專利名稱：核黃素的純化的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及回收和純化發(fā)酵得到的核黃素的方法。
如眾所周知，核黃素(維生素B2)具有有價值的保鍵、醫(yī)藥(如抗腳氣病)和生長促進性質(zhì)，因而被廣泛地用作食品和飼料添加劑。其也可用作食品的黃色著色劑。另外，已知可用合成方法及各種不同的發(fā)酵方法，特別是可經(jīng)在適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)或阿舒假囊酵母(Eremothecium ashbyii)而產(chǎn)生之。依據(jù)適當(dāng)?shù)陌ǚ蛛x/回收和純化步驟在內(nèi)的特定生產(chǎn)方法，可使此得到的核黃素滿足某些質(zhì)量要求，例如用于動物飼料中，但不能滿足其他應(yīng)用，特別是用于人類食品中。然而在過去，盡管廣泛深入地研究了合成后或發(fā)酵后分離/回收及純化方法，卻一直沒有達到適于其預(yù)期使用目的預(yù)期質(zhì)量。
本發(fā)明的目的是提供回收和純化以發(fā)酵方法產(chǎn)生的核黃素的方法，即回收和純化發(fā)酵已達到令人滿意的程度，最好是發(fā)酵完成后存在于所謂發(fā)酵肉湯(所說的肉湯下文稱為“發(fā)酵后肉湯”)中的核黃素的方法，該方法可使核黃素產(chǎn)物至少達到適于預(yù)期應(yīng)用目的之可接受的質(zhì)量。
本發(fā)明提供了從發(fā)酵后肉湯中回收和純化核黃素的方法，其特征在于以下基本步驟(i)在大約45℃至120℃將所說的發(fā)酵后肉湯加熱約10分鐘至2小時，以進行巴氏滅菌，(ii)將巴氏滅菌后的肉湯離心一次或多次，以得到主要由核黃素組成的產(chǎn)物，(iii)在大約80℃至130℃溫度下用無機酸水溶液將前述步驟得到的產(chǎn)物處理約30分鐘至24小時和(iv)從上述步驟的含水酸性介質(zhì)中過濾收集核黃素并用水洗滌之，及選擇性步驟(v)干燥前述步驟收集的洗過的產(chǎn)物，以提供達到實質(zhì)性純度的核黃素。
以這種方式回收并純化的核黃素一般具有至少96％的純度，并且在加適當(dāng)?shù)奶砑觿┡渲撇⒓庸と鐕婌F干燥后，其很適于在動物食物方面的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了(進一步)純化已從發(fā)酵后肉湯中回收并根據(jù)需要經(jīng)用無機酸水溶液處理、過濾和用水洗后已純化到一定程度的核黃素的方法，該方法的特征在于以下基本步驟(vi)從濃鹽酸和水中結(jié)晶所說的核黃素，(vii)從上述步驟的酸性介質(zhì)中過濾收集固體核黃素并用水洗滌之，以及(viii)干燥前述步驟收集的洗滌過的產(chǎn)物，以提供高純度的核黃素。
用于以這種方式(進一步)純化的，即包括前面指出的步驟(vi)、(vii)和(viii)的起始核黃素較好是用上文提到的包括步驟(i)、(ii)、(iii)和(iv)，并且還可包括步驟(v)的方法回收和純化的。但其也可以只是在步驟(i)和(ii)之后得到的核黃素。產(chǎn)物是高純度的，即純度一般至少為98％，并且繼后很適于人類使用，特別是用于食品和藥物中。
可用任何適當(dāng)方法完成用于產(chǎn)生將根據(jù)本發(fā)明的方法回收和純化的核黃素的發(fā)酵過程本身。已知的發(fā)酵方法包括在適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)培養(yǎng)基中，通常在需氧條件下培養(yǎng)枯草芽孢桿菌(B.sabtilis)、棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)、阿舒假囊酵母(Eremothecium ashbyii)、flaveri假絲酵母(Candida flaveri)、丙酮丁醇酸菌(Clostridiumacetobutylicum)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、產(chǎn)氨短桿菌(Brevibacterium ammoniagenes)和Xylinus擬酵母(Torulopsis xylinus)。用于生產(chǎn)核黃素的實際發(fā)酵方法對本發(fā)明來說是無關(guān)緊要的。但就本發(fā)明方法的基本條件而言，優(yōu)選的發(fā)酵產(chǎn)生核黃素的培養(yǎng)的微生物是枯草芽孢桿菌(B.subtilis)。無論使用什么發(fā)酵方法，確定發(fā)酵已達到滿足的程度，特別是發(fā)酵完成的技術(shù)也是已知的，并且包括HPLC。
