專利名稱：生長激素和血清白蛋白重組融合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組融合蛋白、生長激素(GH)、血清白蛋白和酵母中的蛋白產(chǎn)物。
人血清白蛋白(HSA)是一具有585個氨基酸的蛋白質(zhì)，它是血清中滲透壓的一個重要組成部分，而且起內(nèi)源和外源配體的載體的作用。目前，臨床上所用的HSA是從人的血漿中提取出來的。微生物體內(nèi)重組HA(rHA)的生產(chǎn)已在EP 330 451和EP 361 991中公開。
白蛋白作為一種載體分子的作用及其惰性性質(zhì)對它用作一穩(wěn)定劑和多肽的運(yùn)載蛋白是必需的特征。白蛋白作為融合蛋白的組份，以穩(wěn)定其它蛋白質(zhì)的應(yīng)用已在WO 93/15199，WO 93/15200和EP 413 622中公開。HSA的N-端片段融合到多肽上去的用途亦已在EP 399 666中公開。融合到所說多肽上去是通過遺傳操作的方法，使得編碼HSA的DNA或其片段與編碼所說多肽的DNA連接。然后，用該融合核苷酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染合適的宿主，從而使得合適的質(zhì)粒表達(dá)融合多肽。Nomura等在1995年曾嘗試在釀酒酵母中表達(dá)人的載脂蛋白E成和HSA或HSA的片段的融合蛋白，并利用HSA的前序列直接分泌。發(fā)現(xiàn)當(dāng)和HSA全長融合時導(dǎo)致介質(zhì)中分泌的融合蛋白量低(最大產(chǎn)量為每升6.3mg)，而與HSA的1到198個氨基酸序列或1至390個氨基酸序列融合時，導(dǎo)致融合蛋白不分泌到介質(zhì)中。
人生長激素(見Strobl和Thomas 1994年的綜述)由191個氨基酸的單肽組成，其內(nèi)部通過兩個二硫鍵形成交聯(lián)。每一個hGH分子可與兩個hGH受體分子結(jié)合以便于信號傳導(dǎo)(Cunningham等1991；de Vos等1992)。hGH分子的C-末端與結(jié)合第一個受體分子相關(guān)，但其N-末端與受體的結(jié)合的相關(guān)程度是未知的。該激素由下丘腦控制下的前體垂葉腺分泌，它引起體內(nèi)大范圍的生長促進(jìn)效應(yīng)。臨床上，hGH用于治療垂體性侏儒病，兒童期慢性腎功能不全，骨折和燒傷?，F(xiàn)在用于治療的hGH的生產(chǎn)方法是從人腦垂體腺中提取，或者在EP 127 305(Genentech)中公開的大腸桿菌(E.Coli)中重組表達(dá)，或者為哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)中的重組表達(dá)(Zeisel等，1992)。
除此之外，hGH已在酵母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)(Tokunaga等，1995)，此生物體可提供一個EP 60 057(Genentech)中揭示的方法的一種變通形式。Tsiomenko等報(bào)道了酵母MFα-1前引導(dǎo)序列在酵母中分泌hGH中的作用。將此前導(dǎo)序列的前端部分(pre-portion)與hGH基因結(jié)合導(dǎo)致hGH在外周質(zhì)和液泡中的積累，而前導(dǎo)序列的前部分(pro-portion)與hGH基因的接合則導(dǎo)致定位于細(xì)胞內(nèi)的非糖基化前體的表達(dá)。只有在前導(dǎo)序列兩部分均與hGH基因結(jié)合，才能使hGH分泌到培養(yǎng)基中。其它的分泌信號(前序列)同樣無助于hGH分泌到培養(yǎng)基中，除非用酵母自身的原序列(pro sequence)，說明這種原序列對酵母中hGH的分泌是關(guān)鍵的。
在人體中，hGH以脈沖的形式分泌到血液中，其在循環(huán)過程中的半衰期少于20分鐘(Haffner等，1994)。該激素的清除主要通過肝和腎中的代謝，成人中的清除速度快于兒童(Kearns等，1991)。hGH不足的治療一般持續(xù)六到二十四個月，其間每星期肌肉注射三次或者每天進(jìn)行皮下注射。這種頻繁的治療方法是必需的，因?yàn)樵摲肿拥陌胨テ诙獭?br> Poznansky等1988年通過將hGH和豬源或人源的血清白蛋白(HSA)綴合成一相當(dāng)大的綴合體(約180KD)的方法延長了豬生長激素的半衰期。利用交聯(lián)劑戊二醛進(jìn)行的化學(xué)反應(yīng)，使得平均每兩個白蛋白分子和六個生長激素分子綴合。所產(chǎn)生的180KD的綴合體在小鼠中的半衰期達(dá)到2到3小時，而沒有發(fā)生綴合的生長激素在小鼠中的半衰期只有五分鐘?；钚詼y定表明綴合體在體外保持全部活性，甚至可能增加了活性，但在體內(nèi)無活性。
本發(fā)明涉及關(guān)將一個白蛋白分子，或其變種或片段與一個生長激素分子，或其變種或片段融合，所形成的融合蛋白較未融合的生長激素延長了循環(huán)半衰期。為方便起見，只提到人白蛋白(HA)和人生長激素(hGH)，但其它脊椎動物的白蛋白和生長激素均包括在內(nèi)。優(yōu)選地，含有HA，或其變種或片段的N-末端部分和hGH，或其變種，或片段的C-末端部分的融合蛋白可使受體結(jié)合的所有可能的負(fù)效應(yīng)最小化?；蛘撸蠬A，或其一個變種，或其片段的C-末端部分和hGH，或其一個變種，或其片段的N-末端部分的融合蛋白同樣具信號傳導(dǎo)的作用。一般地，此多肽只具有一個HA來源的區(qū)域和一個GH來源的區(qū)域。
另外，本發(fā)明中的融合蛋白在其兩個融合部分間還具有一個接頭肽，以便于融合蛋白兩組分間有較大的物理隔離(physical separation)，從而使hGH部分最大可能地與hGH受體結(jié)合。接頭肽由氨基酸組成使得其是柔韌性或剛性的。
