專利名稱：促肝細胞生長素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種用于治療肝炎、肝硬化等疾病的藥物-促肝細胞生長素，具體的講，它是一種從幼齡動物的新鮮肝臟中提取的分子量約為一萬的肝細胞刺激因子，屬于一類生化藥物。本發(fā)明也是本申請人的CN89107217的后續(xù)專利。
多年來，研究人員一直在研究能阻止肝細胞壞死和能促進肝細胞再生的物質(zhì)，所述的研究集中在肝臟本身所產(chǎn)生的肝再生刺激因子的上，并已證明它們具有刺激肝細胞再生的作用。
申請人CN89107217中已公開了一種采用負壓透析法制備肝細胞生長素的方法，該制備方法簡單方便，易于推廣應(yīng)用，便于大批量生產(chǎn)；但由于沒有給出該方法所生產(chǎn)出的制品的物化參數(shù)或沒有給出測試的條件，因此無法確定該多肽化合物的具體結(jié)構(gòu)或無法用已公開的參數(shù)來確定該多肽化合物，這樣就使所生產(chǎn)出的產(chǎn)品沒有重現(xiàn)性。
本發(fā)明的目的在于提供一種以幼齡哺乳動物的新鮮肝臟為原料，制備一種用于治療肝炎、肝硬化等疾病并且具有高度重現(xiàn)性和更高的相對活性的藥物-促肝細胞生長素。
本發(fā)明的目的可以通過以下方法實現(xiàn)采集幼齡哺乳動物的新鮮肝臟，除去肝膜及韌帶后切碎，加入蒸餾水在高速搗碎機中高速搗碎并制成勻漿，離心沉淀去沉渣，取上清液裝入透析裝置中進行透析將透析物用SephadexLH20柱層析分離后得到本發(fā)明所述的促肝細胞生長素。
本發(fā)明的


如下圖一是本發(fā)明采用小于60天乳豬的新鮮肝臟制備的促肝細胞生長素在波長為λ=254nm下的高效液相色譜；圖二是本發(fā)明采用乳豬的新鮮肝臟制備的促肝細胞生長素在波長為λ=230nm下的高效液相色譜；圖三是本發(fā)明采用乳豬的新鮮肝臟制備的促肝細胞生長素在波長為λ=280nm下的高效液相色譜；圖四是本發(fā)明所述的促肝細胞生長素的紅外光譜圖；下面結(jié)合附圖和各種表格所列數(shù)據(jù)對本發(fā)明所述的促肝細胞生長素作進一部的說明本發(fā)明的詳細的制備工藝是采集豬齡(或其它動物，如乳牛、大鼠等)小于60天乳豬的新鮮肝臟，要求離體6小時以內(nèi)，去肝膜及韌帶切碎；按1克肝加2～5克蒸餾水的比例加入蒸餾水后打碎制成勻漿；離心沉淀去沉渣，用透析裝置截取數(shù)均分子量為10685D，重均分子量為11350D的透析液，低溫濃縮，調(diào)整多肽量高于5mg/ml。然護用現(xiàn)有技術(shù)中的除菌方法，如正壓超濾除菌。
對再生肝細胞有絲分裂的影響的實驗按如下步驟進行促肝細胞生長素的分離SephadexLH20柱，直徑9mm，柱長100cm，將20mg的促肝細胞生長素溶于0.5ml0.05MPBS(PH7.4)加于層析柱上，采用0.05MPBS(PH7.4)淋洗，流速為1.1ml/5min，收集樣品，測光密度值，樣品收集后凍干低溫保存。
體內(nèi)實驗雄性Wistar大鼠，135～190g，于上午9∶00～11∶30在戊巴比妥鈉(4mg/100g體重)麻醉下進行32%的肝部分切除，術(shù)后4-6小時經(jīng)腹腔分別注射生理鹽水4ml，促肝細胞生長素20ml，促肝細胞生長素經(jīng)層析柱后的分離組分，于30小時固定于肝右葉中下1/3處取材，Bouin's液固定，包埋切片6u，H.E染色，有絲分裂計數(shù)。
體外實驗，雄性豚鼠200-300G，經(jīng)心臟采血致死，無菌取出肝臟，沖洗后剪碎于100目尼龍網(wǎng)上輕研，過濾，用含10%胎牛血清1640培養(yǎng)液制備肝細胞懸液，細胞計數(shù)為5-7*10的5次方個/ml,0.2%臺盤藍染色活率為81%。當活率大于70%時進行24孔板培養(yǎng)，每孔加1ml含血清1640培養(yǎng)液，37度，5%CO2，培育4小時，吸取各孔的上清液，正常對照組不加促肝細胞生長素，實驗組每孔加含40ug促肝細胞生長素的無血清1640培養(yǎng)液，24小時每孔加2uci的3H-dTR，37度，5%CO2，2.5小時，分別收集各孔的細胞，用0.01MPBS沖洗3次，涂于玻璃纖維濾紙片上，37度干燥過夜，將紙片放入閃爍杯中，加閃爍液5ml，閃爍計數(shù)器測各樣品的CPM值。
