專利名稱：具長半衰期的ob蛋白質(zhì)衍生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及半衰期長的OB蛋白質(zhì)衍生物。更具體地，本發(fā)明涉及OB蛋白質(zhì)-免疫球蛋白嵌合體、其他半衰期長的OB蛋白質(zhì)衍生物、以及含有這些衍生物的組合物和施用這些衍生物的方法。本發(fā)明還涉及一種通過施用半衰期長的OB蛋白質(zhì)的變異蛋白(如OB蛋白質(zhì)-免疫球蛋白嵌合體)而治療肥胖的方法。
背景技術(shù)：
肥胖癥是最常見的營養(yǎng)失調(diào)，根據(jù)最近的流行病學(xué)研究的結(jié)果，它影響著約1／3的全美國20歲以上人口。Kuczmarski等人，J．Am．Med．Assoc．272，25-11(1994)。肥胖癥導(dǎo)致各種不同的嚴重健康問題，其中包括心血管疾病、Ⅱ型糖尿病、胰島素抗藥性、高血壓、高甘油三酯血癥、血脂蛋白異常和某些形式的癌癥。Pi-Sunyer，F(xiàn)．X．，Anns．Int．Med．119，655-60(1993)；Colfitz，G．A．，Am．J．ClinNutr．55 503S-507S(1992)。已表明，單基因突變(肥胖癥或“ob”突變)會在小鼠中導(dǎo)致肥胖癥和Ⅱ型糖尿病。Friedam．Genomics 11，1054-1062(1991)。Zhang等人，自然372，425-431(1994)最近已報道了對小鼠ob基因及其人同源物進行的克隆和測序工作，并且揭示，ob基因產(chǎn)物可作為脂肪組織信號途徑中的一部分而發(fā)揮作用，它調(diào)節(jié)身體脂肪貯存的多少。在20多年前進行的異種共生(parabiosis)試驗預(yù)測，含有2個突變型ob基因拷貝的遺傳性肥胖小鼠(ob／ob小鼠)不會產(chǎn)生調(diào)節(jié)食物攝入飽脹因子(satiety factor)，而糖尿病(db／db)小鼠產(chǎn)生但是不作出應(yīng)答的飽脹因子。Coleman和Hummal，Am．J．Physiol．217，1298-1304(1969)；Coleman，Diabetol 9，294-98(1973)。3個獨立研究小組最近的報道表明，每天注射重組的OB蛋白質(zhì)可抑制食物攝入并可減少過肥的ob／ob小鼠的體重和脂肪，但是對db／db小鼠無作用(Pelleymounter等人，科學(xué)，269，540-43；Halaas等人，科學(xué)，269，543-46；Campfield等人，科學(xué)，269，546-549)，這暗示OB蛋白質(zhì)是正如早期交叉循環(huán)研究中所提出的飽脹因子。這些最早的研究結(jié)果留下了許多未解之謎，并且也表現(xiàn)出許多未解決的矛盾之處。例如，報道說，盡管每天注射OB蛋白質(zhì)對食物攝入和體重的影響，在瘦小鼠中是適度的，但是在這些報道中的一篇報道(Halaas等人，同上)中，用畜體組成分析表明身體脂肪有顯著下降，而在另一篇報道(Pelleymounter等人，同上)中卻沒有該現(xiàn)象，雖然體重同樣下降了。此外，Pelleymounter等人(同上)觀察到，出于某些未知的原因，用劑量為0．1mg／kg／天的OB蛋白質(zhì)進行處理的ob／ob小鼠，事實上體重增加了17．13％，而接受劑量為1mg／kg／天的OB的小鼠中，體重下降相當(dāng)普通。OB蛋白質(zhì)的受體尚沒有被鑒別出。盡管在目前還不能排除外周受體的存在，但是最近的報道，即在具有下丘腦病變的小鼠脂肪組織中ob基因的更高表達并不導(dǎo)致瘦肉表型，暗示OB蛋白并不直接作用于脂肪細胞。Maffei等人，美國科學(xué)院院報(Proc．Natl．Acad．Sci．)，92，6957-60(1995)。研究者暗示，至少有一種OB受體位于腦中。leptin受體(OB-R)的鑒別和表達克隆工作由Tartaglia等人，細胞，83，1263-71(1995)。Cioffi等人，自然，2，585-89(1996)描述了leptin受體的各種同種型。在PCT申請出版物No．WO 96／08510，(1996年3月21日出版)中描述了一種人血細胞生成素(hematopoetin)受體。一種OB蛋白質(zhì)受體公開于Tartaglia，等人，細胞，83，1263-71(1995)。
發(fā)明概述本發(fā)明基于這樣的觀察結(jié)果即當(dāng)OB蛋白質(zhì)以連續(xù)皮下輸注(infusion)形式給藥時，與相同劑量以每天皮下注射方式給藥相比，會明顯更有效地降低體重和脂肪組織重量。本發(fā)明還基于一個出乎意料的發(fā)現(xiàn)與天然的人OB相比，嵌合蛋白(其中OB多肽融合于免疫球蛋白的恒定區(qū))明顯能更有效力地減少體重和脂肪貯存，這時的條件是兩種蛋白質(zhì)每天皮下注射給藥一次。后一觀察結(jié)果特別令人吃驚，因為OB蛋白質(zhì)-免疫球蛋白嵌合體的分子量大，所以預(yù)期不能通過腦血屏障達到據(jù)信位于腦中的OB受體。
一方面，本發(fā)明涉及半衰期長的OB蛋白質(zhì)衍生物，它能夠減少受處理個體的體重和／或食物攝入。本發(fā)明還涉及含有這些衍生物的組合物，以及為了減少體重和／或食物攝入而進行的施用。
另一方面，本發(fā)明涉及一類嵌合的多肽，該多肽包括與免疫球蛋白序列相連的、能夠結(jié)合天然OB受體的OB蛋白質(zhì)氨基酸序列(簡稱為OB-免疫球蛋白嵌合體或免疫粘附素)。在一具體例子中，嵌合的多肽是能夠結(jié)合天然OB受體的OB氨基酸序列與免疫球蛋白恒定區(qū)序列相連的形成的融合蛋白。本發(fā)明嵌合體的OB部分宜具有足夠的、來自天然OB蛋白質(zhì)的氨基酸序列，從而保留能與天然OB受體結(jié)合并能通過天然OB受體傳遞信號的能力。最佳地，當(dāng)施用于肥胖者或非人的對象時，OB蛋白質(zhì)保留能降低體重的能力。較佳地，OB多肽是人的，而且融合較佳地是與免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)序列融合。在一個具體例子中，2個OB多肽-免疫球蛋白重鏈融合蛋白的締合(如通過二硫鍵而共價連接起來)導(dǎo)致形成了同二聚體型的免疫球蛋白樣的結(jié)構(gòu)。免疫球蛋白輕鏈還可進一步地與二硫鍵連接的二聚體中的一個或兩個OB-免疫球蛋白嵌合體締合，從而形成同三聚體或同四聚體結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明嵌合多肽鏈的核酸、含有編碼這些分子的DNA的表達載體、轉(zhuǎn)化的宿主細胞、以及通過培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細胞而產(chǎn)生這些分子的方法。
盡管本發(fā)明的長半衰期的衍生物對于減少體重和／或食物攝入特別有用，但是它們一般可被用于治療與OB基因的表達或功能異常有關(guān)的病癥，和／或引起OB受體介導(dǎo)的生物反應(yīng)。因此，本發(fā)明的OB衍生物可用于治療食欲過盛(bulemia)、降低胰島素水平(如在Ⅰ型或Ⅱ糖尿病人中)、以及作為表達OB受體的各種細胞類型的促分裂原。所有這些以及有關(guān)的應(yīng)用都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
另一實施例中，本發(fā)明還涉及使用OB蛋白-免疫球蛋白嵌合體來純化OB受體。
附圖簡述圖1，上方--以連續(xù)皮下輸注方式或每天皮下注射方式，用鼠OB蛋白處理瘦型雌性小鼠。顯示的數(shù)據(jù)是以克表示的每組的平均體重，n=4只小鼠／點。
圖1下方--顯示了腹膜后脂肪墊的平均重量。連續(xù)地皮下輸注OB蛋白質(zhì)也能比每天皮下注射更有效地降低脂肪組織的重量。
圖2上方--用人OB蛋白(hOB)或用人OB-IgG-1融合蛋白(hOB-IgG-1)處理肥胖的雌性ob／ob小鼠。顯示的數(shù)據(jù)是，以克表示的，每個處理組中從試驗第一天至最后一天期間體重的平均變化值，其中n=3只小鼠／數(shù)據(jù)柱，但是hOB 0．19mg／kg／天的注射組中n=4而PBS注射組中n=1。
圖2下方-顯示的數(shù)據(jù)是每個處理組在6個24小時的試驗期間內(nèi)的平均食物攝入量，以克／小鼠／天表示，n=1頭／數(shù)據(jù)柱。
圖3上方和下方--用hOB或hOB-IgG-1，通過每天皮下注射7天而處理肥胖的雌性ob／ob小鼠。數(shù)據(jù)如圖2那樣進行描述，對所有的處理組n都是4只小鼠。
圖4上方--用人蛋白(hOB)或用PEG-hOB處理肥胖的雌性ob／ob小鼠。顯示的數(shù)據(jù)是，以克表示的，每個處理組中從試驗第一天至最后一天期間體重的平均變化值，其中n=3-4只小鼠／數(shù)據(jù)柱，但是對于PBS注射組，n=1。物質(zhì)是每天皮下注射的?！癙EF1X”和“PEG2X”指制備分子時PEG試劑對蛋白質(zhì)的比例。
圖4下方-顯示的數(shù)據(jù)是每個處理組在6個24小時的試驗期間內(nèi)的平均食物攝入量，以克／小鼠／天表示，n=3-4頭／數(shù)據(jù)柱。
圖5--用hOB-IgG融合蛋白、天然hOB或hCD4-IgG，通過每天皮下注射7天而處理肥胖的(ob／ob)雌性小鼠。對于所有的處理組，n=6只，但是對于3．8mg／kg／天的hOB組，n=2。同樣觀察到，在減少體重(上圖和中圖)和食物攝入方面，融合蛋白比天然hOB蛋白更有效。
圖6--實施例1中人OB-IgG-1嵌合體的核苷酸序列(SEQ ID NO1)和氨基酸序列(SEQ ID NO2)。
發(fā)明詳述A．定義術(shù)語“肥胖”指與具有過多身體脂肪有關(guān)的身體過重的狀況。對于某個個體而言，合適的體重取決于許多因素，其中包括性別、高度、年齡、總的身體構(gòu)造等。這些相同的因素也用于確定個體是否被認為肥胖。確定給定個體的最佳體重，是一般醫(yī)師能夠做到的。
術(shù)語“長半衰期”及其語法上的變化形式，當(dāng)與OB衍生物一起使用時，指與相應(yīng)的天然OB蛋白質(zhì)相比，OB衍生物具有更長的血漿半衰期和／或更慢的清除情況。長半衰期衍生物宜具有比天然OB蛋白質(zhì)長至少1．5倍的半衰期；較佳地比天然OB蛋白質(zhì)長至少2倍的半衰期；更佳地比天然OB蛋白質(zhì)長至少3倍的半衰期。較佳地，天然OB蛋白質(zhì)是待治療的個體的蛋白質(zhì)。