接頭序列可通過一種蛋白酶或化學(xué)方法切割，以產(chǎn)生生長激素相關(guān)的部分。優(yōu)選地，此蛋白酶可由宿主天然產(chǎn)生，如啤酒糖酵母蛋白酶Kex2或相當(dāng)?shù)牡鞍酌浮４撕?，本發(fā)明還進(jìn)一步提供通過在一合適的宿主中表達(dá)編碼本發(fā)明中多肽的聚核苷酸以制備生長激素，或其變種，或其片段的方法及切割可切割的接頭以產(chǎn)生GH-型復(fù)合物和從宿主培養(yǎng)基中以更純的形式獲得GH-型復(fù)合物的方法。
發(fā)現(xiàn)本發(fā)明中的多肽在溶液中的穩(wěn)定性明顯高于hGH。后者在溶液中4℃下貯存一個月后迅速失活?，F(xiàn)在市售hGH為凍干粉劑。
合適地，融合多肽是由酵母，微生物，如細(xì)菌，人細(xì)胞系或酵母以重組分子的形式分泌產(chǎn)生。優(yōu)選地，此多肽可從宿主中分泌出來。發(fā)現(xiàn)將編碼hGH的序列融合到編碼HA序列的5′-端或3′端，酵母均可以分泌此融合蛋白，而無需一種酵母來源的原序列(pro sequence)。此發(fā)現(xiàn)是驚人的，因?yàn)槠渌ぷ髡邆儼l(fā)現(xiàn)酵母來源的原序列對酵母有效分泌hGH是必需的。如Hiramitsu等1990年和1991年分別發(fā)現(xiàn)微小毛霉(Mucor pusillus)菌株凝乳酶前原引導(dǎo)序列(pre-pro leader)中原序列(pro sequence)的N-端部分是重要的。其他的作者，在用MFα-1信號分泌hGH時，總是包括MFα-1的原序列。此原序列被認(rèn)為是作為一種分子內(nèi)的分子伴侶而有助于hGH的折疊過程。本發(fā)明顯示HA或HA的片段可行使相似的功能。
因而，本發(fā)明中的一個具體的實(shí)施方案包括酵母中有效地直接分泌編碼信號序列的DNA構(gòu)建體，尤其是酵母來源信號序列(特別是與酵母宿主有同源性的信號序列)，和本發(fā)明的第一方面的融合分子，其中信號和成熟的多肽間沒有酵母來源的原序列存在。
啤酒糖酵母(S.cerevisiae)轉(zhuǎn)化酶的信號酵母來源信號的優(yōu)選的實(shí)施例子。
不考慮Poznansky等1988年利用化學(xué)交聯(lián)方法連接兩個分別制備的那種綴合體。
白蛋白或hGH可以分別是正常HSA/rHA(下文稱為“HA”)或hGH的一個變體。在這些“變體”中，包括在保守區(qū)域或非保守區(qū)域的插入，缺失和取代，但這些變化不能明顯改變白蛋白的一個或多個腫脹的(oncotic)有用的配體結(jié)合和非免疫原的特征，或在hGH中則是其非免疫原性及可結(jié)合并激活hGH受體的能力。特別地，將人白蛋白和人白蛋白片段中天然發(fā)生的多態(tài)性變體包括在內(nèi)，如在EP 322 094中公開的那些片段(稱為HA(1-n)，其中n指369到419)。白蛋白或生長激素可來自于任何脊椎動物，特別是任何哺乳動物，如人、牛、羊、豬、雞(hen)，或鮭魚。融合蛋白中的白蛋白和GH部分可分別來自于不同的動物。
“保守性替代物”用指在諸如甘氨酸(Gly)，丙氨酸(Ala)；纈氨酸(Val)，異亮氨酸(Ile)，亮氨酸(Leu)；天冬氨酸(Asp)，谷氨酸(Glu)；天冬酰氨(Asn)，谷氨酰氨(Gln)；絲氨酸(Ser)，蘇氨酸(Thr)；賴氨酸(Lys)，精氨酸(Arg)；和苯丙氨酸(Phe)，酪氨酸(Tyr)這些組中的替換。只要本領(lǐng)域內(nèi)認(rèn)為允許插入和刪除是慣常的，這些變體與同一長度的正常HA或hGH具有至少75％的序列同源性(優(yōu)選地是至少具80％，90％，95％，或99％的同源性)，而且比其它長度的正常HA或hGH更具同源性。概括地說，一HA變體至少具100個氨基酸長度，優(yōu)選地至少有150個氨基酸長度。此HA變體至少包含或是由HA的一個完整的結(jié)構(gòu)域組成，如結(jié)構(gòu)域1(1-194)，2(195-387)，3(388-585)，1+2(1-387)，2+3(195-585)，或1+3(1-194，+388-585)。每個結(jié)構(gòu)域本身由兩個同源亞結(jié)構(gòu)域組成，這些亞結(jié)構(gòu)域稱為1-105，120-194，195-291，316-387，388-491，和512-585，包括賴氨酸(Lys)106至谷氨酸(Glu)199，谷氨酸(Glu)292至纈氨酸(Val)315和谷氨酸(Glu)492至丙氨酸(Ala)511區(qū)的氨基酸殘基的帶有柔性的間-亞結(jié)構(gòu)域接頭區(qū)域。優(yōu)選地，融合蛋白的HA部分至少包含一個HA的亞結(jié)構(gòu)域，或結(jié)構(gòu)域，或它們的保守性修飾部分。如果此融合蛋白基于亞結(jié)構(gòu)域，部分或全部的毗鄰的接頭優(yōu)選地用于連接hGH組成成分。hGH的變體應(yīng)具有GH活性，一般至少具有十個氨基酸(盡管一些作者發(fā)現(xiàn)僅具四個殘基時同樣具活性)，優(yōu)選地至少有20個氨基酸，優(yōu)選地至少有50，100，150，180，或191個氨基酸長，并優(yōu)選地保留其兩個內(nèi)部二硫鍵的半胱氨酸(Cys)。
本發(fā)明中融合分子的分子量一般低于100KD，如低于90KD，或70KD。因而它們較Poznansky等的180KD的綴合體(見前文)要小得多，而后者體內(nèi)是無活性的。正常情況下，該融合蛋白的分子量至少有20KD，通常至少有30KD，或50KD。大多數(shù)融合蛋白的分子量大小介于60至90KD間。
本發(fā)明的第二個主要部分是提供轉(zhuǎn)化酵母以表達(dá)本發(fā)明中的融合蛋白。
除轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞自身外，本發(fā)明還考慮在一營養(yǎng)介質(zhì)中進(jìn)行這些細(xì)胞的培養(yǎng)，優(yōu)選地單克隆(克隆均一的)培養(yǎng)，或一來自于單克隆培養(yǎng)物的培養(yǎng)。特別是一旦多肽分泌，培養(yǎng)基中同時具有此多肽和這些細(xì)胞，或者通過過濾或離心的方法將這些細(xì)胞除去。
