作細(xì)胞庫(kù)的孢子懸浮液，還是基本上用實(shí)施例4描述的方法制備第一代和第二代菌種培養(yǎng)物。使用該方法產(chǎn)生的第二代菌種培養(yǎng)物，根據(jù)圖1詳述的改進(jìn)的方法類(lèi)型進(jìn)行兩個(gè)生物轉(zhuǎn)化，并且根據(jù)圖2詳述的改進(jìn)的方法類(lèi)型進(jìn)行兩個(gè)生物轉(zhuǎn)化。表21給出了進(jìn)行這些轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)培養(yǎng)基，烯睪丙內(nèi)酯加入方案，收集時(shí)間，和轉(zhuǎn)化程度。進(jìn)行R2A使用了以實(shí)施例3的相同原理為基礎(chǔ)的烯睪丙內(nèi)酯加入方案，同時(shí)，進(jìn)行R2C通過(guò)只加入兩次烯睪丙內(nèi)酯，一次在一個(gè)批量開(kāi)始時(shí)，一次在24小時(shí)之后，來(lái)改變實(shí)施例3的方案。進(jìn)行R2B和R2D時(shí)，在一次生產(chǎn)批量開(kāi)始時(shí)加入全部的烯睪丙內(nèi)酯的量，該過(guò)程一般以實(shí)施例4描述的方法進(jìn)行，除了在加入到發(fā)酵罐之前，烯睪丙內(nèi)酯進(jìn)料在分開(kāi)的容器中滅菌，并且隨著一次生產(chǎn)批量的進(jìn)行加入葡萄糖。使用韋林氏摻合器來(lái)減少滅菌中產(chǎn)生的塊。進(jìn)行R2A和R2B時(shí)，向批量的甲醇溶液中加入烯睪丙內(nèi)酯，其中預(yù)期這些操作分別進(jìn)一步不同于實(shí)施例3和實(shí)施例4的操作。在進(jìn)行R2A和R2B時(shí)，發(fā)酵液中甲醇濃度積累到大約6.0％，發(fā)現(xiàn)其抑制培養(yǎng)物的生長(zhǎng)和生物轉(zhuǎn)化。但是，以這些操作的結(jié)果為基礎(chǔ)，認(rèn)為甲醇或其它水互溶性溶劑可以在低濃度下有效作用，來(lái)提高烯睪丙內(nèi)酯量，并且以細(xì)顆粒沉淀物提供烯睪丙內(nèi)酯，提供大的界面面積，向反應(yīng)提供烯睪丙內(nèi)酯。證明烯睪丙內(nèi)酯在滅菌條件下(121℃)穩(wěn)定，但是凝集成塊。使用韋林氏摻合器將這些塊破碎成細(xì)小顆粒，其成功地轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物。實(shí)施例7使用根據(jù)實(shí)施例4描述的方法產(chǎn)生的工作細(xì)胞庫(kù)的孢子懸浮液，還是基本上用實(shí)施例4描述的方法制備第一代和第二代菌種培養(yǎng)物。實(shí)施例7的說(shuō)明和結(jié)果在表22中給出。使用該方法產(chǎn)生的第二代菌種培養(yǎng)物，基本上根據(jù)實(shí)施例3的描述進(jìn)行一次生物轉(zhuǎn)化(R3C)，并根據(jù)實(shí)施例5概述的方法進(jìn)行3次生物轉(zhuǎn)化。在后三次中(R3A，R3B和R3D)，烯睪丙內(nèi)酯與除了葡萄糖以外的生長(zhǎng)培養(yǎng)基一起在輕便型容器中滅菌。葡萄糖由另一個(gè)容器無(wú)菌加入。在接種之前或在生物轉(zhuǎn)化早期階段向發(fā)酵罐加入滅菌的烯睪丙內(nèi)酯懸浮液。在R3B操作中，在46.5處加入補(bǔ)充的滅菌烯睪丙內(nèi)酯和生長(zhǎng)培養(yǎng)基。滅菌時(shí)形成的烯睪丙內(nèi)酯塊通過(guò)韋林氏摻合器破碎，這樣生產(chǎn)出進(jìn)入到發(fā)酵罐的細(xì)小顆粒懸浮液。表22和23列出了轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)培養(yǎng)基，烯睪丙內(nèi)酯加入方案，營(yíng)養(yǎng)物加入方案，收集時(shí)間，和這些操作的轉(zhuǎn)化程度。因?yàn)槭墙z狀生長(zhǎng)，所以在該實(shí)施例所有4種操作中可見(jiàn)高粘度發(fā)酵肉湯。為了克服高粘度產(chǎn)生的有關(guān)通氣，混合，pH控制和溫度控制的障礙，在這些操作中提高了通氣速度和攪拌速度。轉(zhuǎn)化在更嚴(yán)格的條件下令人滿(mǎn)意地進(jìn)行，但是在液態(tài)肉湯表面上形成致密的塊狀物。一些未反應(yīng)的肉湯通過(guò)這種塊狀物帶出肉湯。實(shí)施例8實(shí)施例8的說(shuō)明和結(jié)果總結(jié)于表24。進(jìn)行4種發(fā)酵操作，其中通過(guò)烯睪丙內(nèi)酯的生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)生11α-羥基烯睪丙內(nèi)酯。在兩次發(fā)酵中(R4A和R4D)，基本上以實(shí)施例6的R3A和R3D操作相同的方法進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。在R4C操作中，烯睪丙內(nèi)酯一般以實(shí)施例3描述的方法轉(zhuǎn)化成11α-羥基烯睪丙內(nèi)酯。在R4B操作中，一般以實(shí)施例4描述的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，即在接種前在發(fā)酵罐中將烯睪丙內(nèi)酯和生長(zhǎng)培養(yǎng)基滅菌，在一批生產(chǎn)量開(kāi)始時(shí)加入所有的氮和磷營(yíng)養(yǎng)物，并且向發(fā)酵罐加入只含有葡萄糖的補(bǔ)充溶液來(lái)保持隨著生產(chǎn)進(jìn)行期間的葡萄糖的水平。在后一過(guò)程中(R4B操作)，每6小時(shí)監(jiān)測(cè)葡萄糖濃度，根據(jù)控制葡萄糖水平在0.5-1％范圍內(nèi)的指示加入葡萄糖溶液。表25給出了進(jìn)行這些操作的烯睪丙內(nèi)酯加入的方案。在大多數(shù)發(fā)酵周期中所有的發(fā)酵物在高攪拌和通氣下進(jìn)行工作，因?yàn)榘l(fā)酵液在接種后一天內(nèi)或左右變得高度粘稠。實(shí)施例9表26列出了該實(shí)施例這些操作的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)培養(yǎng)基，烯睪丙內(nèi)酯加入方案，收集時(shí)間，和轉(zhuǎn)化程度。除了下面說(shuō)明外，基本上根據(jù)對(duì)于實(shí)施例8R4B操作說(shuō)明的方法進(jìn)行4次生物轉(zhuǎn)化。在R5B操作中，用向下抽吸水用葉輪代替在其它操作中用于攪拌的頂部渦輪圓輪。向下抽吸軸向作用將肉湯倒向發(fā)酵物中心，并減少了塊的形成。在R5D操作中接種后立即加入甲醇(200ml)。因?yàn)橄┎G丙內(nèi)酯是在發(fā)酵罐中滅菌的，除了葡萄糖外的所有營(yíng)養(yǎng)物在一批生產(chǎn)量開(kāi)始時(shí)加入，避免了一連串加入氮源，磷源或抗生素。</tables>為了保持液體表面生長(zhǎng)的固相的浸入，在一批生產(chǎn)量開(kāi)始96小時(shí)后向每個(gè)發(fā)酵罐加入生長(zhǎng)培養(yǎng)基(2L)。通過(guò)加入生長(zhǎng)培養(yǎng)基或者使用向下抽吸葉輪(R5B操作)者不能完全克服混合問(wèn)題，但是操作結(jié)果證明該方法的可行性和優(yōu)點(diǎn)，并且指明根據(jù)常規(guī)操作可以提供令人滿(mǎn)意的混合。實(shí)施例10基本上以實(shí)施例9中說(shuō)明的方法進(jìn)行三次生物轉(zhuǎn)化。表27列出了轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)培養(yǎng)基，烯睪丙內(nèi)酯加入方案，收集時(shí)間，和該實(shí)施例這些的轉(zhuǎn)化程度在R6A操作71小時(shí)后加入生長(zhǎng)培養(yǎng)基(1.3L)和滅菌水(0.8L)，以浸沒(méi)液體肉湯表面生長(zhǎng)的菌絲體塊。為了相同的目的，在R6B操作95小時(shí)后加入生長(zhǎng)培養(yǎng)基(0.5L)和滅菌水(0.5L)。物料平衡數(shù)據(jù)表明，液體表面形成塊最少情況下，測(cè)得更好的質(zhì)量平衡。實(shí)施例11進(jìn)行幾輪發(fā)酵操作來(lái)比較烯睪丙內(nèi)酯的預(yù)滅菌作用和轉(zhuǎn)化發(fā)酵罐中烯睪丙內(nèi)酯和生長(zhǎng)基的滅菌作用。在R7A中，根據(jù)圖2的說(shuō)明，在類(lèi)似于R2C，R2D，R3A，R3B，R3D，R4A和R4D的條件下進(jìn)行該方法。R7B操作根據(jù)圖3的詳細(xì)說(shuō)明在類(lèi)似于實(shí)施例4，9和10，及R4B操作的條件下進(jìn)行。表28列出了該實(shí)施例各操作的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)培養(yǎng)基，烯睪丙內(nèi)酯加入方案，收集時(shí)間，和轉(zhuǎn)化程度<以從R7B操作取出的最終樣品為基礎(chǔ)的質(zhì)量平衡是89.5％，表明生物轉(zhuǎn)化中沒(méi)有明顯的底物損失或降解。認(rèn)為混合對(duì)于兩種操作是適當(dāng)?shù)?。最?0小時(shí)期間殘留的葡萄糖的濃度高于期望的5-10gpl控制范圍。處理效率明顯不受兩個(gè)發(fā)酵罐上方空間中蓄積的輕餅的影響。實(shí)施例12在表29中總結(jié)的一系列1L提取操作中測(cè)定提取效率。在這些操作的每一種操作中，用乙酸乙酯(1L/L發(fā)酵體積)從菌絲體中提取甾類(lèi)化合物。在每一種操作中進(jìn)行兩次連續(xù)提取。以RP-HPLC為基礎(chǔ)，第一次提取中回收了總的甾類(lèi)化合物的大約80％；第二次提取回收率提高到95％。第三次提取又回收了3％甾類(lèi)化合物。損失上清液含水相中殘留的2％。使用真空使提取液至于，而不使用任何其他溶劑洗滌。如果通過(guò)工藝經(jīng)濟(jì)學(xué)證明是正確的，則用溶劑處理會(huì)提高自初始提取物的回收率。作為在1L肉湯規(guī)模時(shí)11α-羥基烯睪丙內(nèi)酯的提取/結(jié)晶溶劑，評(píng)定甲基異丁基酮(MIBK)和甲苯。使用如上所述的提取方案，MIBK和甲苯在提取效率和結(jié)晶效率方面與乙酸乙酯類(lèi)似。實(shí)施例13作為圖2和3方法的評(píng)價(jià)的一部分，對(duì)這些方法的每一個(gè)中的發(fā)酵循環(huán)開(kāi)始時(shí)提供的烯睪丙內(nèi)酯底物進(jìn)行了顆粒大小研究。如上所述，在加入發(fā)酵罐中之前，將向圖1方法加入的烯睪丙內(nèi)酯微?；Ｔ谠摲椒ㄖ?，烯睪丙內(nèi)酯沒(méi)有被滅菌，而通過(guò)加入抗生素來(lái)控制不期望的微生物的生長(zhǎng)。在圖2和3的方法中，在反應(yīng)前將烯睪丙內(nèi)酯滅菌。在圖2方法中，在將烯睪丙內(nèi)酯加入到發(fā)酵罐之前，在一個(gè)摻合器中滅菌。在圖3方法中在一批生產(chǎn)量開(kāi)始時(shí)，將烯睪丙內(nèi)酯在生長(zhǎng)基中的懸浮液滅菌。如上所討論的，滅菌作用有引起烯睪丙內(nèi)酯顆粒團(tuán)聚的趨勢(shì)。因?yàn)橄┎G丙內(nèi)酯在含水培養(yǎng)基有限的溶解度，該方法的產(chǎn)率取決于從固相轉(zhuǎn)移的質(zhì)量，因此預(yù)期取決于固體顆粒底物存在的界面面積，接著取決于顆粒大小分布。這些考慮最初作為圖2和3的方法的阻礙。但是發(fā)現(xiàn)圖2的摻合器和圖3的發(fā)酵罐中的攪拌作用以及圖2中一批生產(chǎn)量的轉(zhuǎn)移所使用的剪切泵的作用，共同將結(jié)塊降解成顆粒大小范圍合理，類(lèi)似于向圖1方法中加入的未滅菌和微?；南┎G丙內(nèi)酯的大小。這可通過(guò)三種方法的每一種中反應(yīng)周期開(kāi)始時(shí)得到的烯睪丙內(nèi)酯的顆粒大小的分布來(lái)進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。參見(jiàn)表30和圖4和5。由表30數(shù)據(jù)注意到，攪拌器和剪切泵有效地將滅菌烯睪丙內(nèi)酯平均顆粒大小減小到和未滅菌底物相同級(jí)別，但是未滅菌底物保持明顯的大小差異。盡管存在該差別，但是反應(yīng)效率數(shù)據(jù)表明預(yù)先滅菌方法至少與圖1方法一樣有效果。通過(guò)進(jìn)一步減小和控制顆粒大小的一些步驟，例如滅菌的烯睪丙內(nèi)酯的濕磨，和/或通過(guò)巴斯德氏消毒而不是滅菌，可以顯示出來(lái)圖2方法的進(jìn)一步的優(yōu)點(diǎn)。實(shí)施例14根據(jù)實(shí)施例5描述的方法制備菌種培養(yǎng)物。20小時(shí)時(shí)，種菌發(fā)酵罐中的菌絲體是漿狀，PMV是40％。其pH是5.4，并且14.8gpl葡萄糖保留沒(méi)有使用。制備具有表20所示組成的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)基(35L)。在制備進(jìn)料培養(yǎng)基中，葡萄糖和酵母抽提物分開(kāi)滅菌，并混合成單一進(jìn)料，初始濃度為30％重量葡萄糖和10％重量酵母抽提物。進(jìn)料的pH調(diào)至5.7。使用該培養(yǎng)基，(表20)，進(jìn)行兩輪烯睪丙內(nèi)酯向11α-羥基烯睪丙內(nèi)酯的生物轉(zhuǎn)化。每一輪在安裝有帶有一個(gè)Rushton渦輪葉輪和兩個(gè)Lightnin’A315葉片的攪拌器的60L發(fā)酵罐中進(jìn)行。最初加入到發(fā)酵罐中的生長(zhǎng)基是35L。加入微?；臀礈缇南┎G丙內(nèi)酯，使初始濃度是0.5％。以初始接種比例是2.5％的比例，用在實(shí)施例5描述的方法中制備的菌種培養(yǎng)物接種發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基。發(fā)酵在28℃的溫度下進(jìn)行，攪拌速度是200-500rpm，通氣速度是0.5vvm，背壓足以保持溶解的氧氣的水平至少是20％體積。在生產(chǎn)操作中，轉(zhuǎn)化作用培養(yǎng)物生長(zhǎng)成非常小的橢圓形小丸(大約1-2mm)。基本上以實(shí)施例1描述的方法向發(fā)酵罐中連續(xù)加入烯睪丙內(nèi)酯和補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)。每4小時(shí)加入營(yíng)養(yǎng)物，比例是每升發(fā)酵罐中肉湯有3.4g葡萄糖和0.6g酵母抽提物。表31列出的是該實(shí)施例各輪中的通氣速度，攪拌速度，溶解的氧氣，PMV，和所述時(shí)間間隔時(shí)實(shí)現(xiàn)的pH，以及每批生產(chǎn)量期間的葡萄糖的加入。表32給出烯睪丙內(nèi)酯轉(zhuǎn)化曲線(xiàn)。46小時(shí)后終止R11A操作；R11B操作持續(xù)96小時(shí)。在后一操作中，81小時(shí)時(shí)達(dá)到93％轉(zhuǎn)化率；84小時(shí)時(shí)又加入進(jìn)料；然后終止進(jìn)料。注意進(jìn)料終止時(shí)間和該操作終止時(shí)間之間發(fā)生的粘度的明顯變化。實(shí)施例15根據(jù)上面概述的方法，對(duì)各種培養(yǎng)物測(cè)定烯睪丙內(nèi)酯向11α-烯睪丙內(nèi)酯生物轉(zhuǎn)化中的效率。根據(jù)實(shí)施例5的方法制備各黑色曲霉ATCC11394，無(wú)根根霉ATCC11145和葡枝根霉ATCC6227b的工作細(xì)胞庫(kù)。用來(lái)自工作細(xì)胞庫(kù)的孢子懸浮液(1ml)接種表18所示組成的生長(zhǎng)基(50ml)并且放置在恒溫箱中。通過(guò)在26℃發(fā)酵大約20小時(shí)在恒溫箱中制備菌種培養(yǎng)物。