術(shù)語“OB”、“OB多肽”、“OB蛋白質(zhì)”及其語法上的變化形式可互換使用，它們指“天然的”或“天然序列的”O(jiān)B蛋白質(zhì)(也被稱為“l(fā)eptin”)及其功能衍生物。OB多肽具有典型的細胞因子結(jié)構(gòu)特征，即由一種細胞群釋放并且作為細胞間中介體作用于其他細胞的多肽，比如生長激素、胰島素樣生長因子、白細胞介素、胰島素、糖蛋白激素，如促卵泡激素(FSH)；促甲狀腺素(TSH)；腫瘤壞死因子-α和β(TNA-α和TNF-β)；神經(jīng)生長因子如NGF-β、PDGF；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)如TGF-α和TGF-β；胰島素樣生長因子-1和-2(IgF-1和IgF-2)；促紅細胞生成素；骨誘導(dǎo)因子(osteoinductive factors)；干擾素(IFN)如IFN-α，IFN-β和IFN-γ；集落刺激因子(CSF)如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白細胞介素(IL)如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8；以及其他多肽因子。
術(shù)語“天然的”和“天然序列的”O(jiān)B多肽指來自任何動物物種(如人、鼠、兔、牛、羊、雞、豬、馬等)的、天然存在的OB多肽，其中包括目前已知的或未來可能被鑒別出的、天然存在的等位基因、缺失、取代和／或插入變異體，只要它們保留結(jié)合于OB受體以及較佳地通過OB受體傳遞信號的能力。因此，天然的人OB多肽包括圖6中所示的氨基酸序列中從N端至167位之間的氨基酸序列(還可參見SEQ ID NO2和Zhang等人，(同上)中的圖6)，以及該蛋白質(zhì)的目前已知的或未來可能被鑒別出的、天然存在的變異蛋白。類似地，“天然的”或“天然序列的”鼠OB多肽具有Zhang等人，(同上)的圖6中所示的氨基酸序列，以及該蛋白質(zhì)的目前已知的或未來可能被鑒別出的、天然存在的變異蛋白。該定義具體地包括在氨基酸49位(采用Zhang等人(同上)的氨基酸編號)有或沒有谷氨酰胺的變異蛋白?！疤烊坏摹被颉疤烊恍蛄械摹監(jiān)B多肽包括具有或不具有起始的N端甲硫氨酸(Met)、具有或不具有天然信號序列的天然蛋白，無論其處于單體形式還是二聚體形式。本領(lǐng)域中已知的天然的人和鼠OB多肽長167個氨基酸，含有2個保守半胱氨酸，并且具有分泌型蛋白質(zhì)的特征。該多肽大多是親水的，其預(yù)計的信號序列切割位點是21位(采用Zhang等人(同上)的氨基酸編號)。人和鼠序列之間的全序列同源性約為84％。這2種蛋白質(zhì)在成熟蛋白質(zhì)的N端區(qū)域具有更廣的相同性，其中僅有的4個保守的和3個非保守的取代位于信號肽切割位點和117位保守半胱氨酸之間。單體形式的OB蛋白質(zhì)的分子量約為16千道爾頓。
天然多肽的“功能衍生物”是具有與天然多肽共同的定性生物特性的化合物。OB多肽的功能衍生物是具有與天然(人的或非人的)OB多肽共同的定性生物特性的化合物?！肮δ苎苌铩卑?但并不限于)任何動物物種(包括人)的天然多肽片段、以及天然(人的和非人的)多肽和其片段的衍生物，只要它們具有與相應(yīng)天然多肽相同的生物活性。
“片段”包括在成熟的天然OB多肽序列中的區(qū)域。優(yōu)選的OB多肽片段包括成熟蛋白質(zhì)的C末端，而且可在N端和其他對于受體結(jié)合和／或結(jié)構(gòu)完整性不需要的分子部分具有較小的缺失。
術(shù)語“衍生物”被用于定義氨基酸序列變異體，以及天然多肽的共價修飾形式；而術(shù)語“變異體(變異蛋白)”指該定義中的氨基酸序列變異體。
在定義“功能衍生物”的上下文中的“生物特性”被定義為或者(1)與天然多肽(即任何物種的天然OB多肽)的至少一個表位發(fā)生免疫交叉反應(yīng)，或者(2)定性地具有與天然多肽相同的至少一種粘附、調(diào)控或效應(yīng)子功能。
較佳地，功能衍生物是與天然多肽相比具有至少約65％氨基酸序列相同，較佳地約75％氨基酸序列相同，更佳地至少約85％氨基酸序列相同，最佳地至少約95％氨基酸序列相同的多肽。在本發(fā)明上下文中，天然序列的人OB多肽的功能衍生物優(yōu)選地與天然OB蛋白具有至少約95％氨基酸序列相同，而且在人體中是非免疫原性的。
氨基酸序列的相同性或同源性在此處被定義為在候選序列中，與相應(yīng)的天然多肽序列中殘基相同的氨基酸殘基的百分比，其中將兩個序列對齊排列并引入空隙(如果需要)，從而實現(xiàn)最大百分比的同源性，并且保守性取代不認為是序列相同性的一種。N端和C端的延伸部分或插入都不認為會降低相同性或同源性。
如本文所用，免疫交叉反應(yīng)意指，候選(多)肽能夠競爭性地抑制相應(yīng)天然多肽的定性的生物活性，該天然多肽具有與針對已知活性分子而產(chǎn)生的多克隆抗體或抗血清進行反應(yīng)的活性。這些抗體和抗血清是以常規(guī)方式，通過將已知的天然OB蛋白質(zhì)和Freud氏完全佐劑皮下注射入動物(如羊和兔)，然后用Freud氏不完全佐劑進行加強腹腔內(nèi)注射或皮下注射而制得的。
術(shù)語“分離的OB多肽”及其語法上的變化形式都指從存在于人、其他動物、或其他可分離出該多肽來源中混雜多肽中分離出的OB多肽(如上所定義)。
一般，術(shù)語“氨基酸序列變異體”指與參照多肽(如天然序列)相比，在氨基酸序列上有某些差異的分子。氨基酸改變可以是在天然氨基酸序列中的取代、插入、缺失或這些變化的任何所需的組合形式。
取代變異體是在天然序列中有至少一個氨基酸殘基被去除并且在相同位置上插入不同氨基酸的變異蛋白。取代可以是單取代，其中分子中僅一個氨基酸被取代；也可以是多取代，其中在同一分子中有2個或多個氨基酸被取代。
插入變異體是在天然氨基酸序列中緊挨著特定位置處的氨基酸而插入一個或多個氨基酸。緊挨著某氨基酸意指，連接于該氨基酸的α-羧基或α-氨基官能團。
缺失變異體是在天然氨基酸序列中有一個或多個氨基酸被去除的變異體。一般，缺失變異體在分子特定區(qū)域缺失一個或2個氨基酸。
“共價衍生物”包括天然多肽或其片段與有機蛋白衍生劑(derivatizing agent)或非有機蛋白衍生劑形成的修飾形式，以及翻譯后的修飾形式。共價修飾形式一般是通過將靶氨基酸殘基與有機衍生劑反應(yīng)而引入(其中該衍生劑能夠與選定的位點或末端殘基反應(yīng))，或者通過利用在選定的重組宿主細胞中起作用的翻譯后修飾機制而引入。某些翻譯后修飾形式是重組宿主細胞對所表達的多肽作用的結(jié)果。谷氨酰胺酰基和天冬酰胺?；ǔＴ诜g后被脫去氨基，分別形成相應(yīng)的谷氨?；吞於滨；??；蛘撸@些殘基在微酸的條件下脫去氨基。這2種殘基的任何一種形式都可存在于本發(fā)明的OB-免疫球蛋白嵌合體中。其他的翻譯后修飾形式包括脯氨酸和賴氨酸的羥基化，絲氨?；?、酪氨酸或蘇氨?；狭u基的磷酸化，賴氨酸、精氨酸和組氨酸側(cè)鏈上α-氨基的甲基化[T．E．Creighton，ProteinsStructure and Molecular Properties，W．H．Freeman & Co．，San Francisco，pp．79-86(1983)]。
術(shù)語“編碼……的DNA序列”、“編碼……的DNA”和“編碼……的核酸”指沿著脫氧核酸核糖核酸鏈的脫氧核糖核苷酸的順序或序列。這些脫氧核糖核苷酸的順序決定了沿著多肽鏈的氨基酸順序。這樣，DNA序列便編碼了氨基酸序列。
術(shù)語“可復(fù)制的表達載體”和“表達載體”指一種DNA，它通常是雙鏈的而且其中可插入一段外源DNA。外源DNA被定義為外來的DNA，它是并不天然存在于宿主細胞中的DNA。載體被用于將外源或外來DNA運送到合適的宿主細胞中。一旦位于宿主細胞中，載體可以獨立于宿主染色體DNA進行復(fù)制，從而可以產(chǎn)生多個拷貝的載體及其插入的(外源)DNA。此外，載體含有用于將外源DNA翻譯成多肽的必要元件。這樣，便可以快速地合成許多由外源DNA所編碼的多肽分子。
術(shù)語“調(diào)控序列”指，在特定宿主生物中表達可操作地連接著的編碼序列時所需的DNA序列。適用于原核生物的調(diào)控序列包括例如啟動子、可有可無的操縱子序列、核糖體結(jié)合位點、以及其他目前認識還不深的序列。已知真核細胞會利用啟動子、聚腺苷酸化信號和增強子。
當(dāng)核酸被放置，從而與另一核酸序列有功能上聯(lián)系時，那么該核酸就是“可操作地連于…(或連接的)”。例如，前序列(presequence)或分泌前導(dǎo)序列的DNA是可操作地連于多肽DNA的，如果它以參與多肽分泌的前蛋白(preprotein)形式表達的話；啟動子或增強子是可操作地連于編碼序列的，如果它的影響序列轉(zhuǎn)錄的話；核糖體結(jié)合位點是可操作地連于編碼序列的，如果它位置有助于翻譯。一般，“可操作地連于”意指被連接的DNA序列是毗連的(或鄰接的)，而在分泌前導(dǎo)序列的情況下是毗連的和處于閱讀相(read phase)的。然而，增強子不必是毗連的。連接可通過在方便的限制性位點處進行連接而實現(xiàn)。如果不存在這樣的位點，那么可以根據(jù)常規(guī)操作使用合成的寡核苷酸銜接頭或接頭。
在本發(fā)明的上下文中，詞語“細胞”、“細胞系”和“細胞培養(yǎng)物”可互換使用，而且所用這些名稱都包括子代。因此，詞語“轉(zhuǎn)化體”和“轉(zhuǎn)化的(宿主)細胞”包括原代的對象細胞以及由其衍生而得的培養(yǎng)物，而不論傳代次數(shù)。還應(yīng)理解，因為故意的或非故意的突變，所有的子代可能其DNA內(nèi)容并不完全相同。具有與篩選最初轉(zhuǎn)化細胞時相同的功能或生物活性的突變子代被包括在內(nèi)。在需要明確指定的情況下，會在上下文中加以說明。
天然免疫球蛋白一般是約150，000道爾頓的異四聚體糖蛋白，它由2條相同的輕鏈(L)和2條相同的重鏈(H)構(gòu)成。每條輕鏈通過一個共價二硫鍵而連于重鏈，而在不同的免疫球蛋白同種型(isotype)的重鏈之間，二硫鍵的數(shù)目是不同的。每一重鏈和輕鏈也有規(guī)則地間隔的鏈內(nèi)二硫鍵。每條重鏈在一端有可變區(qū)(VH)，然后是多個恒定區(qū)。每條輕鏈在一端有可變區(qū)(VL)，在另一端有恒定區(qū)；輕鏈的恒定區(qū)與重鏈的第一個恒定區(qū)相對應(yīng)，而輕鏈可變區(qū)與重鏈的可變區(qū)相對應(yīng)。據(jù)信，有特定的氨基酸殘基在輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)之間形成界面(Clothia等人J．Mol．Biol．186651-663；Novotny和Haber，美國科學(xué)院院報(Proc．Natl．Acad．Sci．USA)，824592-4596)。