從小于60天的乳豬或其它附合上述條件的哺乳動物的肝臟中提取出來的提取物經(jīng)SephadexLH20柱層析后得6個活性峰，其中第一峰占相對面積為27%，第二峰為23.3%，第三峰為14.2%，第四峰為19.4%，第五峰為10.6%，第六峰為5.5%。然后將促肝細胞生長素及各活性峰進行對再生肝細胞有絲分裂的影響的實驗。
實驗結(jié)果表明，除第2峰外，其余各峰均能明顯促進再生肝細胞的有絲分裂。各活性峰的使用劑量均為20mg；所述的提取物經(jīng)分離后的組份盡管蛋白含量減少，但活性并未見明顯降低，尤其是第6峰和第3峰，其活性分別為對照組的3.3倍和3.1倍(見表一)，與20mgHGF的活性相似(3.6倍)。并使體外培養(yǎng)肝細胞的DNA合成增加到原來的3.24倍(表二)，表明本發(fā)明所述的促肝細胞生長素能夠促進細胞的DNA合成和有絲分裂。說明從乳豬中提取出來的提取物經(jīng)提純后，其產(chǎn)物雖蛋白含量減少，而相對活性有所提高。
促肝細胞生長素及其組分對再生肝細胞有絲分裂百分率的作用影響見下表1；各活性峰的使用劑量均為20mg促肝細胞生長素經(jīng)SephadexlLH20柱層析分離后的組分表1.促肝細胞生長素及各活性峰對再生肝細胞有絲分裂的影響動物數(shù)有絲分裂百分率倍數(shù)P值對照組80.9440.166HGF(20mg)103.4160.4343.6<0.001峰132.4210.6252.6<0.001峰250.4600.3110.5>0.05峰342.9250.6053.1<0.001峰442.3940.9302.5<0.05峰561.8600.5812.0<0.05峰633.1300.6403.3<0.001從表一可知，從小于60天的乳豬中提取出來的提取物的第2峰有絲分裂百分率為0.460±0.311，比鹽水對照組0.944±0.166還低，但沒有顯著性差異(P＞0.55)，因此，第2峰具有抑制肝細胞增生的作用或第2峰就是所謂的肝抑制因子。
表2本發(fā)明促肝細胞生長素對體外肝細胞
DNA3H-dTR摻入量的影響孔數(shù)CPM值倍數(shù)P值對照組46565.31579.2實研組421275.57683.33.24<0.05本實驗結(jié)果表明，從乳豬中提取出來的提取物的分子量在10，000左右，經(jīng)SephadexLH20柱層析分離后得6個峰，5個峰具有促進肝細胞增生的活性，說明HGF的分子量在1萬左右呈連續(xù)性分布(表一)。因此，促進肝細胞增生的生物因子并不是單一分子，而是許多不同分子量的蛋白和核酸共同作用的結(jié)果。
現(xiàn)有技術(shù)所述的肝細胞生長因子有兩種來源1.肝外來源包括血清中肝特異性的生長因子，PDGF、胰島素，胰高血糖素等；2.肝臟來源即本發(fā)明所述的促肝細胞生長素。而對于上述1所述的因子能否促進肝細胞的有絲分裂沒有文獻報道。本發(fā)明所述的促肝細胞生長素的研究結(jié)果表明促肝細胞生長素能促進肝細胞的DNA合成，和促進再生肝細胞的有絲分裂，證實促肝細胞生長素可做為肝細胞的有絲分裂原而存在。
將本發(fā)明所述的促肝細胞生長素不進行SephadexLH20柱層析分離，而用高效液相色譜進行分析，在λ=280下測定本發(fā)明所述的促肝細胞生長素主要峰保留時間(tr)和峰的面積(A%)表三λ=280本發(fā)明所述的促肝細胞生長素主要峰保留時間(tr)和峰的面積(A%)
設(shè)定方法如下，在分離較完全的條件下1、可用(2+3)及4號峰表示促肝細胞生長素的主成份峰，其面積和占總峰面積的27%；2、可用6、7、9、10號峰表征第二類峰，其面積約占總峰面積的35%；3、其它可看作第三類表征峰；4、所有峰的保留時間(tr)是在上述特定的色譜條件下測定的，除色譜分離的流動相外，也會受到使用不同廠家生產(chǎn)的柱而有所變化(均為反相碳十八柱)。