已知有許多表達(dá)系統(tǒng)，包括細(xì)菌(如大腸桿菌(E.Coli)，和枯草芽孢桿菌(B.Subtitis))，酵母菌(如啤酒糖酵母(S.cerevisiae)、乳克魯維氏酵母(K.lactis)、和巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris))，絲狀真菌(如曲霉菌屬(Aspergillus))，植物細(xì)胞，動物細(xì)胞及昆蟲細(xì)胞。
所需蛋白通過便捷的方式產(chǎn)生，如從插入到宿主染色體或一自游離質(zhì)粒的編碼序列中產(chǎn)生。
轉(zhuǎn)化所需蛋白的編碼序列到酵母中去可用通常的方法，如電穿孔。用電穿孔轉(zhuǎn)化酵母的方法已被Becker和Guarente公開，(《酶學(xué)方法(MethodsEnzymol)》1990年，第194期第182頁)。
成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，即含有本發(fā)明中DNA構(gòu)建體的細(xì)胞，可通過人們熟知的技術(shù)加以鑒定。如，細(xì)胞中表達(dá)構(gòu)建體的引入將生長產(chǎn)生所需的多肽。這些細(xì)胞經(jīng)收集并裂解，可用Southern 1975年發(fā)表在《分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol)》第98期第503頁的方法，或Berent等1985年發(fā)表于《生物技術(shù)(Biotech)》第三期第208頁的方法來檢查其DNA中該DNA的存在與否?；蛘撸锨逯械牡鞍卓捎每贵w進(jìn)行檢測。
有用的酵母質(zhì)粒載體包括pRS 403-406和pRS 413-416，這些載體一般可從Stratagene Cloning Systerns獲得，(Stratagene Cloning systerns，LaJolla，CA92037，USA)。質(zhì)粒pRS 403，pRS 404，pRS 405和pRS 406為酵母整合型質(zhì)粒(YIp)，并結(jié)合有酵母選擇性標(biāo)記HIS3，TRP1，LEU2和URA3。質(zhì)粒pRS 413-416為酵母著絲粒質(zhì)粒(YCp)。
已構(gòu)建了各種通過互補(bǔ)粘性末端將DNA可操作地連接到載體上去的方法。如，在DNA片段上加上互補(bǔ)的同聚體序列，從而插入到載體DNA中去。然而，載體和DNA片段通過在互補(bǔ)的同聚體尾間形成氫鍵連結(jié)以組成重組DNA分子。
具有一個或多個限制性位點(diǎn)的合成接頭提供了將DNA片段連到載體上去的另一種方法。通過限制性內(nèi)切酶降解的DNA片段用噬菌體T4 DNA聚合酶或大腸桿菌(E.Coli)DNA聚合酶I處理，這些酶以它們的3′- 5′核酸外切酶活性除去3′-單鏈的突出末端，然后用其聚合酶活性補(bǔ)平3′-凹端。
這些活性的聯(lián)合使用從而產(chǎn)生了具平末端的DNA節(jié)段。然后此平末端的節(jié)段與摩爾數(shù)過量的多的接頭分子在可以催化平末端DNA分子連接的酶(如噬菌體T4 DNA連接酶)的存在下溫育。因此，反應(yīng)產(chǎn)物為末端攜有同聚體接頭序列的DNA節(jié)段。然后，將此DNA節(jié)段用一合適的限制性酶切割，并連到用酶切并產(chǎn)生和這些DNA節(jié)段的相容的末端的表達(dá)載體上。
具有各種限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)的合成接頭已商品化，可通過包括國際生物技術(shù)公司(International Biotechnologies Inc，New Haven，CN，USA)在內(nèi)的各種途徑獲得。
若需要，如，制備HA的變體，修飾本發(fā)明DNA的一個理想方法可用Saiki等1988年發(fā)表在《科學(xué)(Science)》第239期第487-491頁的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法。在此方法中，待酶促擴(kuò)增的DNA在其兩側(cè)分別加上了兩個特異的寡核苷酸引物，而引物本身可摻入該擴(kuò)增的DNA中。所說的特異引物可有限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)，可用本領(lǐng)域周知的方法將之克隆到表達(dá)載體中去。
本發(fā)明中所用的能用于表達(dá)融合蛋白的宿主酵母菌示范屬為畢赤氏酵母屬(Pichia(Hansenula))，釀酒酵母屬(Saccharomyces)，克魯維酵母菌屬(Kluyverornyces)，念珠菌屬(Candida)，圓酵母屬(Torulopsis)，有孢圓酵母屬(Torulaspora)，裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)，固囊酵母屬(Citeromyces)，(Pachysolen)，德巴利酵母屬(Debaromyces)，梅奇酵母屬(Metschunikowia)，紅冬孢屬(Rhodosporidium)，無色擔(dān)子孢子屬(Leucosporidium)，葡狀子囊菌屬(Botryoascus)，鎖擲酵母屬(Sporidiobolus)，擬內(nèi)孢霉屬(Endomycopsis)，及類似屬。優(yōu)選的屬選自釀酒酵母屬(Saccharomyces)，裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)，克魯維酵母菌屬(Kluyveromyces)，畢赤氏酵母屬(Pichia)和有孢圓酵母屬(Torulaspora)。其中釀酒酵母屬(Saccharomyces spp)屬中有釀酒酵母(S.cerevisiae)，S.italius和S.rouxill.?？唆斁S酵母菌屬(Kluyveromyces spp.)屬中有脆壁克魯維酵母(K.fragilis)，乳克魯維酵母(K.lactis)和馬克斯克魯維酵母(K.marxianus)。合適的有孢圓酵母屬(Torulaspora)種有戴爾數(shù)氏有孢圓酵母(T.delbrueckii)。畢赤氏酵母屬(漢遜酵母屬)(Pichia(Hansenula)spp.)屬中有P.angusta(以前為多形漢遜氏酵母(H.polymorpha))，異常畢赤氏酵母(P.anomala)(以前為異常漢遜氏酵母(H.anomala))和巴斯德畢赤氏酵母(P.pastoris)。
