專利名稱：用于治療腫瘤的二氟谷氨酸與葉酸類化合物和抗葉酸劑的結(jié)合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及二氟谷氨酸與葉酸類化合物和抗葉酸劑的新的結(jié)合物，這些結(jié)合物在治療腫瘤方面的應(yīng)用，以及用于上述結(jié)合物制備過程的中間體。
通過葉酰聚谷氨酸合成酶(folylpolyglutamate synthetase)的作用，葉酸類藥物和經(jīng)典的抗葉酸劑(如MTX1)在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)變成聚(γ-谷氨酰)代謝物，
由于現(xiàn)在已知葉酰聚谷氨酸(folylpolyglutamates)對(duì)于葉酸代謝的正常運(yùn)行是必需的，并且知道抗葉酰聚谷氨酸(antifolylpolyglutamates)與經(jīng)典的抗葉酸劑(如MTX)的細(xì)胞毒性作用有連帶關(guān)系，因此葉酰聚谷氨酸合成酶已成為研究葉酸生物化學(xué)和生化藥理學(xué)的重要的酶。在這方面，已經(jīng)廣泛研究了該種酶對(duì)蝶酰和L-谷氨酸酶底物的特異性。對(duì)于蝶酰酶底物，其雜環(huán)部分的結(jié)構(gòu)可以明顯地不同，但是現(xiàn)在所有的報(bào)告均表明，末端的L-谷氨酸殘基對(duì)于酶底物活性是絕對(duì)需要的。引入的氨基酸的特異性是嚴(yán)格的，但不是絕對(duì)的。L-高磺基丙氨酸和D，L-疊同-或D，L-對(duì)映-4-氟谷氨酸都可以用作有效的代用酶底物，但是在每種情況下其摻入均會(huì)引起鏈終止。由4-氟谷氨酸非對(duì)映體所引起的鏈終止證明，在γ-谷氨?；荏w位點(diǎn)對(duì)L-谷氨酸具有嚴(yán)格的特異性。
應(yīng)用〔3H〕Glu和氨甲蝶呤(4-NH2-10-CH3Pte-Glu)或四氫葉酸作底物時(shí)，F(xiàn)2Glu是聚(γ-谷氨酰化作用)(Poly(γ-glutamylation))的強(qiáng)有力的濃度依賴性抑制劑。申請(qǐng)人已經(jīng)檢測(cè)了F2Glu作為可替代之底物的作用，但是與以前所特征化的可替代之底物4-氟谷氨酸(McGuire和Coward，J.Biol.Chem.2606747(1985))相反，F(xiàn)2Glu并不終止聚谷氨酸鏈延長(zhǎng)反應(yīng)。換句話說，即F2Glu可促進(jìn)鏈延長(zhǎng)。因此，當(dāng)與Glu存在下進(jìn)行的同一反應(yīng)進(jìn)行比較時(shí)，在F2Glu存在下能夠以明顯高的速度從含有1個(gè)和2個(gè)附加氨基酸殘基的〔3H〕氨甲蝶呤得到合成產(chǎn)物，而對(duì)于多含2個(gè)殘基的產(chǎn)物來講，這種效果尤為明顯。增加加入的速度不只是起到連接F2Glu到內(nèi)部Glu上或到以前摻入之F2Glu上的功能，因?yàn)檫B接Glu到4-NH2-10-CH3PtGlu-γ-(3，3-二氟谷氨酸)上的作用也增加了。上述結(jié)果與F2Glu在引入氨基酸(谷氨酸類似物)或在γ-谷氨酰基受體水平上增加聚(γ-谷氨酸)代謝產(chǎn)物的合成是一致的。因此，F(xiàn)2Glu是第一個(gè)谷氨酸類似物，它可增加由葉酰聚谷氨酸合成酶所催化的鏈延長(zhǎng)。
應(yīng)用化合物3，3-二氟谷氨酸(F2Glu)與某些葉酸類化合物和抗葉酸劑制備式1的結(jié)合物及其藥學(xué)上適用的鹽，
其中R1為-NH2、H或-CH3;