根據(jù)它們重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，免疫球蛋白可被分成不同的類別。有5種主要的免疫球蛋白類別IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中某些還可被進一步劃分為亞類(同種型)，如IgG-1、IgG-2、IgG-3、IgG-4、IgA-1和IgA-2。對應(yīng)于不同類別免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)分別被稱為α、δ、ε、γ、和μ。不同類別的免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是熟知的。IgA-1和IgA-2是IgA的單體亞類，而IgA通常是二聚體或更高的多聚體的形式。在腸胃(gut)中的免疫細胞主要產(chǎn)生多聚體型的IgA(也稱為聚-IgA，其中包括二聚體和更高的多聚體)。這種聚-IgA含有二硫鍵連接的多肽(被稱為“連接”鏈或“J”鏈)，而且可以與具有5個亞基并含有J鏈的多聚體型IgM(poly-IgM)一起被運送通過腺上皮。
雜交宜在“嚴緊條件”下進行，嚴緊條件意味著(1)洗滌時采用高溫度和低離子強度，如0．015M氯化鈉／0．0015M檸檬酸鈉／0．1％十二烷基磺酸鈉，50℃，或者(2)在雜交期間采用變性劑如甲酰胺，如50％(體積／體積)甲酰胺和0．1％牛血清白蛋白／0．1％聚蔗糖(Ficoll)／0．1％聚乙烯吡咯烷酮／50nM磷酸鈉緩沖液(pH6．5)以及750mM氯化鈉、75mM檸檬酸鈉，42℃。另一例子是使用50％甲酰胺、5×SSC(0．75M氯化鈉、0．075M檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH6／8)，0．1％焦磷酸鈉、5×Denhartdt＇s溶液、超聲波處理過的鮭精DNA(50微克／毫升)、0．1％SDS、和10％葡聚糖硫酸酯，42℃；并于42℃，在0．2×SSC和0．1％SDS中進行洗滌。
B．OB蛋白-免疫球蛋白嵌合體(免疫粘附素)免疫粘附素(immunoadhesin)是嵌合的、類似抗體的分子，它將結(jié)合蛋白(通常是受體、細胞粘附分子或配體)的功能結(jié)構(gòu)域與免疫球蛋白序列相合并。這種類型融合蛋白的最常見例子是，將免疫球蛋白(Ig)的絞鏈區(qū)和Fc區(qū)，與識別特異性配體的細胞表面受體的結(jié)構(gòu)域相結(jié)合。這種類型的分子被稱為“免疫粘附素”，因為它同時具有“免疫”和“粘附”功能；其他經(jīng)常使用的名稱是“Ig-嵌合體”、“Ig-”或“Fc-融合蛋白”、或“受體-球蛋白”。
目前為止，在本領(lǐng)域中已報道了50種以上的免疫粘附素。在文獻中已報道的免疫粘附素包括融合T細胞受體(Gascoigne等人，美國科學(xué)院院報842936-2940[1987))；CD4(Capan等人，自然337525-531；Traunecker等人，自然33968-70；Zettmeissl等人，DNA細胞生物學(xué)USA 9347-353；和Byrn等人，自然344667-670)；L-選擇蛋白(歸巢受體)(Watson等人，J．Cell．Biol．1102221-2229；和Watson等人，自然349164-167)；E-選擇蛋白(Mulligan等人，免疫學(xué)雜志(J．Immunol．)151，6410-17；Jacob等人，生物化學(xué)，34，1210-1217)；P-選擇蛋白(Mulligan等人，同上；Hollenbaugh等人，生物化學(xué)，34，5678-84)；ICAM-1(Staunton等人，J．Exp．Med．176，1471-1476；Martin等人，J．Virol．67，3561-68；Roep等人，柳葉刀(Lancet)343，1590-93)；ICAM-2(Damle等人，免疫學(xué)雜志(J．Immunol．)148，665-71)；ICAM-3(Holness等人，生物化學(xué)雜志(J．Biol．Chem．)270，877-84)；LFA-3(Kanner等人，免疫學(xué)雜志(J．Immunol．)148，2-23-29)；L1糖蛋白(Doherty等人，Neuron 14，57-66)；TNF-R1(Ashkenazi等人，美國科學(xué)院院報8810535-10539；Lesslauer等人，歐洲免疫學(xué)雜志(Eur．J．Immunnl．)212883-2886；和Peppel等人，J．Exp．Med．1741483-1489)；TNF-R2(Zack等人，美國科學(xué)院院報90，2335-39；Wooley等人，免疫學(xué)雜志(J．Immunol．)151，6602-07)；CD44(Aruffo等人，細胞611303-1313)；CD28和B7(Linsley等人，J．Exp．Med．173721-730)；CTLA-4(Lisley等人，J．Exp．Med．174561-569)；CD22(Stamenkovic等人，細胞661133-1144)；NP受體(Bennett等人，J．Biol．Chem．26623060-23067)；IgE受體α(Ridgway和Gorman，J．Cell．Biol．115，摘要．1448)；HGF受體(Mark M．R．等人，1992，生物化學(xué)雜志(J．Biol．Chem．)，提交的)；干擾素γ Rα-和β-鏈(Marsters等人，美國科學(xué)院院報92，5401-05)；trk-A、-B和-C(Shelton等人，J．Neurosci．15，477-91)；IL-2(Landolfi，免疫學(xué)雜志(J．Immunol．)146，915-919)；IL-10(Zheng等人，免疫學(xué)雜志，154，5590-5600)。
最簡單和最直接的免疫粘附素設(shè)計，是將“粘附素”蛋白質(zhì)的結(jié)合區(qū)域與免疫球蛋白轉(zhuǎn)錄的絞鏈區(qū)和Fc區(qū)結(jié)合在一起。一般，當(dāng)制備本發(fā)明的OB-免疫球蛋白嵌合體時，將編碼所需OB多肽的核酸融合于編碼免疫球蛋白恒定區(qū)序列N末端的核酸的C末端，然而也可以融合于N末端。典型地，在這種融合方式中，所編碼的嵌合多肽會保留至少有功能活性的、免疫球蛋白轉(zhuǎn)錄恒定區(qū)的絞鏈區(qū)、CH2區(qū)和CH3區(qū)。融合還可連于恒定區(qū)Fc部分的C末端、或剛好在轉(zhuǎn)錄重鏈CH1或輕鏈的相應(yīng)區(qū)域的N末端處進行融合。進行融合的確切位點并不重要；具體的位點是眾所周知的并且可以選擇，以優(yōu)化OB-免疫球蛋白嵌合體的生物活性、分泌或結(jié)合特性。
在一個優(yōu)選例子中，將天然的成熟OB多肽序列融合于抗體C末端部分(尤其是Fc區(qū))的N末端，該C末端部分具有免疫球蛋白如IgG-1的效應(yīng)子功能?？梢詫⒄麄€重鏈恒定區(qū)融合于OB序列。然而，更佳的是，用于融合的是從剛好位于木瓜蛋白酶酶切位點(該位點在化學(xué)上定義了IgG Fc；即殘基216，將重鏈恒定區(qū)的第一個殘基定為殘基114[Kobet等人，同上]，或其他免疫球蛋白的類似位點)上游的絞鏈區(qū)開始的序列。在一個特別優(yōu)選的例子中，OB多肽序列被融合于IgG-1、IgG-2或IgG-3重鏈的絞鏈區(qū)以及CH2和CH3，或者CH1、絞鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)。融合的確切位置并不重要，并且可通過常規(guī)的試驗方法確定最佳位置。
在某些例子中，OB-免疫球蛋白被裝配成多聚體形式，尤其是同二聚體或同四聚體(WO 91／08298)。一般，這些裝配的免疫球蛋白會具有已知的單元結(jié)構(gòu)。一種基本的4鏈結(jié)構(gòu)單元是IgG、IgD、和IgE存在的形式。4鏈單元在分子量更大的免疫球蛋白中會重復(fù)；IgM一般是由二硫鍵維持在一起的4種基本單元構(gòu)成的五聚體。IgA球蛋白以及偶爾IgG球蛋白也可以多聚體形式存在于血清中。在多聚體情況下，4種單元中的每一種可以相同或不同。
在此處范圍內(nèi)的、各種代表性的、裝配的OB-免疫球蛋白嵌合體被示意性地如下表示(a)ACL-ACL；(b)ACH-[ACH，ACL-ACH，ACL-VHCH，或VLCL-ACH]；(c)ACL-ACH-[ACL-ACH，ACL-VHCH， VLCL-ACH，或VLCL-VHCH]；(d)ACL-VHCH-[ACH，或ACL-VHCH，或VLCL-ACH]；(e)VLCL-ACH-[ACL-VHCH，或VLCL-ACH]；和(f)[A-Y]n-[VLCL-VHCH]2，其中，每個A表示相同或不同的OB多肽氨基酸序列；VL是免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)；VH是免疫球蛋白重鏈可變區(qū)；
CL，是免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)；CH是免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)；n是大于1的整數(shù)；Y是共價交聯(lián)劑的殘基。
為了簡潔起見，上述結(jié)構(gòu)中僅顯示了關(guān)鍵特征，它們沒有顯示免疫球蛋白的連接(J)區(qū)或其他的區(qū)域，也沒有顯示二硫鍵。然而，當(dāng)為了結(jié)合活性而需要這些區(qū)域時，它們應(yīng)被構(gòu)建并處于它們在免疫球蛋白分子中所處的常規(guī)位置。
或者，可將OB氨基酸序列插入免疫球蛋白重鏈和輕鏈之間，這樣便獲得了具有嵌合重鏈的免疫球蛋白。在這種情況下，OB多肽序列就被融合于免疫球蛋白每個臂中免疫球蛋白重鏈的3＇端，或者在絞鏈和CH2區(qū)之間，或者在CH2和CH3區(qū)之間。類似的構(gòu)建物已由Hoogenboom，H．R．等人，分子免疫學(xué)281027-1037(1991)報道過。
盡管在本發(fā)明的免疫粘附素中并不要求存在免疫球蛋白輕鏈，但是可以存在免疫球蛋白輕鏈，它或者共價地連于OB蛋白-免疫球蛋白重鏈融合多肽，或者直接融合于OB多肽。在前一種情況下，編碼免疫球蛋白輕鏈的DNA一般與編碼OB-免疫球蛋白重鏈融合蛋白的DNA共表達。一旦分泌，雜合體的重鏈和輕鏈會共價締合，從而形成免疫球蛋白樣(immunoglobulin-like)的結(jié)構(gòu)，它含有2個由二硫鍵連接的免疫球蛋白重鏈-輕鏈對。適用于制備這種結(jié)構(gòu)物的方法公開于例如美國專利No．4，816，567(1989年3月28日授權(quán))。