這樣，上數(shù)述批號的試樣的平均數(shù)為峰號12+3456789101112 A%5.510.0217.193.767.138.906.249.829.1264.814.27在λ=230nm下測定本發(fā)明所述的促肝細胞生長素主要峰保留時間(tr)和峰面積(A%)表四在λ=230nm本發(fā)明所述的促肝細胞生長素主要峰保留時間(tr)和峰面積(A%)RECALCTITLE:HPLCANALYSISOFHGFPRODUCTS11:476JUL93CHANNELNO:1SAMPLE:930504,λ=230nmMETHOD:HGFPEAKPEAKRESULTTIMEAREASEPNONAMEA%(MIN)COUNTSCODE114.571.8471058320BV21.171.975295812VV32.422.026175749VV47.392.121536837VV511.302.404820881VV62.592.697187853VV71.802.837130449VV84.072.917295518VV96.863.121498003VV103.823.573277642VV1116.463.8521195300VV127.884.131572303VV132.524.662183398VV143.595.377260895VV152.036.986147232VV165.367.974389223VV171.718.446124053VV181.579.334113865VVTOTALS:100.017263330MULTIPLIER:1.00000
具體的譜圖見圖二；本發(fā)明制備出來的促肝細胞生長素，經(jīng)高效液相色譜組份分析證明，促肝細胞生長素的數(shù)均分子量為10685D，重均分子量為11350D的小分子物質(zhì)；并排除促肝細胞生長素中含有胰島素、胰高糖素的存在；活性測定表明有明顯的刺激肝細胞DNA合成的作用，與鹽水對照有顯著的差異。
本發(fā)明所束述的促肝細胞生長素還含有多種微量元素和多種氨基酸。
表五促肝細胞生長素的氨基酸含量的分析測定結(jié)果 表5說明采用本發(fā)明的方法制備的促肝細胞生長素含有18種氨基酸，總量點25.06。
表六促肝細胞生長素微量元素分析測定平均值(μg/ml)FeSeMgZnCaMnCoCuK7-8<0.05100-15013-1635.00.40<0.0050.76>2000
表6表明，促肝細胞生長素中除含有K、Na、Ca、Mg外，還存在著比正常人血清高15倍的Zn和微量的Se。
實施例一按前述方法制備促肝細胞生長素，所述樣品的數(shù)均分子量為10685D，重均分子量為11350D；以表七的表頭所列條件進行色譜分析，結(jié)果如表七。
實施例二和實施例一同樣的方法制備樣品，在λ=280nm的波長下對本發(fā)明所述的促肝細胞生長素進行高效液相色譜分析，相應(yīng)的圖是圖三，具體的結(jié)果見表八。
實施例三和實施例一同樣的方法制備樣品，在表九所列的條件下對本發(fā)明所述的促肝細胞生長素進行色譜分析，相應(yīng)的圖是圖一，具體的結(jié)果如表九列出實施例四和實施例一同樣的方法制備樣品，對本發(fā)明所述的促肝細胞生長素進行紅外光譜分析，見圖四；本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)中所述的類似產(chǎn)品相比具有無過敏反應(yīng)、降酶幅度大、速度快、退黃顯著等優(yōu)點，并能明顯改善患者肝區(qū)疼痛、乏力、腹脹等癥狀。
表七SAMPLE:DATAFJLE:-57.BFFDATE:07/28/93METHOD:METHODFJLE:-05.MTHTIME:08:09:00ANALYST:SYSTEMFILE:1TYPE:AREAPERCENTRUNNUMBER:4JNDEX:1WAVELENGTH:254nmPEAK#AREA%RTAREABC10.0580.37205230220.2290.67813980230.0580.69206340240.2290.93811520250.4070.971443630260.1051.25371260270.0961.31341820280.0871.37307910290.0781.442759702100.0791.472808802110.6261.6522214802123.7372.11132550902135.032.541784302021470.6572.672506415908153.463.17122750105164.2973.7152411301