R2為-NH2或-OH;
R3為H、(C1～C4)烷基、烯丙基或炔丙基，并且X、Y和Z各自獨(dú)立地為氮原子或CH基團(tuán)。
結(jié)構(gòu)式1的結(jié)合物可用于治療腫瘤和牛皮癬。此外，化合物F2Glu和某些PABA-F2Glu化合物是用于制備式1化合物的中間體。
本發(fā)明化合物的二氟谷氨酸部分具有一個(gè)手性中心，因此本發(fā)明化合物存在立體化學(xué)異構(gòu)體對(duì)。雖然相當(dāng)于L-谷氨酸天然構(gòu)型的對(duì)映體是較好的，但是申請(qǐng)人意圖是各別異構(gòu)體和包括外消旋混合物在內(nèi)的各個(gè)異構(gòu)體混合物均包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。除非另有說明，否則本申請(qǐng)的化合物是2個(gè)立體異構(gòu)體的混合物。此外，其中Z為CH基團(tuán)，R3不是氫的上述式1化合物有第2個(gè)手性位點(diǎn)。以第2個(gè)手性位置為基礎(chǔ)的立體化學(xué)構(gòu)型不是很嚴(yán)格的，并且申請(qǐng)人再次指出，分離的異構(gòu)體及其混合物均包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。就上述第2個(gè)手性位點(diǎn)來說，異構(gòu)體的外消旋混合物是較好的。
式1化合物含有2個(gè)羧酸部分，因此能形成1個(gè)或2個(gè)堿或鹽。具體地說，這些鹽包括堿金屬鹽，例如鈉鹽和鉀鹽;堿土金屬鹽，例如鈣鹽和鎂鹽，包括鋁在內(nèi)的ⅢA族輕金屬鹽;有機(jī)伯胺、仲胺和叔胺鹽，例如包括三乙胺在內(nèi)的三烷基胺，普魯卡因、二芐胺、1-乙胺、N，N′-二芐基乙二胺、二氫樅胺、N-(低級(jí))烷基哌啶以及其他合適的胺鹽。其中優(yōu)選的是鈉鹽。
式1化合物還可以與任一無毒的有機(jī)或無機(jī)酸一起形成藥學(xué)上適用的酸加成鹽?？尚纬珊线m鹽的具體的無機(jī)酸有鹽酸、氫溴酸、硫酸和磷酸，以及酸式金屬鹽，如磷酸一氫鈉和硫酸氫鉀?？梢孕纬珊线m鹽的具體的有機(jī)酸有一、二和三羧酸。這樣的羧酸其實(shí)例有乙酸、羥基乙酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、富馬酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、抗壞血酸、馬來酸、羥基馬來酸、苯甲酸、羥基苯甲酸、苯乙酸、肉桂酸、水楊酸、2-苯氧基苯甲酸和磺酸(如甲磺酸和2-羥基乙磺酸)。優(yōu)選的是鹽酸鹽。
式1化合物可以從式2的葉酸或抗葉酸衍生物-其中R1、R2、R3、X、Y和Z定義同上述式Ⅰ化合物，與被合適保護(hù)的F2Glu的衍生物-如式3的叔丁基酯衍生物，F(xiàn)2Glu(OtBu)2，
反應(yīng)，然后由其反應(yīng)產(chǎn)物上除去保護(hù)基團(tuán)而制得。
式2化合物與式3的受保護(hù)之F2Glu衍生物的偶聯(lián)可按照由胺和羧酸制備酰胺任何適當(dāng)方法來實(shí)現(xiàn)。本申請(qǐng)人已使用磷酰氰酸二乙酯((EtO)2P(＝O)CN)實(shí)現(xiàn)了式2與式3化合物的偶聯(lián)。該反應(yīng)按下法進(jìn)行將合適的式2化合物的溶液慢慢地滴加到((EtO)2P(＝O)CN)和酸消除劑(如吡啶，或最好為三乙胺)的溶液中。