對(duì)恒溫箱的振蕩速度是200rpm。用各微生物菌種培養(yǎng)物等份(2ml)接種含有表18生長(zhǎng)基(30ml)的轉(zhuǎn)化瓶。每個(gè)培養(yǎng)物用來(lái)接種兩個(gè)瓶，共六個(gè)瓶。在36℃將烯睪丙內(nèi)酯(200mg)溶解于甲醇(4ml)，向各瓶中加入0.5ml等份該溶液。一般情況下，在實(shí)施例5描述的條件下，每天加入50％重量葡萄糖溶液(1ml)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。頭72小時(shí)后，在各轉(zhuǎn)化發(fā)酵瓶中生長(zhǎng)的菌絲體上發(fā)現(xiàn)ATCC11394-很好均勻生長(zhǎng)ATCC11145-頭48小時(shí)中很好生長(zhǎng)，但是菌絲體聚成球；最后24小時(shí)中沒(méi)用明顯生長(zhǎng)；ATCC6227b-很好生長(zhǎng)，菌絲體質(zhì)聚成球。取肉湯樣品分析生物轉(zhuǎn)化程度。三天后，使用ATCC11394的發(fā)酵向11α-羥基烯睪丙內(nèi)酯的轉(zhuǎn)化達(dá)80-90％；ATCC11145提供50％的轉(zhuǎn)化；以及ATCC6227b提供80-90％的轉(zhuǎn)化。實(shí)施例16基本上使用實(shí)施例15說(shuō)明的方法，對(duì)附加的微生物測(cè)定烯睪丙內(nèi)酯向11α-烯睪丙內(nèi)酯生物轉(zhuǎn)化中的效能。試驗(yàn)的微生物和試驗(yàn)結(jié)果在表33中列出1培養(yǎng)基CSL-玉米漿；TSB-胰蛋白酶大豆肉湯；P&amp;CSL-胨和玉米漿；BP-牛肉浸液和胨。實(shí)施例17對(duì)各種微生物測(cè)定烯睪丙內(nèi)酯向9α-烯睪丙內(nèi)酯生物轉(zhuǎn)化中的效能。進(jìn)行該實(shí)施例的發(fā)酵培養(yǎng)基根據(jù)表34所示制備表34大豆粉葡萄糖20g大豆粉5gNaCl5g酵母抽提物5gKH2PO45g水to1LpH7.0胨/酵母抽提物/葡萄糖葡萄糖40g細(xì)菌培養(yǎng)用胨10g酵母抽提物5g水to1LMueller-Hinton牛肉浸液300g酪蛋白水解物17.5g淀粉1.5g水to1L真菌在大豆粉培養(yǎng)基和胨-酵母抽提物葡萄糖中生長(zhǎng)；atinomycetes和真桿菌在大豆粉(加0.9％重量甲酸鈉用于生物轉(zhuǎn)化)和Mueller-Hinton肉湯中生長(zhǎng)。用凍干的孢子原種(在250mlErlenmayer瓶中的20ml大豆粉)接種起始培養(yǎng)物。瓶上蓋上乳濾器和生物屏蔽。用起始培養(yǎng)物(24或48小時(shí)生長(zhǎng))接種代謝培養(yǎng)物(也是在在250mlErlenmayer瓶中的20ml)-10％-15％雜交體積-后者在加入用于轉(zhuǎn)化反應(yīng)的甾類(lèi)化合物之前溫育24-48小時(shí)。烯睪丙內(nèi)酯溶解于/懸浮于甲醇(20mg/ml)，過(guò)濾滅菌，加入到培養(yǎng)物中使終濃度為0.1mg/ml。所有的轉(zhuǎn)化發(fā)酵瓶在溫度控制在26℃和60％濕度的室內(nèi)在250rpm(2”擺度)振蕩。加入底物后5和48小時(shí)，或24小時(shí)，收集生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。向發(fā)酵瓶中加入乙酸乙酯(23ml)或二氯甲烷開(kāi)始進(jìn)行收集。然后發(fā)酵瓶振蕩2分鐘，將每個(gè)瓶中的物質(zhì)倒入50ml錐形瓶。為了分離各相，在室溫下以4000rpm將試管離心20分鐘。將有機(jī)層從各試管中轉(zhuǎn)移到20ml硼硅酸鹽玻璃管形瓶中，在真空速下蒸發(fā)。將管形瓶蓋蓋并且在-20℃儲(chǔ)存。為了獲得用于結(jié)構(gòu)測(cè)定的物質(zhì)，通過(guò)將發(fā)酵振蕩瓶的數(shù)目增加到25個(gè)使生物轉(zhuǎn)化規(guī)模達(dá)到500ml。收集時(shí)(加入底物后24小時(shí)或48小時(shí))，分別向每個(gè)瓶中加入乙酸乙酯，將瓶子蓋蓋，放回到振蕩器振蕩20分鐘。然后將瓶子中的物質(zhì)倒入聚丙烯瓶，并離心分離固相，或者倒入分液漏斗中通過(guò)重力使各相分離。干燥有機(jī)相，得到包含在反應(yīng)混合物中的甾類(lèi)化合物的粗提取物。首先在以熒光為背景的硅膠(250μm)板上(254nm)用薄層色譜分析反應(yīng)產(chǎn)物。。向含有從反應(yīng)混合物中提取出來(lái)的干燥的乙酸乙酯提取物的各管形瓶中加入乙酸乙酯(500μl)。用高效液相色譜和質(zhì)譜作進(jìn)一步的分析。平板在95∶5v/v氯仿/甲醇介質(zhì)中展開(kāi)。用高效液相色譜和質(zhì)譜作進(jìn)一步的分析。使用Millennium軟件，光電二極管陣列檢測(cè)器和自動(dòng)取樣器的WatersHPLC。反相HPLC使用WatersNovaPakC-18(4μm顆粒度)RadialPak4mm柱體。用水∶乙腈(75∶25)開(kāi)始，水∶乙腈(25∶75)結(jié)束，開(kāi)始25分鐘的線(xiàn)性溶劑梯度洗脫。接著是3分鐘梯度達(dá)到100％乙腈的洗脫，并且在初始條件下再生柱子之前進(jìn)行4分鐘等度洗脫。對(duì)于LC/MS，以2nM濃度向乙腈和水相加入乙酸銨。色譜不被明顯影響。將來(lái)自柱子的洗脫液分為22∶1，大部分材料送入PDA檢測(cè)器。剩余的4.5％材料送入SciexAPIIII質(zhì)譜儀的電子噴射離子化室。以陽(yáng)極方式進(jìn)行質(zhì)譜。來(lái)自HPLC上PDA檢測(cè)器的同系數(shù)據(jù)線(xiàn)將單波長(zhǎng)色譜轉(zhuǎn)移給質(zhì)譜用于UV和MS的共同分析。質(zhì)譜裂解方式圖用來(lái)將羥基化的底物分類(lèi)。預(yù)期的兩種羥基化烯睪丙內(nèi)酯，11α-羥基和9α-羥基，以一致方式在不同的頻率失水，其可以用作一種診斷劑。而且9α-羥基烯睪丙內(nèi)酯比11α-羥基烯睪丙內(nèi)酯更容易生成銨加成物。表35給出的是烯睪丙內(nèi)酯發(fā)酵的TLC，HPLC/UV和LC/MS數(shù)據(jù)的總結(jié)，表明哪一種試驗(yàn)的微生物在烯睪丙內(nèi)酯向9α-羥基烯睪丙內(nèi)酯的生物轉(zhuǎn)化中是有效的。其中優(yōu)選的微生物是山扁豆生棒孢(Corynesporacassiicola)ATCC16718。實(shí)施例18根據(jù)上文概述的方法對(duì)各種培養(yǎng)物測(cè)試雄甾烯二酮向11α-羥基雄甾烯二酮生物轉(zhuǎn)化的效率。基本上根據(jù)實(shí)施例4描述的方法制備各赭色曲霉NRRL405(ATCC18500)；黑色曲霉ATCC11394和構(gòu)巢曲霉ATCC11267；米根霉ATCC11145；葡枝根霉ATCC6227b；玫瑰單端孢ATCC12519和ATCC8685的工作細(xì)胞庫(kù)。用來(lái)自工作細(xì)胞庫(kù)的孢子懸浮液接種表18所示組成的生長(zhǎng)基(50ml)，并且放置在恒溫箱中。通過(guò)在26℃發(fā)酵大約20小時(shí)在恒溫箱中制備菌種培養(yǎng)物。恒溫箱的振蕩速度是200rpm。用各微生物菌種培養(yǎng)物等份(2ml)接種含有表15生長(zhǎng)基(30ml)的轉(zhuǎn)化瓶。每個(gè)培養(yǎng)物用來(lái)接種兩個(gè)瓶，共十六個(gè)瓶。在36℃將雄甾烯二酮(300mg)溶解于甲醇(6ml)，向各瓶中加入0.5ml等份該溶液。一般情況下，在實(shí)施例6描述的條件下，生物轉(zhuǎn)化進(jìn)行48小時(shí)。48小時(shí)后將肉湯樣品收集并根據(jù)實(shí)施例17用乙酸乙酯提取。蒸發(fā)濃縮乙酸乙酯，用薄層色譜分析樣品，確定是否存在具有類(lèi)似于11α-羥基雄甾烯二酮標(biāo)準(zhǔn)(SigmaChemicalCo.，St.Louis)色譜遷移率的產(chǎn)物。結(jié)果見(jiàn)表36，正結(jié)果標(biāo)記為“+”。表36的數(shù)據(jù)證明所列的每一種培養(yǎng)物都能從雄甾烯二酮產(chǎn)生具有與11α-羥基雄甾烯二酮標(biāo)準(zhǔn)相同的Rf值的化合物。用上述相同的方法對(duì)赭色曲霉NRRL405(ATCC18500)再次測(cè)定，通過(guò)常規(guī)相硅膠柱色譜用甲醇作為溶劑將培養(yǎng)物產(chǎn)物分離并純化。用薄層色譜分析級(jí)分。TLC板是WhatmanK6F硅膠60埃，10×20大小，250μ厚的板。溶劑體系是甲醇∶氯仿，5∶95，v/v。用LC-MS和NMR光譜分析結(jié)晶產(chǎn)物和11α-羥基雄甾烯二酮標(biāo)準(zhǔn)物。兩種化合物得到相似的曲線(xiàn)和分子量。實(shí)施例19對(duì)各種微生物測(cè)試mexrenone向11β-羥基mexrenone生物轉(zhuǎn)化的效率。根據(jù)表34制備用于該實(shí)施例的發(fā)酵培養(yǎng)基。發(fā)酵條件與分析方法與實(shí)施例17相同。TLC板和溶劑體系與實(shí)施例18描述的相同。色譜分析原理如下11α-羥基mexrenone和11α-羥基烯睪丙內(nèi)酯具有相同的色譜遷移率。11α-羥基烯睪丙內(nèi)酯和9α-羥基烯睪丙內(nèi)酯具有與11α-羥基雄甾烯二酮和11β-羥基雄甾烯二酮相同的遷移方式。因此，11β-羥基mexrenone應(yīng)該具有與9α-羥基烯睪丙內(nèi)酯相同的遷移率。因此從生長(zhǎng)基中提取的化合物應(yīng)該以9α-羥基烯睪丙內(nèi)酯為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行操作。結(jié)果見(jiàn)表36。<p>1M＝Mueller-HintonP＝PYG(胨/酵母抽提物/葡萄糖)S＝大豆粉SF＝大豆粉加甲酸鹽2？＝與沒(méi)用底物對(duì)照的有疑問(wèn)的區(qū)別。這些數(shù)據(jù)表明該表中大部分微生物產(chǎn)生與從mexrenone得到的11β-羥基mexrenone相似或相同的產(chǎn)物。實(shí)施例20方法1步驟1制備5’R(5’α)，7’β-20’-氨基十六氫-11’β-羥基-10’a，13’α-二甲基-3’，5-二氧螺[呋喃-2(3H)，17’α(5’H)-[7，4]亞甲基(metheno)[4H]環(huán)戊[a]菲]-5’-腈。攪拌下向50加侖搪玻璃反應(yīng)器中加入61.2L(57.8kg)DMF，接著加入23.5Kg11-羥基烯睪丙內(nèi)酯1。向反應(yīng)物中加入7.1kg氯化鋰。將反應(yīng)混合物攪拌20分鐘，加入16.9kg丙酮氰醇，接著加入5.1kg三乙胺。將混合物加熱到85℃并在此溫度下保持13-18小時(shí)。反應(yīng)后加入353L水，接著加入5.6kg碳酸氫鈉?；旌衔锢鋮s到0℃，轉(zhuǎn)移到200加侖搪玻璃反應(yīng)器中用130kg6.7％次氯酸鈉溶液緩慢地中止。過(guò)濾產(chǎn)物并用3×40L水洗滌，得到21.4kg產(chǎn)物烯胺。實(shí)施例21方法1步驟2制備4’S(4’α)，7’α-十六氫-11’α-羥基-10’β，13’β-二甲基-3’，5，20’-三氧螺[呋喃-2(3H)，17’β-[4，7]亞甲基[17H]環(huán)戊[a]菲]-5’β(2’H)-腈。向200加侖搪玻璃反應(yīng)器中加入50kg烯胺2，大約445L0.8N稀鹽酸和75L甲醇。混合物加熱到80℃反應(yīng)5小時(shí)，冷卻到0℃反應(yīng)2小時(shí)。過(guò)濾固體產(chǎn)物得到36.5kg干燥產(chǎn)物二酮。實(shí)施例22方法1步驟3A制備11α，17α-二羥基-3-氧代孕甾-4-烯-7α，21-二羧酸氫甲酯，γ-內(nèi)酯。在4口5L圓底燒瓶上安裝機(jī)械攪拌子，帶有氮?dú)鈱?dǎo)管的等壓添加漏斗，溫度計(jì)和帶有擴(kuò)散器的冷凝管。擴(kuò)散器通過(guò)聚乙烯管與兩個(gè)2L阱連接，第一個(gè)阱是空的，其是為了防止第二個(gè)阱中的物質(zhì)(1L濃次氯酸鈉溶液)倒吸到反應(yīng)器中。向裝有3L甲醇的燒瓶中加入二酮3(79.50g；[重量沒(méi)用對(duì)純度校正，其是85％])。將25％甲醇鈉的甲醇溶液(64.83g)裝載到漏斗里并滴加，在氮?dú)庀聰嚢?，歷時(shí)10分鐘。加完后，將亮橙黃色反應(yīng)混合物加熱到回流，反應(yīng)20小時(shí)。然后通過(guò)添加漏斗向仍然回流的反應(yīng)混合物中滴加167ml，4NHCl(注意，HCN在此刻蒸發(fā))。反應(yīng)混合物顏色變淺為淺金黃色。然后用接取柱頭代替冷凝器，并且在通過(guò)漏斗向燒瓶同時(shí)加入1.5L水的同時(shí)通過(guò)蒸餾去除1.5L甲醇，加入水的速度與蒸餾速度一致。反應(yīng)混合物冷卻到室溫并且用2.25L等份的二氯甲烷萃取兩次。合并的萃取物依次用750ml等份的冷的飽和的氯化鈉溶液，1N氫氧化鈉和飽和的氯化鈉洗滌。有機(jī)層用硫酸鈉干燥過(guò)夜，過(guò)濾，真空下使體積減少到約250ml。加入甲苯(300ml)，減壓去除殘留的二氯甲烷，期間，產(chǎn)物開(kāi)始在燒瓶壁上以白色固體形成。將燒瓶中的物質(zhì)冷卻過(guò)夜，并過(guò)濾去除固體。用250ml甲苯洗滌一次，用250ml等份乙醚洗滌兩次，在真空漏斗上干燥，得到58.49g白色固體，HPLC測(cè)定純度是97.3％。濃縮母液時(shí)，得到了另外的6.76g77.1％純度的產(chǎn)物。校正純度后總產(chǎn)率是78％。實(shí)施例23方法1步驟3B由11α，17α-二羥基-3-氧代孕甾-4-烯-7α，21-二羧酸氫甲酯，γ-內(nèi)酯轉(zhuǎn)化成17α-羥基-11α-(甲基磺?；?氧-3-氧代孕甾-4-烯-7α，21-二羧酸氫甲酯，γ-內(nèi)酯。象上面的實(shí)施例一樣安裝5-L四口燒瓶，除了沒(méi)有捕集系統(tǒng)安裝在擴(kuò)散器外面。通氮?dú)猓瑪嚢柘孪驘恐屑尤攵?38.7g羥基酯，接著加入1425ml二氯甲烷。用鹽/冰浴將反應(yīng)混合物冷卻到-5℃?？焖偌尤爰谆酋Ｂ?51.15g，0.447摩爾)，接著緩慢滴加在225ml二氯甲烷中的三乙胺(54.37g)。需要大約30分鐘的進(jìn)料期間，控制加入速度使反應(yīng)溫度不升高到5℃。加入后持續(xù)攪拌1小時(shí)，將反應(yīng)物轉(zhuǎn)移到12-L分液漏斗中，并加入2100ml二氯甲烷。連續(xù)用700ml等份的冷1N鹽酸，1N氫氧化鈉，和飽和的氯化鈉的氯化鈉水溶液洗滌溶液。合并水相并用3500ml二氯甲烷反萃。所有的有機(jī)相合并到9-L罐中，加入500g中性氧化鋁，II級(jí)活性，和500g無(wú)水硫酸鈉。將罐中物質(zhì)充分混合30分鐘，過(guò)濾。真空使濾液至干，得到粘性黃色泡沫。將其溶解于350ml二氯甲烷，并且攪拌下滴加1800ml乙醚。調(diào)節(jié)加入速度使大約一半乙醚在30分鐘內(nèi)加入。加入大約750ml后，產(chǎn)物開(kāi)始分離出結(jié)晶固體。剩余的醚在10分鐘內(nèi)加入。過(guò)濾取出固體，濾餅用2L乙醚洗滌，在50℃真空烘箱中干燥，得到144.61g(88％)幾乎白的固體，m.p.149-150℃。用該方法制備的物質(zhì)一般HPLC(面積％)純度是98-99％。在一次操作中，得到熔點(diǎn)153-153.5℃的物質(zhì)，根據(jù)HPLC測(cè)定，純度是99.5％。實(shí)施例24方法1步驟3C方法A制備17α-羥基-3-氧代孕甾-4，9(11)-二烯-7α，21-二羧酸氫甲酯，γ-內(nèi)酯。象第二個(gè)實(shí)施例一樣安裝1-L四口燒瓶。通氮?dú)?，攪拌下向燒瓶中加入甲?250ml)和乙酸酐(62ml)。