轉(zhuǎn)化釀酒酵母的方法已在EP 251 744，EP 258 067和WO 90/01063中概括地介紹了，所有這些均以參考文獻(xiàn)形式并入本發(fā)明。
釀酒酵母中合適的啟動子包括與PGK1基因，GAL1或GAL10基因，CYC1，PH05，TRP1，ADH1，ADH2基因，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)，已糖激酶(hexokinase)，丙酮酸脫羧酶(Pyruvate decarboxylase)，果糖磷酸激酶(phosphofructokinase)，丙糖磷酸異構(gòu)酶(triose phosphate isomerase)，磷酸葡糖異構(gòu)酶(phosphoglucoseisomerase)，葡糖激酶(glucokinase)，α-配對因子外激素(α-mating factorpheromone)，a-配對因子外激素(a-mating factor pheromone)的基因有關(guān)的啟動子，PRB1啟動子，GUT2啟動子，GPD1啟動子，雜合啟動子(包括5′-調(diào)控區(qū)部分與其它啟動子的5′-調(diào)控區(qū)部分雜合，或與上游激活位點(diǎn)(如EP-A-258 067中的啟動子)雜合的啟動子)。
在粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)中用的便捷的調(diào)控啟動子為nmt基因中的硫胺素阻遏型啟動子(該啟動子已被Maundrell在1990年的《生物化學(xué)雜志J.Biol.chem.》第265期第10857-10864中述及)和葡糖阻遏型fbp1基因的啟動子(已被Hoffman和Winstion在1990年的《遺傳學(xué)Genetics》第124期第807-816頁中述及)。
轉(zhuǎn)化Pichia以表達(dá)外源基因的方法已在如Cregg等1993年，及各種phillips專利(如US 4 857 467，以參考文獻(xiàn)形式并入本發(fā)明)中描述，Pichia表達(dá)試劑盒已商品化，可從Invitrogen BV，Leek，Netherlands和InvitrogenCorp.，San Diego，California獲得。合適的啟動子包括AOX1和AOX2。
Gleeson等1986年發(fā)表于《微生物遺傳學(xué)雜志》(J.Gen.Microbiol)第132期第3459-3465頁的方法中包括Hansenula載體和轉(zhuǎn)化的信息，合適的啟動子為MOX1和FMD1；而EP 361991，F(xiàn)leer等(1991)及其他一些來自于Phone-Poulenc Rorer報(bào)道則告訴人們?nèi)绾卧诳唆斁S氏酵母屬(Kluyveromyces spp.)中表達(dá)外源蛋白，其中合適的啟動子為PGK1。
轉(zhuǎn)錄終止信號優(yōu)選地為一真核基因的3′-側(cè)序序列，該序列中包括合適的轉(zhuǎn)錄終止信號和多聚腺苷酸信號。合適的3′-側(cè)序序列為如那些天然連接在所用的表達(dá)控制序列上的基因，即相當(dāng)于啟動子。或者，在優(yōu)選地用釀酒酵母ADH1基因終止信號時，它們可以是不同的。
所需的融合蛋白可與一分泌型前導(dǎo)序列一起起始表達(dá)，該前導(dǎo)序列可以是任何在所選擇的酵母有效的前導(dǎo)序列。釀酒酵母中有用的前導(dǎo)序列包括來自于EP-A-387 319中的配對因子α多肽(MFα-1)和雜合引導(dǎo)序列。這些引導(dǎo)序列(或信號)在成熟的白蛋白釋放到周圍介質(zhì)中去之前即被酵母切割。而且該前導(dǎo)序列包括JP 62-096086(授權(quán)為91/036516)中公開的釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶(SUC2)；酸性磷酸酶(PH05)；MFα-1，β-葡聚糖酶(BGL2)和致死毒素的前序列；S.diastaticus的葡糖淀粉酶II；S.carlsbergensis的o-半乳糖苷酶(MEL1)；K.lactis中的致死毒素；和念珠菌(Candida)的葡糖淀粉酶。
本發(fā)明中的融合蛋白或其配方可通過任何傳統(tǒng)的方法，包括非經(jīng)胃腸道(如皮下或肌肉)注射或靜脈輸注的方法給藥。治療包括在一段時間內(nèi)使用單一劑量或復(fù)合劑量。
本發(fā)明中的融合蛋白可單獨(dú)使用，而優(yōu)選地則為與一個或多個可接受的載體一起成藥物制劑的形式使用。該載體必需在與融合蛋白相容且不能對受體自身有害的意義上說是“可接受的”。典型的載體為水或鹽水，它們需是無菌的，且無致熱原。此制劑需是非免疫原性的；包括佐劑的疫苗型制劑不考慮。
該制劑可以單元劑量的便捷形式存在，并可通過任何藥物學(xué)領(lǐng)域已知的方法制備。這些方法包括將融合蛋白與具有一種或多種輔助成份的載體接合到一塊的步驟。概括地說，將活性成分和液相載體或細(xì)分固相載體或其兩者緊密均勻結(jié)合以制備該制劑，然后，如果需要的話，將產(chǎn)品成形。