在一個優(yōu)選例子中，用于構(gòu)建本發(fā)明的免疫粘附素的免疫球蛋白序列來自IgG免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)。對于人的免疫粘附素，優(yōu)選使用人的IgG-1和IgG-3免疫球蛋白序列。使用IgG-1的一個主要優(yōu)點是，IgG-1免疫粘附素可以有效地在固定化的蛋白質(zhì)A上被純化。相反，IgG-3的純化需要蛋白質(zhì)G(一種多用途性較差的介質(zhì))。但是，當(dāng)選擇用于特定的免疫粘附素構(gòu)建中的Ig融合配對物時，應(yīng)考慮免疫球蛋白的其他結(jié)構(gòu)和功能特性。例如，IgG-3的絞鏈更長和更柔韌，所以它可容納更大的“粘附素”結(jié)構(gòu)域，而這些“粘附素”結(jié)構(gòu)域在融合于IgG-1時，可能不能正常地折疊或發(fā)揮功能?；贗gG的可能的免疫粘附素結(jié)構(gòu)示于圖3a-c。盡管IgG免疫粘附素一般是一價或二價的，但是其他Ig亞型如IgA和IgM會分別產(chǎn)生由基本的Ig同二聚體單元構(gòu)成的二聚體的或五聚體的結(jié)構(gòu)。典型的基于IgM的多聚體型免疫粘附素示于圖3d。多聚體型免疫粘附素的優(yōu)點在于，與基于IgG的對應(yīng)免疫粘附素相比，它們能夠以更大的親和力結(jié)合各自的靶目標。已報道的這種結(jié)構(gòu)的例子是CD4-IgM(Traunecker等人，同上)；ICAM-IgM(Martin等人，病毒學(xué)雜志(J．Virol．)67，3561-68)；和CD2-IgM(Arulanandam等人，J．Exp．Med．177，1439-50)。
對于設(shè)計用于體內(nèi)的OB-Ig免疫粘附素，藥物動力學(xué)性質(zhì)和Fc區(qū)導(dǎo)致的效應(yīng)子功能也是重要的。盡管IgG-1、IgG-2和IgG-4都有21天的體內(nèi)半衰期，但是它們激活補體系統(tǒng)的有關(guān)能力卻不相同。IgG-4不激活補體，而與IgG-1相比，IgG-2激活補體的能力非常弱。此外，與IgG-1不同，IgG-2不結(jié)合單核細胞或嗜中性白細胞上的Fc受體。盡管IgG-3對于補體激活是最佳的，但是其體內(nèi)半衰期約為其他IgG同種型的1／3。對于用于人體治療的免疫粘附素的另一重要考慮因素是，某一同種型的同種異型(allotypic)變體的數(shù)目。一般，優(yōu)選的是按血清學(xué)上劃分時同種異型較少的IgG同種型。例如，IgG-1僅有4種血清學(xué)同種異型位點，其中2種(Glm和2)位于Fc區(qū)；而且這些位點中的一個即Glm是非免疫原性的。與之相反，IgG-3有12種血清學(xué)的同種異型，所有的都位于Fc區(qū)；這些位點中僅有3個(G3m5、11和21)具有一個非免疫原性的同種異型。這樣，γ3免疫粘附素潛在的免疫原性就大于γl免疫粘附素。
在設(shè)計本發(fā)明的OB-Ig免疫粘附素時，對于分子的受體結(jié)合、結(jié)構(gòu)完整性(如適當(dāng)?shù)恼郫B)和／或生物活性等而言不需要的區(qū)域可以被刪去。在這種結(jié)構(gòu)中，重要的是，將融合連接處置于位于結(jié)構(gòu)域之間的殘基處，從而避免錯誤的折疊。至于親代免疫球蛋白，一種有用的接點是正好位于絞鏈區(qū)中半胱氨酸的上游，該半胱氨酸在兩個重鏈之間形成二硫鍵。在一種經(jīng)常使用的設(shè)計中，將對應(yīng)于分子的“粘附素”(OB)部分的C末端殘基的密碼子，正好置于編碼IgG1絞鏈區(qū)的序列DKTHTCPPCP的密碼子上游。
最方便的是，通過將編碼處于閱讀框的OB部分的cDNA序列融合于Ig的cDNA序列，從而構(gòu)建OB-Ig免疫粘附素。然而，還可以融合于基因組Ig片段(參見例如Gascoigne等人，美國科學(xué)院院報84，2936-2940；Aruffo等人，細胞，611303-1313；和Stamenkovic等人，細胞661133-1144)。后一種類型的融合需要存在Ig調(diào)控序列以便表達?？梢愿鶕?jù)出版的序列，從來自脾或外周血淋巴細胞的cDNA文庫中，通過雜交或聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)分離出編碼IgG重鏈恒定區(qū)的cDNA。例如，鼠OB cDNA可通過PCR法從鼠脂肪組織cDNA文庫(Clontech)中獲得，其中可使用基于Zhang等人的序列而設(shè)計引物?？梢杂妙愃频姆绞将@得人OB cDNA?；蛘撸蓪⑹驩B基因用作探針，從例如Zhang等人描述的λgtⅡ文庫中分離出人脂肪組織的cDNA克隆(Clontech)。編碼免疫粘附素的“粘附素”和Ig部分的cDNA被串聯(lián)式地插入質(zhì)粒載體中，該質(zhì)粒載體在選定的宿主細胞中指導(dǎo)有效的表達。對于在哺乳動物細胞中進行表達，優(yōu)選的是基于pRK5的載體(Schall等人，細胞61，361-370)、pRK7載體和基于CDM8的載體(Seed，自然，329，840)。(除了在ClaⅠ和HindⅢ之間的多接頭中內(nèi)切核酸酶限制性位點的次序相反之外，pRK7與pRK5是相同的。請參見1992年1月28日授權(quán)的美國專利No．5，108，901)?？捎霉押塑账峤閷?dǎo)的缺失誘變法(Zolier和Smith，《核酸研究》(Nucleic．Acids Res．)10，6487；Capon等人，自然337，525-531)，通過去除位于設(shè)計的連接密碼子之間的多余序列，從而形成確切的接界(junction)。可使用合成的寡核苷酸，其中該寡核苷酸的每一半與所需接界的一側(cè)序列互補；而且較佳地這些寡核苷酸是36-48聚體?；蛘?，用PCR技術(shù)將分子的兩部分與合適的載體按閱讀框連接在一起。
免疫粘附素可在多種宿主細胞中有效地表達，其中包括骨髓瘤細胞系、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、猴COS細胞、人胚胎腎293細胞和桿狀病毒感染的昆蟲細胞。在這些系統(tǒng)中，免疫粘附素多肽被裝配和分泌入細胞培養(yǎng)基中。還可以作為宿主使用的是酵母如釀酒酵母、巴士德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)等，以及細菌細胞，尤其是大腸桿菌。OB-免疫球蛋白嵌合體可以在酵母中表達，比如用類似于下述文獻中所述的表達OB蛋白的方法Leiber等人，Crit．Res．Food Sci．Nutr．33，351(1993)；Friedman和Leibel，細胞69，217(1992)；以及Beavis和Chait，美國科學(xué)院院報87，6873(1990)。這樣，編碼序列可以被亞克隆入酵母質(zhì)粒，如酵母表達質(zhì)粒pPIC．9(Invitrogen)。該載體指導(dǎo)將異源蛋白質(zhì)從酵母中分泌到培養(yǎng)基中。根據(jù)Halaas等人(同上)，在用載體轉(zhuǎn)化的釀酒酵母中，鼠和人OB基因的表達產(chǎn)生了一種分泌的16千道爾頓蛋白質(zhì)，這是未經(jīng)加工的、缺乏信號序列的OB蛋白。在大腸桿菌中表達鼠或人的OB-免疫球蛋白嵌合體，可以用例如類似于Halaas等人(同上)所述的程序進行。通過使用T7大腸桿菌RNA聚合酶系統(tǒng)，可將鼠和人OB-免疫球蛋白嵌合體的編碼序列亞克隆入PET15b表達載體(Novagen)中，然后在大腸桿菌(BL21(DE3)pIYsS)中表達?；蛘?，可以通過將閱讀框正確的編碼序列和大腸桿菌熱穩(wěn)定的腸毒素Ⅱ的分泌序列，插入大腸桿菌堿性磷酸酶啟動子的下游(Chang等人，基因55，189-96)，而在大腸桿菌中表達融合蛋白。
用于表達OB-Ig免疫粘附素的宿主細胞系的選擇，主要取決于表達載體。另一考慮因素是所需要的蛋白質(zhì)數(shù)量。用瞬時轉(zhuǎn)染?？僧a(chǎn)生毫克級數(shù)量。例如，通過改進的磷酸鈣法，用腺病毒EIA轉(zhuǎn)化的293人胚腎細胞系可以用基于pRK5和pRK7的載體進行瞬時轉(zhuǎn)染，從而有效地表達免疫粘附素。該方法在實施例中有闡述。基于CDM8的載體，可用于通過DEAE-葡聚糖法(Aruffo等人，細胞611303-1313；和Zettmeissl等人，DNA細胞生物學(xué)(US)9347-353)轉(zhuǎn)染COS細胞。如果需要更多數(shù)量的蛋白質(zhì)，那么可在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染宿主細胞系之后表達免疫粘附素。例如，在編碼二氫葉酸還原酶(DHFR)并賦予G418抗性的額外質(zhì)粒存在下，將基于pRK5或pRK7的載體引入中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。在培養(yǎng)物中選擇出對G418有抗性的克隆。在存在水平逐漸上升的DHFR抑制劑氨甲蝶呤下，使這些克隆生長，并選擇克隆，這樣編碼DHFR和免疫粘附素序列的基因拷貝數(shù)目便一起增加了。如果免疫粘附素在N-端含有疏水的前導(dǎo)序列，那么它可能被轉(zhuǎn)染的細胞所加工和分泌。結(jié)構(gòu)更復(fù)雜的免疫粘附素的表達會需要非常合適的宿主細胞。例如，諸如輕鏈或J鏈之類的元件可由某些骨髓瘤或雜交瘤宿主細胞所提供[Gascoigne等人，1987，同上；和Martin等人，病毒學(xué)雜志673561-3568(1993)]。
具有更復(fù)雜的寡聚體結(jié)構(gòu)的免疫粘附素的表達，會需要非常合適的宿主細胞。例如，諸如輕鏈或J鏈之類的元件可由某些骨髓瘤或雜交瘤宿主細胞所提供[Gascoigne等人，1987，同上；和Martin等人，病毒學(xué)雜志673561-3568(1993)]。
免疫粘附素可方便地用親和色譜進行純化。蛋白質(zhì)A作為親和配體的合適性，取決于在嵌合體中所用的免疫球蛋白Fc區(qū)的種類和同種型。蛋白質(zhì)A可用于純化基于人γ1、γ2或γ4重鏈的免疫粘附素(Lindmark等人，J．Immunol．Meth．621-13)。蛋白質(zhì)G被推薦用于所有小鼠的同種型和人的γ3(Guss等人，歐洲分子生物學(xué)協(xié)會雜志515671575)。至于親和配體所附著的基質(zhì)，最常見的是瓊脂糖，但是其他的基質(zhì)也是可行的。與瓊脂糖相比，機械上穩(wěn)定的基質(zhì)如受控的多孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯允許更快的流速和更短的處理時間。使免疫粘附素結(jié)合于蛋白質(zhì)A或G親和柱的條件，完全由Fc區(qū)的性質(zhì)(即其種類和同種型)所決定。一般而言，當(dāng)選擇了合適的配體時，便可與未處理的培養(yǎng)液中直接發(fā)生有效的結(jié)合。免疫粘附素的一種區(qū)別性特征是，對于人γ1分子，對蛋白質(zhì)A的結(jié)合能力相對于相同F(xiàn)c型的抗體而言有些下降。結(jié)合的免疫粘附素可有效地或者在酸性pH(大于或等于3．0)被洗脫，或者在適度地含有離液序列高的鹽的中性pH緩沖液中被洗脫。該親和色譜步驟能使免疫粘附素制劑的純度大于95％。