加入甲酸鉀(6.17g)，用油浴將反應(yīng)混合物內(nèi)部溫度加熱到40℃(稍后在70℃重復(fù)這樣做會(huì)得到更好的結(jié)果)反應(yīng)16小時(shí)。16小時(shí)后，加入甲磺酸鹽5，內(nèi)部溫度升至100℃。持續(xù)加入攪拌2小時(shí)，然后在rotavap上真空去除溶劑。殘余物與500ml冰水一起攪拌15分鐘，然后用500ml等份的乙酸乙酯萃取兩次。合并有機(jī)相，依次用冷的250ml等份飽和的氯化鈉溶液(兩次)，1N氫氧化鈉溶液，和飽和的氯化鈉洗滌。有機(jī)相用硫酸鈉干燥，過(guò)濾，真空至干，得到亮黃白色泡沫，當(dāng)用刮勺刮時(shí)，其呈粉末玻璃狀。形成粉末14.65g，分析為82.1％6，7.4％8和5.7％9(HPLC面積百分比)。實(shí)施例25方法1步驟3C方法B制備17α-羥基-3-氧代孕甾-4，9(11)-二烯-7α，21-二羧酸氫甲酯，γ-內(nèi)酯。象上述實(shí)施例一樣安裝5-L4口燒瓶。通氮?dú)?，攪拌下向燒瓶中加?28.26g乙酸和41.37g乙酸鈉。用油浴將反應(yīng)混合物內(nèi)部溫度加熱到100℃。加入甲磺酸鹽(123.65g)，繼續(xù)加熱30分鐘。該階段完成后，停止加熱，并加入200ml冰水。溫度降至40℃，并繼續(xù)攪拌1小時(shí)，然后將反應(yīng)混合物緩慢倒入5-L攪拌的燒瓶中的1.5L冷水中。分離成膠質(zhì)油狀產(chǎn)物。將油溶解于1L乙酸乙酯。用1L等份冷的飽和的氯化鈉溶液，1N氫氧化鈉溶液，和飽和的氯化鈉洗滌。有機(jī)相用硫酸鈉干燥，過(guò)濾，濾液真空至干，得到泡沫，癟成膠質(zhì)油。用乙醚研制并最終固化。過(guò)濾固體并用乙醚洗滌，得到79.59g黃白色固體。由70.4％期望的Δ9，11烯酯6，12.3％Δ11，12烯酯8，10.8％7-α，9-α內(nèi)酯9和5.7％未反應(yīng)5組成。實(shí)施例26方法1步驟3D制備9，11α-環(huán)氧-17α-羥基-3-氧代孕甾-4-烯-7α，21-二羧酸氫甲酯，γ-內(nèi)酯。4口加套的500ml反應(yīng)器安裝機(jī)械攪拌子，冷凝管/擴(kuò)散器，溫度計(jì)，帶有氮?dú)鈱?dǎo)管的添加漏斗。通氮?dú)?，攪拌下向反?yīng)器中加入83ml二氯甲烷中8.32g粗產(chǎn)物烯酯。向其中加入4.02g二堿價(jià)磷酸鉀，接著加入12ml三氯乙腈。外部冷卻水通過(guò)反應(yīng)器加套，反應(yīng)混合物冷卻到8℃。在10分鐘內(nèi)通過(guò)添加漏斗加入36ml30％過(guò)氧化氫。完全加入后最初淺黃色的反應(yīng)混合物幾乎變得沒(méi)有顏色。自始至終添加的反應(yīng)混合物保持在9±1℃，并且連續(xù)攪拌過(guò)夜(共23小時(shí))。向反應(yīng)混合物中加入二氯甲烷(150ml)。將全部?jī)?nèi)含物加入到大約250ml冰水中。用150ml等份二氯甲烷萃取三次。合并的二氯甲烷萃取液用400ml冷的3％亞硫酸鈉溶液洗滌以分解殘留的過(guò)氧化物。接著用330ml冷的1N氫氧化鈉洗滌，400ml冷的1N鹽酸洗滌，最終用400ml鹽水洗滌。有機(jī)相用硫酸鎂干燥，過(guò)濾，濾餅用80ml二氯甲烷洗滌。真空去除溶劑得到9.10g淺黃色固體粗產(chǎn)物。從大約25ml2-丁酮重結(jié)晶，得到5.52g幾乎白的結(jié)晶。最終從丙酮(大約50ml)中重結(jié)晶，得到3.16g長(zhǎng)針狀結(jié)晶，mp.241-243℃實(shí)施例27方法1步驟3選擇1由4’S(4’α)，7’α-十六氫-11’α-羥基-10’β，13’β-二甲基-3’，5，20’-三氧螺[呋喃-2(3H)，17’β-[4，7]亞甲基[17H]環(huán)戊[a]菲]-5’β(2’H)-腈制備9，11α-環(huán)氧-17α-羥基-3-氧代孕甾-4-烯-7α，21-二羧酸氫甲酯，γ-內(nèi)酯。向干凈干燥的反應(yīng)器中加入二酮(20g)，接著加入820ml甲醇和17.6ml25％甲醇鈉/甲醇溶液。反應(yīng)混合物加熱到回流條件(大約67℃)反應(yīng)16-20小時(shí)。用40ml4N鹽酸中止反應(yīng)。常壓蒸餾去除溶劑。加入100ml甲苯，與甲苯共沸蒸餾去除殘留的甲醇。濃縮后，將粗產(chǎn)物羥基酯4溶解于206ml二氯甲烷并冷卻到0℃。加入甲磺酰氯(5ml)后緩慢加入10.8ml三乙胺。產(chǎn)物攪拌45分鐘。真空蒸餾去除溶劑得到粗產(chǎn)物甲磺酸鹽5。在分離的干燥的反應(yīng)器中加入5.93g甲酸鉀，240ml甲酸，接著加入118ml乙酸酐?；旌衔锛訜岬?0℃反應(yīng)4小時(shí)。向上述制備的濃甲磺酸鹽溶液5中加入甲酸混合物。將混合物加熱到95-105℃反應(yīng)2小時(shí)。產(chǎn)物混合物冷卻到50℃，在50℃真空蒸餾去除揮發(fā)成分。產(chǎn)物分配在275ml乙酸乙酯和275ml水中。用137ml乙酸乙酯反萃水層，用240ml冷的1N氫氧化鈉溶液然后用120ml飽和的氯化鈉洗滌。相分離后，真空蒸餾濃縮有機(jī)相，得到粗產(chǎn)物烯酯。將產(chǎn)物溶解于180ml二氯甲烷并冷卻到0-15℃。加入8.68g磷酸氫二鉀后加入2.9ml三氯乙腈。3分鐘內(nèi)向混合物中加入78ml30％過(guò)氧化氫溶液。反應(yīng)混合物在0-15℃攪拌6-24小時(shí)。反應(yīng)后，分離兩相混合物。有機(jī)層用126ml3％亞硫酸鈉溶液，126ml0.5N氫氧化鈉溶液，126ml1N鹽酸和126ml10％鹽水洗滌。產(chǎn)物用無(wú)水硫酸鎂干燥，并通過(guò)Celite過(guò)濾，常壓蒸餾去除溶劑二氯甲烷。產(chǎn)物從甲基乙基酮中結(jié)晶兩次，得到7.2geplerenone。實(shí)施例28方法1步驟3方法2由1’S(4’α)，7’α-十六氫-11’α-羥基-10’β，13’β-二甲基-3’，5，20’-三氧螺[呋喃-2(3H)，17’β-[4，7]亞甲基[17H]環(huán)戊[a]菲]-5’β(2’H)-腈轉(zhuǎn)化成9，11α-環(huán)氧-17α-羥基-3-氧代孕甾-4-烯-7α，21-二羧酸氫甲酯，γ-內(nèi)酯，沒(méi)有中間體。在4口5L圓底燒瓶上安裝機(jī)械攪拌子，帶有氮?dú)鈱?dǎo)管的添加漏斗，溫度計(jì)和帶有擴(kuò)散器的冷凝管，其與次氯酸鈉洗滌器連接。將3.05L甲醇中的二酮(83.20g)加入到燒瓶中。添加漏斗中裝入67.85g25％(w/w)甲醇鈉的甲醇溶液。氮?dú)鈹嚢柘陆?jīng)15分鐘向燒瓶中滴加甲醇化物。產(chǎn)生暗橘/黃色漿液。將反應(yīng)混合物加熱至回流反應(yīng)20小時(shí)，持續(xù)回流的同時(shí)滴加175ml4N鹽酸(注意，HCN在該操作中蒸發(fā))。用接取柱頭代替回流冷凝器，并且在通過(guò)漏斗滴加1.6L10％氯化鈉水溶液的同時(shí)通過(guò)蒸餾去除1.6L甲醇，加入速度與蒸餾速度一致。反應(yīng)混合物冷卻到室溫并且用2.25L等份的二氯甲烷萃取兩次。合并的萃取物用750ml等份的冷的1N氫氧化鈉和飽和的氯化鈉溶液洗滌。有機(jī)層在1大氣壓下與甲醇共沸蒸餾干燥，使終體積為1L(取出總量的0.5％用于分析)。將濃縮的有機(jī)溶液(羥基酯)加回到?jīng)]有HCN阱的如前所配制的原反應(yīng)瓶中。燒瓶冷卻到0℃，氮?dú)鈹嚢柘录尤?0.7g甲磺酰氯。添加漏斗裝有32.65g三乙胺，保持5℃溫度，經(jīng)15分鐘滴加。持續(xù)攪拌2小時(shí)，同時(shí)反應(yīng)混合物升至室溫。制備由250gDowex50W×8-100酸離子交換樹(shù)脂組成的柱子，并在使用前用250ml水，250ml甲醇和500ml二氯甲烷洗滌。反應(yīng)混合物經(jīng)柱子流下并收集。制備新柱子并重復(fù)上面的過(guò)程。制備第三個(gè)250g柱子，由Dowex1×8-200堿性離子交換樹(shù)脂組成，象上述酸樹(shù)脂處理一樣預(yù)處理。反應(yīng)混合物經(jīng)柱子流下并收集。制備第四個(gè)堿性樹(shù)脂柱，反應(yīng)混合物又經(jīng)柱子流下并收集。每次通過(guò)柱子后兩次用250ml二氯甲烷洗滌柱子，每次流經(jīng)柱子的時(shí)間是大約10分鐘。溶劑洗液與反應(yīng)混合物合并，真空將體積減小到大約500ml，取出2％用于qc.。剩余的進(jìn)一步減小到150ml終體積(粗產(chǎn)物甲磺酸鹽溶液)。向原5-L反應(yīng)裝置加入960ml甲酸，472ml乙酸酐和23.70g甲酸鉀。氮?dú)鈹嚢柘聦⒃摶旌衔锛訜岬?0℃反應(yīng)16小時(shí)。然后將溫度升至100℃，通過(guò)添加漏斗經(jīng)30分鐘加入粗產(chǎn)物甲磺酸鹽溶液。隨著二氯甲烷蒸餾出反應(yīng)混合物，溫度降至85℃。所有二氯甲烷去除后，溫度升至100℃，在100℃反應(yīng)2.5小時(shí)。反應(yīng)混合物冷卻到40℃減壓去除甲酸直到達(dá)到最小攪拌體積(大約150ml)。殘余物冷卻到室溫，加入375ml二氯甲烷。稀釋的殘余物用冷的1L等份的飽和的氯化鈉溶液，1N碳酸鈉，及又一次氯化鈉溶液洗滌。有機(jī)相用硫酸鎂(150g)干燥，過(guò)濾得到暗紅棕色溶液(粗產(chǎn)物烯酯溶液)。在4口加套的1L反應(yīng)器上安裝機(jī)械攪拌子，冷凝管/擴(kuò)散器，溫度計(jì)和帶有氮?dú)鈱?dǎo)管的添加漏斗。氮?dú)鈹嚢柘孪蚍磻?yīng)器中加入600ml二氯甲烷中粗產(chǎn)物烯酯溶液(大約60g)。向其中加入24.0g二堿價(jià)磷酸鉀，接著加入87ml三氯乙腈。外部冷卻水通過(guò)反應(yīng)器加套，反應(yīng)混合物冷卻到10℃。在30分鐘內(nèi)通過(guò)添加漏斗加入147ml30％過(guò)氧化氫。完全加入后，最初暗紅棕色的反應(yīng)混合物變成淺黃色。添加的反應(yīng)混合物自始至終保持在10±1℃，并且連續(xù)攪拌過(guò)夜(共23小時(shí))。相分離，含水部分用120ml等份二氯甲烷萃取兩次。接著合并的有機(jī)相加入210ml3％亞硫酸鈉溶液洗滌，重復(fù)第二次，此后，通過(guò)淀粉/碘化物試紙檢測(cè)，有機(jī)相和水相都對(duì)過(guò)氧化物呈陰性。有機(jī)相依次用210ml等份冷的1N氫氧化鈉，1N鹽酸洗滌，最終用鹽水洗滌兩次。有機(jī)相共沸干燥至大約100ml體積，加入新鮮溶劑(250ml)并且共沸蒸餾至相同100ml體積，。真空去除殘留的溶劑得到57.05g粘性黃色泡沫粗產(chǎn)物。一部分(51.01g)進(jìn)一步干燥至恒重44.3g，并用HPLC定量分析。在27.1％EPX測(cè)定。實(shí)施例29氮?dú)庀孪蚍磻?yīng)器中加入11α-羥基雄甾烯二酮(429.5g)和甲苯磺酸水合物(7.1g)。向反應(yīng)器中加入乙醇(2.58L)，得到的溶液冷卻到5℃。在0-15℃經(jīng)15分鐘向溶液中加入原甲酸三乙酯(334.5g)。加完原甲酸三乙酯后，反應(yīng)混合物升至40℃，并在該溫度下反應(yīng)2小時(shí)，然后溫度升至回流，反應(yīng)在回流下繼續(xù)3小時(shí)。真空下冷卻反應(yīng)混合物，真空去除溶劑得到3-乙氧基雄甾-3，5-二烯-17-酮。實(shí)施例30--由11α-羥基烯睪丙內(nèi)酯形成烯胺向裝有機(jī)械攪拌器的25ml3-口燒瓶中加入氰化鈉(1.72g)。加入水(2.1ml)，加熱下攪拌混合物直到固體溶解。加入二甲基甲酰胺(15ml)后加入11α-羥基烯睪丙內(nèi)酯(5.0g)。向混合物中加入水(0.4ml)和硫酸(1.49g)的混合物?；旌衔锛訜岬?5℃反應(yīng)2.5小時(shí)，此時(shí)HPLC分析說(shuō)明產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化完全。反應(yīng)混合物冷卻到室溫。加入硫酸(0.83g)，攪拌混合物0.5小時(shí)。將反應(yīng)混合物加入到冰浴中冷卻的60ml水中。燒瓶用3mlDMF和5ml水洗滌。將漿液攪拌40分鐘并過(guò)濾。濾餅用40ml水洗滌兩次，在60℃真空烘箱中干燥過(guò)夜，得到11α-羥基烯胺，即5’R(5’α)，7’β-20’-氨基十六氫-11’β-羥基-10’α，13’α-二甲基-3’，5-二氧螺[呋喃-2(3H)，17’α(5’H)-[7，4]亞甲基(metheno)[4H]環(huán)戊[a]菲]-5’-腈(4.9g)。實(shí)施例31--11α-羥基烯睪丙內(nèi)酯向二酮的轉(zhuǎn)化向裝有機(jī)械攪拌器的50ml3-口燒瓶中加入氰化鈉(1.03g)。加入水(1.26ml)，稍微加熱燒瓶以使固體溶解。加入二甲基乙酰胺(或二甲基甲酰胺)(9ml)后加入11α-羥基烯睪丙內(nèi)酯(3.0g)。攪拌下向反應(yīng)燒瓶中加入水(0.25ml)和硫酸(0.47ml)的混合物?；旌衔锛訜岬?5℃反應(yīng)2小時(shí)，HPLC分析表明反應(yīng)完全。加入硫酸(0.27ml)，攪拌混合物30分鐘。加入另外的水(25ml)和硫酸(0.90ml)，反應(yīng)混合物攪拌16小時(shí)。然后混合物在冰浴中冷卻到5-10℃。通過(guò)多孔玻璃過(guò)濾器過(guò)濾后用水(20ml)洗滌兩次來(lái)分離固體。固體二酮即4’S(4’α)，7’α-十六氫-11’α-羥基-10’β，13’β-二甲基-3’，5，20’-三氧螺[呋喃-2(3H)，17’β-[4，7]亞甲基[17H]環(huán)戊[a]菲]-5’β(2’H)-腈在真空烘箱中干燥得到3.0g固體。實(shí)施例32實(shí)施例31描述的方法制備的5.0g二酮的甲醇(100ml)的懸浮液加熱至回流，經(jīng)1分鐘加入25％甲醇鉀的甲醇溶液(5.8ml)?；旌衔镒兊镁鶆颉?5分鐘后，出現(xiàn)沉淀?；亓飨录訜峄旌衔铮蠹s4小時(shí)后又變得均勻。回流下加熱一共持續(xù)了23.5小時(shí)，加入4.0N鹽酸(10ml)。蒸餾去除一共60ml氰化氫的甲醇溶液。經(jīng)15分鐘向蒸餾殘余物中加入水(57ml)。在加入水期間溶液溫度升至81.5℃，通過(guò)蒸餾去除了另外的4ml氰化氫/甲醇溶液。加完水后，混合物變混濁，去除熱源。將混合物攪拌3.5小時(shí)，產(chǎn)物緩慢結(jié)晶。過(guò)濾懸浮液，用水洗滌收集的固體。在漏斗上經(jīng)空氣風(fēng)干，92℃下(26英寸汞柱)干燥16小時(shí)，得到2.98g灰白色固體。該固體是91.4％重量羥基酯，即11α，17α-二羥基-3-氧代孕甾-4-烯-7α，21-二羧酸氫甲酯，γ-內(nèi)酯。產(chǎn)率是56.1％。實(shí)施例33向裝有溫度計(jì)，DeanStark阱和機(jī)械攪拌器的干凈干燥的3-口反應(yīng)燒瓶中加入實(shí)施例31描述的方法制備的二酮。室溫下(22℃)向反應(yīng)器加入甲醇(24ml)，將得到的漿液攪拌5分鐘。向反應(yīng)器加入25％重量甲醇鈉的甲醇溶液(52.8ml)。室溫下將混合物攪拌10分鐘，期間反應(yīng)混合物變成淺棕色澄清溶液，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)微放熱(2-3℃)?？刂萍尤胨俣龋乐狗磻?yīng)器溫度超過(guò)30℃。然后將反應(yīng)混合物加熱到回流條件(大約67℃)，繼續(xù)在回流條件下反應(yīng)16小時(shí)。然后取樣品，用HPLC分析轉(zhuǎn)化作用。反應(yīng)在回流下繼續(xù)，直到殘留的二酮不超過(guò)二酮加入量的3％?；亓髌陂g向反應(yīng)器加入4N鹽酸(120ml)，產(chǎn)生HCN，其被洗滌器吸收。反應(yīng)完全后，常壓下從反應(yīng)混合物中蒸餾出90-95％甲醇溶劑。蒸餾期間上方溫度從67℃變化為75℃，堿處理含有HCN的蒸餾液，并且在處理前漂白。去除甲醇后將反應(yīng)混合物冷卻到室溫，當(dāng)混合物在40-45℃范圍冷卻時(shí)，開(kāi)始沉淀固體產(chǎn)物。向冷卻的漿液中加入任選地含有5％重量碳酸氫鈉(1200ml)(25℃)的水溶液，然后將得到的反應(yīng)混合物大約1小時(shí)冷卻到0℃。