本發(fā)明方法的起始點是上文提到的了酵后肉湯。按照步驟(i)在大約45℃至120℃的溫度范圍將所說的肉湯加熱大約10分鐘至2小時。一般說來，為了以這種方式進行“巴氏滅菌”，需要高達120℃以上的溫度，和短至約10分鐘的時間。在這些條件下加熱和巴氏滅菌的作用是失活前面發(fā)酵后余留的微生物，防止過度的肉湯自溶并且在長時間里維持或造成相對低的肉湯粘度，從而使繼后的離心(步驟(ii)能夠更加容易和有效地進行。在加熱期間，較好在大約50℃至70℃的較窄的溫度范圍內(nèi)進行加熱，有利地攪拌發(fā)酵后肉湯。將加熱期間限制在少于大約45分鐘也是優(yōu)選的條件。雖然在加熱步驟(i)前無需改變發(fā)酵后肉湯的pH值，但必要時可經(jīng)加入適當(dāng)量的無機酸較好是濃鹽酸或硫酸將其調(diào)整到大約5至7的范圍。這種酸化作用的目的是與加熱的目的一樣的，并且事實上甚至可替代加熱步驟(i)。
下一步驟，即步驟(ii)包括一次或多次離心已經(jīng)過巴氏滅菌的發(fā)酵后肉湯。在將肉湯移入離心裝置的正常過程中，根據(jù)需要可以包括在室溫下的中間存放過程，肉湯將受到相當(dāng)程度的冷卻，特別是可冷卻到大約40℃至20℃的溫度。但這種冷卻并不是必需的，并且不必采取特殊手段來完成這一冷卻過程。但在開始(第一次)離心之前較好使肉湯的溫度保持在上述溫度范圍之內(nèi)。該肉湯是固體核黃素和生物量在含有來自前述發(fā)酵的溶解的營養(yǎng)物質(zhì)，鹽等的含水培養(yǎng)基中的懸浮液形式的。
離心本身是用于從較稀的生物量中分離較濃的核黃素，從而在重復(fù)離心之間將分離的較稠層常規(guī)懸浮在去離子水中以進一步離心。每次離心之后，所分離的較稠層均比前次離心富集更多的核黃素。如果進行一次以上的離心，則加到從離心管中分離的固體(核黃素)層中以進一步離心的去離子水的量一般約為所說分離的或排放的固體層重量的2至6倍。如上文所指出的，所離心的核黃素、生物量和含水介質(zhì)之混合物的溫度不是嚴格的，并可在大約15℃至大約80℃范圍內(nèi)，但在單次離心或幾次離心的第一次期間，實踐中這一溫度一般約為20℃至40℃。在繼后的離心期間，所離心之混合物的溫度較好為室溫。就用于離心的相對離心力(RCF)來說，單次或第一次離心的RCF范圍一般約為2500xg至3000xg，較好約為2600xg至2800xg。繼后的離心較好在RCF大約600xg至750xg的范圍內(nèi)進行。適當(dāng)?shù)碾x心裝置，特別是所謂離心潷析器如Flottweg ZILα和Flottweg Z18-3可從市場上購得并且完全適合于本使用目的；在這種裝置中，為達到最佳效果，有關(guān)參數(shù)如轉(zhuǎn)簡和螺卷軸間的差速、溢流直徑及原料和液體排放的流速可能是有所不同的。已發(fā)現(xiàn)，進行2-4次特別是3次離心，是可使核黃素材料在分離后達到足夠的純度，使之處在適宜的狀態(tài)以便在后續(xù)加工步驟中進一步純化。
在完成上述加工步驟(i)和(ii)例如經(jīng)過3次離心后，所分離的核黃素材料一般可具有大約90％的純度。
本發(fā)明方法的步驟(iii)包括在上述溫度和時間條件下加熱在先與無機酸水溶液一起離心后分離的核黃素，因而如步驟(i)一樣，實際的加熱方法不是重要的。但所說的加熱是在大約6至10巴的壓力下使用超加熱的氣流進行的。此外，加熱溫度高至大約130℃所需的時間可短至大約30分鐘。已經(jīng)確定了各種優(yōu)選的加熱溫度范圍與時間的組合，即于大約90℃至130℃加熱大約30分鐘至6小時，特別是于大約100℃至125℃加熱大約1至3小時，以及于大約80℃至100℃加熱大約8至16小時。在該處理步驟中，原則上可利用任何一種無機酸，如鹽酸、硫酸、硝酸、磷酸、乙酸及這些酸的混合物，但較好是使用鹽酸。無機酸水溶液中酸(如HCl)濃度一般約為0.1至2％(重量)，無機酸水溶液中核黃素的濃度一般約為3至10％(重量)。使核黃素與無機酸接觸的實際技術(shù)一般包括將核黃素懸浮在水中，然后加入濃酸，或者將核黃素懸浮在較少的濃酸中并向懸浮液中加入水。所使用的水較好是去離子的。然后通常在攪拌下加熱該懸浮液。