適合于非經(jīng)胃腸道途徑使用的制劑包括含水的或不含水的無菌注射液，該液含有抗氧化劑，緩沖液，抑菌劑和溶解物，使藥物的滲透性與待施用受體血液中的滲透性相等；含水的和不含水的無菌懸浮液(包括懸浮劑和增稠劑)。該制劑可存在于單元劑量或多劑量的容器中，如密封的安瓿瓶和小管中，在凍干(凍干法)條件下貯存，使用前即加入無菌液態(tài)載體，如注射用水。臨時性注射液和懸浮液可通過無菌粉劑制備。
優(yōu)選的單元劑量制備是那些包括有活性成分的日用劑量或單元，日用亞劑量或其適當(dāng)?shù)男》荨?br> 本發(fā)明中的融合蛋白用于治療任何表現(xiàn)出生長激素缺乏的情況，如孤立性生長激素缺乏癥(isolated growth hormone deficiency)，全垂體功能減弱(Panhypopituitarism)，顱骨內(nèi)照射后(following cranial irradiation)(如，在治療白血病或腦腫瘤中)，先天性卵巢發(fā)育不全(Turner′s-syndrome)，唐氏先天愚癥(Down′s Syndrome)，子宮生長障礙(intrauterine growth retardation)，自發(fā)性生長缺陷(idiopathic growth deficiency)，慢性腎衰竭(chronic renal faiure)，軟骨發(fā)育不全(achondroplasia)，雌性不孕(female infertility)和各種分解代謝紊亂。它們也可用于刺激生長，和(或)增加家畜(如牛、羊、山羊及豬)的瘦肉的比重。
該融合蛋白可與胰島素樣生長因子I(IGF-1)一起給藥。
使用劑量可通過融合蛋白的效價(jià)相對于hGH的效價(jià)計(jì)算出，此時考慮融合蛋白相對于天然hGH延長的半衰期。生長激素的典型用量為每星期0.3至30.0IU/kg，如0.9至12.0IU/kg/星期，如果一年三個或七個分包劑量施用或更多。在由全長HA和全長GH融合的融合蛋白中，按照單位的相當(dāng)劑量意味著使用較大重量的制劑，但施用制劑的頻率可降低，如一星期兩次，一星期一次或更少。
本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施例將通過實(shí)施例和參考附圖進(jìn)行描述。其中

圖1示編碼成熟的hGH的人生長激素cDNA序列；圖2示pHGH1的限制性酶切圖；圖3示pBST(+)的限制性酶切圖和多接頭的DNA序列；圖4示pHGH12的構(gòu)建；圖5示pHGH16的構(gòu)建；圖6示HSAcDNA序列，特別是編碼成熟蛋白的區(qū)域；圖7示pHGH14的構(gòu)建；圖8示pHGH38的構(gòu)建；圖9示pHGH31的構(gòu)建；圖10示pHGH58或pHGH59的構(gòu)建(實(shí)施例7)；圖11為一具間隔區(qū)的融合蛋白的構(gòu)建方案；圖12藥物動力學(xué)研究結(jié)果以顯示小鼠靜脈注射125I標(biāo)記的rHA-hGH較之于hGH的清除率。所示數(shù)據(jù)為每組中的兩只小鼠的數(shù)據(jù)，包括總放射活性和可通過TCA沉淀的放射活性，即其與蛋白有關(guān)而不是與游離125I有關(guān)。所計(jì)算出的hGH的清除半衰期約六分鐘，而rHA-hGH融合蛋白的清除半衰期則達(dá)六十分鐘，見實(shí)施例3。·-hGH(總數(shù))■-hGH(TCA沉淀數(shù))-rHA-hGH(總數(shù))▲-rHA-hGH(TCA沉淀數(shù))。
所有標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA過程見Sambrook等1989年的敘述，不同情況時將注明。編碼HSA的DNA序列來自于EP 201 239公開的cDNA。實(shí)施例1hGH cDNA的克隆。
hGH的cDNA通過PCR擴(kuò)增的方法從人垂體腺cDNA文庫中獲得(目錄號為HL1097V，(Clontech Laboratories，Inc)。兩個適于hGH cDNA擴(kuò)增的寡核苷酸引物HGH1和HGH2用應(yīng)用生物系統(tǒng)380B(Applied Biosystems380B)寡核苷酸合成儀合成。
HGH15′-CCCAAGAATTCCCTTATCCAGGC-3′HGH25′-GGGAAGCTTAGAAGCCACAGGATCCCTCCACAG-3′HGH1和HGH2與hGH cDNA序列相應(yīng)部分分別有兩個和三個核苷酸的區(qū)別(圖1，Martial等，1979)，從而，PCR擴(kuò)增后，在cDNA的5′-端引入一個EcoRI位點(diǎn)，3′-端引入一個BamHI位點(diǎn)。此外，HGH2中在緊接著hGH序列下游存在一個Hind III位點(diǎn)。
用Perkin-ELmer-Cetus Thermal Cycler 9600擴(kuò)增儀和Perkin-Elmer cetus PCR試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增是用分離于cDNA文庫的噬菌體粒子(phage particles)的單鏈DNA模板進(jìn)行的，模板來源如下加入10μl噬菌體裂解緩沖液(含280μg/ml.蛋白酶K的TE緩沖液)以裂解10μl噬菌體粒子，55℃溫育15分鐘后，85℃15分鐘。冰上培育1分鐘后，14,000rpm離心3分鐘以沉淀噬菌體碎片。PCR反應(yīng)混合液含6μl此DNA模板，0.1μM每種引物的濃度和均為200μM的每種脫氧核糖核苷酸。共進(jìn)行30個PCR循環(huán)，94℃變性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸30秒，每經(jīng)一個循環(huán)將延伸時間增加1秒。通過凝膠電泳分析反應(yīng)物顯示一預(yù)期大小(589個堿基)的單一產(chǎn)物。