碳酸氫鈉處理有效地從反應(yīng)混合物中消除了殘留的未反應(yīng)的二酮。漿液在0℃攪拌2小時(shí)，以完成沉淀和結(jié)晶，然后，過(guò)濾回收固體產(chǎn)物，濾餅用水(100ml)洗滌。產(chǎn)物在26”汞柱真空80-90℃干燥至恒重。干燥后的水含量小于0.25％重量。得到的摩爾產(chǎn)率大約77-80％重量。實(shí)施例34在碘化鋅(1當(dāng)量)存在下，根據(jù)實(shí)施例31制備的二酮(1當(dāng)量)與甲醇鈉(4.8當(dāng)量)在甲醇溶劑中反應(yīng)?；蛘吒鶕?jù)這里所描述的提取方法或者根據(jù)其中沒(méi)有二氯甲烷萃取，鹽水和堿洗滌，和硫酸鈉干燥步驟的非提取方法處理反應(yīng)產(chǎn)物。在非提取方法中用5％重量碳酸氫鈉溶液代替甲苯。實(shí)施例35根據(jù)實(shí)施例34制備的羥基酯(1.97g)與四氫呋喃(20ml)合并，得到的混合物冷卻到-70℃。加入磺酰氯(0.8ml)，混合物攪拌30分鐘，之后加入咪唑(1.3g)。反應(yīng)混合物升至室溫并再攪拌2小時(shí)。然后用二氯甲烷稀釋混合物并用水萃取。濃縮有機(jī)相，得到粗產(chǎn)物烯酯(1.97g)。一小部分粗產(chǎn)物樣品用HPLC分析。分析表明9，11-烯烴∶11，12-烯烴∶7，9-內(nèi)酯比例是75.5∶7.2∶17.3。根據(jù)上述但是在0℃下進(jìn)行時(shí)，反應(yīng)得到一種產(chǎn)物，其中9，11-烯烴∶11，12-烯烴∶7，9-內(nèi)酯分布是77.6∶6.7∶15.7。該方法合并成一步，引入離去基團(tuán)，并消除該離去基團(tuán)，產(chǎn)生烯酯9，11-烯烴結(jié)構(gòu)，即反應(yīng)是由磺酰氯引起式V羥基酯的11α-羥基基團(tuán)被鹵化物置換，接著脫鹵化氫產(chǎn)生Δ-9，11結(jié)構(gòu)。進(jìn)行這樣的烯酯生成反應(yīng)不使用強(qiáng)酸(例如甲酸)或干燥劑例如乙酸酐。也消除了另外的產(chǎn)生一氧化碳的方法的回流步驟。實(shí)施例36向裝有機(jī)械攪拌器，添加漏斗和熱電偶的干凈干燥的3-口圓底燒瓶中加入根據(jù)實(shí)施例34制備的羥基酯(20g)和二氯甲烷(400ml)。得到的混合物在室溫下攪拌直到獲得完全的溶液。用冰浴將溶液冷卻到5℃。向含有羥基酯的二氯甲烷溶液中加入甲磺酰氯(5ml)，很快接著緩慢滴加三乙胺(10.8ml)。調(diào)節(jié)加入速度使反應(yīng)溫度不超過(guò)5℃。反應(yīng)極端放熱；因此必需冷卻。反應(yīng)混合物在大約5℃攪拌1小時(shí)。當(dāng)反應(yīng)完全時(shí)(HPLC和TLC分析)，混合物在大約0℃在26英寸汞柱真空下濃縮，直到變成稠的漿液。得到的漿液用二氯甲烷(160ml)稀釋。混合物在大約0℃在26英寸汞柱真空下濃縮得到濃縮物。發(fā)現(xiàn)濃縮物(式IV甲磺酸鹽產(chǎn)物，其中R3＝H，-A-A-和-B-B-都是-CH2-CH2-，即11α，17α-二羥基-3-氧代孕甾-4-烯-7α，21-二羧酸氫甲酯，γ-內(nèi)酯轉(zhuǎn)化成17α-羥基-11α-(甲基磺?；?氧-3-氧代孕甾-4-烯-7α，21-二羧酸氫甲酯，γ-內(nèi)酯)純度是82％(HPLC面積百分比)。該物質(zhì)不用分離即可用于下一步反應(yīng)。向裝有機(jī)械攪拌器，添加漏斗和熱電偶和加熱罩的干凈干燥的反應(yīng)器中加入甲酸鉀(4.7g)，甲酸(16ml)和乙酸酐(8ml，0.084mol)。所得溶液加熱到70℃并攪拌大約4-8小時(shí)。乙酸酐的加入是放熱的并產(chǎn)生氣體(CO)，因此要調(diào)節(jié)加入速度，控制溫度和氣體的產(chǎn)生(壓力)。制備活性消除劑的反應(yīng)時(shí)間取決于反應(yīng)中存在的水的量(甲酸和甲酸鉀分別含有大約3-5％的水)。消除反應(yīng)對(duì)水存在量敏感；如果大于0.1％水(KF)，可能提高7，9內(nèi)酯雜質(zhì)量。這種副產(chǎn)物難于從終產(chǎn)物中去除。當(dāng)KF表明小于0.1％水時(shí)，活性消除劑被轉(zhuǎn)移到先前步驟中制備的甲磺酸鹽濃縮物(0.070mol)。得到的溶液加熱到95℃，蒸餾揮發(fā)性物質(zhì)并收集在DeanStark阱中。當(dāng)停止放出揮發(fā)性物質(zhì)時(shí)，用冷凝管代替DeanStark阱，反應(yīng)混合物在95℃又加熱1小時(shí)。完成時(shí)(TLC和HPLC分析少于0.1％起始物)，將內(nèi)含物冷卻到50℃，并開(kāi)始真空蒸餾(26英寸汞柱/50℃)?；旌衔餄饪s成粘稠的漿液后冷卻到室溫。得到的漿液用乙酸乙酯(137ml)稀釋?zhuān)瑪嚢枞芤?5分鐘。用水(137ml)稀釋。分離各相，用乙酸乙酯(70ml)再次萃取下面的水相。合并的乙酸乙酯溶液用鹽水(120ml)洗滌一次，用冰冷卻的1N氫氧化鈉溶液洗滌兩次(每次120ml)。測(cè)定水相pH，如果用過(guò)的洗液pH小于8，則再次洗滌有機(jī)層。當(dāng)發(fā)現(xiàn)用過(guò)的洗液pH大于8時(shí)，用鹽水溶液(120ml)洗滌乙酸乙酯層一次，使用50℃水浴通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干。得到的固體產(chǎn)物烯酯，即17α-羥基-3-氧代孕甾-4，9(11)-二烯-7α，21-二羧酸氫甲酯，γ-內(nèi)酯重92g(77％摩爾產(chǎn)率)。實(shí)施例37向裝有機(jī)械攪拌器，添加漏斗和熱電偶的2-L3-口圓底燒瓶中加入根據(jù)實(shí)施例34制備的羥基酯(100g；0.22mol)。使用自動(dòng)控制溫度的循環(huán)冷卻浴。反應(yīng)前干燥燒瓶，因?yàn)榧谆酋Ｂ葘?duì)水敏感。向燒瓶中加入二氯甲烷(1L)，攪拌下羥基酯溶解于其中。該溶液冷卻到0℃，通過(guò)添加漏斗向燒瓶加入甲磺酰氯(25ml，0.32mol)。通過(guò)添加漏斗向燒瓶加入三乙胺(50ml，0.59mol)，用另外的二氯甲烷(34ml)淋洗漏斗。三乙胺的加入是高度放熱的。攪拌和冷卻下加入時(shí)間是10分鐘左右。混合物冷卻到0℃，在該溫度下攪拌下進(jìn)行附加的45分鐘，期間，反應(yīng)瓶上方通入氮?dú)狻Ｈ缓笥帽由V和高效液相色譜分析反應(yīng)混合物樣品來(lái)檢查反應(yīng)是否完全。然后混合物在0℃又?jǐn)嚢?0分鐘，并再次檢查反應(yīng)是否完全。分析表明反應(yīng)在此刻基本上完全；在0℃在26”汞柱真空去除溶劑二氯甲烷。蒸餾液的氣相色譜分析表明存在甲磺酰氯和三乙胺兩者。然后向反應(yīng)器中加入二氯甲烷(800ml)，在0-15℃溫度下攪拌得到的混合物5分鐘。又在0-5℃在26”汞柱真空去除溶劑，得到式IV甲磺酸鹽，其中R3＝H，-A-A-和-B-B-都是-CH2-CH2-及R1是甲氧羰基。產(chǎn)物的純度是大約90-95面積％。為了制備消除劑，在分開(kāi)的干燥的反應(yīng)器中混合甲酸鉀(23.5g，0.28mol)，甲酸(80ml)和乙酸酐(40ml)。甲酸和乙酸酐被泵入到反應(yīng)器中，在加入乙酸酐期間保持溫度不超過(guò)40℃。加熱消除劑混合物到70℃，從反應(yīng)體系中棄除水。繼續(xù)該反應(yīng)，直到根據(jù)KarlFisher分析水含量少于0.3％重量。然后將消除劑溶液轉(zhuǎn)移到含有根據(jù)上述制備的濃縮的粗產(chǎn)物甲磺酸鹽溶液的反應(yīng)器中。得到的混合物被加熱到95℃最大溫度，收集揮發(fā)的蒸餾物直到不再產(chǎn)生蒸餾物。在大約90℃停止蒸餾。蒸餾完成后，反應(yīng)混合物在95℃又?jǐn)嚢?小時(shí)，用薄層色譜檢查反應(yīng)是否完全。當(dāng)反應(yīng)完全后，反應(yīng)器冷卻到50℃在50℃26”汞柱真空下從反應(yīng)混合物中去除甲酸和溶劑。濃縮物冷卻到室溫，然后加入乙酸乙酯(688ml)，乙酸乙酯和濃縮物的混合物攪拌15分鐘。此時(shí)，加入12％鹽水溶液(688ml)，有助于從有機(jī)相去除水可溶性雜質(zhì)。然后用20分鐘使各相分離。水相轉(zhuǎn)移到另一個(gè)容器中，向其中加入附加量的乙酸乙酯(350ml)。將水相反萃30分鐘，然后使各相分離，合并乙酸乙酯層。向合并的乙酸乙酯層加入飽和的氯化鈉溶液(600ml)，攪拌30分鐘。使各相分離。去除水相。進(jìn)行又一次氯化鈉(600ml)洗滌。從第二次余下的洗液中分離有機(jī)相。然后在攪拌下用1N氫氧化鈉(600ml)洗滌有機(jī)相30分鐘。各相靜置30分鐘，去除水相。測(cè)定水相pH，發(fā)現(xiàn)大于7。用飽和的氯化鈉(600ml)又一次洗滌15分鐘。最后在50℃26”汞柱真空下濃縮有機(jī)相，過(guò)濾回收產(chǎn)物。干燥時(shí)終產(chǎn)物是泡沫狀棕色固體。在45℃減壓下進(jìn)一步干燥24小時(shí)，得到95.4g烯酯產(chǎn)物，產(chǎn)率68.8％。校正起始羥基酯和終產(chǎn)物烯酯得摩爾產(chǎn)率是74.4％。實(shí)施例38重復(fù)實(shí)施例37的方法，除了通過(guò)用離子交換樹(shù)脂處理反應(yīng)溶液而避免了多次洗滌步驟。堿性氧化鋁或堿性二氧化硅。用堿性二氧化硅處理的條件在表38中給出。發(fā)現(xiàn)每一種處理，沒(méi)有實(shí)施例44的多次洗滌，對(duì)于去除雜質(zhì)是有效的實(shí)施例39在100ml反應(yīng)器中混合乙酸鉀(4g)和三氟乙酸(42.5ml)。以保持溫度在加入期間低于30℃的控制速度下向混合物中加入三氟乙酸酐(9.5ml)。然后將溶液加熱到30℃反應(yīng)30分鐘，得到用于將式IV甲磺酸鹽轉(zhuǎn)化成式II的烯酯的消除劑。向預(yù)先制備的式IV甲磺酸鹽溶液中加入預(yù)先形成的TFA/TFA酸酐消除劑。得到的混合物在40℃加熱4個(gè)半小時(shí)，用TLC或HPLC周期性檢查轉(zhuǎn)化程度。反應(yīng)完全后，混合物轉(zhuǎn)移到1-口燒瓶中并室溫(22℃)減壓下濃縮至干。向混合物中加入乙酸乙酯(137ml)使固相物質(zhì)完全溶解，然后加入水/鹽水混合物(137ml)，攪拌得到的兩相混合物10分鐘。使各相分離20分鐘。鹽水濃度是24％重量。水相中加入附加量的乙酸乙酯(68ml)，將這樣制備的兩相混合物攪拌10分鐘，此后使靜置15分鐘使相分離。合并兩次萃取的乙酸乙酯層并用24％重量鹽水(120ml)，另一等份24％重量鹽水(60ml)，1N氫氧化鈉溶液(150ml)和另一份鹽水(60ml)洗滌。加入各水相后，混合物攪拌10分鐘并靜置15分鐘使分離。用水吸氣器在45℃減壓下濃縮得到的溶液至干。HPLC分析固體產(chǎn)物(8.09g)，發(fā)現(xiàn)含有83.4面積％的烯酯，2.45面積％11，12-烯烴，1.5％7，9-內(nèi)酯，和1.1％未反應(yīng)的甲磺酸鹽。實(shí)施例40具有實(shí)施例23制備的結(jié)構(gòu)的甲磺酸鹽(1.0g)，乙酸異丙烯酯(10g)和對(duì)甲苯磺酸(5mg)置于50ml燒瓶中，攪拌下加熱到90℃。5小時(shí)后，混合物冷卻到25℃，在10mmHg真空下濃縮。殘余物溶解于二氯甲烷(20ml)，用5％碳酸氫鈉水溶液洗滌。真空濃縮二氯甲烷層，得到1.47g褐色油。該物質(zhì)從二氯甲烷/乙醚中重結(jié)晶，得到0.50g式IV(Z)烯醇的乙酸酯。攪拌下向預(yù)先加熱到100℃的乙酸鈉(0.12g)和乙酸(2.0ml)的混合物中加入該物質(zhì)。60分鐘后混合物冷卻到25℃，并用二氯甲烷(20ml)稀釋。溶液用水(20ml)洗滌，硫酸鎂干燥。過(guò)濾去除干燥劑，真空濃縮濾液，得到0.4g期望的9，11-烯烴，IV(Y)。粗產(chǎn)物含有少于2％的7，9-內(nèi)酯雜質(zhì)。實(shí)施例41--甲磺酸鹽在DMSO中的熱消除。燒瓶中2g甲磺酸鹽和5mlDMSO的混合物在80℃加熱22.4小時(shí)。對(duì)反應(yīng)混合物的HPLC分析表明沒(méi)有檢測(cè)到起始物。向反應(yīng)中加入水(10ml)，用二氯甲烷萃取沉淀三次。合并的二氯甲烷層用水洗滌，硫酸鎂干燥，濃縮得到烯酯。實(shí)施例42在50ml梨形燒瓶中攪拌下將式IIA(1.07g，74.4％烯酯)，三氯乙酰胺(0.32g)，作為固體的磷酸氫二鉀與二氯甲烷(15.0ml)混合。得到澄清的溶液。用移液管經(jīng)1分鐘加入過(guò)氧化氫(30％重量；5.0ml)。得到的混合物在室溫下攪拌6小時(shí)，此刻，HPLC分析表明反應(yīng)混合物中epoxymexrenone與烯酯的比是大約1∶1。向反應(yīng)混合物中加入附加的三氯乙酰胺(0.32g)，反應(yīng)在攪拌下再持續(xù)8小時(shí)，之后顯示殘留的烯酯部分減少到10％。加入附加的三氯乙酰胺(0.08g)，反應(yīng)混合物靜置過(guò)夜，此刻混合物中相對(duì)于epoxymexrenone，只保留5％未反應(yīng)烯酯。實(shí)施例43向100ml反應(yīng)器中加入式IIA烯酯(5.4g，74.4％烯酯)。向烯酯中加入固體形式的三氯乙酰胺(4.9g)，和磷酸氫二鉀(3.5g)后加入二氯甲烷(50ml)?；旌衔锢鋮s到15℃，經(jīng)10分鐘加入30％過(guò)氧化氫(25g)。使反應(yīng)混合物達(dá)20℃，并在該溫度下攪拌6小時(shí)，此刻用HPLC檢測(cè)轉(zhuǎn)化作用。測(cè)定出剩余的烯酯少于1％重量。反應(yīng)混合物加入到水中(100ml)，使各相分離，取出二氯甲烷層。向二氯甲烷層中加入氫氧化鈉(0.5N；50ml)。20分鐘后各相分離，向二氯甲烷層中加入鹽酸(0.5N；50ml)。然后各相分離，有機(jī)相用飽和的鹽水洗滌(50ml)。二氯甲烷層用無(wú)水硫酸鎂干燥并去除溶劑。得到白色固體(5.7g)。氫氧化鈉水層被酸化和萃取處理得到另外的0.2g產(chǎn)物。epoxymexrenone產(chǎn)率是90.2％。實(shí)施例44根據(jù)實(shí)施例43的方法將式IIA烯酯轉(zhuǎn)化成epoxymexrenone，有下面的不同初始加料由烯酯(5.4g，74.4％烯酯)，三氯乙酰胺(3.3g)和磷酸氫二鉀(3.5g)組成。加入過(guò)氧化氫溶液(12.5ml)。反應(yīng)在20℃進(jìn)行過(guò)夜，HPLC表明90％烯酯轉(zhuǎn)化成epoxymexrenone。加入另外的三氯乙酰胺(3.3g)和30％過(guò)氧化氫(5.0ml)，反應(yīng)又進(jìn)行6小時(shí)，此時(shí)殘留的烯酯只是烯酯加入量的2％。根據(jù)實(shí)施例43后處理后得到6.71gepoxymexrenone。實(shí)施例45根據(jù)實(shí)施例43的概述的方法將式IIA烯酯轉(zhuǎn)化成epoxymexrenone。在該實(shí)施例的反應(yīng)中，烯酯加入量是5.4g(74.4％烯酯)，三氯乙酰胺加入量是4.9g，過(guò)氧化氫加入量是25g，和磷酸氫二鉀加入量是3.5g。反應(yīng)在20℃進(jìn)行18小時(shí)，殘留的烯酯少于2％。后處理后得至5.71gepoxymexrenone。實(shí)施例46根據(jù)實(shí)施例43的描述的方法將式IIA烯酯轉(zhuǎn)化成epoxymexrenone，只是該實(shí)施例中的反應(yīng)溫度是28℃。反應(yīng)器中加入的材料包括烯酯(2.7g)，三氯乙酰胺(2.5g)，磷酸氫二鉀(1.7g)，過(guò)氧化氫(17.0g)和二氯甲烷(50ml)。反應(yīng)4小時(shí)后，未反應(yīng)的烯酯只是烯酯加入量的2％。根據(jù)實(shí)施例43后處理后得到3.0gepoxymexrenone。實(shí)施例47式IIA烯酯(17g，72％烯酯)溶解于二氯甲烷(150ml)，然后緩慢攪拌下加入三氯乙酰胺(14.9g)?；旌衔餃囟日{(diào)至25℃，400rpm攪拌下將磷酸氫二鉀(10.6g)的水(10.6ml)溶液攪拌著加入到烯酯底物溶液中。