上述處理步驟(iii)的目的是水解作為不期望的雜質(zhì)存在的生物量，從而將其轉(zhuǎn)化成在含水無機酸中呈可溶形式的物質(zhì)。同時，所存在的任何DNA也受到降解(水解)，并且高分子量雜質(zhì)如蛋白質(zhì)和多糖被分解并也被轉(zhuǎn)化成可溶形式。在該加工步驟完成后核黃素仍以基本上未被溶解的形式存在。
在下一個處理步驟(iv)中，從含水酸性介質(zhì)中分離出經(jīng)過前述酸處理步驟后基本上已沒有生物量和其他雜質(zhì)的核黃素，并用水洗滌之?？稍谑覝鼗蚋哌_125℃甚至可能高達約130℃的升高溫度下用介質(zhì)進行過濾。在完成前述酸處理步驟后直接進行過濾步驟(iv)，即在這兩個步驟間不作任何冷卻處理是很便利的，并且這確實代表了本發(fā)明的優(yōu)選特征。還較好在大約70℃至90℃的溫度范圍下進行過濾，而不依賴于是否也在同樣溫度下進行前述酸處理步驟。根據(jù)濾器具(其對本發(fā)明不是重要的)的性質(zhì)和其他因素的不同，過濾可進行大約3至4小時。在收集了核黃素之后，可以反復(fù)用水，最好是用去離子水洗滌，一般可在濾器上或?qū)⑵鋺腋≡谒^好是去離子水中過濾，并精濾。在任何洗滌過程中，洗滌水本身可以處于室溫或更高溫度，甚至高達約80℃。
如果要將核黃素配制成動物飼料或其添加劑，一般可進行干燥步驟(v)。這一干燥步驟一般在大約70℃至90℃，較好在大約80℃，在降低的壓力下較好在大約60至30mmHg下進行。如上文所指出的，該階段的核黃素一般有至少96％的純度。但如果要進一步純化核黃素，特別是要將其供人使用，可以刪去干燥步驟(v)，以利于上文限定的其他三個處理步驟(vi)、(vii)和(viii)。
處理步驟(vi)包括從濃鹽酸和水中結(jié)晶出有待進一步純化的核黃素，并可于所選擇的特定溫度下將核黃素溶解在最小量，或至少不大于最小量太多的濃鹽酸中，然后使核黃素在濃鹽酸中制成的溶液與水較好是去離子水接觸以促進核黃素沉淀，特別是結(jié)晶。所說的接觸可經(jīng)將溶液加入例如倒入水中而方便地完成?？捎谑覝鼗蚋邷囟热绱蠹s80℃下，但較好在室溫下使核黃素溶解于鹽酸中。鹽酸濃度較好為大約25％至35％。必要時可向溶液中加入吸附劑活性碳和/或助濾劑如纖維素或硅藻土，然后在與水接觸之前過濾之。核黃素的鹽酸溶液對水的體積比一般在大約1∶5至1∶15范圍內(nèi)，較好為大約1∶7至1∶12。沉淀/結(jié)晶可適當(dāng)?shù)匕l(fā)生在大約20℃至95℃的溫度，較好在大約80℃的溫度條件下。
然后過濾由前述處理步驟得到的核黃素在含水酸介質(zhì)中的懸浮液并按照處理步驟(vii)用水洗滌如此收集的核黃素。該過程可按上述步驟(iv)的相似的方法完成，但建議所用溫度不超過大約40℃。過濾和洗滌較好用大約室溫至40℃的介質(zhì)來進行。
最后，干燥步驟(vii)中收集的核黃素(步驟(viii))。該步驟也是在如前所述的步驟(v)的相似條件下進行的。如此純化的核黃素一般具有至少98％的高純度，并可根據(jù)需要直接用來加工成食品或醫(yī)藥。
本發(fā)明的其他方面在于對上述包括步驟(i)至(iv)并且亦可包括(v)的方法的改變，這種改變包括用步驟(ia)增強或取代第一個步驟(i)，即加入適當(dāng)量的無機酸如鹽酸、硫酸、硝酸或磷酸，較好是(濃)鹽酸或硫酸，將發(fā)醇后肉湯的pH值調(diào)到大約5至7范圍內(nèi)。在加入酸過程中可適當(dāng)?shù)財嚢璋l(fā)酵后肉湯。
一般說來，各處理步驟可以分步進行，或者作為連續(xù)程序的一部分連續(xù)完成兩個或多個步驟。后者的例子是不包括如上所述的中間冷卻的連續(xù)酸處理和過濾步驟((iii)和(iv))。
借助下列實施例舉例說明本發(fā)明。
實施例1按已知方法使用枯草芽孢桿菌(B.subtilis)發(fā)酵生產(chǎn)核黃素。然后將發(fā)酵后肉湯于大約60℃加熱約30分鐘以進行巴氏滅菌。
用離心潷析器(Tanabe 23LL-V)離心一部分(約6,900L)發(fā)酵后肉湯。離心在相對離心力(RCF)為2,800xg，轉(zhuǎn)筒和螺卷軸間的差速(DS-BS)為10rpm。且葉輪直徑(ID)為240mm條件下進行。發(fā)酵后肉湯以2,700L/h的速度供入離心潷析器內(nèi)。將固體排出物1(核黃素純度55.7％)送入下一個離心步驟進行加工處理。