還可以使用本領(lǐng)域已知的其他方法來純化免疫粘附素，以代替在蛋白質(zhì)A或G上進行的親和色譜，或者作為親和色譜的額外純化方法。在親硫凝膠色譜[Hutchens和Porath，分析生物化學(xué)(Anal．Biochem．)159，217-226(1986)]和固定化金屬螯合色譜[Al-Mashikhi和Makai，J．Dairy Sci．71，1756-1763(1988)]中，免疫粘附素的行為類似于抗體。然而，與抗體相反，它們在離子交換柱上的行為不僅受其等電點支配，而且還受到電荷偶極的支配。因為其嵌合本質(zhì)，所以在分子中可能有電荷偶極。電荷的微不均一性(microheterogeneity)也可以是免疫粘附素的一個因素，其中分子的粘附素部分是糖基化的而且含有唾液酸。在實施例中描述了一種具體的純化方案。
用目前所產(chǎn)生的眾多免疫粘附素所獲得的結(jié)果顯示，將粘附素部分融合于Fc區(qū)通常不會擾亂各結(jié)構(gòu)域的折疊。粘附素和免疫球蛋白區(qū)兩者似乎都正確地折疊，而且Fc區(qū)保留了許多抗體特有的效應(yīng)子功能，如結(jié)合于Fc受體。
一般性地適用于構(gòu)建、表達和純化免疫粘附素的方法，在例如美國專利No．5，225，538(1993年7月6日授權(quán))和5，455，165(1995年10月30日)中有描述，這些文獻的公開內(nèi)容在此引用作為參考。免疫粘附素的構(gòu)建、表達、純化以及各種免疫粘附素的設(shè)計，還描述于Ashkenazi和Chamow，Methods in Enzymology 8，104-115(1995)以及Peach和Linsley，Methods in Enzymology 8，116-123(1995)的綜述性文章中，這2篇文獻以及在本文中引用的文獻的公開內(nèi)容，在此引用作為參考。
C．其他長半衰期的OB衍生物其他具有比天然分子更長半衰期的OB蛋白衍生物，包括共價地連于非蛋白質(zhì)聚合物的OB蛋白或OB-免疫球蛋白嵌合體。非蛋白質(zhì)聚合物通常是親水的合成聚合物，即原本在自然界沒有的聚合物。然而，也可使用自然界存在的和用重組方法或體外方法生產(chǎn)出的聚合物，以及從天然來源中分離出的聚合物。親水的聚乙烯基聚合物在本發(fā)明范圍之內(nèi)，如聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮。特別有用的是，聚亞烷基醚(polyalkylene ether)如聚乙二醇(PEG)；聚氧烷烯(polyelkyene)如聚氧乙烯、聚氧丙烯、和聚氧乙烯和聚氧丙烯的嵌段共聚物(Pluronics)；聚甲基丙烯酸酯；carbomer；支鏈或直鏈的多糖，該多糖具有糖單體如D-甘露糖、D-和L-半乳糖、巖藻糖、果糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-葡糖醛酸、唾液酸、D-半乳糖醛酸、D-甘露糖醛酸(如聚甘露糖醛酸或藻酸)、D-葡糖胺、D-半乳糖胺、D-葡萄糖和神經(jīng)氨酸，其中包括同多糖(homopolysaccharide)和異多糖如乳糖、支鏈淀粉、淀粉、羥乙基淀粉、直鏈淀粉、葡聚糖硫酸酯、葡聚糖、糊精、糖元或酸性粘多糖的多糖亞基，如透明質(zhì)酸；糖醇的聚合物如聚山梨糖醇和聚甘露糖醇；肝素或類肝素。在交聯(lián)之前的聚合物不必是水溶性的，但是優(yōu)選地是水溶性的，而且最終的偶聯(lián)物必須是水溶性的。此外，聚合物在偶聯(lián)形式下不應(yīng)是高度免疫原性，而且也不應(yīng)具有與靜脈內(nèi)輸液或注射不相容的濃度，如果準備采用這些途徑給藥的話。
較佳地，聚合物僅含有一個活性基團。這有助于避免蛋白質(zhì)分子的交聯(lián)。然而，通過優(yōu)化反應(yīng)條件以減少交聯(lián)、或者通過凝膠過濾或?qū)游龊Y(chromatographicsieve)來純化產(chǎn)物，從而回收基本均質(zhì)的衍生物都在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
聚合物的分子量宜在約100-500，000之間，更佳地約為1，000-20，000。選定的分子量取決于聚合物的性質(zhì)和取代的程度。一般，如果聚合物的親水性更大以及取代程度更大，那么就可采用較低的分子量。最佳的分子量可用常規(guī)實驗加以確定。
聚合物一般通過多官能交聯(lián)劑而共價地連于OB蛋白或OB-免疫球蛋白嵌合體，其中該交聯(lián)劑可與聚合物以及待交聯(lián)的OB蛋白或OB-免疫球蛋白嵌合體的一個或多個氨基酸殘基或糖基反應(yīng)。但是，通過將衍生聚合物(derivatized polymer)與雜合分子(hybrid)反應(yīng)(反之亦然)而直接交聯(lián)聚合物也在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
在OB蛋白或OB-Ig上的共價偶聯(lián)位點包括N端氨基酸和在賴氨酸殘基上的ε-氨基、以及其他的氨基、亞氨基、羧基、巰基、巰基或其他的親水基團?？梢圆皇褂枚喙倌?通常為雙官能)的交聯(lián)劑，而將聚合物直接共價連于雜合分子。共價地連于氨基可以用已知的基于下列物質(zhì)的化學(xué)方法而完成氰尿酰氯、羰基二咪唑(carbonyl diimidazole)、醛反應(yīng)基團(PEG醇鹽加溴代乙醛的二乙基乙縮醛；PEG加DMSO和乙酸酐，或PEG氯化物加4-羥基苯甲醛的酚鹽，琥珀酰亞胺基(succinimidyl)活性酯、活化的二硫代碳酸酯PEG、2，4，5-三氯苯基氯甲酸酯(2，4，5-trichlorophenylcloroformate)或者對-硝基苯基氯甲酸酯激活的PEG)?？赏ㄟ^用碳化二亞胺偶聯(lián)PEG-胺而衍生得到羧基。
可用化學(xué)物質(zhì)如偏高碘酸鹽，或者用酶如葡萄糖或半乳糖氧化酶(兩者都產(chǎn)生碳水化合物的醛衍生物)，通過氧化反應(yīng)而將聚合物偶聯(lián)于寡糖基團上，然后按Heitzmann等人美國科學(xué)院院報，71，3537-41(1974)或Bayer等人，Methods inEnzymology 62，310(1979)中所述的相同方式，與酰肼或氨基衍生聚合物反應(yīng)，以便用生物素或抗生物素蛋白標記寡糖。此外，目前已用于連接寡糖的其他化學(xué)和酶學(xué)方法是特別有利的，因為一般除了用于衍生的氨基酸位點之外很少有改變，而且這樣產(chǎn)生的寡糖一般更為均一。在聚合物衍生反應(yīng)之前，還可任選地對寡糖取代基進行修飾，如通過酶消化(例如用神經(jīng)氨酸酶)而去除糖。
聚合物會具有與氨基酸側(cè)鏈、或待連接多糖的N末端或C末端直接反應(yīng)的基團，或者該基團可與多官能交聯(lián)劑反應(yīng)。一般，具有這樣反應(yīng)基團的聚合物已知可用于制備固定化蛋白質(zhì)。為了在此處使用這些化學(xué)方法，人們應(yīng)使用目前蛋白質(zhì)固定化中所用的水溶性聚合物，或用與蛋白固定化同樣方式衍生后不溶的聚合物。溴化氰激活反應(yīng)是一種特別有用的方法，可用于交聯(lián)多糖。
對于起始聚合物的“水溶性”指，用于偶聯(lián)反應(yīng)的該聚合物或其反應(yīng)性中間體是充分溶解于水的，從而參與衍生反應(yīng)。
對于聚合物偶聯(lián)體的“水溶性”指，該偶聯(lián)體在生理流體如血液中是可溶的。
用這種聚合物進行替代(substitution)的程度取決于蛋白質(zhì)上活性位點的數(shù)目、使用的是全長蛋白質(zhì)還是蛋白質(zhì)片段、蛋白質(zhì)是否是與異源蛋白質(zhì)的融合蛋白(如OB-免疫球蛋白嵌合體)、分子量、親水性和蛋白質(zhì)的其他特性，以及所選定的蛋白質(zhì)具體衍生位點。一般，偶聯(lián)體含有約1-1O個聚合物分子，盡管任何異源序列可用數(shù)目幾乎不受限制的聚合物分子進行替代，只要所需的活性大體上沒有被有害地影響。交聯(lián)的最佳程度可由實驗?zāi)Ｐ?matrix)容易地確定，其中改變時間、溫度和其他反應(yīng)條件以改變替代程度，隨后測定偶聯(lián)物按所需方式發(fā)揮功能的能力。
聚合物(如PEG)可用已有的各種不同方法進行交聯(lián)，以便用非蛋白的聚合物如PEG來共價修飾蛋白質(zhì)。但是，某些這樣的方法對于此處的目的并不是優(yōu)選的。氰尿酰氯(cyanuronic chloride)化學(xué)法會導(dǎo)致許多副反應(yīng)，其中包括蛋白質(zhì)交聯(lián)。此外，它特別容易使含有巰基的蛋白質(zhì)失活。羰基二咪唑法(Beauchamp等人，AnalBiochem．131，25-33)需要高pH(＞8．5)，這會使蛋白質(zhì)失活。此外，因為“活化的PEG”中間體能與水反應(yīng)，所以相對于蛋白質(zhì)而言，需要按摩爾計非常大過量的“活化PEG”。羰基二咪唑法所需要的高濃度PEG，還會導(dǎo)致純化問題，因為會對凝膠過濾色譜和親水作用色譜(hydrophilic interaction chromatography)都產(chǎn)生不利影響。另外，高濃度的“活化PEG”會使蛋白質(zhì)沉淀，這一問題本身早就被注意到了(Davis，美國專利No．4，179，337)。另一方面，醛法(Royer，美國專利No．4，002，531)是更有效的，因為它僅需要40倍摩爾過量的PEG和1-2小時的保溫。但是，Royer所建議的用于制備PEG醛的二氧化錳是有問題的，“因為PEG有明顯的與以金屬為基礎(chǔ)(metal-based)的氧化劑形成復(fù)合物的傾向”。(Harris等人，J Polym．Sci．Polym．Chem．Ed 22，341-52)。使用Moffatt氧化法(采用DMSO和酸酐)可避免該問題。此外，Royer所建議的硼氫化鈉必須在高pH下使用，而且它有較強的還原二硫鍵的傾向。與之相反，優(yōu)選的是氰基硼氫化鈉，它在中性pH下是有效的而且還原二硫鍵的傾向非常弱。
用于修飾本發(fā)明的OB蛋白或OB-Ig嵌合體的、官能化的(functionalized)PEG聚合物，可從Shearwater Polymers，Inc．(Huntsville，AL)獲得。這些市售的PEG衍生物包括(但并不限于)氨基PEG、PEG氨基酸酯、PEG-酰肼、PEG-硫醇、PEG-琥珀酸酯、羧甲基化的PEG、PEG-丙酸、PEG氨基酸、PEG琥珀酰亞胺基琥珀酸酯、PEG-琥珀酰亞胺基丙酸酯、羧甲基化PEG的琥珀酰亞胺基酯、PEG的琥珀酰亞胺基碳酸酯、氨基酸PEG的琥珀酰亞胺基酯、PEG-氧羰基咪唑(oxycarbonylimidazole)、PEG-碳酸硝基苯酯、PEG-tresylate、PEG-縮水甘油基醚、PEG-醛、PEG-乙烯砜、PEG-馬來酰亞胺、PEG-二硫化鄰吡啶(orthopyridyl-disulfide)、雜官能的PEG、PEG乙烯基衍生物、PEG硅烷、和PEGphospholide。取決于蛋白質(zhì)、所需的PEG化程度、和所采用的PEG衍生物等因素，對這些PEG衍生物進行偶聯(lián)的反應(yīng)條件可有所不同。在選擇PEG衍生物中涉及的一些因素包括所需的連接位點(賴氨酸或半胱氨酸)，衍生物的水解穩(wěn)定性和反應(yīng)性，連接的穩(wěn)定性、毒性和免疫原性，適合分析的程度等。使用任一具體衍生物的具體說明可從制造商處獲得。