經(jīng)3-5分鐘向底物/磷酸鹽/三氯乙酰胺中加入過(guò)氧化氫(30％重量溶液；69.4ml)。發(fā)現(xiàn)沒(méi)有放熱或放出氧氣。這樣制備的反應(yīng)混合物以400rpm攪拌，在25℃反應(yīng)18.5小時(shí)。反應(yīng)期間沒(méi)有氧氣逸出。用水(69.4ml)稀釋反應(yīng)混合物，混合物在大約250rpm攪拌15分鐘。該操作不需要控制溫度，基本上在室溫下進(jìn)行(5-25℃范圍內(nèi)的任何溫度可以接受)。分離水層和有機(jī)層，取出下面的二氯甲烷層。在250rpm攪拌下用二氯甲烷(69.4ml)反萃水層15分鐘。分離水層和有機(jī)層，取出下面的二氯甲烷層。水層(177g；pH＝7)進(jìn)行過(guò)氧化氫測(cè)定。結(jié)果(12.2％)表明反應(yīng)中消耗僅僅0.0434mol過(guò)氧化氫是0.0307烯烴。用小體積二氯甲烷反萃足以保證水相中不損失epoxymexrenone。應(yīng)用第二次大量二氯甲烷萃取，其中只回收三氯乙酰胺，證明了該結(jié)果。合并來(lái)自上述萃取的合并的二氯甲烷溶液，并以250rpm用3％重量亞硫酸鈉溶液(122ml)洗滌至少15分鐘。在攪拌期終了時(shí)發(fā)現(xiàn)陰性淀粉碘化物試驗(yàn)(KI試紙；沒(méi)有發(fā)現(xiàn)顏色；陽(yáng)性試驗(yàn)中紫色表明存在過(guò)氧化物)。分離水層和有機(jī)層，取出下面的二氯甲烷層。棄除水層(pH＝6)。注意亞硫酸鈉溶液的加入引起稍微放熱，因此應(yīng)該在控制溫度下加入。二氯甲烷層用0.5N氫氧化鈉(61ml)以大約250rpm在15-25℃范圍內(nèi)洗滌45分鐘(pH＝12-13)。在該過(guò)程中去除三氯乙酰胺衍生的雜質(zhì)。酸化堿性水部分，接著用二氯甲烷萃取保證在該操作中幾乎沒(méi)有epoxymexrenone損失。二氯甲烷層用0.1N鹽酸(61ml)以250rpm攪拌在15-25℃范圍內(nèi)洗滌一次15分鐘。分離水層和有機(jī)層，取出下面的二氯甲烷層。再次用10％重量氯化鈉水溶液(61ml)以大約250rpm在15-25℃范圍內(nèi)洗滌15分鐘。分離水層和有機(jī)層，取出下面的有機(jī)層。有機(jī)層通過(guò)Solkafloc板過(guò)濾后減壓蒸發(fā)至干。用65℃水浴使干燥完全。得到米色固體(17.95g)，進(jìn)行HPLC分析。測(cè)得epoxymexrenone是93.1％。產(chǎn)物溶解于熱的甲基乙基酮(189ml)，常壓蒸餾得到的溶液直到去除95ml酮溶劑。使溫度降至50℃，產(chǎn)物結(jié)晶，在50℃繼續(xù)攪拌1小時(shí)。然后使溫度降至20-25℃，又繼續(xù)攪拌2小時(shí)。過(guò)濾固體并用MEK洗滌(24ml)，固體干燥到恒重9.98g，HPLC分析含有93.63％epoxymexrenone。該產(chǎn)物再次溶解于熱的MEK(106ml)，壓力下熱溶液通過(guò)10微米在線(xiàn)過(guò)濾器過(guò)濾。加入又18mlMEK淋洗，常壓蒸餾過(guò)濾的MEK溶液，直到去除53ml溶劑。使溫度降至50℃，產(chǎn)物結(jié)晶，在50℃繼續(xù)攪拌1小時(shí)。然后使溫度降至20-25℃，在該溫度下反應(yīng)，同時(shí)繼續(xù)攪拌2小時(shí)。過(guò)濾固體產(chǎn)物并用MEK淋洗(18ml)。固體產(chǎn)物干燥至恒重8.32g，定量HPLC分析其含有99.6％epoxymexrenone。干燥時(shí)的最終損失少于1.0％。根據(jù)該實(shí)施例的反應(yīng)和后處理，epoxymexrenone總的產(chǎn)率是65.8％。該總產(chǎn)率反映出93％反應(yīng)產(chǎn)率，78.9％初始結(jié)晶收率和89.5％重結(jié)晶收率。實(shí)施例48--使用甲苯的式IIA的環(huán)氧化作用根據(jù)實(shí)施例46概述的方法將式IIA烯酯轉(zhuǎn)化成eplerenone，除了使用甲苯為溶劑。反應(yīng)器中加入的材料包括烯酯(2.7g)，三氯乙酰胺(2.5g)，磷酸氫二鉀(1.7g)，過(guò)氧化氫(17.0g)和甲苯(50ml)。反應(yīng)放熱到28℃，反應(yīng)4小時(shí)完成，得到的三相混合物冷卻到15℃，過(guò)濾，用水洗滌，真空干燥，得到2.5g產(chǎn)物。實(shí)施例49--9，11-二烯酮的環(huán)氧化作用在1L3-口燒瓶中，稱(chēng)之為XVIIA的化合物(化合物XVII，其中-A-A-和-B-B-兩者是-CH2-CH2-)(40.67g)溶解于二氯甲烷(250ml)，冰鹽混合物外部冷卻。加入磷酸二鉀(22.5g)和三氯乙腈(83.5g)，混合物冷卻到2℃，然后經(jīng)1小時(shí)緩慢加入30％過(guò)氧化氫(200g)。反應(yīng)混合物在12℃攪拌8小時(shí)，在室溫下攪拌14小時(shí)。取出一滴有機(jī)物，測(cè)定是否含有起始烯酮，發(fā)現(xiàn)少于0.5％。加入水(400ml)，攪拌15分鐘，分離各相。有機(jī)相連續(xù)用200ml碘化鉀(10％)，200ml硫代硫酸鈉(10％)，和100ml飽和的碳酸氫鈉溶液洗滌，每次分離各相。有機(jī)層用無(wú)水硫酸鎂干燥并濃縮，得到粗環(huán)氧化物(41g)。產(chǎn)物從乙酸乙酯∶二氯甲烷中結(jié)晶，得到14.9g純產(chǎn)物。實(shí)施例50--使用間-氯代過(guò)苯甲酸的化合物XVIIA的環(huán)氧化作用化合物XVIIA(18.0g)溶解于250ml二氯甲烷并冷卻到10℃。攪拌下在15分鐘內(nèi)加入固體間-氯代過(guò)苯甲酸(50-60％純度，21.86g)。發(fā)現(xiàn)沒(méi)有溫度提高。反應(yīng)混合物攪拌3小時(shí)，檢測(cè)是否存在二烯酮。反應(yīng)混合物依次用亞硫酸鈉(10％)，氫氧化鈉溶液(0.5N)，鹽酸溶液(5％)和最后用50ml飽和的鹽水溶液處理。用無(wú)水硫酸鎂干燥后蒸發(fā)，得到17.64g環(huán)氧化物，直接用于下面的步驟。發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物包含Baeyer-Villiger氧化產(chǎn)物，通過(guò)從乙酸乙酯研制后從二氯甲烷中重結(jié)晶將其去除。在500g規(guī)模下，將沉淀的間-氯代苯甲酸過(guò)濾后常規(guī)后處理。實(shí)施例51--使用三氯乙酰胺的化合物XVIIA的環(huán)氧化作用化合物XVIIA(2g)溶解于25ml二氯甲烷。加入三氯乙酰胺(2g)，磷酸二鉀(2g)。室溫?cái)嚢柘录尤?0％過(guò)氧化氫(10ml)，繼續(xù)攪拌18小時(shí)，得到環(huán)氧化物(1.63g)。沒(méi)有生成Baeyer-Villiger產(chǎn)物。實(shí)施例52室溫下向2000ml燒瓶中加入氫氧化鉀(56.39g，1005.03mmol；3.00當(dāng)量)，與二甲亞砜(750.0ml)混合成漿液。向燒瓶中與THF(956.0ml)一起加入相應(yīng)于式XX的三烯酮(其中R3是氫，A-A-和-B-B-兩者是-CH2-CH2-)(100.00g；335.01mmol；1.00當(dāng)量)。向燒瓶中加入甲基硫酸三甲基硫鎓鹽(126.14g；670.02mmol；2.00當(dāng)量)。得到的混合物在80-85℃加熱回流1小時(shí)。用HPLC檢查向17-螺氧亞甲基的轉(zhuǎn)化作用。真空下從反應(yīng)混合物中去除大約1LTHF，然后在30分鐘內(nèi)加入水(460ml)，同時(shí)反應(yīng)混合物冷卻到15℃。過(guò)濾得到的混合物。固體環(huán)氧乙烷產(chǎn)物用200ml等份水洗滌兩次。發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物高度結(jié)晶，容易進(jìn)行過(guò)濾。然后產(chǎn)物在40℃真空下干燥，分離得到104.6g3-甲基烯醇醚Δ-5，6，9，11，-17-環(huán)氧甾類(lèi)化合物產(chǎn)物。實(shí)施例53氮?dú)鈱酉孪蚋稍锏?00ml反應(yīng)器中加入乙醇鈉(41.94g；616.25mmol；1.90當(dāng)量)。向反應(yīng)器中加入乙醇(270.9ml)，將甲醇鈉在乙醇中制成漿液。向漿液中加入丙二酸二乙酯(103.90g；648.68mmol；2.00當(dāng)量)，之后加入用實(shí)施例52描述的方法制備的環(huán)氧甾類(lèi)化合物(104.60g；324.34mmol；1.00當(dāng)量)，得到的混合物加熱回流，即80-85℃。加熱繼續(xù)4小時(shí)，然后用HPLC檢查反應(yīng)的完全程度。經(jīng)30分鐘向反應(yīng)混合物加入水(337.86ml)，同時(shí)將混合物冷卻到15℃。繼續(xù)攪拌30分鐘，然后將反應(yīng)漿液過(guò)濾，得到含有細(xì)孔粉末的濾餅。濾餅用水(每次200ml)洗滌兩次，然后室溫真空下干燥。分離得到133.8g3-甲基-烯醇醚-Δ-5，6，9，11，-17-螺內(nèi)酯-21-甲氧羰基中間體。實(shí)施例54與氯化鈉(27.50g；470.52mmol；1.5當(dāng)量)二甲基甲酰胺(709ml)一起向反應(yīng)器中加入實(shí)施例53制備的3-甲基-烯醇醚-Δ-5，6，9，11，-17-螺內(nèi)酯-21-甲氧羰基中間體(式XVIII，其中R3是氫，A-A-和-B-B-兩者是-CH2-CH2-，133.80g，313.68mmol；1.00當(dāng)量)，并且攪拌下向2000ml反應(yīng)器中加入水(5ml)。得到的混合物在138-142℃加熱回流3小時(shí)。然后用HPLC檢查反應(yīng)混合物的完全程度。然后在30分鐘內(nèi)向混合物中加入水，同時(shí)反應(yīng)混合物冷卻到15℃。攪拌繼續(xù)30分鐘，反應(yīng)漿液過(guò)濾后回收無(wú)定形固體反應(yīng)產(chǎn)物，為濾餅。濾餅用200ml等份水洗滌兩次后干燥。得到91.6g(82.3％產(chǎn)率；96面積％)產(chǎn)物3-甲基烯醇醚-17-螺內(nèi)酯。實(shí)施例55向2000ml反應(yīng)器中加入根據(jù)實(shí)施例54制備的烯醇醚(91.60g，258.36mmol；1.00當(dāng)量)，乙醇(250ml)，乙酸(250ml)，和水(250ml)，得到的漿液加入到回流2小時(shí)。在30分鐘內(nèi)向混合物中加入水(600ml)，同時(shí)反應(yīng)混合物冷卻到15℃。過(guò)濾反應(yīng)漿液，濾餅用水洗滌兩次(每次200ml等份)。然后干燥濾餅；分離得到84.4g產(chǎn)物3-酮Δ4，5，9，11，-17-螺內(nèi)酯(化合物XVII，其中R3是氫，A-A-和-B-B-兩者是-CH2-CH2-；產(chǎn)率95.9％)。實(shí)施例56向22L4-口燒瓶中與四氯化碳(3.2L)一起加入化合物XVIIA(1kg，2.81摩爾)。向混合物中加入N-溴代琥珀酰胺(538g)后加入乙腈(3.2L)。得到的混合物加熱至回流并保持在68℃回流溫度下反應(yīng)大約3小時(shí)，產(chǎn)生澄清的橙色溶液。加熱5小時(shí)后，溶液變暗。加熱6小時(shí)后移去熱源，對(duì)反應(yīng)混合物取樣。真空去除溶劑，向底部殘余物中加入乙酸乙酯(6L)。攪拌得到的混合物，然后加入5％碳酸氫鈉溶液(4L)，將混合物攪拌15分鐘，后使相分離。取出水層，向混合物中加入飽和的鹽水溶液(4L)，然后攪拌15分鐘。再使相分離，真空去除有機(jī)層，得到粘稠的漿液。然后加入二甲基甲酰胺(4L)，繼續(xù)去除至55℃。使靜止的底部靜置過(guò)夜，并加入DABCO(330g)和溴化鋰(243g)。然后將混合物加熱到70℃。加熱1.5小時(shí)后，取出液相色譜樣品，加熱3.50小時(shí)后，加入另外的DABCO(40g)。加熱4.5小時(shí)后，加入水(4L)，得到的混合物冷卻到15℃。過(guò)濾漿液，濾餅用水(3L)洗滌，并學(xué)過(guò)濾器上干燥過(guò)夜。將濕的濾餅(978g)放回到22L燒瓶中并加入二甲基甲酰胺(7L)。將這樣制備的混合物加熱到105℃，在此點(diǎn)，濾餅完全溶解于溶液。停止加熱，攪拌燒瓶中的混合物并冷卻。向反應(yīng)器加套中加入冰水，反應(yīng)器中的混合物冷卻到14℃并保持2小時(shí)。得到的漿液過(guò)濾并用2.5L等份的水洗滌兩次。濾餅在真空下干燥過(guò)夜。得到510g淺棕色固體產(chǎn)物。實(shí)施例57向2L四口燒瓶中加入實(shí)施例49，50或51的產(chǎn)物9，11-環(huán)氧烯睪丙內(nèi)酯(100.00g；282.1mmol；1.00當(dāng)量)，二甲基甲酰胺(650.0ml)，氯化鋰(30.00g；707.7mmol；2.51當(dāng)量)，和丙酮氰醇(72.04g；77.3ml；846.4mmol；3.00當(dāng)量)。機(jī)械攪拌得到的懸浮液，并用四甲基胍(45.49g；49.6ml；395.0mmol；1.40當(dāng)量)處理。過(guò)濾該體系，使用水冷凝器和干冰冷凝器(裝入干冰丙酮溶液)防止HCN逸出。干冰冷凝器的通風(fēng)線(xiàn)通過(guò)裝有大大過(guò)量氯氣漂白劑的洗氣器?；旌衔锛訜岬?0℃。18小時(shí)后，得到暗紅棕色溶液，其在攪拌下冷卻到室溫。冷卻期間向溶液中通入氮?dú)?，以去除殘留的HCN，通風(fēng)線(xiàn)通過(guò)阱中的漂白劑。2小時(shí)后，用乙酸(72g)處理溶液并攪拌30分鐘。然后攪拌下將粗混合物倒入冰水(2L)。攪拌的懸浮液進(jìn)一步用10％鹽酸水溶液(400ml)處理并攪拌1小時(shí)。然后過(guò)濾混合物，得到暗磚紅色固體(73g)。濾液置于4L分液漏斗中，并用二氯甲烷(3×800ml)萃?。缓喜⒂袡C(jī)層，并用水反萃(2×2L)。真空濃縮二氯甲烷溶液，得到61g暗紅色油狀物。水洗級(jí)分放置過(guò)夜后，出現(xiàn)大量沉淀。過(guò)濾收集沉淀，測(cè)定為純產(chǎn)物烯胺(14.8g)。干燥原紅色固體(73g)后進(jìn)行HPLC分析，測(cè)得主要成分是9，11-環(huán)氧烯胺。進(jìn)一步HPLC分析表明烯胺是二氯甲烷后處理得到的紅色油狀物的主要成分。烯胺摩爾產(chǎn)率計(jì)算值是46％。實(shí)施例58向1000ml圓底燒瓶中加入根據(jù)實(shí)施例57制備的9，11-環(huán)氧烯胺(4.600g；0.011261mol；1.00當(dāng)量)。向混合物中加入甲醇(300ml)和0.5％重量鹽酸水溶液(192ml)，然后回流17小時(shí)。然后真空去除甲醇，將物質(zhì)的量在蒸餾瓶中減少到50ml，形成白色沉淀。向漿液中加入水(100ml)后過(guò)濾，得到白色濾餅，用水洗滌三次。固體9，11-環(huán)氧二酮產(chǎn)物產(chǎn)率是3.747g(81.3％)。實(shí)施例59將根據(jù)實(shí)施例58制備的環(huán)氧二酮(200mg；0.49mmol)懸浮于甲醇(3ml)中，向混合物加入1，8-二氮雜雙環(huán)[5.4.0]十一-7-烯(DBU)?；亓骷訜?4小時(shí)，混合物變均勻。然后在30℃在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮至干，殘余物分配在二氯甲烷和3.0N鹽酸中。濃縮有機(jī)相得到黃色固體(193mg)，測(cè)得其是22％重量epoxymexrenone。產(chǎn)率20％。實(shí)施例60向懸浮于1.5ml甲醇中的100mg二酮中加入10毫升(0.18當(dāng)量)25％(w/w)甲醇鈉的甲醇溶液。將溶液加熱回流。30分鐘后，沒(méi)有剩下二酮，存在5-氰基酯。向混合物中加入46毫升25％(w/w)甲醇鈉的甲醇溶液?