使生成的混合物于0°～60℃(最好于室溫)下約反應(yīng)1～10小時(shí)，最好反應(yīng)2～5小時(shí)，直至式2化合物充分地與磷酰氰酸酯反應(yīng)為止。然后向該混合物中加入F2Glu(OtBu)2溶液，使產(chǎn)生的反應(yīng)于0°～60℃(最好于室溫)下進(jìn)行約24～100小時(shí)，一般為約72小時(shí)。例如可通過蒸發(fā)溶劑，用水洗滌并干燥等方法分離粗產(chǎn)物。然后用純的三氟乙酸處理粗產(chǎn)物，以便脫去叔丁基酯保護(hù)基。分離出所需的式1化合物，并進(jìn)行純化，例如可用柱層析法純化。適用于上述偶聯(lián)反應(yīng)的溶劑包括各種反應(yīng)物在其中均可溶并且對(duì)反應(yīng)無干擾的任何溶劑，例如二甲基甲酰胺(DMF)是較好的。
其中Z為氮原子的式1化合物可以由另一方法制備，該方法包括使式4的使對(duì)氨基苯甲酸(PABA)衍生物-其中，R3與在上述式1化合物中的定義相同，與式3化合物(F2Glu(OtBu)2)反應(yīng)，得到式5中間體化合物，
-其中，R3與在上述式1化合物中的定義相同。該偶聯(lián)反應(yīng)可以按任一合適的方式進(jìn)行，例如可以按McGuire等(Cancer Research 1989，49，4517～4525);Galican等(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，1985，82，2598～2602);Piper和Montgomery(J.Org.Chem.，42(2)，208～211(1977));Taylor等(J.Med.Chem.28，913～921(1985));Taylor等(J.Med.Chem.28，1517～1522(1985));Jones等(J.Med.Chem.32，847～852(1989))所述的方法進(jìn)行。
然后將式5中間體與式6的溴甲基衍生物縮合，得到叔丁氧基保護(hù)的化合物，例如用三氟乙酸水解，除去叔丁氧基保護(hù)基，即得到所需的式1化合物。
-其中R1、R2、X和Y與在上述式1化合物中的定義相同。該反應(yīng)可以按下法進(jìn)行使式5和式6化合物的混合物與二甲基乙酰胺(Me2NAc)于25°～80℃，最好在50～55℃下反應(yīng)2～12小時(shí)，最好約4小時(shí)，然后將反應(yīng)混合物于室溫下靜置6～24小時(shí)，最好為約12小時(shí)。再在減壓下除去Me2NAC，將粗產(chǎn)物置于冰浴中，并用三氟乙酸處理，在加入完成之后使混合物升溫至室溫。靜置1～6小時(shí)(一般為約4小時(shí))之后，減壓下除去TFA，得到所需的式1的粗產(chǎn)物。該產(chǎn)物可以經(jīng)層析法(DEAE-纖維素柱，用NH4HCO3梯度洗脫)純化。該縮合反應(yīng)更詳細(xì)的敘述見前面所提到的參考文獻(xiàn)。
對(duì)具體保護(hù)基的選擇和應(yīng)用是本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)一般專業(yè)人員所熟知的。一般來講，應(yīng)該選擇在接著進(jìn)行的合成步驟中能充分保護(hù)所述氨基或羥基，并且在不引起所需產(chǎn)物降解的條件下容易脫去的保護(hù)基。合適的羥基保護(hù)基其實(shí)例有C1～C6烷基、四氫吡喃基、甲氧基甲基、甲氧基乙氧基-甲基、叔丁基、苯甲?；腿交谆Ｐg(shù)語C1～C6烷基是指有1～6個(gè)碳原子的直鏈、支鏈或環(huán)狀結(jié)構(gòu)的飽和烴基。苯甲?