在5KL發(fā)酵罐懸浮容器中用生產(chǎn)用水懸浮固體排出物1(約1，180kg)，得到3,330L懸浮液。攪拌30分鐘后，以1,500L/h的速度將懸浮液供入離心潷析器。以2,800xg的RCF和10rpm的DS-BS及240mm的ID進行離心。將固體排出物2(核黃素純度76.9％)送入下一個處理步驟。
在5KL發(fā)酵罐懸浮容器中用生產(chǎn)用水懸浮固體排出物2(約740kg)得到3,330L懸浮液。攪拌30分鐘后，將懸浮液以1,200L/h的速度供入離心潷析器。離心主要以1,630xg的RCF、8rpm的DS-BS和240mm的ID進行。固體排出物3稱重為552kg，并具有72.6％的含濕量和87.4％的核黃素純度。
將大約550kg核黃素漿液(固體排出物3)懸浮在4KL玻璃襯里的容器內(nèi)的去離子水和鹽酸中。將固體物和鹽酸的濃度調(diào)整到3.9％(重量)固含量和0.6％(重量)HCl含量。將核黃素懸浮液加熱到大約120-125℃，在攪拌下于該溫度范圍保持約60分鐘，然后冷卻到80℃。
使用橡膠襯里的離心機(Mitsubishi Krauss-Maffei，Peeler Cen-trifuge Type HZ125)過濾按前述步驟的經(jīng)酸處理的懸浮液。于80℃用2,000L去離子水，再于20-30℃用200L去離子水洗核黃素濾餅，得到約190kg具有30.5％含濕量和97％核黃素純度的濕“核黃素96％”。
在3KL混合容器中混合338L 35％鹽酸和115L去離子水，并向此鹽酸溶液中供入180kg濕“核黃素96％”。將混合物攪拌1小時。從容器中取樣品溶液并證實核黃素的溶解。向混合容器中引入1kg活性碳(Takeda Shirasagi-A，50％濕度)并將溶液攪拌1小時。然后加入0.6kg助濾劑(Nippon Paper Industries KC-Floc，纖維素)并將混合物攪拌30分鐘。將混合物從混合容器移入橡膠襯里的溶解溶器中進行過濾。
準備兩個橡膠襯里的金剛石(Sparkler)濾器用于過濾。第一個濾器包含Toyo No.424濾紙，第二個濾器墊有Toyo NA10濾紙。然后用加壓空氣將橡膠襯里的溶解容器中的鹽酸溶液供入Sparkler濾器中，并在儲留罐中收集濾液。在進一步證實濾液中沒有活性碳污染之后，將儲留罐中的濾液轉(zhuǎn)移到溶解容器中。然后將濾液轉(zhuǎn)入濾液罐內(nèi)。用加壓空氣將留在濾器中的溶液轉(zhuǎn)入濾液罐內(nèi)。用130L35％鹽酸60L去離子水的混合物清洗溶解容器和濾器。還將過濾的洗滌溶液轉(zhuǎn)入濾液罐內(nèi)。從濾液罐中取樣品溶液，不能檢測到活性碳的污染。
將7,500L去離子水裝入17KL玻璃襯里的結(jié)晶容器中并加熱至78-82℃。將濾液罐中的核黃素的鹽酸溶液以300-350L/h的流速倒入結(jié)晶器中，致使核黃素在熱水中結(jié)晶。將混合物攪拌1小時，然后在不攪拌情況下使之冷卻。在混合物的溫度冷卻至50℃后，經(jīng)攪拌使混合物進一步冷卻到40℃以下。
將1,300L去離子水裝入2KL橡膠襯里的新漿液罐中。將結(jié)晶器中的核黃素漿液供入攪拌卸料濾器中。用去離子水洗過濾的核黃素并分離到新漿液罐中，并使濾液排放到廢水處理廠。
用離心機(Mitsubishi Krauss-Maffei，Peeler Gentrifuge Type HZ125)以950rpm離心過濾除去懸浮的核黃素結(jié)晶并用500L去離子水沖洗之。在一容器中收集約140kg濾餅并移入10KL錐形干燥器中。
將核黃素的濾餅裝入錐形干燥器內(nèi)并在60-35mmHg壓力下于68-72℃干燥8小時。然后將干燥器冷卻到35℃以下并可在塑料袋中收集約90kg干粉末。將此產(chǎn)物稱為“核黃素98％”。
分析結(jié)果表1中顯示了核黃素96％和98％的純度。經(jīng)分光光度檢測(E值＝328)重結(jié)晶核黃素的含量為100.2％。就雜質(zhì)來說，從核黃素98％中除去6，7-二甲基-8-核糖基-2，4-二氧四氫蝶啶(DMRL)，而8-羥甲基核黃素則是在重結(jié)晶期間形成的。檢測核黃素96％和98％中的光色素。根據(jù)光譜檢測結(jié)果，按上述方法得到的核黃素98％比合成的核黃素98％含有較少雜質(zhì)。核黃素98％的質(zhì)量符合EP/BP和USP的說明書的規(guī)定。