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用Wizard PCR Preps DNA純化系統(tǒng)(Promego Corp)進(jìn)行純化，然后用EcoRI和Hind III酶切。進(jìn)一步通過凝膠電泳純化EcoRI-HindIII酶切片段后，將它們克隆到一用EcoRI和Hind III酶解的PUC 19(GIBCOBRL)質(zhì)粒上，形成pHGH1(圖2)。EcoRI-Hind III區(qū)的DNA測序結(jié)果表明此PCR產(chǎn)物在序列上是和hGH序列相同(Martial等，1979)，只是在其5′-端和3′-端分別加入了一個EcoRI位點(diǎn)和BamHI位點(diǎn)。實(shí)施例2hGH cDNA的表達(dá)噬菌粒pBluescribe(+)(Stratagene)的多接頭序列通過在EcoRI和HindIII位點(diǎn)間插入由兩個長75-mer的寡核苷酸退火形成的寡核苷酸接頭被取代并形成pBST(+)(圖3)。新的多接頭中含有一個唯一的NotI位點(diǎn)(多接頭區(qū)的全序列見圖3)。
含有PRB1啟動子，編碼HSA/MFα-1雜合前導(dǎo)序列的DNA，編碼HSA的DNA，和ADH1終止子的pAYE 309(EP 431 880)的NotI HSA表達(dá)盒轉(zhuǎn)化到pBST(+)上以形成pHA1(圖4)。用Hind III酶切將HSA的編碼序列從該質(zhì)粒上移去，再重連以形成pHA2(圖4)。
實(shí)施例1中述及的hGH cDNA的克隆提供了缺乏原h(huán)GH序列和成熟hGH序列的前8個堿基對(bp)的hGH編碼區(qū)。為構(gòu)建酵母中分泌hGH的表達(dá)質(zhì)粒，在克隆的hGH序列的5′-端如下加上一酵母啟動子，信號肽和該hGH序列的前8個堿基對將pHA1的Hind III-SfaNI的片段通過兩合成的寡核苷酸HGH3和HGH4加到pHBH1的EcoR1-Hind III片段的5′-端HGH35′-GATAAGATTCCCAAC-3′HGH45′-AATTGTTGGGAATCTTT-3′將如此形成的Hind III片段克隆到Hind III酶切的pHA2上構(gòu)成pHGH2(圖4)，從而將hGH cDNA置于PRB1啟動子和HSA/MFα-1融合前導(dǎo)序列(WO 90/01063)的下游區(qū)。包含在pHGH2中的NotI表達(dá)盒克隆到NotI酶切的pSAC35(Sleep等，1990)中形成pHGH12(圖4)，其中NotI表達(dá)盒包括hGH cDNA下游的ADH1終止子。此質(zhì)粒含有整個2μm質(zhì)粒，從而具有復(fù)制功能和可用于篩選轉(zhuǎn)化體的LEU2基因。
將pHGH12通過轉(zhuǎn)化引入到釀酒酵母DH1(Sleep等，1990)中，單個的轉(zhuǎn)化體在10ml YEPD(1％w/v酵母提取物，2％w/v蛋白胨，2％w/v葡聚糖)中，30℃生長三天。離心該細(xì)胞后，上清通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測，發(fā)現(xiàn)含有期望大小的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)印跡(Westernblots)顯示該蛋白可被抗hGH抗血清(Sigma，Poole，UK)識別。實(shí)施例3HSA-hGH融合蛋白的克隆和表達(dá)為了將HSAcDNA融合到hGH cDNA的5′-端，由兩個寡核苷酸HGH7和HGH8將pHA1 Hind III-Bsu 36I片段(含有HSA cDNA的大部分)和pHGH1的EcoR1-Hind III片段連接HGH75′-TTAGGCTTTTCCCAAC-3′HGH85′-AATTGTTGGGAATAAGCC-3′將如此形成的Hind III片段克隆到用Hind III酶切的pHA2中形成pHGH10(圖5)，此質(zhì)粒NotI的表達(dá)盒克隆到Not1酶切的pSAC35中形成pHGH16(圖5)。
pHGH 16用于轉(zhuǎn)化到釀酒酵母DB1中，培養(yǎng)的上清用實(shí)施例2中的方法分析。觀察到一分子量大小約88KD的主帶，相當(dāng)于HA和hGH結(jié)合后的大小。用抗HSA和抗hGH抗血清(Sigma)進(jìn)行的Western印跡證實(shí)了融合蛋白中兩個組成部分的存在。
從培養(yǎng)上清液中先后用陽離子交換層析，陰離子交換層析和凝膠滲透層析法純化該融合蛋白。通過其N-端的氨基酸序列分析證明了預(yù)期的白蛋白序列的存在。
體外生長激素活性測定(Ealey等，1995)顯示該融合蛋白具有全部的hGH活性，但與hGH標(biāo)準(zhǔn)相比其效價(jià)降低了。在一垂體摘除的小鼠體重增加模型(基本按照European Pharmacopoeia(1987，monograph 556)描述的方法)中，當(dāng)每天使用相同活性單位數(shù)量(以上述體外測定為基礎(chǔ))時，融合蛋白分子較hGH具更高的效價(jià)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，即每四天用融合蛋白給藥一次，表明它與每天都使用hGH類似地具全部生長反應(yīng)。藥物動力學(xué)實(shí)驗(yàn)(即對小鼠給藥125I標(biāo)記的蛋白)表明融合蛋白的循環(huán)半衰期較hGH約增加了十倍(圖12)。
用編碼釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶(SUC2)前導(dǎo)序列的DNA替代雜合前導(dǎo)序列以構(gòu)建一相似的質(zhì)粒，從而編碼的引導(dǎo)序列和與HSA序列接頭如下MLLQAFLFLLAGFAAKISA ↓ DAHKS......