本發(fā)明的長半衰期的偶聯(lián)物可從未反應(yīng)的原料中，通過凝膠過濾而分離出。用相同方式，可將不同種類的偶聯(lián)物相互純化開。聚合物還可以是水不溶性的，如作為親水凝膠。
偶聯(lián)物還可用離子交換色譜法進行純化。親電活化的眾多PEG的化學(xué)性質(zhì)，會導(dǎo)致PEG化產(chǎn)物氨基酸電荷的減少。因此，可使用高分辨率的離子交換色譜法來分離游離的和偶聯(lián)的蛋白質(zhì)，并且可用于分辨PEG化程度不同的種類。事實上，因為未反應(yīng)氨基酸的離子特性不同，所以分辨不同種類(如含有一個或兩個PEG基的種類)也是可能的。
D．OB-免疫球蛋白嵌合體和其他長半衰期衍生物的用途本發(fā)明的OB-免疫球蛋白嵌合體和其他長半衰期衍生物，可用于減少體重，尤其是用于治療肥胖癥和其他與OB基因的表達或功能異常有關(guān)的癥狀。我們的研究表明，OB-免疫球蛋白嵌合體和其他長半衰期衍生物(如PEG化的OB)，可減少食物攝入并增加受治療動物的能量消耗，因而對于減少肥胖和正常對象的體重非常有效。出于測試目的，可將本發(fā)明的分子溶解在磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7．4)中，然后通過靜脈內(nèi)或皮下注射或輸液而進行施用。
本發(fā)明的長時間發(fā)揮作用的OB-衍生物，還可用于治療其他代謝疾病如糖尿病和食欲過盛。已表明，本發(fā)明的OB蛋白可降低動物中胰島素水平，而且能夠用于降低病人中過高的胰島素水平。在肥胖病人和非肥胖病人(如Ⅰ型或Ⅱ糖尿病)中，胰島素水平的下降可恢復(fù)或改善這些病人的胰島素敏感度。
此外，長半衰期的OB衍生物還可用于治療腎疾病、高血壓、和肺功能失常如肺氣腫。OB蛋白還可在具有受體的組織中，作為這些細胞的生長因子而導(dǎo)致有絲分裂反應(yīng)。
將具有所需純度的活性組份與任選的生理上可接受的載體、賦形劑、或穩(wěn)定劑(Remington＇s Pharmaceutical Sciences，16版，Osol，A．，Ed．)，以凍干劑或水溶液形式進行混合，可以制得本發(fā)明的的治療制劑。可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑，對接受者而言在所用的劑量和濃度下應(yīng)是無毒的，并且可含有緩沖液如磷酸鹽、檸檬酸鹽或其他有機酸的緩沖液；抗氧化劑如維生素C；低分子量(小于約10個殘基)多肽；蛋白質(zhì)如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其他碳水化合物如葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑如EDTA；糖醇如甘露糖醇或山梨糖醇；形成鹽的反荷離子如鈉；和／或非離子型表面活性劑如Tween、Pluronics或聚乙二醇(PEG)。
活性成分還可被包于制備的微囊中，例如通過團聚技術(shù)或通過界面聚合作用(如分別采用羥甲基纖維素，或明膠-微囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊)，包于膠體藥物輸送系統(tǒng)中(如脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳狀液、納米級顆粒和納米級微囊)，或包于粗乳狀液中。這些技術(shù)公開于Remington＇s Pharmaceutical Sciences，同上。
用于體內(nèi)給藥的制劑必須是無菌的。這可通過用滅菌過濾膜過濾而實現(xiàn)，這可在凍干和重新組成(reconstitution)之前或之后進行。
治療性的組合物一般被置于具有無菌入口的容器中，如具有可被皮下注射器針頭穿刺的塞頭的小瓶或靜脈溶液包(intravenous solution bag)。
給藥途徑可根據(jù)已知的方法，如靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)等途徑的注射或輸注。緩釋制劑也是可行的。緩釋制劑的合適例子包括半滲透性基質(zhì)，該基質(zhì)為成形制品，如膜或微囊。緩釋基質(zhì)的例子包括聚酯、水凝膠、聚交酯(美國專利No．3，773，919、EP 58，481)、L-谷氨酸和L-谷氨酸γ乙基酯的共聚物(U．Sidman等人，1983，“Biopolymer”22(1)547-556)、聚(甲基丙烯酸2-羥基乙基酯(R．Langer等人，1981，＂J．Biomed．Mater．Res＂．15167-277和R．Langer，1982，＂Chem．Tech．＂1298-105)、乙烯-乙烯基乙酸酯(R．Langer等人，同上)、或聚D-(-)-3-羥基丁酸(EP133，988A)。緩釋組合物還包括脂質(zhì)體。含有本發(fā)明范圍內(nèi)分子的脂質(zhì)體可用已知的方法制備DE 3，218，121A；Epstein等人，1985，美國科學(xué)院院報823688-3692；Hwang等人，1980，美國科學(xué)院院報774030-4034；EP 52322A；EP36676A；EP 88046A；EP143949A；EP 142，641A；日本專利申請83-118008；美國專利No．4，485，045和4，544，545；和EP 102，324A。一般，脂質(zhì)體是小型的(約200-800埃)單層類型，其中脂類含量大于約30mol％膽固醇，為了最佳治療效果可調(diào)節(jié)選定的比例。
本發(fā)明分子在治療中所用的有效量取決于例如，治療目的、給藥途徑和病人的狀況。因此，治療專家有必要測定劑量的效價并按需要對給藥途徑進行修改，以便獲得最佳的治療效果。一種典型的日劑量約為1微克／千克至10毫克／千克或更高，這取決于上述的因素。典型地，臨床醫(yī)師會施用本發(fā)明的分子，直至到達可實現(xiàn)所需生物效果的劑量。治療的進程可方便地用常規(guī)分析方法加以監(jiān)視。如果治療目的是減少體重，那么治療一般繼續(xù)到達到所需的體重為止。
本發(fā)明的OB蛋白-免疫球蛋白的非治療用途包括將它們用于OB受體的鑒別和純化。在下面的參考實施例描述了施用OB蛋白-免疫粘附素對OB受體進行鑒別和表達克隆。
下面通過不起限制作用的實施例，進一步闡述本發(fā)明。
實施例1OB-免疫粘附素的表達用蛋白質(zhì)工程技術(shù)，以具有IgG-1的絞鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)的融合蛋白形式，表達人OB蛋白。用人IgG-1的Fc區(qū)克隆，制備編碼人OB蛋白和IgG-1Fc區(qū)的嵌合體的DNA構(gòu)建物。人OB cDNA是用PCR法，從人脂肪細胞雙鏈cDNA(Clontech Buick-Clone cDNA產(chǎn)物)中獲得的。IgG-1 cDNA的來源是質(zhì)粒pBSSK-CH2CH3。嵌合體含有全長OB蛋白(圖5中氨基酸1-167)和從216位的天冬氨酸開始并結(jié)束于441位氨基酸的人IgG-1序列的編碼序列(將114位氨基酸作為重鏈恒定區(qū)的第一個氨基酸(Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest第4版)，該天冬氨酸是在重鏈-輕鏈結(jié)合中涉及的半胱氨酸殘基后的IgG-1絞鏈區(qū)的第一個殘基。在OB和IgG-1編碼序列之間插入了編碼3個氨基酸(Gly Val Thr)的密碼子。如果需要，這個短的接頭序列可以被方便地去除(例如通過定點缺失誘變法)，從而產(chǎn)生OB蛋白和IgG-1絞鏈區(qū)編碼序列之間精確的連接?？蓪B-IgG-1免疫粘附素的編碼序列亞克隆入基于pRK5載體pRK5tk-neo(它含有供選擇的新霉素標記基因)中，以便用硫酸鈣技術(shù)(Suva等人，科學(xué)237，893-896)在293細胞中進行瞬時表達。在含有10％FBS和2mM L-Gln的HAM＇s低葡萄糖DMEM培養(yǎng)基(50∶50)中培養(yǎng)293細胞。為了純化OB-IgG-1，在轉(zhuǎn)染后那一天將細胞換到?jīng)]有血清的生產(chǎn)培養(yǎng)基PS24中，并在3天后收獲培養(yǎng)基。對培養(yǎng)基進行過濾。
在過濾后的、含有重組人OB-IgG-1的293細胞上清液(400毫升)中，加入1mM苯甲基磺?；锖?微克／毫升抑蛋白酶肽(aprotinin)。在4℃，將該材料上樣于在100mM HEPES(pH8．0)中平衡過的1×4．5厘米蛋白質(zhì)A瓊脂糖柱(Pierce目錄#20365)。流速為75毫升／小時。一旦將樣品上樣后，用平衡緩沖液洗滌柱，直到A280達到基線水平。用流速為15毫升／小時的3．5M氯化鎂+2％甘油(未緩沖過的)洗脫OB-IgG-1蛋白。收集洗脫液，并偶爾將其混入10毫升100mMHEPES(pH8)中以便將氯化鎂濃度降低約一半并使pH上升。洗脫出的蛋白質(zhì)接著被透析到磷酸鹽緩沖液中，濃縮，無菌過濾然后儲藏在4℃或冰凍儲藏在-70℃。這種方法制備的OB-IgG-1免疫粘附素，經(jīng)SDS-PAGE測定，純度大于90％。
實施例2動物研究A．材料和方法OB蛋白質(zhì)的產(chǎn)生--通過PCR法，使用基于Zhang等人(同上)的序列的引物，從脂肪細胞cDNA庫中獲得鼠OB cDNA。通過將處于閱讀框的OB編碼序列和大腸桿菌熱穩(wěn)定的腸毒素Ⅱ分泌序列，插入大腸桿菌堿性磷酸酶啟動子下游，在大腸桿菌中表達成熟的OB蛋白(氨基酸22-167)。Chang等人，基因，55 189-96(1987)。在細胞裂解后，在25mM DTT存在下，將不溶性組份增溶(solubilize)在8M尿素緩沖液(pH8．35)中。還原后的OB蛋白，用分子排阻層析和反向HPLC進行純化，然后在谷胱甘肽存在下再次進行折疊。再折疊后的OB蛋白用反向HPLC進行純化，然后用SDS-PAGE及氨基酸和質(zhì)譜分析法進行分析。