；难苌锟梢栽谶拎ご嬖谙掠晌幢槐Ｗo(hù)的化合物與苯甲酰氯反應(yīng)生成。合適的氨基保護(hù)基的實(shí)例有苯甲?；?、甲?；?、乙?；⑷阴；?、鄰苯二甲?；⒓妆交酋；?、苯磺?；?、芐氧基羰基、取代的芐氧基羰基(例如對(duì)-氯、對(duì)-溴、對(duì)-硝基、對(duì)-甲氧基、鄰-氯、2，4-二氯和2，6-二氯衍生物)、叔丁氧基羰基(BOC)、叔戊氧基羰基、異丙氧基羰基、2-(對(duì)-聯(lián)苯基)-異丙氧基羰基、烯丙氧基羰基、環(huán)戊氧基羰基、環(huán)己氧基羰基、金剛烷氧基羰基、苯基硫代羰基和三苯基甲基。較好的氨基被保護(hù)的化合物包括苯甲酰基衍生物和乙?；苌?，它們可以分別由未被保護(hù)的化合物與苯甲酰氯反應(yīng)或者未被保護(hù)的化合物與乙酸酐反應(yīng)而制得。
本發(fā)明提供了治療患有腫瘤性疾病患者的方法，該方法包括給患者使用治療上抗腫瘤有效劑量的式1化合物。通過給患有腫瘤性疾病的患者使用治療上抗腫瘤有效劑量的式1化合物，可以得到抗腫瘤的效果。術(shù)語“患者”是指溫血?jiǎng)游?，例如包括人的靈長(zhǎng)目、羊、馬、牛、豬、狗、貓、大白鼠和小白鼠。
這里所用的術(shù)語“腫瘤性疾病”是指異常的狀態(tài)或疾病，其特征在于迅速增殖性細(xì)胞生長(zhǎng)或腫瘤生成。根據(jù)本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的一般實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)技術(shù)和方法，以及根據(jù)與已知的有效化合物進(jìn)行對(duì)比的結(jié)果證明，式1化合物可用于治療患有通常是用或者可以用葉酸類藥物或抗葉酸劑(如氨甲蝶呤、氨蝶呤、5，10-二脫氮雜葉酸(5，10-dideazafolate)和甲酰四氫葉酸)治療之腫瘤的患者。上述腫瘤性疾病包括但不限于急性成淋巴細(xì)胞白血病、慢性淋巴細(xì)胞白血病、急性成髓細(xì)胞白血病和慢性髓細(xì)胞白血病;包括但不限于子宮頸癌、食管癌、胃癌、小腸癌、結(jié)腸癌和腫癌;包括但不限于骨細(xì)胞肉瘤、骨肉瘤、脂肪瘤、脂肉瘤、血管瘤、血管肉瘤;無黑色素的黑素瘤和黑變病的黑素瘤;混合型的腫瘤，如淋巴系統(tǒng)癌肉瘤、濾泡網(wǎng)狀組織癌肉瘤、細(xì)胞肉瘤和何杰全氏疾病。當(dāng)然，熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員懂得，不是每個(gè)式1化合物對(duì)上述各種腫瘤都會(huì)有效，并且懂得，選擇最合適的化合物是屬于本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍之內(nèi)的事，并且可以根據(jù)包括在普通動(dòng)物腫瘤模型上得到的結(jié)果在內(nèi)的各種因素來選擇最合適的式1化合物。一般來講，目前用葉酸類藥物和抗葉酸劑治療的上述腫瘤性疾病均可用式1化合物進(jìn)行治療。與未結(jié)合的葉酸類藥物或抗葉酸劑相比較，本發(fā)明的化合物預(yù)計(jì)將是更有效的，并且是更具有選擇性的。本發(fā)明化合物所增加的效果據(jù)信是由于這些化合物具有促進(jìn)谷氨酰鏈延長(zhǎng)的作用，從而可致使毒性葉酸和抗葉酸劑在細(xì)胞內(nèi)的聚集。