；旌衔镌诨亓飨录訜?3小時(shí)，根據(jù)HPLC分析，此時(shí)主要產(chǎn)物是eplerenone。實(shí)施例61向懸浮于30ml無(wú)水甲醇的2g二酮中加入0.34ml三乙胺。懸浮液在回流下加熱4.5小時(shí)。混合物在25℃攪拌16小時(shí)。過(guò)濾得到的懸浮液，得到1.3g5-氰基酯，為白色固體。向懸浮于80ml甲醇的6.6g二酮中加入2.8ml三乙胺?；旌衔镌诨亓飨录訜?小時(shí)，并在25x攪拌88小時(shí)，此間產(chǎn)物從溶液中結(jié)晶出來(lái)。過(guò)濾后用甲醇洗滌得到5.8g氰基酯，為白色固體。從氯仿/甲醇中重結(jié)晶，得到3.1g結(jié)晶產(chǎn)物，HPLC測(cè)定其是均勻的。由此可見(jiàn)，實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的目的，也獲得了其它有益結(jié)果。只要不脫離本發(fā)明范圍對(duì)上述組合物和方法可以進(jìn)行各種各樣的改變，上述描述中涉及的所有內(nèi)容和附圖所示內(nèi)容只是為了詳細(xì)說(shuō)明而不是為了限制本發(fā)明。權(quán)利要求1.一種制備式II化合物的方法其中-A-A-代表基團(tuán)-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，R3，R4和R5各自獨(dú)立地選自氫，鹵素，羥基，低級(jí)烷基，低級(jí)烷氧基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，氰基，芳基氧基，R1代表α-取向的低級(jí)烷氧羰基或羥基羰基殘基，-B-B-代表基團(tuán)-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基團(tuán)其中R6和R7各自獨(dú)立地選自氫，鹵素，低級(jí)烷氧基，?；u基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，酰氧基烷基，氰基，芳基氧基，和R8和R9各自獨(dú)立地選自氫，鹵素，低級(jí)烷氧基，?；?，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，酰氧基烷基，氰基，芳基氧基，或者R8和R9一起構(gòu)成一個(gè)碳環(huán)或雜環(huán)結(jié)構(gòu)，或者R8或R9與R6或R7一起構(gòu)成一個(gè)與五元環(huán)D環(huán)稠合的碳環(huán)或雜環(huán)結(jié)構(gòu)，該方法包括從式IV化合物去除11α-離去基團(tuán)其中-A-A-，R1，R3，-B-B-，R8和R9如上定義，和R2是離去基團(tuán)，它的除去有效地在9-和11-碳原子之間產(chǎn)生雙鍵。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述式II化合物相應(yīng)于式IIA其中-A-A-代表基團(tuán)-CH2-CH2-或-CH＝CH-，-B-B-代表基團(tuán)-CH2-CH2-或α-取向或β-取向的式IIIA基團(tuán)R1代表α-取向的低級(jí)烷氧羰基，X代表兩個(gè)氫原子或氧代基團(tuán)，Y1和Y2一起代表氧橋-O-，或Y1代表羥基，和Y2代表羥基，低級(jí)烷氧基，或者，如果X代表H2，則也可以代表低級(jí)烷酰氧基，和其中X代表氧代基團(tuán)及Y2代表羥基的化合物的鹽，該方法包括使含有一種低級(jí)鏈烷酸和一種低級(jí)鏈烷酸的鹽的溶液與相應(yīng)于式IVA的化合物接觸其中-A-A-，R1，-B-B-，X，Y1和Y2如式IIA所定義，和R2是低級(jí)烷基磺?；趸蝓；趸?。3.權(quán)利要求1的方法，其中所述式IV化合物是17α-羥基-11α-(甲基磺?；?氧基-3-氧代孕甾-4-烯-7α，21-二羧酸氫甲酯，γ-內(nèi)酯，所述式II化合物是17α-羥基-3-氧代孕甾-4，9(11)-二烯-7α，21-二羧酸氫甲酯，γ-內(nèi)酯。4.一種制備式IV化合物的方法其中-A-A-代表基團(tuán)-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，R3，R4和R5各自獨(dú)立地選自氫，鹵素，羥基，低級(jí)烷基，低級(jí)烷氧基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，氰基，芳基氧基，R1代表α-取向的低級(jí)烷氧羰基或羥基羰基殘基，-B-B-代表基團(tuán)-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基團(tuán)其中R6和R7各自獨(dú)立地選自氫，鹵素，低級(jí)烷氧基，?；?，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，酰氧基烷基，氰基，芳基氧基，和R8和R9各自獨(dú)立地選自氫，鹵素，低級(jí)烷氧基，?；?，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，酰氧基烷基，氰基，芳基氧基，或者R8和R9一起構(gòu)成一個(gè)碳環(huán)或雜環(huán)結(jié)構(gòu)，或者R8或R9與R6或R7一起構(gòu)成一個(gè)與五元環(huán)D環(huán)稠合的碳環(huán)或雜環(huán)結(jié)構(gòu)，和R2是低級(jí)烷基磺?；趸蝓；趸螓u素，該方法包括使低級(jí)烷基磺?；噭┗蝓；噭┗虍a(chǎn)生鹵素的試劑，例如亞硫酰鹵，磺酰鹵，或草酰鹵與式V化合物反應(yīng)其中-A-A-，R1，R3，-B-B-，R8和R9如上定義。5.權(quán)利要求4的方法，其中所述式IV化合物相應(yīng)于式IVA其中-A-A-代表基團(tuán)-CH2-CH2-或-CH＝CH-，R1代表α-取向的低級(jí)烷氧羰基，R2代表低級(jí)烷基磺?；趸蝓；趸?，-B-B-代表基團(tuán)-CH2-CH2-或α-取向或β-取向的式IIIA基團(tuán)X代表兩個(gè)氫原子或氧代基團(tuán)，Y1和Y2一起代表氧橋-O-，或Y1代表羥基，和Y2代表羥基，低級(jí)烷氧基，或者，如果X代表H2，則也可以代表低級(jí)烷酰氧基，和其中X代表氧代基團(tuán)及Y2代表羥基的化合物的鹽，該方法包括在一種鹵化氫清除劑存在下使一種低級(jí)烷基磺酰鹵或酰鹵與相應(yīng)于式VA的化合物反應(yīng)其中-A-A-，R1，-B-B-，X，Y1和Y2如式IVA所定義。6.權(quán)利要求4的方法，其中所述式IV化合物是17α-羥基-11α-(甲基磺酰基)氧基-3-氧代孕甾-4-烯-7α，21-二羧酸氫甲酯，γ-內(nèi)酯，所述式V化合物是11α，17α-二羥基-3-氧代孕甾-4-烯-7α，21-二羧酸氫甲酯，γ-內(nèi)酯。7.一種制備式V化合物的方法其中-A-A-代表基團(tuán)-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，R3，R4和R5各自獨(dú)立地選自氫，鹵素，羥基，低級(jí)烷基，低級(jí)烷氧基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，氰基，芳基氧基，R1代表α-取向的低級(jí)烷氧羰基或羥基羰基殘基，-B-B-代表基團(tuán)-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基團(tuán)其中R6和R7各自獨(dú)立地選自氫，鹵素，低級(jí)烷氧基，酰基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，酰氧基烷基，氰基，芳基氧基，和R8和R9各自獨(dú)立地選自氫，鹵素，低級(jí)烷氧基，酰基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，酰氧基烷基，氰基，芳基氧基，或者R8和R9一起構(gòu)成一個(gè)碳環(huán)或雜環(huán)結(jié)構(gòu)，或者R8或R9與R6或R7一起構(gòu)成一個(gè)與五元環(huán)D環(huán)稠合的碳環(huán)或雜環(huán)結(jié)構(gòu)，該方法包括使式VI化合物與相應(yīng)于式R10OM的堿金屬烷氧化物反應(yīng)，其中M是堿金屬，R10O-相應(yīng)于R1的烷氧基取代基，所述式VI化合物具有下面的結(jié)構(gòu)其中-A-A-，R3，-B-B-，R8和R9如上定義。8.權(quán)利要求7的方法，其中所述式V化合物相應(yīng)于式VA其中-A-A-代表基團(tuán)-CH2-CH2-或-CH＝CH-，R1代表α-取向的低級(jí)烷氧羰基，-B-B-代表基團(tuán)-CH2-CH2-或α-取向或β-取向的式IIIA基團(tuán)X代表兩個(gè)氫原子或氧代基團(tuán)，Y1和Y2一起代表氧橋-O-，或Y1代表羥基，和Y2代表羥基，低級(jí)烷氧基，或者，如果X代表H2，則也可以代表低級(jí)烷酰氧基，和其中X代表氧代基團(tuán)及Y2代表羥基的化合物的鹽，該方法包括在一種具有式R10OH的醇存在下使式VIA化合物與相應(yīng)于式R10OM的堿金屬烷氧化物反應(yīng)，其中M是堿金屬，R10O-相應(yīng)于R1的烷氧基取代基，所述式VIA化合物具有下面的結(jié)構(gòu)其中-A-A-，-B-B-，Y1，Y2和X如式VA所定義。9.權(quán)利要求7的方法，其中所述式V化合物是11α，17α-二羥基-3-氧代孕甾-4-烯-7α，21-二羧酸氫甲酯，γ-內(nèi)酯，式VI化合物是4’S(4’α)，7’α-十六氫-11’α-羥基-10’β，13’β-二甲基-3’，5，20’-三氧代螺[呋喃-2(3H)，17’β-[4，7]亞甲基[17H]環(huán)戊[a]菲]-5’β(2’H)-腈。10.權(quán)利要求7的方法，其中氰化物離子是作為反應(yīng)的副產(chǎn)物生成的，該方法進(jìn)一步包括在反應(yīng)過(guò)程中從反應(yīng)區(qū)去除氰化物離子，以減少氰化物離子與式V產(chǎn)物反應(yīng)的程度。11.權(quán)利要求10的方法，其中通過(guò)用沉淀劑沉淀來(lái)從反應(yīng)中去除氰化物離子。12.權(quán)利要求11的方法，其中所述反應(yīng)在一種溶劑基質(zhì)中進(jìn)行，所述沉淀劑包括一種鹽，該鹽包括生成在所述基質(zhì)中的溶解度比其中沉淀劑的溶解度低的低溶解度氰化物的陽(yáng)離子。13.權(quán)利要求12的方法，其中所述陽(yáng)離子選自堿土金屬離子和過(guò)渡金屬離子。14.一種制備式VI化合物的方法其中-A-A-代表基團(tuán)-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，R3，R4和R5各自獨(dú)立地選自氫，鹵素，羥基，低級(jí)烷基，低級(jí)烷氧基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，氰基，芳基氧基，-B-B-代表基團(tuán)-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基團(tuán)其中R6和R7各自獨(dú)立地選自氫，鹵素，低級(jí)烷氧基，?；u基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，酰氧基烷基，氰基，芳基氧基，和R8和R9各自獨(dú)立地選自氫，鹵素，低級(jí)烷氧基，?；u基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，酰氧基烷基，氰基，芳基氧基，或者R8和R9一起構(gòu)成一個(gè)碳環(huán)或雜環(huán)結(jié)構(gòu)，或者R8或R9與R6或R7一起構(gòu)成一個(gè)與五元環(huán)D環(huán)稠合的碳環(huán)或雜環(huán)結(jié)構(gòu)，該方法包括水解相應(yīng)于式VII的化合物其中-A-A-，R3，-B-B-，R8和R9如上定義。15.權(quán)利要求14的方法，其中所述式VI化合物相應(yīng)于式VIA其中-A-A-代表基團(tuán)-CH2-CH2-或-CH＝CH-，-B-B-代表基團(tuán)-CH2-CH2-或α-取向或β-取向的式IIIA基團(tuán)X代表兩個(gè)氫原子或氧代基團(tuán)，Y1和Y2一起代表氧橋-O-，或Y1代表羥基，和Y2代表羥基，低級(jí)烷氧基，或者，如果X代表H2，則也可以代表低級(jí)烷酰氧基，和其中X代表氧代基團(tuán)及Y2代表羥基的化合物的鹽，該方法包括在一種酸和一種有機(jī)溶劑和/或水的存在下，水解式VIIA化合物，所述式VIIA化合物具有下面的結(jié)構(gòu)其中-A-A-，-B-B-，Y1，Y2和X如式VIA所定義。16.權(quán)利要求14的方法，其中所述式VI化合物是4’S(4’α)，7’α-十六氫-11’α-羥基-10’β，13’β-二甲基-3’，5，20’-三氧代螺[呋喃-2(3H)，17’β-[4，7]亞甲基[17H]環(huán)戊[a]菲]-5’β(2’H)-腈，所述式VII化合物是5’R(5’α)，7’β-20’-氨基十六氫-11’β-羥基-10’α，13’α-二甲基-3’，5，-二氧代螺[呋喃-2(3H)，17’α(5’H)-[7，4]亞甲基[4H]環(huán)戊[a]菲]-5’-腈。17.一種制備式VII化合物的方法其中-A-A-代表基團(tuán)-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，R3，R4和R5各自獨(dú)立地選自氫，鹵素，羥基，低級(jí)烷基，低級(jí)烷氧基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，氰基，芳基氧基，-B-B-代表基團(tuán)-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基團(tuán)其中R6和R7各自獨(dú)立地選自氫，鹵素，低級(jí)烷氧基，?；u基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，酰氧基烷基，氰基，芳基氧基，和R8和R9各自獨(dú)立地選自氫，鹵素，低級(jí)烷氧基，?；?，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，酰氧基烷基，氰基，芳基氧基，或者R8和R9一起構(gòu)成一個(gè)碳環(huán)或雜環(huán)結(jié)構(gòu)，或者R8或R9與R6或R7一起構(gòu)成一個(gè)與五元環(huán)D環(huán)稠合的碳環(huán)或雜環(huán)結(jié)構(gòu)，該方法包括在一種堿金屬鹽的存在下，使式VIII化合物與氰化物離子源反應(yīng)，所述式VIII化合物具有下面的結(jié)構(gòu)其中-A-A-，R3，-B-B-，R8和R9如上定義。18.權(quán)利要求17的方法，其中所述式VII化合物相應(yīng)于式VIIA其中-A-A-代表基團(tuán)-CH2-CH2-或-CH＝CH-，-B-B-代表基團(tuán)-CH2-CH2-或α-取向或β-取向的式IIIA基團(tuán)X代表兩個(gè)氫原子或氧代基團(tuán)，Y1和Y2一起代表氧橋-O-，或Y1代表羥基，和Y2代表羥基，低級(jí)烷氧基，或者，如果X代表H2，則也可以代表低級(jí)烷酰氧基，和其中X代表氧代基團(tuán)及Y2代表羥基的化合物的鹽，該方法包括在一種堿的存在下，在氯化鋰的存在下，使氰化物源例如酮基氰醇與一種相應(yīng)于下式的11α-羥基化合物反應(yīng)其中-A-A-，-B-B-，Y1，Y2和X如式VIIA所定義。19.權(quán)利要求17的方法，其中所述式VII化合物是5’R(5’α)，7’β-20’-氨基十六氫-11’β-羥基-10’α，13’α-二甲基-3’，5，-二氧代螺[呋喃-2(3H)，17’α(5’H)-[7，4]亞甲基[4H]環(huán)戊[a]菲]-5’-腈，和所述式VIII化合物是11α，17α-二羥基-3-氧代孕甾-4，6-二烯-21-羧酸，γ-內(nèi)酯。