PEG-hOB的制備--通過將反向色譜純化的hOB與公稱分子量為10kD的PEG丙酸的琥珀酸酰亞胺基衍生物(SPA-PEG)(可從Shearwater Polymers，Inc．，Huntsville，AL獲得)反應(yīng)，制備人OB蛋白質(zhì)的PEG衍生物。在用反向色譜純化hOB蛋白之后，將在0．1％三氟乙酸和約40％乙腈中的約1-2毫克／毫升的蛋白質(zhì)溶液，用1／3至1／2體積的0．2M硼酸鹽緩沖液稀釋，并用NaOH將pH調(diào)節(jié)至8．5。將SPA-PEG加入反應(yīng)混合物中，使蛋白質(zhì)對SPA-PEG的摩爾比為1∶1和1∶2，然后在室溫下保溫混合物1小時。在反應(yīng)和用凝膠電泳或離子交換色譜法純化之后，讓樣品對磷酸鹽緩沖液進行全面地透析，然后通過在0．22微米濾膜上過濾而滅菌。將樣品在4℃下儲藏。在這些條件下，蛋白質(zhì)與SPA-PEG摩爾比為1∶1時所形成的PEG-hOB，主要由連有一個10kD PEG分子構(gòu)成，同時有少量含2個PEG的種類。摩爾比為1∶2的反應(yīng)所形成的PEG-hOB，用SDS凝膠電泳測定表明，主要由幾乎等量的連有2個和3個PEG的hOB所構(gòu)成。在兩個反應(yīng)中，還都檢測到少量未反應(yīng)的蛋白質(zhì)。如果需要，這些未反應(yīng)的蛋白質(zhì)可通過凝膠過濾或離子交換步驟而有效去除。人OB蛋白的PEG衍生物還可大體上按EP372，752(1990年6月13日出版)中所述的醛法而制備。
動物研究--所有涉及動物的操作都得到Genentech＇s研究所動物養(yǎng)護和使用委員會(Genentech＇s Institutional Aminal Care and Use Committee)審查和批準。從Jackson Labs(Bar Harbor，ME)購買7-8周大小的、遺傳上肥胖的C57B1／6J-ob／ob(ob／ob)雌性小鼠。從Harlan Sprague Dawley(Hollister，CA)購買具有相同遺傳背景(C57B1／6)的瘦型雌小鼠。將小鼠分成3-6組，飼養(yǎng)在控制溫度、濕度和光的(光照從6點至18點)的鼠群室(colony room)中，并可隨意地飲水和食用標準的鼠食(Purina 5010Purina Mills，Richmond，IN)。
在無菌條件下按照制造商的說明，將無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)中純化的重組OB蛋白質(zhì)(100微克／千克／天)，或僅PBS注入小型滲透泵(Alzet 2002型；Alza Corp．，Palo Alto，CA)中，然后在植入小鼠之前，在無菌鹽水中于室溫下保溫過夜。小鼠用氯胺酮／甲苯噻嗪麻醉，將小型滲透泵植入在中肩胛區(qū)域的皮下。每天，將純化的重組OB蛋白、hOB-IgG-1融合蛋白或PBS皮下注射入清醒小鼠的中肩胛區(qū)域。注射是在燈熄滅后1小時內(nèi)進行的。每只小鼠的體重(精確到0．1克)和每個籠子中食品斗中含有的食物重量(精確到0．1克)，每1到2天在燈熄滅后1小時內(nèi)作記錄。數(shù)據(jù)以平均值±SEM表示。動物的數(shù)目如下面及


中所述。
B．連續(xù)皮下輸注OB蛋白所獲得的結(jié)果以連續(xù)皮下輸注方式或每天皮下注射方式，用鼠OB蛋白處理瘦型雌小鼠。結(jié)果示于圖1。上圖顯示，與每天以皮下注射方式施用相同劑量相比，以連續(xù)輸注方式施用時OB蛋白能明顯更有效地降低體重。下圖顯示了OB蛋白在降低脂肪組織重量的能力方面有同樣的差別。
C．用OB-IgG-1嵌合體獲得的結(jié)果用人OB蛋白或用人OB-IgG-1嵌合體處理肥胖的雌性ob／ob小鼠。數(shù)據(jù)示于圖2。上圖中的數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)兩種蛋白都類似地通過皮下輸注方式給藥時，hOB-IgG-1融合蛋白與天然hOB蛋白相比更能夠降低體重。應(yīng)注意到，如果數(shù)據(jù)被轉(zhuǎn)化為摩爾數(shù)量的話，能力的增加就更顯著，因為僅約1／3部分的OB-IgG-1嵌合體來自O(shè)B蛋白。數(shù)據(jù)還證實了前面的觀察結(jié)果，即在降低體重方面，連續(xù)皮下輸注(泵)hOB蛋白比每天皮下注射更有效。
在圖2下圖中所示的數(shù)據(jù)顯示，hOB-IgG-1融合蛋白能顯著減少食物攝入。該結(jié)果是出乎意料的，因為人們認為融合蛋白太大了，以致于不能通過腦血屏障去發(fā)揮其功效。
以每天皮下注射方式，用hOB或hOB-IgG-1嵌合體處理肥胖(ob／ob)雌性小鼠7天。圖3所示的數(shù)據(jù)再次顯示，嵌合體能比天然hOB蛋白更有效地降低體重(上圖)和食物攝入(下圖)。
在另一試驗中，以每天皮下注射方式，用hOB-IgG-1融合蛋白、天然hOB或hCD4-IgG-1(對照)處理肥胖(ob／ob)雌性小鼠7天。圖5所示的數(shù)據(jù)證實，hOB-IgG-1融合蛋白能比天然hOB蛋白更有效地降低體重(上圖和中圖)和食物攝入(下圖)。
D．用PEG-hOB獲得的結(jié)果用人OB蛋白或人OB的PEG衍生物處理肥胖的雌性ob／ob小鼠。數(shù)據(jù)示于圖4。上圖中的數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)兩種蛋白都類似地通過皮下輸注方式給藥時，PEG-hOB與天然hOB蛋白相比更能夠降低體重。
圖4下圖中的數(shù)據(jù)顯示，與未修飾的天然hOB蛋白相比，PEG-hOB蛋白明顯能更有效地減少食物攝入。
參考實施例OB受體的鑒別和克隆用實施例1中的OB蛋白-免疫粘附素來檢測OB受體并進行表達克隆。
首先，為了鑒別出受體源，通過流式細胞計量術(shù)，用1微克／毫升OB-IgG-1篩選數(shù)個細胞系。檢測系統(tǒng)由偶聯(lián)有二級抗體及隨后的鏈霉抗生物素蛋白-藻紅蛋白構(gòu)成，該系統(tǒng)可使信號大為放大并且可檢測表達少量受體的細胞。發(fā)現(xiàn)2個細胞系，人胚腎293細胞和人肺A549細胞與OB-IgG-1結(jié)合，但是不與Flt-4對照免疫粘附素結(jié)合。OB-IgG-1特異性地結(jié)合于細胞，還可通過添加過量的細菌表達的人OB蛋白而加以證實。添加10微克／毫升的人OB可完全阻斷OB-IgG-1結(jié)合于293細胞。
為了分離出編碼OB受體的cDNA，用約105克隆的、pRK5B中的寡聚dT引導(dǎo)合成的293細胞cDNA庫的集合體(pool)，來瞬時轉(zhuǎn)化COSN細胞。在與OB-IgG-1一起溫育之后，通過將轉(zhuǎn)染細胞在涂有抗-人Fc抗體的平板上篩選而富集轉(zhuǎn)染細胞。在3輪富集之后，30個集合體中一個會有OB-IgG-1介導(dǎo)的COSN細胞粘附于結(jié)合平板的情況，該粘附可被人OB蛋白所競爭。在10-20個集合體中，轉(zhuǎn)染用第3輪中隨機挑選出cDNA克隆。在分析完10個中的一個集合體(該集合體通過篩選而被評為陽性)之后，最終鑒別出了各克隆。
序列分析揭示出一個約5300bp的克隆，其開放閱讀框編碼896個氨基酸的蛋白質(zhì)。其序列對應(yīng)于Ⅰ型跨膜蛋白，具有長22個氨基酸的信號肽、819個氨基酸的胞外結(jié)合域、21個氨基酸的跨膜結(jié)合域和34個氨基酸短的胞內(nèi)結(jié)合域。發(fā)現(xiàn)該序列基本上與Tartaglia等人(同上)鑒別和分離出的人OB受體一致，而且與1996年1月11日申請的未審定申請No．08，585，005中公開的人受體序列相同。
盡管本發(fā)明用實施例的形式加以闡述，但是本發(fā)明的范圍并不限于實施例。應(yīng)理解，在本發(fā)明的總體構(gòu)思之下可以作其他的改動和修改。所有的這些改動形式都在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
所有在說明書(包括實施例)中提及的文獻，以及在此處提及的文獻都明確地在此引用作為參考。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人Genentech，Inc．De Sauvage，F(xiàn)rederic J．Levin，NancyVandlen，Richard L．(ⅱ)發(fā)明名稱OB蛋白質(zhì)衍生物(ⅲ)序列數(shù)目2(ⅳ)通信地址(A)收信人Genentech，Inc．(B)街道460 Point San Bruno Blvd(C)城市South San Francisco(D)州California(E)國家USA(F)郵編94080(ⅴ)計算機可讀形式(A)記錄介質(zhì)類型3．5英寸，1．44Mb軟盤(B)計算機IBM PC兼型(C)操作系統(tǒng)PC-DOS／MS-DOS(D)軟件WinPatin(Genentech)(ⅵ)本申請資料(A)申請?zhí)?B)申請日19日-12月-1996(C)分類(ⅶ)在先申請資料(A)申請?zhí)?8／667184(B)申請日20日-6月-1996(ⅶ)在先申請資料(A)申請?zhí)?8／579494(B)申請日27日-12月-1995(ⅷ)律師／代理人信息(A)姓名Dreger，Ginger R．(B)登記號33，055(C)參考／案卷號985P2PCT(ⅸ)通訊信息(A)電話415／225-3216(B)傳真415／952-9881(C)電傳910／371-7168(2)SEQ ID NO1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度7127堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO1TTCGAGCTCG CCCGACATTG ATTATTGACT AGTTATTAAT AGTAATCAAT 50TACGGGGTCA TTAGTTCATA GCCCATATAT GGAGTTCCGC GTTACATAAC 100TTACGGTAAA TGGCCCGCCT GGCTGACCGC CCAACGACCC CCGCCCATTG 150ACGTCAATAA TGACGTATGT TCCCATAGTA ACGCCAATAG GGACTTTCCA 200TTGACGTCAA TGGGTGGAGT ATTTACGGTA AACTGCCCAC TTGGCAGTAC 250ATCAAGTGTA TCATATGCCA AGTACGCCCC 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CCGCTCCCGA TTCGCAGCGC ATCGCCTTCT ATCGCCTTCT 3700TGACGAGTTC TTCTGAGCGG GACTCTGGGG TTCGAAATGA CCGACCAAGC 3750GACGCCCAAC CTGCCATCAC GAGATTTCGA TTCCACCGCC GCCTTCTATG 3800AAAGGTTGGG CTTCGGAATC GTTTTCCGGG ACGCCGGCTG GATGATCCTC 3850CAGCGCGGGG ATCTCATGCT GGAGTTCTTC GCCCACCCCG GGAGATGGGG 3900GAGGCTAACT GAAACACGGA AGGAGACAAT ACCGGAAGGA ACCCGCGCTA 3950TGACGGCAAT AAAAAGACAG AATAAAACGC ACGGGTGTTG GGTCGTTTGT 4000TCATAAACGC GGGGTTCGGT CCCAGGGCTG GCACTCTGTC