表1
實施例2使用枯草芽孢桿菌按已知方法發(fā)酵產(chǎn)生核黃素。將發(fā)酵后肉湯于大約60℃加熱約30分鐘以進行巴氏消毒，然后泵入肉湯儲存罐作進一步加工處理。
以大約3.0m3/h的流速將肉湯連續(xù)加料于第一離心潷析器。以2,800xg的相對離心力(RCF)進行第一次離心。將從該離心潷析器排出的固體物送入漿液罐，并使用管線內(nèi)混合器加生產(chǎn)用水再次制成漿液。然后以大約1.5m3/h的流速將漿液送入第二個離心潷析器。以700xg的RCF進行第二次離心。用生產(chǎn)用水將從第二個離心潷析器中排出的固體物重新制成漿液并以大約1.5m3/h的速度供入第三個離心潷析器。以700xg的RCF進行第三次離心。將第三步驟固體物與去離子水和35％鹽酸混合并移入儲存罐進行酸處理。從儲存罐中泵出35％鹽酸。將離心潷析器中的上清流層供入水相接受罐并排放到廢水處理廠。
將含有3％固體物和0.7％HCl的核黃素漿液供入三個玻璃襯里的反應(yīng)器。將漿液加熱到125℃保持2小時并在反應(yīng)器中冷卻到80℃。然后將反應(yīng)器中的漿液以大約2.5m3/h的流速供入連續(xù)的真空濾器。用熱去離子水洗濾餅并收集于混合罐內(nèi)。將濾液和洗滌水排放到廢水處理廠。
再在混合罐中用去離子水將過濾的核黃素制成漿液(約65％濕度)并連續(xù)地送入裝配有空氣加熱器、抽風(fēng)機和螺旋進料器的噴霧型干燥器。以大約70kg/h的速度將干燥的產(chǎn)物收集到產(chǎn)物接受器中。將產(chǎn)物接受器中的產(chǎn)物“核黃素96％”送入包裝系統(tǒng)并包裝在散裝袋或盒裝袋容器中。
實施例3在一次產(chǎn)生核黃素的發(fā)酵中，用枯草芽孢桿菌發(fā)酵48小時后，以蒸汽溫度為120℃的蒸汽套加熱器加熱2000L發(fā)酵容器。以這種方式將發(fā)酵后肉湯加熱45分鐘達到60℃，在58-62℃范圍內(nèi)保持30分鐘(巴氏滅菌)并在1小時時間內(nèi)使之冷卻到25℃。經(jīng)巴氏滅菌的發(fā)酵后肉湯具有下述性質(zhì)氣味微酸；顏色桔黃；密度1.037g/ml(20℃)；pH值6.93(20℃)；核黃素滴度18.45g/L(HPLC)。
在Flottweg ZILd離心潷析器上離心大約900L經(jīng)巴氏滅菌的肉湯。完成巴氏滅菌后立即啟動離心機。借助固定在發(fā)酵器上的大約0.5巴的壓力將肉湯送入離心潷析器。調(diào)整參數(shù)設(shè)定(轉(zhuǎn)筒和螺卷軸間的差速、溢水口直徑、槽深度、干燥和集合體帶、潷析器體積、液體排放流量和相對離心力)后，使?jié)銎饕?600xg的RCF運轉(zhuǎn)約30分鐘，然后取固體和液體排出物樣品進行分析。將液體排出物收集到400L攪拌容器中并加入28％氫氧化鈉水溶液(液體排出物的11/20L)調(diào)到pH≥11。將溶液于堿性pH下保持30分鐘，使液體排入廢水處理廠并用工業(yè)用水徹底清洗該潷析器。
在此第一次離心后共得到61.4kg固體排出物(產(chǎn)物1)，并將此產(chǎn)物于4℃下儲存過夜。
將第一次離心的產(chǎn)物(1)重新懸浮在裝于400L容器內(nèi)的去離子水中得到230L懸浮液，該懸浮液具有下列特征氣味微酸；顏色桔黃；密度1.028g/ml(于20℃)；pH值7.45(于20℃)；粘度2.28cSt(于20℃)；核黃素濃度52.49g/L(HPLC)。
用Watson-Marlow 701S/R蠕動泵(硅管，內(nèi)徑φ10mm，外徑φ15mm)將核黃素懸浮液泵入Flottweg ZLKd離心潷析器。調(diào)整參數(shù)標(biāo)定值后使?jié)銎饕?50xg的RCF運轉(zhuǎn)約15分鐘，然后取固體和液體排出物樣品進行分析。
收集液體排出物并按第一次離心時的相似方法處理。
該第二次離心后得到共45.6kg固體排出物(產(chǎn)物2)，并直接進一步處理該產(chǎn)物。
將產(chǎn)物2重新懸浮于去離子水中得到210L具有下列特征的懸浮液氣味微酸；顏色桔黃；密度1.021g/ml(于20℃)；pH值8.21(于20℃)；粘度1.37cSt(于20℃)；核黃素濃度54.13g/L(HPLC)。