20.權(quán)利要求17的方法，其中所述氰化物離子源包括堿金屬氰化物，所述式VIII化合物與氰化物離子之間的反應(yīng)在一種酸和水的存在下進(jìn)行。21.一種制備式VIII化合物的方法其中-A-A-代表基團(tuán)-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，R3，R4和R5各自獨(dú)立地選自氫，鹵素，羥基，低級(jí)烷基，低級(jí)烷氧基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，氰基，芳基氧基，-B-B-代表基團(tuán)-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基團(tuán)其中R6和R7各自獨(dú)立地選自氫，鹵素，低級(jí)烷氧基，?；u基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，酰氧基烷基，氰基，芳基氧基，和R8和R9各自獨(dú)立地選自氫，鹵素，低級(jí)烷氧基，?；?，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，酰氧基烷基，氰基，芳基氧基，或者R8和R9一起構(gòu)成一個(gè)碳環(huán)或雜環(huán)結(jié)構(gòu)，或者R8或R9與R6或R7一起構(gòu)成一個(gè)與五元環(huán)D環(huán)稠合的碳環(huán)或雜環(huán)結(jié)構(gòu)，該方法包括在一種對(duì)于向所述底物以α-取向引入11-羥基有效的微生物的存在下，通過(guò)發(fā)酵氧化相應(yīng)于式X的底物化合物，所述底物具有下面的結(jié)構(gòu)其中-A-A-，R1，R3，-B-B-，R8和R9如上定義。22.權(quán)利要求21的方法，其中所述式VIII化合物是11α，17α-二羥基-3-氧代孕甾-4，6-二烯-21-羧酸，γ-內(nèi)酯。23.一種制備相應(yīng)于下式mexrenone衍生物的方法其中-A-A-代表基團(tuán)-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，R3，R4和R5各自獨(dú)立地選自氫，鹵素，羥基，低級(jí)烷基，低級(jí)烷氧基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，氰基，芳基氧基，R1代表α-取向的低級(jí)烷氧羰基或羥基羰基殘基，-B-B-代表基團(tuán)-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基團(tuán)其中R6和R7各自獨(dú)立地選自氫，鹵素，低級(jí)烷氧基，?；u基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，酰氧基烷基，氰基，芳基氧基，該方法包括使式XIV化合物與相應(yīng)于式R10OM的堿金屬烷氧化物反應(yīng)，其中M是堿金屬，R10O-相應(yīng)于R1的烷氧基取代基，所述式XIV化合物具有下面的結(jié)構(gòu)其中-A-A-，R3，和-B-B-如上所定義。24.權(quán)利要求23的方法，其中所述式XIV化合物是4’S(4’α)，7’α-1’，2’，3’，4，4’，5，5’，6’，7’，8’，10’，12’，13’，14’，15’，16’-十六氫-10β，13’β-二甲基-3’，5，20’-三氧代螺[呋喃-2(3H)，17’β-[4，7]亞甲基[17H]環(huán)戊[a]菲]-5’-腈。25.一種制備式XIV化合物的方法其中-A-A-代表基團(tuán)-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，R3，R4和R5各自獨(dú)立地選自氫，鹵素，羥基，低級(jí)烷基，低級(jí)烷氧基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，氰基，芳基氧基，-B-B-代表基團(tuán)-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基團(tuán)其中R6和R7各自獨(dú)立地選自氫，鹵素，低級(jí)烷氧基，?；?，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，酰氧基烷基，氰基，芳基氧基，該方法包括水解相應(yīng)于式XV的化合物其中-A-A-，R3，和-B-B-如上所定義。26.權(quán)利要求25的方法，其中所述式XIV化合物是4’S(4’α)，7’α-1’，2’，3’，4，4’，5，5’，6’，7’，8’，10’，12’，13’，14’，15’，16’-十六氫-10β，13’β-二甲基-3’，5，20’-三氧代螺[呋喃-2(3H)，17’β-[4，7]亞甲基[17H]環(huán)戊[a]菲]-5’-腈，和所述式XV的化合物是5’R(5’α)，7’β-20’-氨基-1’，2’，3’，4，5，6’，7’，8’，10’，12’，13’，14’，15’，16’-十四氫-10’α，13’α-二甲基-3’，5，-二氧代螺[呋喃-2(3H)，17’α[5’H]-[7，4]亞甲基[4H]環(huán)戊[a]菲]-5’-腈。27.一種制備相應(yīng)于式XV化合物的方法其中-A-A-代表基團(tuán)-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，R3，R4和R5各自獨(dú)立地選自氫，鹵素，羥基，低級(jí)烷基，低級(jí)烷氧基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，氰基，芳基氧基，-B-B-代表基團(tuán)-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基團(tuán)其中R6和R7各自獨(dú)立地選自氫，鹵素，低級(jí)烷氧基，酰基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，酰氧基烷基，氰基，芳基氧基，該方法包括在一種堿金屬鹽存在下，使式XVI化合物與氰化物離子源反應(yīng)，所述式XVI化合物具有下面的結(jié)構(gòu)其中-A-A-，R3，和-B-B-如上定義。28.權(quán)利要求27的方法，其中所述式XV化合物是9α，17α-二羥基-3-氧代孕甾-4-烯-7α，21-二羧酸氫甲酯，γ-內(nèi)酯。29.一種制備相應(yīng)于下式化合物的方法其中-A-A-代表基團(tuán)-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，R3，R4和R5各自獨(dú)立地選自氫，鹵素，羥基，低級(jí)烷基，低級(jí)烷氧基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，氰基，芳基氧基，R1代表α-取向的低級(jí)烷氧羰基或羥基羰基殘基，-B-B-代表基團(tuán)-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基團(tuán)其中R6和R7各自獨(dú)立地選自氫，鹵素，低級(jí)烷氧基，?；?，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，酰氧基烷基，氰基，芳基氧基，該方法包括使式XXI化合物與相應(yīng)于式R10OM的堿金屬烷氧化物反應(yīng)，其中M是堿金屬，R10O-相應(yīng)于R1的烷氧基取代基，所述式XXI化合物具有下面的結(jié)構(gòu)其中-A-A-，R1，R3，和-B-B-如上所定義。30.權(quán)利要求29的方法，其中所述式XXI化合物是4’S(4’α)，7’α-9’，11α-環(huán)氧十六氫-10β-，13’β-二甲基-3’，5，20’-三氧代螺[呋喃-2(3H)，17’β-[4，7]亞甲基[17H]環(huán)戊[a]菲]-5’-腈。31.一種制備相應(yīng)于式XXI化合物的方法其中-A-A-代表基團(tuán)-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，R3，R4和R5各自獨(dú)立地選自氫，鹵素，羥基，低級(jí)烷基，低級(jí)烷氧基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，氰基，芳基氧基，-B-B-代表基團(tuán)-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基團(tuán)其中R6和R7各自獨(dú)立地選自氫，鹵素，低級(jí)烷氧基，?；?，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，酰氧基烷基，氰基，芳基氧基，該方法包括水解相應(yīng)于式XXII的化合物其中-A-A-，R3，和-B-B-如上所定義。32.權(quán)利要求31的方法，其中所述式XXI化合物是4’S(4’α)，7’α-9’，11α-環(huán)氧十六氫-10β-，13’β-二甲基-3’，5，20’-三氧代螺[呋喃-2(3H)，17’β-[4，7]亞甲基[17H]環(huán)戊[a]菲]-5’-腈，和所述式XXII的化合物是5’R(5’α)，7’β-20’-氨基-9，11β-環(huán)氧十六氫-10’，13’-二甲基-3’，5，-二氧代螺[呋喃-2(3H)，17’α(5’H)-[7，4]亞甲基[4H]環(huán)戊[a]菲]-5’-腈。33.一種制備相應(yīng)于式XXII化合物的方法其中-A-A-代表基團(tuán)-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，R3，R4和R5各自獨(dú)立地選自氫，鹵素，羥基，低級(jí)烷基，低級(jí)烷氧基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，氰基，芳基氧基，-B-B-代表基團(tuán)-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基團(tuán)其中R6和R7各自獨(dú)立地選自氫，鹵素，低級(jí)烷氧基，酰基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，酰氧基烷基，氰基，芳基氧基，該方法包括在一種堿金屬鹽的存在下，使式XXIII化合物與氰化物離子源反應(yīng)，所述式VIII化合物具有下面的結(jié)構(gòu)其中-A-A-，R3，和-B-B-如上所定義。34.權(quán)利要求33的方法，其中所述式XXII化合物是5’R(5’α)，7’β-20’-氨基9，11β-環(huán)氧十六氫-10’，13’-二甲基-3’，5，-二氧代螺[呋喃-2(3H)，17’α(5’H)-[7，4]亞甲基[4H]環(huán)戊[a]菲]-5’-腈，和所述式XXII化合物是9，11α-環(huán)氧-17α-羥基-3-氧代孕甾-4，6-二烯-21-羧酸，γ-內(nèi)酯。35.一種制備相應(yīng)于式XIII化合物的方法其中-A-A-代表基團(tuán)-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，R3，R4和R5各自獨(dú)立地選自氫，鹵素，羥基，低級(jí)烷基，低級(jí)烷氧基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，氰基，芳基氧基，R1代表α-取向的低級(jí)烷氧羰基，-B-B-代表基團(tuán)-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基團(tuán)其中R6和R7各自獨(dú)立地選自氫，鹵素，低級(jí)烷氧基，?；?，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，酰氧基烷基，氰基，芳基氧基，該方法包括從相應(yīng)于下式的化合物的6位和7位去除氫其中-A-A-，R3，和-B-B-如上所定義。36.一種制備式XIV化合物的方法其中-A-A-代表基團(tuán)-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，R3，R4和R5各自獨(dú)立地選自氫，鹵素，羥基，低級(jí)烷基，低級(jí)烷氧基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，氰基，芳基氧基，-B-B-代表基團(tuán)-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基團(tuán)其中R6和R7各自獨(dú)立地選自氫，鹵素，低級(jí)烷氧基，?；u基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，酰氧基烷基，氰基，芳基氧基，該方法包括水解相應(yīng)于式XXV的化合物其中Rx是羥基保護(hù)基，-A-A-，R3，-B-B-，R8和R9如上所定義。37.權(quán)利要求36的方法，其中所述式XIV化合物是4’S(4’α)，7’α-1’，2’，3’，4，4’，5，5’，6’，7’，8’，10’，12’，13’，14’，15’，16’-十六氫-10β-，13’β-二甲基-3’，5，20’-三氧代螺[呋喃-2(3H)，17’β-[4，7]亞甲基[17H]環(huán)戊[a]菲]-5’-腈，和所述式XXV的化合物是5’R(5’α)，7’β-20’-氨基-十六氫-9’β-羥基-10’α，13’α-二甲基-3’，5，-二氧代螺[呋喃-2(3H)，17’α(5’H)-[7，4]亞甲基(metheno)[4H]環(huán)戊[a]菲]-5’-腈。38.一種制備相應(yīng)于式XXV化合物的方法其中-A-A-代表基團(tuán)-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，R3，R4和R5各自獨(dú)立地選自氫，鹵素，羥基，低級(jí)烷基，低級(jí)烷氧基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，氰基，芳基氧基，-B-B-代表基團(tuán)-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基團(tuán)其中R6和R7各自獨(dú)立地選自氫，鹵素，低級(jí)烷氧基，?；?，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，酰氧基烷基，氰基，芳基氧基，和R8和R9各自獨(dú)立地選自氫，鹵素，低級(jí)烷氧基，?；u基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，酰氧基烷基，氰基，芳基氧基，或者R8和R9一起構(gòu)成一個(gè)碳環(huán)或雜環(huán)結(jié)構(gòu)，其中RX是羥基保護(hù)基團(tuán)，該方法包括在一種堿金屬鹽存在下，使式XXVI化合物與氰化物離子源反應(yīng)，所述式XXVI化合物具有下面的結(jié)構(gòu)其中-A-A-，R3，和-B-B-如上所定義。39.權(quán)利要求38的方法，其中所述式XXV的化合物是5’R(5’α)，7’β-20’-氨基-十六氫-9’β-羥基-10’a，13’α-二甲基-3’，5，-二氧代螺[呋喃-2(3H)，17’α(5’H)-[7，4]亞甲基(metheno)[4H]環(huán)戊[a]菲]-5’-腈，和所述式XXVI化合物是9α，17α-二羥基-3-氧代孕甾-4，6-二烯-21-羧酸，γ-內(nèi)酯。40.