GATACCCCAC 4050CGAGACCCCA TTGGGGCCAA TACGCCCGCG TTTCTTCCTT TTCCCCACCC 4100CAACCCCCAA GTTCGGGTGA AGGCCCAGGG CTCGCAGCCA ACGTCGGGGC 4150GGCAAGCCCG CCATAGCCAC GGGCCCCGTG GGTTAGGGAC GGGGTCCCCC 4200ATGGGGAATG GTTTATGGTT CGTGGGGGTT ATTCTTTTGG GCGTTGCGTG 4250GGGTCAGGTC CACGACTGGA CTGAGCAGAC AGACCCATGG TTTTTGGATG 4300GCCTGGGCAT GGACCGCATG TACTGGCGCG ACACGAACAC CGGGCGTCTG 4350TGGCTGCCAA ACACCCCCGA CCCCCAAAAA CCACCGCGCG GATTTCTGGC 4400GCCGCCGGAC GAACTAAACC TGACTACGGC ATCTCTGCCC CTTCTTCGCT 4450GGTACGAGGA GCGCTTTTGT TTTGTATTGG TCACCACGGC CGAGTTTCCG 4500CGGGACCCCG GCCAGGGCAC CTGTCCTACG AGTTGCATGA TAAAGAAGAC 4550AGTCATAAGT GCGGCGACGA TAGTCATGCC CCGCGCCCAC CGGAAGGAGC 4600TGACTGGGTT GAAGGCTCTC AAGGGCATCG GTCGAGCGGC CGCATCAAAG 4650CAACCATAGT ACGCGCCCTG TAGCGGCGCA TTAAGCGCGG CGGGTGTGGT 4700GGTTACGCGC AGCGTGACCG CTACACTTGC CAGCGCCCTA GCGCCCGCTC 4750CTTTCGCTTT CTTCCCTTCC TTTCTCGCCA CGTTCGCCGG CTTTCCCCGT 4800CAAGCTCTAA ATCGGGGGCT CCCTTTAGGG TTCCGATTTA GTGCTTTACG 4850GCACCTCGAC CCCAAAAAAC TTGATTTGGG TGATGGTTCA CGTAGTGGGC 4900CATCGCCCTG ATAGACGGTT TTTCGCCCTT TGACGTTGGA GTCCACGTTC 4950TTTAATAGTG GACTCTTGTT CCAAACTGGA ACAACACTCA ACCCTATCTC 5000GGGCTATTCT TTTGATTTAT AAGGGATTTT GCCGATTTCG GCCTATTGGT 5050TAAAAAATGA GCTGATTTAA CAAAAATTTA ACGCGAATTT TAACAAAATA 5100TTAACGTTTA CAATTTTATG GTGCAGGCCT CGTGATACGC CTATTTTTAT 5150AGGTTAATGT CATGATAATA ATGGTTTCTT AGACGTCAGG TGGCACTTTT 5200CGGGGAAATG TGCGCGGAAC CCCTATTTGT TTATTTTTCT AAATACATTC 5250AAATATGTAT CCGCTCATGA GACAATAACC CTGATAAATG CTTCAATAAT 5300ATTGAAAAAG GAAGAGTATG AGTATTCAAC ATTTCCGTGT 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Thr Cys Pro Pro Cys Pro170 175 180Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro185 190 195Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr200 205 210Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe215 220 225Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys230 235 240Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val245 250 255Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys260 265 270Cys Lys Val Ser Ash Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr275 280 285Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr290 295 300Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu305 310 315Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu320 325 330Trp Glu Ser Ash Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro335 340 345Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu350 355 360Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys365 370 375Ser Val Met His Glu Ala Leu His Ash His Tyr Thr Gln Lys Ser380 385 390Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys395 39權(quán)利要求
1．一種長半衰期的OB蛋白衍生物，其特征在于，它保留天然OB蛋白的生物特性。
2．如權(quán)利要求1所述的長半衰期的衍生物，其特征在于，它能夠減少受處理個體的體重和／或食物攝入。
3．如權(quán)利要求1所述的衍生物，其特征在于，它是天然人OB蛋白的衍生物。
4．如權(quán)利要求1所述的衍生物，其特征在于，它是OB-免疫球蛋白嵌合體。
5．如權(quán)利要求1所述的衍生物，其特征在于，它是用非蛋白質(zhì)聚合物修飾的天然OB蛋白或OB-免疫球蛋白嵌合體。
6．如權(quán)利要求4所述的衍生物，其特征在于，非蛋白質(zhì)聚合物是聚乙二醇(PEG)。
7．一種用于治療與OB基因功能或表達異常有關(guān)病癥，或者用于引發(fā)OB受體介導(dǎo)的生物反應(yīng)的組合物，其特征在于，它含有有效量的權(quán)利要求1所述的OB衍生物。
8．如權(quán)利要求7所述的組合物，其特征在于，它能有效地減少體重和／或食欲。
9．如權(quán)利要求7所述的組合物，其特征在于，它能有效地使升高的胰島素水平降低。
10．一種治療與OB基因功能或表達異常有關(guān)病癥，或者引發(fā)OB受體介導(dǎo)的生物反應(yīng)的方法，其特征在于，它包括向待治療的個體施用權(quán)利要求1所述的衍生物。
11．如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，待治療的病癥選自下組肥胖、食欲過盛和Ⅰ型或Ⅱ型糖尿病。
12．一種引發(fā)對象減少體重或喪失食欲的方法，其特征在于，它包括向該對象施用有效量的權(quán)利要求1所述的衍生物。
13．一種嵌合多肽，其特征在于，它包含連接于免疫球蛋白序列的、能夠結(jié)合天然OB受體的OB蛋白氨基酸序列。
14．如權(quán)利要求13所述的嵌合多肽，其特征在于，該免疫球蛋白序列是恒定區(qū)序列。
15．如權(quán)利要求14所述的嵌合多肽，其特征在于，該OB蛋白是人的。
16．如權(quán)利要求15所述的嵌合多肽，其特征在于，兩個OB多肽-IgG重鏈融合蛋白，通過至少一個二硫鍵而相互連接在一起，從而形成同二聚體型的免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)。
17．如權(quán)利要求16所述的嵌合多肽，其特征在于，至少一個該OB多肽-IgG重鏈融合蛋白是與免疫球蛋白輕鏈締合的。
18．一種分離的核酸序列，其特征在于，它編碼OB蛋白-免疫球蛋白融合蛋白。
19．一種可復(fù)制的表達載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求18所述的核酸。
20．一種宿主細胞，其特征在于，它被權(quán)利要求19所述的可復(fù)制的表達載體所轉(zhuǎn)化。
21．一種方法，其特征在于，該方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求16所述的宿主細胞，從而表達編碼OB蛋白-免疫球蛋白融合蛋白的核酸。
22．如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，該宿主細胞被編碼至少2個OB蛋白-免疫球蛋白融合蛋白的核酸共轉(zhuǎn)化。
23．如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，該細胞還被編碼至少一個免疫球蛋白輕鏈的核酸所轉(zhuǎn)化。
24．一種治療與OB基因功能或表達異常有關(guān)病癥，或者引發(fā)OB受體介導(dǎo)的生物反應(yīng)的方法，其特征在于，它包括向病人施用治療有效量的權(quán)利要求13所述的嵌合多肽。
25．如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，該病癥選自下組肥胖、食欲過盛和Ⅰ型或Ⅱ型糖尿病。
26．一種治療肥胖的組合物，其特征在于，它含有有效量的權(quán)利要求13所述的嵌合多肽和藥學(xué)上可接受的載體。
27．一種誘導(dǎo)表達OB受體的細胞生長的方法，其特征在于，將該細胞與權(quán)利要求1所述的OB衍生物接觸。
全文摘要
本發(fā)明涉及肥胖蛋白質(zhì)OB的長半衰期衍生物。更具體地,本發(fā)明涉及OB蛋白質(zhì)－免疫球蛋白嵌合體和聚乙二醇(PEG)－OB衍生物,與相應(yīng)的天然OB蛋白相比,它們具有更長的半衰期。本發(fā)明還涉及通過使用這種長半衰期的OB蛋白衍生物,而減少食欲和/或體重的方法以及治療其它生理癥狀的方法。
文檔編號C07K19/00GK1205738SQ96199265
公開日1999年1月20日 申請日期1996年12月19日 優(yōu)先權(quán)日1995年12月27日
發(fā)明者F·J·德蘇瓦茨, N·萊文, R·L·范德倫 申請人:基因技術(shù)股份有限公司