用Watson-Matlow 701S/R蠕動泵(同上所述)將核黃素懸浮液泵入Flottweg ZILd離心潷析器中。調(diào)整參數(shù)標(biāo)定值后，使?jié)銎饕?50xg的RCF運轉(zhuǎn)大約15分鐘，然后取固體和液體排出物樣品進行分析。收集液體排出物并按前述離心的相似方法處理之。
該第三次離心后得到共36.4kg固體排出物(產(chǎn)物3)。
使用包括最佳值在內(nèi)的不同離心潷析器參數(shù)設(shè)定值，重復(fù)進行上述離心的結(jié)果如下列表2中所示
表2
從發(fā)酵后肉湯中回收并按上述方法經(jīng)三次離心純化后得到所謂“90％核黃素”，然后按實施例1(從第5段)和2(從第2段)所述的相似方法完成酸處理(iii)、過濾和沖洗(iv)、結(jié)晶(vi)、過濾和沖洗(vii)及干燥(viii)步驟，以根據(jù)需要得到“核黃素96％”和/或“核黃素98％”。
實施例4用發(fā)酵后肉湯以實驗室規(guī)模進行兩次對照實驗。第一次實驗(A)中，用25％鹽酸將發(fā)酵后肉湯酸化到pH5，但不加熱，然后回收核黃素；第二次實驗(B)中將發(fā)酵后肉湯于大約60℃加熱約30分鐘(巴氏滅菌)，然后回收產(chǎn)物。
每種情況下均將1L發(fā)酵后內(nèi)湯以1100xg的RCF離心5分鐘(在帶有甩平式轉(zhuǎn)子258-963的Mistral 6000離心機上，以2，000rpm離心)。棄去上清液，伴隨攪拌15分鐘將固體較濃厚物料(沉淀物)重新懸浮在去離子水中。然后將如此得到的核黃素以630xg的RCF離心5分鐘(在同樣離心機上，1500rpm)，棄去新的上清液并將沉淀再懸浮于水中。以這種方法進行最后一次(第三次)離心后，在真空中將所得到的沉淀物于80℃干燥20小時，然后粉碎并于這些條件下繼續(xù)干燥4小時。
在每個階段檢測有關(guān)產(chǎn)物的產(chǎn)率和純度取2ml核黃素懸浮液于110℃真空干燥30分鐘以確定經(jīng)干燥的殘留物的重量，并取10ml核黃素懸浮液分析核黃素濃度(純度)。
下列表3中給出了這些實驗的結(jié)果
表3
從發(fā)酵后肉湯中回收并按上述方法經(jīng)三次離心純化后得到所謂的“90％核黃素”，然后根據(jù)需要按實施例1(從第5段)和2(從第2段)中所述的相似方法，經(jīng)酸處理(iii)、過濾和沖洗(iv)、結(jié)晶(vi)、過濾和沖洗(vii)及干燥(viii)步驟，得到“核黃素96％”和/或“核黃素98％”。
實施例5將133g“核黃素90％”(30g核黃素、3g生物量、100g水)、120ml1M鹽酸和440ml去離子水混合成含5％固體物的懸浮液。加入50μl辛醇作為消泡劑。在以300rpm攪拌下將漿液于100℃加熱10分鐘。由地在加熱到100℃期間核黃素結(jié)晶的形狀改變，所以當(dāng)漿液的粘度增加時須將攪拌速度降低至75rpm。然后將漿液移入蒸汽容器并于120-125℃加熱60分鐘。將核黃素漿液冷卻到80℃后于濾紙(Machery omd Nagel 713，φ90mm)上真空過濾。于80℃用300ml去離子水洗滌濾餅。用300ml去離子水使核黃素重新漿化。攪拌下將漿液于80℃加熱15分鐘。然后在濾紙上于80℃真空過濾核黃素漿液。用300ml溫度80℃的去離子水洗濾餅。于80℃真空干燥所得到的核黃素并粉碎之。如此得到的稱為“核黃素96％”的核黃素產(chǎn)物一般具有至少96％的純度，并且是高質(zhì)量的。
實施例6在室溫下攪拌10分鐘使30g“核黃素90％”溶解在105ml 25％鹽酸(3.5ml/g核黃素)中。加入0.9g Norit SX2活性炭。溢大約8分鐘將溶液加熱到80℃，然后于該溫度保持20分鐘。在頂部有1.0gClarcel的雙層濾紙(Machery and Nagel 713，φ40mm)上真空過濾熱溶液。根據(jù)所用“核黃素90％”的質(zhì)量，過濾時間為10-70分鐘。在80℃攪拌下以2ml/分鐘的流速將濾液(約117m1)導(dǎo)入840ml(為所用酸的8倍體積)去離子水中。5和10分鐘的加入核黃素的晶種。當(dāng)核黃素沉淀完全時，再于80℃將結(jié)晶體漿液攪拌30分鐘。然后在60分鐘內(nèi)將漿液冷卻到大約25℃。真空下在濾布(DACRON DA-50)上過濾核黃素漿液。用300ml去離子水洗濾餅，然后再用300ml去離子水制成漿液并于23℃下攪拌15分鐘。真空下在濾布上過濾核黃素漿液并用300ml去離子水再用300ml甲醇(FLUKA puriss.)洗濾餅。在真空烘箱中80℃干燥所得到的核黃素，使之達到恒重并粉碎之。如此得到的稱為“核黃素98％”的核黃素產(chǎn)品一般具有至少98％的純度，并且有特別高的質(zhì)量。