轉(zhuǎn)化酶前導(dǎo)序列 HSA在轉(zhuǎn)化到釀酒酵母DB1中后，該質(zhì)粒控制表達(dá)和分泌融合蛋白的程度與用pHGH16的相似。融合蛋白的N-端分析顯示了前導(dǎo)序列從成熟蛋白中精確和有效的切割。實(shí)施例4 hGH-HSA融合蛋白的克隆和表達(dá)為了將hGH cDNA融合到HSAcDNA的5′-端(圖6)，首先通過定點(diǎn)突變改變HSA cDNA以在編碼區(qū)的5′-端附近引入一個EcoNI位點(diǎn)。已通過Kunkel等(1987年)方法用由pHA1制備的單鏈DNA模板和一合成的寡核苷酸LEU4LEU45′-GAGATGCACACCTGAGTGAGG-3′完成。用此寡核苷酸的定點(diǎn)突變是指改變HSA cDNA的編碼區(qū)以使Lys4變?yōu)長eu 4(K4L)。然而，這種改變在hGH cDNA的5′-端隨后連到突變pHA1后即修復(fù)了。此連接是由兩個寡核苷酸HGH5和HGH6將pHGH2的NotI-BamHI片段連在突變pHA1的EcoNI-NotI片段上。
HGH55′-GATCCTGTGGCTTCGATGCACACAAGA-3′HGH65′-CTCTTGTGTGCATCGAAGCCACAG-3′形成的NotI片段克隆到NotI酶切的pSAC 35上以構(gòu)成pHGH14(圖7)。用實(shí)施例2中的方法將pHGH14轉(zhuǎn)化到釀酒酵母DB1中，并分析培養(yǎng)上清。觀察到一分子量大小約為88KD的主帶，其與hGH和HA結(jié)合后的大小相當(dāng)。利用抗-HSA和抗-hGH抗血清進(jìn)行的Western印跡實(shí)驗(yàn)證實(shí)了此融合蛋白的兩個組成部分的存在。
培養(yǎng)上清液中的融合蛋白先后用陽離子交換層析、陰離子交換層析和凝膠滲透層析法純化。通過其N-端的氨基酸序列分析證明了預(yù)期的hGH序列的存在。
體外研究表明此融合蛋白保留有hGH的活性，但其效價(jià)明顯低于實(shí)施例3中的含有全長HA(1-585)N-端部分和hGH C-端部分的融合蛋白。實(shí)施例5與HSA結(jié)構(gòu)域融合的hGH的表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。
hGH分子與HA的前兩個結(jié)構(gòu)域(1至387個氨基酸殘基)融合形成融合多肽。由寡核苷酸HGH11和HGH12將pHA1的Hind III-SapI片段(該片段具有HA結(jié)構(gòu)域1和2的大部分編碼序列、)連到pHGH1的EcoRI-HindIII片段上形成hGH的N-端融合。
HGH115′-TGTGGAAGAGCCTCAGAATTTATTCCCAAC-3′HGH125′-AATTGTTGGGAATAAATTCTGAGGCTCTTCC-3′如此形成的Hind III片段克隆到Hind III酶切的pHA2上形成pHGH37(圖8)，并將該質(zhì)粒的NotI表達(dá)盒免隆到NotI-酶切的pSAC 35中。形成的質(zhì)粒pHGH38(圖8)具有一表達(dá)盒，當(dāng)轉(zhuǎn)化到釀酒酵母DB1中后可將融合多肽直接分泌到上清液中。利用抗-HSA和抗hGH抗血清進(jìn)行的Western印跡證實(shí)融合蛋白中兩組成部分的存在。
從培養(yǎng)上清液中先后通過陽離子交換層析和凝膠滲透層析方法純化該融合蛋白。純化蛋白體外研究顯示其循環(huán)半衰期長于hGH，與實(shí)施例3中具有全長HA(1-585)N-端部分和hGH C-端部分的融合蛋白循環(huán)半衰期相似。體外研究顯示該融合蛋白保留有hGH的活性。
利用相似于上面詳述的方法，將具有HA第一個結(jié)構(gòu)域(第1至194個氨基酸殘基)的N-端部分和hGH C-端部分的融合蛋白克隆到釀酒酵母DB1中并在其中表達(dá)。用抗HSA和抗hGH抗血清對上清液進(jìn)行Western印跡分析，證明了融合蛋白中兩組成部分的存在。實(shí)施例6通過在HSA和hGH間加入切割位點(diǎn)表達(dá)hGH。
在HA-hGH融合蛋白間引入一可被Kex2蛋白酶識別的多肽序列可分泌hGH。利用兩寡核苷酸HGH14和HGH15將一編碼絲氨酸(Ser)-亮氨酸(Leu)-天冬氨酸(Asp)-賴氨酸(Lys)-精氨酸(Arg)的序列引入。
HGH145′-TTAGGCTTAAGCTTGGATAAAAGATTCCCAAC-3′HGH155′-AATTGTTGGGAATCTTTTATCCAAGCTTAAGCC-3′這些用于將pHA1的Hind III-Bsu 36I片段接到pHGH1的EcoRI-Hind III片段上，然后克隆到Hind III酶切的pHA2中形成pHGH25(圖9)。將此質(zhì)粒的NotI表達(dá)盒克隆到NotI酶切的pSAC35中形成pHGH31(圖9)。將pHGH31轉(zhuǎn)化到釀酒酵母DB1中，SDS-PAGE分析培養(yǎng)上清液，發(fā)現(xiàn)其分泌兩種主要成分。此兩種成分的分子量分別約為與(全長)HA相當(dāng)?shù)?6KD，相當(dāng)于(全長)hGH的22KD，顯示體外可用Kex2蛋白酶或一相似活性蛋白酶切割此融合蛋白。用抗HSA和抗hGH抗血清進(jìn)行的Western印跡證明了此兩種分離成分的存在。對hGH部分的N-端序列分析證明從HA部分的精確和有效的切割。
培養(yǎng)上清液先后通過陰離子交換層析和凝膠滲透層析以純化hGH部分。此純化的hGH的體外研究表明該蛋白具有活性并具全部的效價(jià)。
利用相似的策略，將含有HA第一個結(jié)構(gòu)域(第1至194個氨基酸殘基)，或者含有HA前兩個結(jié)構(gòu)域(第1至387個氨基酸殘基)，并接有可被Kex2P蛋白酶識別的序列及hGH cDNA的融合蛋白克隆到釀酒酵母DB1中并表達(dá)。對培養(yǎng)上清液用抗HSA和抗hGH抗血清進(jìn)行的Western印跡證明了此兩種獨(dú)立成分的存在。實(shí)施例7HSA和hGH通過一柔性接頭序列的融合通過寡核苷酸HGH 16，HGH 17，HGH 18，HGH 19的克隆，在HSA和hGH的融合蛋白間引入柔性接頭，該接頭含有[甘氨酸(Gly)-甘氨酸(Gly)-甘氨酸(Gly)-甘氨酸(Gly)-絲氨酸(Ser)]n重復(fù)單元(其中n可以是2或3)。
HGH165′-TTAGGCTTAGGTGGCGGTGGATCCGGCGGTGGTGGATCTTTCCAAC-3′HGH175′-AATTGTTGGGAAAGATCCACCACCGCCGGATCCACCGCCACCTAAGCC-3′HGH185′-TTAGGCTTAGGCGGTGGTGGATCTGGTGGCGGCGGATCTGGTGGCGGTGGATCCTTCCCAAC-3′HGH195′-AATTGTTGGGAAGGATCCACCGCCACCAGATCCGCCGCCACCAGATCCACCACCGCCTAAGCC-3′HGH 16和HGH 17間的退火導(dǎo)致n＝2，而HGH 18和HGH 19間的退火則導(dǎo)致n＝3。退火后，雙鏈寡核苷酸和來自于pHGH1的EcoRI-Bsu36I片段克隆到Bsu36I酶切的pHGH10中形成pHGH56(此時n＝2)和pHGH57(此時n＝3)(圖10)。相應(yīng)地，將這些質(zhì)粒的NotI表達(dá)盒克隆到NotI酶切的pSAC35中分別形成pHGH58和pHGH59。