術(shù)語“抗腫瘤有效的”和術(shù)語“治療腫瘤性疾病”是指控制腫瘤生長(zhǎng)或增殖的效果，或者是指能延長(zhǎng)患者的存活時(shí)間而超過不經(jīng)該治療所能達(dá)到的預(yù)計(jì)存活時(shí)間。通過減慢、中斷、阻止或終止腫瘤的生長(zhǎng)、增殖或轉(zhuǎn)移來控制腫瘤的生長(zhǎng)和增生。因此術(shù)語“治療腫瘤性疾病”不一定表示腫瘤疾病全部消除?？梢哉J(rèn)為，延長(zhǎng)患者的存活時(shí)間超過本來或自身所能夠達(dá)到的顯著有益的效果，也表示控制了該腫瘤疾病。
為了有效地治療患有上述腫瘤性疾病的患者，可在治療腫瘤性疾病的有效劑量下以生物可利用的任一方式服用式1化合物，包括口服和經(jīng)胃腸道外途徑給藥。例如，式1化合物可以口服、局部給藥、皮下注射、肌肉注射、靜脈注射、經(jīng)皮膚給藥、鼻內(nèi)給藥、直腸給藥等。通常優(yōu)先選用口服給藥。根據(jù)所選用的化合物的具體特性、需治療的疾病、疾病的嚴(yán)重程度及其他有關(guān)的情況，本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員可以很容易地選擇合適的給藥形式和方式。
這里所用的術(shù)語“抗腫瘤治療上有效的劑量”是指抗腫瘤作用有效的式1化合物的量。作為本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員，可應(yīng)用已知技術(shù)并觀察在相同情況下所得到的結(jié)果，診斷醫(yī)生可以容易地確定抗腫瘤治療上有效的劑量。在確定抗腫瘤治療上有效的劑量中，主治的診斷醫(yī)生要考慮許多因素，這些因素包括但不限于哺乳動(dòng)物的種類、其大小、年齡、一般健康情況、所患的特定疾病、疾病的嚴(yán)重程度和并發(fā)癥、患者的個(gè)體反應(yīng)性、所服用的具體化合物、給藥方式、所用制劑的生物可利用性、所選用的劑量、伴隨應(yīng)用的藥物以及其他有關(guān)的情況。
式1化合物抗腫瘤治療上有效的劑量可預(yù)計(jì)在每天每公斤體重0.1毫克(mg/kg/天)～每天每公斤體重500毫克的范圍內(nèi)變化。優(yōu)選的劑量可預(yù)計(jì)在1～20mg/kg/天范圍內(nèi)變化。上述范圍尤其與口服的有效劑量有關(guān)，但也與非胃腸道途徑給藥范圍有關(guān)。每天給藥1～4次，通常每次給予之活性化合物的劑量為5mg～100mg。
已將氨甲蝶呤和其他的葉酸類化合物及抗葉酸劑用于治療牛皮癬和以增加表皮細(xì)胞增殖速度為特征的疾病。具有相同作用機(jī)理的式1化合物可望是治療牛皮癬有價(jià)值的新藥劑。抗牛皮癬的劑量與抗腫瘤的劑量是相同的，但式1化合物用于治療牛皮癬時(shí)最好是局部應(yīng)用。
本發(fā)明的化合物可以單獨(dú)使用，也可以與藥用載體或賦形劑一起配成藥用組合物使用，所選用的載體或賦形劑的比例和性質(zhì)可以根據(jù)所選用的化合物的溶解度和化學(xué)性質(zhì)、選擇的給藥途徑以及一般的制醫(yī)經(jīng)驗(yàn)而定。雖然式1化合物本身是有效的，但為了提高其穩(wěn)定性、便于結(jié)晶、增加溶解度等目的，可以將式1化合物以其藥學(xué)上適用的酸加成鹽的形式配制并給藥。