實施例7在室溫下攪拌10分鐘，將30g“核黃素90％”溶解在105ml 25％鹽酸(3.5ml/g核黃素)中。經(jīng)大約8分鐘將溶液加熱到80℃并在此溫度下保持20分鐘。在真空下，于雙層濾紙(Machery and Nagel 713，過濾時間可以是1-6分鐘。80℃攪拌(300rpm)下，將濾液(約121ml)以2ml/分鐘的流速導(dǎo)入840ml(為所用鹽酸8倍體積)去離子水中。5和10分鐘后加入核黃素的晶種。當(dāng)核黃素沉淀完全時，再于80℃將結(jié)晶體漿液攪拌30分鐘。然后在60分鐘之內(nèi)將漿液冷卻到大約25℃。真空下在濾布(DACRON DA-50)上過濾漿液。用300ml去離子水洗濾餅后，再用300ml去離子水制成漿液并于23℃攪拌15分鐘。在濾布上真空過濾核黃素漿液并用300ml去離子水，再用300ml甲醇(FLUKA puriss.)洗濾餅。在真空烘箱中80℃干燥所得到的核黃素達到恒重并粉碎之。如此得到的稱為“核黃素98％”的核黃素一般具有至少98％的純度，并且有特別高的質(zhì)量。
實施例8將90.4g“核黃素90％”(30.74g核黃素、34％雜質(zhì)和56.3g水)懸浮在120ml 1M鹽酸和460ml去離子水中，并向懸浮液中加入50μl消泡劑辛醇。攪拌下將總混合物于100℃加熱30分鐘，然后在蒸汽容器中于120-125℃加熱60分鐘。
將懸浮液冷卻到80℃并在過濾瓶中通過Machevy and Nagel(MN)713濾紙(φ90mm)過濾收集結(jié)晶。在用300ml去離子水(80℃)洗過如此收集的核黃素結(jié)晶后將其重新懸浮在300ml去離子水中，并在攪拌下將懸浮液于80℃加熱15分鐘。然后按前述方法濾出結(jié)晶，于80℃用300ml去離子水洗，于80℃真空干燥20小時，并在粉碎后繼續(xù)真空干燥2小時。
以這種方法得到29.07g有近100％純度的“核黃素96％”，其產(chǎn)率約為95％。
實施例9攪拌10分鐘使30.0g干燥的“核黃素90％”(92.8％純度)溶解在105ml 25％(W/V)鹽酸中，之后加入0.9g Norit SX2活性炭。將混合物于80℃攪拌20分鐘。然后在過濾瓶中通過覆蓋有1.0gClarcel的雙層MN713濾紙(φ40mm)過濾該混合物。
攪拌下將濾液以2ml/分鐘的流速加到840ml去離子水(80％)中，并加入核黃素晶體作為晶種。出現(xiàn)核黃素沉淀后，再將所得懸浮液攪拌30分鐘，然后在60分鐘內(nèi)冷卻到25℃。
使用Dacron DA-50濾布(φ90mm)的過濾瓶內(nèi)的懸浮液中濾出核黃素結(jié)晶，并于20℃用300ml去離子水清洗之。于20℃在300ml去離子水中將如此收集的核黃素重新制成漿液，再次濾出結(jié)晶并按前述方法清洗，然后再用300ml甲醇洗。
于80℃真空干燥如此收集并洗過的核黃素至恒重后，以大約93％的產(chǎn)率得到幾乎有100％純度的25.1g“核黃素98％”。
實施例10經(jīng)3步驟離心后分離“核黃素90％”并在生產(chǎn)裝置中與去離子水和鹽酸混合。將如此得到的懸浮在稀酸溶液中的核黃素的各種樣品于室溫下儲存于儲存罐中。從儲存罐中取各樣品溶液用于涉及本發(fā)明的酸處理和過濾步驟(步驟(iii)和(iv))的實驗。在每種情況下，均將核黃素在稀鹽酸中制成的漿液在大氣壓下，在分液瓶中攪拌下于90℃和120℃加熱一定時間，然后用熱水洗經(jīng)過過濾的熱的(沒有冷卻)，收集的固體物，于80℃真空干燥約12小時并檢測如此得到的“核黃素96％”的純度。下列表4中給出了由本發(fā)明方法的該分批處理步驟(iii)和(iv)所得到的有關(guān)數(shù)據(jù)及結(jié)果。
表4
實施例11在根據(jù)本發(fā)明方法步驟(iii)和(iv)的連續(xù)酸處理和過濾程序進行的另一組實驗中，將“核黃素90％”漿液在濃度為0.8％(重量)的稀鹽酸中的各樣品以72ml/小時的速度輸入加熱瓶中，在其中以90℃加熱，然后仍以72ml/小時的速度連續(xù)輸入第二個加熱瓶并在該燒瓶中以90℃加熱一段時間。不經(jīng)冷卻，以72ml/小時的流速將第二個燒瓶的加熱的內(nèi)容物連續(xù)移入過濾單元并進行熱過濾。最后，用熱水洗收集的固體物，在真空下80℃干燥約12小時并檢測如此得到的“核黃素96％”的純度。下列表5中給出了由該連續(xù)酸處理和過濾步驟得到的有關(guān)數(shù)據(jù)和結(jié)果