如圖11中所示，形成pHGH56和pHGH57的寡核苷酸克隆的接頭序列中引入了一BamHI位點(diǎn)。因而可通過將來自于pHGH56的Hind III-BamHI片段連到來自于pHGH57的BamHI-Hind III片段上(使n＝1)，或?qū)碜杂趐HGH57的Hind III-BamHI片段連到來自于pHGH56的BamHI-HindIII片段上(使n＝2)以構(gòu)建接頭序列，此接頭序列中n＝1和n＝4。這些片段如實(shí)施例2中描述的那樣克隆到pHA2的Hind III位點(diǎn)中，分別形成pHGH60(n＝1)和pHGH61(n＝4)[見圖11]。來自于pHGH60和pHGH61的NotI表達(dá)盒克隆到NotI酶切的pSAC35中分別形成pHGH62和pHGH63。
用pHGH58，pHGH59，pHGH62和pHGH63轉(zhuǎn)化釀酒酵母形成可將融合多肽分泌到上清液中的轉(zhuǎn)化子。
利用抗HSA和抗hGH抗血清進(jìn)行的Western印跡試驗(yàn)證明融合蛋白中兩組成部分的存在。
培養(yǎng)上清先后通過陽離子交換層析，陰離子交換層析和凝膠滲透層析以純化融合蛋白。氨基酸序列分析此蛋白N-端證明了預(yù)期的白蛋白序列的存在。通過電噴射質(zhì)譜學(xué)(electrospray mass spectrometry)分析此純化的蛋白證明與實(shí)施例3中描述的HSA-hGH融合蛋白相比，此蛋白質(zhì)量如預(yù)期那樣增加了315D(n＝1)，630D(n＝2)，945D(n＝3)和1260D(n＝4)。體外實(shí)驗(yàn)中此純化蛋白具有活性。
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權(quán)利要求
1.一種由一個通過肽鍵連接在一起的氨基酸連續(xù)區(qū)域組成的多肽，包括與生長激素(GH)的一相同長度區(qū)至少具75％序列同源性的至少十個氨基酸的第一區(qū)和與血清白蛋白一相同長度區(qū)域至少具有75％序列同源性的至少十個氨基酸的第二區(qū)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的多肽，其中每個所述的第一區(qū)和第二區(qū)分別與所述長度的GH及白蛋白至少具有95％的序列同源性。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的一個多肽，其中每一個所述的第一區(qū)和第二區(qū)至少具50個氨基酸長。
4.根據(jù)任一前述權(quán)利要求的多肽，其中第一區(qū)由GH的C-末端的不間斷氨基酸，或其保守性修飾產(chǎn)物組成，而此多肽結(jié)合并激活的GH受體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的一個多肽，其中第一區(qū)為191個氨基酸長。
6.根據(jù)任一前述權(quán)利要求的一個多肽，其中的白蛋白和/或生長激素是人源的。
7.根據(jù)任一前述權(quán)利要求的一個多肽，其中第二區(qū)具有至少一個白蛋白的不間斷結(jié)構(gòu)域，或其保守性修飾產(chǎn)物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的一個多肽，其中第二區(qū)含有人白蛋白的1-105，120-194，195-291，316-387，388-491，512-585，1-194，195-387，388-585，1-387，或195-585的不間斷氨基酸，或其保守性修飾產(chǎn)物。
9.根據(jù)任一前述權(quán)利要求的一個多肽，其中此多肽的N-末端含有所說的第一區(qū)，而C-末端含有所說的第二區(qū)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一的多肽，其中該多肽的N-末端含有所說的第二區(qū)，而C-末端含有所說的第一區(qū)。
11.根據(jù)任一前述權(quán)利要求的一個多肽，含有所說第一區(qū)和第二區(qū)，任選地在此多肽的任一端再加入氨基酸或其它化合物。
12.一種微生物培養(yǎng)基，它含有轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和根據(jù)任一前述權(quán)利要求的多肽。
13.一種微生物培養(yǎng)基，具有根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一的多肽。
14.一種編碼根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一的多肽的多聚核苷酸。
15.一種微生物宿主，具有便于宿主中表達(dá)的根據(jù)權(quán)利要求14的多聚核苷酸。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的一個宿主，其中多肽由宿主分泌。
17.用于獲得根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一的多肽的方法，包括培養(yǎng)一種根據(jù)權(quán)利要求15或16的宿主及純化該多肽。
18.一種藥物制劑，含有根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一的多肽及藥物可接受的載體。
19.一種治療患有可用生長激素治療的疾病的病人的方法，該方法包括給病人施用緩解所說的病情的，不足以產(chǎn)生毒性量的根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一的多肽。
20.一種提高動物體內(nèi)瘦肉/肥肉的生長比率使之超過正常值的方法，包括對動物施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一的多肽。
21.一種生產(chǎn)生長激素的方法，包括在一種微生物宿主內(nèi)，優(yōu)選地在酵母中，表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求14的一個多核苷酸，此編碼的多肽因而在所述的第一區(qū)和第二區(qū)間有一個位點(diǎn)，此位點(diǎn)可被宿主中的一種酶所切割，或被任何其它的酶，或化學(xué)方法切割。
全文摘要
在酵母中良好分泌的白蛋白和生長激素的融合蛋白,或兩者變種的融合蛋白,并增加了血清和貯存的穩(wěn)定性。
文檔編號C07K14/61GK1207131SQ9619946
公開日1999年2月3日 申請日期1996年12月19日 優(yōu)先權(quán)日1995年12月30日
發(fā)明者戴維·J·巴蘭斯 申請人:達(dá)爾塔生物技術(shù)有限公司