一種制備相應(yīng)于式XXVI化合物的方法其中-A-A-代表基團(tuán)-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，R3，R4和R5各自獨(dú)立地選自氫，鹵素，羥基，低級(jí)烷基，低級(jí)烷氧基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，氰基，芳基氧基，-B-B-代表基團(tuán)-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基團(tuán)其中R6和R7各自獨(dú)立地選自氫，鹵素，低級(jí)烷氧基，?；?，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，酰氧基烷基，氰基，芳基氧基，其中RX是羥基保護(hù)基團(tuán)，該方法包括從相應(yīng)于下式的化合物的6位和7位去除氫(脫氫作用)其中-A-A-，R3，和-B-B-如上所定義。41.權(quán)利要求40的方法，其中所述式XXVI化合物是9α，17α-二羥基-3-氧代孕甾-4，6-二烯-21-羧酸，γ-內(nèi)酯，和式XXVII化合物是9α，17α-二羥基-3-氧代孕甾-4-烯-21-羧酸，γ-內(nèi)酯。42.一種制備相應(yīng)于式VIII化合物的方法其中-A-A-代表基團(tuán)-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，R3選自氫，鹵素，羥基，低級(jí)烷基，低級(jí)烷氧基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，氰基，芳基氧基，-B-B-代表基團(tuán)-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基團(tuán)其中R6和R7各自獨(dú)立地選自氫，鹵素，低級(jí)烷氧基，?；?，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，酰氧基烷基，氰基，芳基氧基，和R8和R9各自獨(dú)立地選自氫，鹵素，低級(jí)烷氧基，?；u基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，酰氧基烷基，氰基，芳基氧基，或者R8和R9一起構(gòu)成一個(gè)碳環(huán)或雜環(huán)結(jié)構(gòu)，或者R8或R9與R6或R7一起構(gòu)成一個(gè)與五元環(huán)D環(huán)稠合的碳環(huán)或雜環(huán)結(jié)構(gòu)，該方法包括氧化相應(yīng)于式104的化合物其中-A-A-，R3，和-B-B-如上所定義，且R11是C1-C4烷基。43.權(quán)利要求42的方法，其中式VIII的化合物與一種氧化劑接觸。44.權(quán)利要求43的方法，其中所述氧化劑是苯醌衍生物。45.權(quán)利要求44的方法，其中所述氧化劑選自2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌和四氯苯醌。46.權(quán)利要求42的方法，其中所述式104化合物與一種鹵化劑接觸產(chǎn)生鹵化的中間體；并且使所述鹵化的中間體與脫氫鹵化物劑接觸，來(lái)使所述的鹵化的中間體脫氫鹵化并生成所述104化合物。47.一種制備相應(yīng)于式104化合物的方法其中-A-A-代表基團(tuán)-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，R3選自氫，鹵素，羥基，低級(jí)烷基，低級(jí)烷氧基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，氰基，芳基氧基，R11是C1-C4低級(jí)烷基；-B-B-代表基團(tuán)-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基團(tuán)其中R6和R7各自獨(dú)立地選自氫，鹵素，低級(jí)烷氧基，?；?，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，酰氧基烷基，氰基，芳基氧基，該方法包括在一種堿金屬鹵化物存在下，將相應(yīng)于式103的化合物熱分解，所述式103的化合物具有下面的結(jié)構(gòu)其中-A-A-，R3，R11，和-B-B-如上所定義，且R12是C1-C4烷基。48.一種制備相應(yīng)于式103化合物的方法其中-A-A-代表基團(tuán)-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，R3選自氫，鹵素，羥基，低級(jí)烷基，低級(jí)烷氧基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，氰基，芳基氧基，R11是C1-C4低級(jí)烷基；-B-B-代表基團(tuán)-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基團(tuán)其中R6和R7各自獨(dú)立地選自氫，鹵素，低級(jí)烷氧基，酰基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，酰氧基烷基，氰基，芳基氧基，該方法包括在一種堿的存在下，將式102的化合物與丙二酸二烷基酯縮合，所述式102的化合物具有下面的結(jié)構(gòu)其中-A-A-，R3，R11，和-B-B-如上所定義。49.一種制備相應(yīng)于式102化合物的方法其中-A-A-代表基團(tuán)-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，R3選自氫，鹵素，羥基，低級(jí)烷基，低級(jí)烷氧基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，氰基，芳基氧基，R11是C1-C4低級(jí)烷基；-B-B-代表基團(tuán)-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基團(tuán)其中R6和R7各自獨(dú)立地選自氫，鹵素，低級(jí)烷氧基，?；u基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，酰氧基烷基，氰基，芳基氧基，該方法包括在一種堿存在下，將式101的化合物與sulfoniumylide反應(yīng)，所述式101化合物具有下面的結(jié)構(gòu)其中-A-A-，R3和-B-B-如上所定義。50.一種制備相應(yīng)于式101化合物的方法其中-A-A-代表基團(tuán)-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，R3選自氫，鹵素，羥基，低級(jí)烷基，低級(jí)烷氧基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，氰基，芳基氧基，R11是C1-C4烷基；-B-B-代表基團(tuán)-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基團(tuán)其中R6和R7各自獨(dú)立地選自氫，鹵素，低級(jí)烷氧基，?；u基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，酰氧基烷基，氰基，芳基氧基，該方法包括在一種酸催化劑存在下，使式XXXVI化合物與一種醚化劑反應(yīng)，所述式XXXVI的化合物具有下面的結(jié)構(gòu)其中-A-A-，R3，和-B-B-如上所定義。51.權(quán)利要求50的方法，其中所述式101化合物通過(guò)在一種酸化的鏈烷醇溶劑中，使式XXXVI的化合物與原甲酸三烷基酯反應(yīng)來(lái)制備。52.一種制備式XXXVI化合物的方法其中-A-A-代表基團(tuán)-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，R3選自氫，鹵素，羥基，低級(jí)烷基，低級(jí)烷氧基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，氰基，芳基氧基，-B-B-代表基團(tuán)-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基團(tuán)其中R6和R7各自獨(dú)立地選自氫，鹵素，低級(jí)烷氧基，?；?，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，酰氧基烷基，氰基，芳基氧基，該方法包括在一種對(duì)于由所述底物向式XXXVI化合物轉(zhuǎn)化有效的微生物的存在下，通過(guò)發(fā)酵氧化式XXXVII的底物化合物其中-A-A-，-B-B-，和R3如上定義，所述式XXXVII的底物化合物相應(yīng)于下式其中-A-A-，R1，R3，-B-B-如上定義，并且-D-D-是-CH2-CH2-或-CH＝CH-，且R13，R14和R15及R16各自獨(dú)立地選自C1-C4烷基；然后通過(guò)在一種對(duì)于11α-羥基化作用有效的微生物的存在下的發(fā)酵作用，在所述式XXXVI化合物中α-取向引入11-羥基。53.一種制備相應(yīng)于式II化合物的方法其中-A-A-代表基團(tuán)-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，R3，R4和R5各自獨(dú)立地選自氫，鹵素，羥基，低級(jí)烷基，低級(jí)烷氧基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，氰基，芳基氧基，R1代表α-取向的低級(jí)烷氧羰基或羥基羰基殘基，-B-B-代表基團(tuán)-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基團(tuán)其中R6和R7各自獨(dú)立地選自氫，鹵素，低級(jí)烷氧基，?；?，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，酰氧基烷基，氰基，芳基氧基，和R8和R9各自獨(dú)立地選自氫，鹵素，低級(jí)烷氧基，?；?，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，酰氧基烷基，氰基，芳基氧基，或者R8和R9一起構(gòu)成一個(gè)碳環(huán)或雜環(huán)結(jié)構(gòu)，該方法包括通過(guò)使式VI化合物與相應(yīng)于式R10OM的堿金屬烷氧化物反應(yīng)，其中M是堿金屬，R10O-相應(yīng)于R1的烷氧基取代基，制備式V化合物，其中-A-A-，R1，R3，-B-B-，R8和R9定義同上，所述式VI化合物具有下面的結(jié)構(gòu)其中-A-A-，R3，和-B-B-，R8和R9如上所定義；不用分離純化形式的所述式V化合物，使所述式V化合物與一種低級(jí)烷基磺酰化試劑或?；噭┓磻?yīng)，產(chǎn)生式IV化合物其中-A-A-，R1，R3，和-B-B-，R8和R9如上所定義，且R2是烷基磺酰基氧基，酰氧基離去基團(tuán)或鹵化物；不用分離純化形式的所述式IV化合物，通過(guò)與用于除去該基團(tuán)的試劑進(jìn)行反應(yīng)從中去除11α-離去基團(tuán)，來(lái)產(chǎn)生式II化合物。54.權(quán)利要求53的方法，其中不用分離純化形式的所述式II化合物，所述式II化合物與環(huán)氧化試劑反應(yīng)，生成式I產(chǎn)物其中-A-A-，R1，R3，和-B-B-，R8和R9如上所定義。55.權(quán)利要求54的方法，其中通過(guò)在一種堿金屬烷氧化物的存在下，使所述式IV化合物與包括鏈烷酸的離去基團(tuán)去除劑反應(yīng)，生成所述式II化合物；從反應(yīng)溶液中除去揮發(fā)成分；通過(guò)用含水洗液洗滌而從反應(yīng)溶液中除去水溶性成分，從而得到適于式II化合物向式I化合物轉(zhuǎn)化的殘留的式II溶液；和過(guò)氧化物氧化劑與殘留的式II溶液混合，以實(shí)現(xiàn)式II化合物向式I化合物轉(zhuǎn)化。56.權(quán)利要求54的方法，其中在一種有機(jī)溶劑中使所述式VI化合物與堿金屬烷氧化物反應(yīng)，生成所述式V化合物；使用有機(jī)溶劑從含有式V反應(yīng)液的溶液中萃取式V化合物，從而制備式V萃取溶液；和為了制備式VI化合物，將低級(jí)烷基磺酰鹵或酰鹵加入到含有所述式V萃取液的溶液中。57.權(quán)利要求54的方法，其中在一種有機(jī)溶劑中，使所述式V化合物與離去基團(tuán)消除劑反應(yīng)，生成式IV所述化合物；為了從中去除堿性和酸性雜質(zhì)，將含有式IV反應(yīng)液的溶液通過(guò)酸性交換樹(shù)脂柱后通過(guò)堿性交換樹(shù)脂柱，從而制備式IV洗脫液；為了制備所述式II化合物，將用于消除烷基磺酰基氧基或?；趸x去基團(tuán)的試劑與含有所述式IV洗脫液的溶液混合。58.一種生成環(huán)氧化物的方法，包括在一種過(guò)氧化物活化劑存在下，使具有烯烴雙鍵的底物化合物與過(guò)氧化物接觸，所述過(guò)氧化物活化劑相應(yīng)于下式其中R是拉電子強(qiáng)度不小于一氯代甲基的取代基。59.權(quán)利要求58的方法，其中所述過(guò)氧化物活化劑相應(yīng)于下式其中X1，X2，和X3選自鹵素，氫，烷基，鹵代烷基，氰基和氰基烷基，RP選自亞芳基和-(CX4X5)n-，n是0或1，X1，X2，X3，X4和X5中至少一個(gè)是鹵素或全鹵代烷基。60.權(quán)利要求58的方法，其中n是0，且X1，X2，和X3中至少兩個(gè)是鹵素或全鹵代烷基。61.權(quán)利要求58的方法，其中X1，X2，X3，X4和X5全部是鹵素或全鹵代烷基。62.權(quán)利要求58的方法，其中所述過(guò)氧化物活化劑是三鹵代乙酰胺。63.權(quán)利要求62的方法，其中所述過(guò)氧化物活化劑是三氯代乙酰胺。64.權(quán)利要求58的方法，其中所述底物化合物相應(yīng)于下式其中-A-A-代表基團(tuán)-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，R3，選自氫，鹵素，羥基，低級(jí)烷基，低級(jí)烷氧基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，氰基，芳基氧基，R1代表α-取向的低級(jí)烷氧羰基或羥基羰基殘基，-B-B-代表基團(tuán)-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基團(tuán)其中R6和R7各自獨(dú)立地選自氫，鹵素，低級(jí)烷氧基，?；?，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，酰氧基烷基，氰基，芳基氧基，和R8和R9各自獨(dú)立地選自氫，鹵素，低級(jí)烷氧基，?；?，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，酰氧基烷基，氰基，芳基氧基，或者R8和R9一起構(gòu)成一個(gè)碳環(huán)或雜環(huán)結(jié)構(gòu)，或者R8或R9與R6或R7一起構(gòu)成一個(gè)與五元環(huán)D環(huán)稠合的碳環(huán)或雜環(huán)結(jié)構(gòu)。65.權(quán)利要求58的方法，其中所述底物化合物選自下組以及環(huán)氧化作用反應(yīng)的產(chǎn)物選自下組全文摘要本發(fā)明提供了用于合成epoxymexrenone和其它式Ⅰ化合物的多種新的反應(yīng)方法,新的反應(yīng)步驟:其中－A－A－代表基團(tuán)－CHR文檔編號(hào)C07J71/00GK1209136SQ96199961公開(kāi)日1999年2月24日申請(qǐng)日期1996年12月11日優(yōu)先權(quán)日1995年12月11日發(fā)明者J·S·吳,P·T·王,J·A·貝茲,劉靖,D·K·安德森,J·P·勞森,D·艾爾布,J·維喬佐雷克,G·慕斯?fàn)柪锪_,F·范扎內(nèi)拉,S·A·昆達(dá),L·J·勒藤德雷,M·J·波佐,Y·L·L·星申請(qǐng)人:G·D·瑟爾公司