表權(quán)利要求
1.從發(fā)酵后肉湯中回收的和純化核黃素的方法，其特征在于下列基本步驟(i)于大約45℃至120℃將所說的發(fā)酵后肉湯加熱大約10分鐘至2小時以進行巴氏滅菌，(ii)將如此巴氏滅菌的肉湯離心一次或多次以得到主要由核黃素組成的產(chǎn)物，(iii)用無機酸水溶液于大約80℃至大約130℃的溫度將上述步驟的產(chǎn)物處理大約30分鐘至24小時和(iv)經(jīng)過濾從前述步驟的含水酸介質(zhì)中收集核黃素并用水洗滌之，以及選擇性步驟(v)干燥前述步驟收集的洗過的產(chǎn)物，以提供有實質(zhì)性純度的核黃素。
2.(進一步)純化已從發(fā)酵后肉湯中回收并且根據(jù)需要用無機酸水溶液處理、過濾及用水洗滌已純化到一定程度的核黃素的方法，該方法的特征在于以下基本步驟(iv)從濃鹽酸和水中結(jié)晶所說的核黃素，(vii)經(jīng)過濾從前述步驟的酸介質(zhì)中收集固體核黃素并用水洗滌之，以及(viii)干燥前述步驟中收集和洗滌過的產(chǎn)物，以提供高純度的核黃素。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中欲如此純化的核黃素是從發(fā)酵后肉湯中回收并以權(quán)利要求1的方法純化的。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中欲如此純化的核黃素是從以權(quán)利要求1的處理步驟(i)和(ii)發(fā)酵后肉湯中回收的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中通過加入適當(dāng)量的無機酸將發(fā)酵后肉湯的pH值調(diào)到大約5至7這一步驟而增強或取代步驟(i)。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項的方法，其中欲被回收和/或純化的核黃素是已經(jīng)過培養(yǎng)微生物枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)而發(fā)酵產(chǎn)生的。
7.根據(jù)權(quán)利要求1和3至6中任何一項的方法，其中步驟(i)是于大約50℃到70℃的溫度范圍將發(fā)酵后肉湯加熱少于約45℃分鐘而進行的。
8.根據(jù)權(quán)利要求1和3至7中任一項的方法，其中步驟(ii)包括三次離心。
9.根據(jù)權(quán)利要求1、3和5至8中任一項的方法，其中步驟(iii)是于大約90℃至130℃的溫度范圍內(nèi)用無機酸水溶液將步驟(ii)的產(chǎn)物處理大約30分鐘至6小時，特別是于大約100℃至125℃的溫度范圍處理大約1至3小時而完成的。
10.根據(jù)權(quán)利要求1、3和5至8中任何一項的方法，其中步驟(iii)是于大約80℃至100℃的溫度范圍用無機酸水溶液將步驟(ii)的產(chǎn)物處理大約8至16小時而完成的。
11.根據(jù)權(quán)利要求1、3和5至10中任何一項的方法，其中步驟(iv)是在完成前面的步驟(iii)后，于這兩個步驟之間沒有經(jīng)過冷卻而直接完成的。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從發(fā)酵后肉湯中回收和純化核黃素的方法。還公開了一種(進一步)純化已從發(fā)酵后肉湯中回收并根據(jù)需要經(jīng)用無機酸處理、過濾和用水洗已純化到一定程度的核黃素的方法。本發(fā)明的進一步的方面是加入無機酸將發(fā)酵后肉湯的pH值調(diào)到大約5至7以取代加熱步驟。
文檔編號C07D475/00GK1146455SQ96104219
公開日1997年4月2日 申請日期1996年3月1日 優(yōu)先權(quán)日1995年3月3日
發(fā)明者E·庫福 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司