170.0643.882278901182.7734.4198365201190.0785.042744062200.0635.252237162210.2115.677489662221.9315.8868521402230.0626.22183602241.0996.4139003302250.1446.725088902260.3567.612641002271.2689.0744974802280.1939.976848002290.55710.0919755902300.11110.973944002310.09211.493248502320.13212.044697002330.08812.13118502340.08612.163031402350.16112.255723902360.06812.372419802370.06712.422355202380.07212.472579502390.07112.532492302400.10312.653657002410.05612.732000502420.27912.829902602430.213.127089402440.0813.452833602450.17813.776308602460.05614.012006802470.06814.162398303TOTAL100.35472972


權(quán)利要求
1.一種促肝細胞生長素，其特征在于所述的促肝細胞生長素的數(shù)均分子量為10685D，重均分子量為11350D；在λ=280nm下測定本發(fā)明所述的促肝細胞生長素具有如下的主要峰保留時間(tr)和峰面積(A%)峰號12+3456789101112平均tr1.852.0002.4002.672.893.093.533.813.9904.575.270A%5.510.0217.193.767.138.906.249.829.1264.814.27在λ=230nm下測定本發(fā)明所述的促肝細胞生長素主要峰保留時間(tr)和峰面積(A%)；本發(fā)明所述的促肝細胞生長素還具有18種氨基酸和10種微量元素。用SephadexLH20柱層析分離本發(fā)明所述的肝臟透析物后得到6個活性峰，其中第一峰占相對面積約為27%，第二峰為約23.3%，第三峰約為14.2%，第四峰約為19.4%，第五峰為約10.6%，第六峰為約5.5%；各活性峰進行對再生肝細胞的有絲分裂應(yīng)滿足有絲分裂百分率倍數(shù)P值對照組0.944±0.166峰12.421±0.6252.6＜0.001峰20.460±0.3110.5＞0.05峰32.925±0.6053.1＜0.001峰42.394±0.9302.5＜0.05峰51.860±0.5812.0＜0.05峰63.130±0.6403.3＜0.001。
2.權(quán)利要求1所述的促肝細胞生長素，其特征在于所述的氨基酸名稱及含量(W%)為1.39Asp,0.39Thr,0.72Ser、3.14Glu、0.94Pro、1.23Glv、1.18Ala、minoCvs、0.84Val0.56Met、0.67Ile，1.66Leu，0.48Tyr，0.73Phr，0.58Hls，2.48Try，1.11Lys，6.96Arg；總量占25.06%。
3.權(quán)利要求1所述的促肝細胞生長素，其特征在于所述的微量元素(λg/ml)7.8Fe,＜0.05Se,111.5Mg,5.8Zn,＞500Na,35.0Ca,0.40Mn,＜0.005Co,0.76Cu,＞2000K
全文摘要
本發(fā)明涉及的是一種用于治療肝炎、肝硬化等疾病的藥物——促肝細胞生長素，具體的講，它是一種從幼齡動物的新鮮肝臟中提取的分子量約為一萬的肝細胞刺激因子，屬于一類生化藥物；具有無過敏反應(yīng)、降酶幅度大，并能改善患者肝痛、乏力、腹脹等癥狀，比利用現(xiàn)有技術(shù)制備的肝細胞生長素具有更加明確的物化參數(shù)和更高的相對活性。
文檔編號C07K14/475GK1104504SQ93120999
公開日1995年7月5日 申請日期1993年12月30日 優(yōu)先權(quán)日1993年12月30日
發(fā)明者孔祥平, 張宜俊, 鄭國池, 陳光明, 楊富強 申請人:中國人民解放軍第四五八醫(yī)院