可以將式1化合物配制在組合物中，該組合物包含可檢測(cè)量的式1化合物，并將其與一種或多種惰性載體一起混合。所述組合物例如可用作為檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品，整裝運(yùn)輸?shù)姆奖阈问剑蜃鳛樗幱媒M合物。式1化合物的可檢測(cè)量是指可以由本領(lǐng)域的專業(yè)人員用熟知的一般檢測(cè)方法和技術(shù)容易地測(cè)定出量。式1化合物的可檢測(cè)量通?？梢詾榻M合物重量的0.001%～75%。惰性載體可以是不降解，或不與式1化合物共價(jià)反應(yīng)的任何物質(zhì)。適用的惰性載體其實(shí)例包括水、含水緩沖液，如通常用于高效液相層析(HPLC)分析的含水緩沖液、有機(jī)溶劑如乙腈、乙酸乙酯、己烷等，以及藥學(xué)上適用的載體或賦形劑?？捎帽炯夹g(shù)領(lǐng)域熟知的技術(shù)和方法，將式1化合物與惰性載體混合而制得這些組合物。
更具體地說，可以將式1化合物配制成藥用組合物，該組合物包括抗腫瘤治療上有效劑量的式1化合物，式1化合物與一種或多種藥用載體或賦形劑組成混合物，或式1化合物與一種或多種藥用載體或賦形劑結(jié)合。
可以按藥學(xué)領(lǐng)域已知的方法制備藥用組合物。載體或賦形劑可以是固體、半固體或液體物質(zhì)，它們可以用作為有效成分的運(yùn)載物或介質(zhì)。合適的載體或賦形劑是本技術(shù)領(lǐng)域中已知的。藥用組合物可適于經(jīng)口服或非胃腸道途徑給藥，并且可以以片劑、膠囊劑、栓劑、溶液劑、懸浮劑等形式給患者使用。
式1化合物可以口服給藥，例如可以與惰性稀釋劑或與可食的載體一起服用?？梢詫⑺鼈兎庠诿髂z膠囊中，或者壓制成片劑。為了口服給藥，可以將本發(fā)明的化合物與賦形劑一起混合，并且以片劑、錠劑、膠囊劑、馳劑、懸浮劑、糖漿劑、糯米紙囊劑、口香糖劑等形式應(yīng)用。上述制劑應(yīng)該含有至少4%本發(fā)明化合物(作為活性成分)，但是可以根據(jù)具體的形式有所變化，并且活性成分通?？梢哉冀M合物重量的4～70%。存在于組合物中的本發(fā)明化合物的量應(yīng)達(dá)到合適的劑量。根據(jù)本發(fā)明的組合物和制劑，最好每一口服單位劑量含有5.0～300mg本發(fā)明的化合物。
片劑、小丸劑、膠囊劑、錠劑等還可以含有一種或多種下述的輔助劑粘合劑，如微晶纖維素、西黃蓍膠或明膠;賦形劑，如淀粉或乳糖;崩解劑，如藻酸、Primogel、玉米淀粉等;潤(rùn)滑劑，如硬脂酸鎂或Sterotex;助流劑，如膠體二氧化硅;并且可以加入甜味劑，如蔗糖或糖精，或矯味劑如薄荷，水楊酸甲酯或矯味橙汁。當(dāng)劑量單位形式為膠囊劑時(shí)，除含有以上類型的物質(zhì)之外還可以含有液體載體，如聚乙二醇或脂肪油。其他劑量單位形式可以含有改變?cè)搫┝繂挝恢锢硇问降钠渌鞣N物質(zhì)，例如包衣材料。因此，片劑和小丸劑可以用糖、紫膠或其他腸包衣劑進(jìn)行包衣。糖漿劑除含有本發(fā)明化合物之外還可以含有蔗糖作為甜味劑，以及某些防腐劑、染料、著色劑和調(diào)味劑。用于制備上述各種組合物的物質(zhì)應(yīng)該是藥學(xué)上純的，并且在所用量的范圍內(nèi)應(yīng)是無毒的。
為了經(jīng)非胃腸道途徑給藥，可以將式1化合物加到溶液或懸浮液中。這些制劑應(yīng)該含有至少0.1%的式1化合物，但是其重量可以在0.1～50%之間變化。存在于上述組合物中之本發(fā)明化合物的量應(yīng)能達(dá)到合適的劑量。制備優(yōu)選的根據(jù)本發(fā)明的組合物和制劑，以使經(jīng)胃腸道外途徑給藥的劑量單位含有5.0～100mg本發(fā)明的化合物。
溶液劑或懸浮劑還可以包括一種或多種下述輔助劑無菌稀釋劑，如注射用水，鹽水溶液，固定的油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成的溶劑;抗菌劑，如苯甲醇或羥苯甲酸甲酯;抗氧化劑，如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉;螯合劑，如乙二胺四乙酸;緩沖劑，如乙酸鹽，檸檬酸鹽或磷酸鹽，以及調(diào)節(jié)體液滲透壓的試劑，如氯化鈉或葡萄糖。非胃腸道途徑給藥的制劑可以封裝在安瓿內(nèi)，由玻璃或塑料制成的一次性注射管內(nèi)或多倍劑量小瓶?jī)?nèi)。
具有特定的同類用途的任何一組結(jié)構(gòu)上相關(guān)的化合物中，就其最終應(yīng)用來說最好選用式1化合物的某些基團(tuán)和構(gòu)型。
申請(qǐng)人優(yōu)先選用其中R1和R2各自為-NH2基團(tuán)，X、Y和Z各自為氮原子，并且R3為甲基的式1化合物。申請(qǐng)人還優(yōu)先用其中R1為-NH2基團(tuán)，R2為OH基團(tuán)，R3為氫，X和Z各自為CH基團(tuán)，并且Y為氮原子的式1化合物。
實(shí)例1N-〔4-(〔(2，4-二氨基-6-蝶呤基)甲基〕甲氨基)-苯甲?；?4，4-D-氟代谷氨酸將N-CH3PABA-F2Glu(OBu)2(0.201mmol)和2，4-二氨基蝶啶-6-溴甲基氫溴酸化物(75mg，0.223mmol)在Me2NAc(2.5ml)中的混合物于50～55℃攪拌4小時(shí)，然后在室溫下放置過夜。再在減壓下除去Me2NAc。將該粗制材料置于冰浴中，在攪拌下加入2ml三氟乙酸。10分鐘后，將反應(yīng)混合物加溫至室溫并攪拌4小時(shí)。在減壓下除去三氟乙酸，得到粗產(chǎn)物。該粗產(chǎn)物經(jīng)DEAE-纖維素層析純化，用NH4HCO3進(jìn)行梯度(15～600mM)洗脫。含所需產(chǎn)物的柱流出物經(jīng)冷凍干燥，得到所需的純產(chǎn)物。
實(shí)例24-氨基-4-脫氧-10-甲基蝶酰〔D，L-疊(同)，對(duì)映-4，4-(二氟)谷氨酸〕(1，R1，R2＝NH2;X，Y，Z＝N;R3＝CH3)將2.5mlDMF，23μlEt3N(0.16mmol)和25μl(0.16mmol)磷酰氰酸二乙酯置于裝有干燥管的15ml園底燒瓶中。然后加入二氨基蝶酸酯(1，R1，R2＝NH2;X，Y，Z＝N;R3＝CH3)(0.16mmol)，并在室溫下攪拌反應(yīng)溶液。3小時(shí)后，加入另外的5μl(0.04mmol)磷酰氰酸二乙酯。將F2Glu(0.16mmol)溶于1mlDMF中，加到反應(yīng)燒瓶?jī)?nèi)并在室溫下繼續(xù)攪拌72小時(shí)。真空下除去溶劑DMF，將殘余物溶于35mlCHCl3中，并用1%NH4OH(2×20ml)洗滌以除去未反應(yīng)的起始物質(zhì)。有機(jī)層用20mlH2O洗滌，再經(jīng)Na2SO4干燥并在真空下蒸發(fā)，得到粗制的受保護(hù)基保護(hù)的產(chǎn)物。將該偶聯(lián)產(chǎn)物溶解于純凈的TFA(3ml)中并用TLC監(jiān)測(cè)脫酯反應(yīng)的進(jìn)程。24小時(shí)后，用旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)儀除去溶劑TFA，并在真空下干燥殘余物。
將粗產(chǎn)物溶于20mlH2O中，用稀NH4OH調(diào)節(jié)PH至8。為了獲得足夠低的流速，在裝填DEAE-纖維素(Whatman DE-52)柱(30×1Cm)之前使樣品體積加到160ml。該柱用100ml水洗滌，用175ml 15mM NH4HCO3和175ml 500mM NH4HCO3進(jìn)行線性梯度洗脫，得到所需的式1化合物。
實(shí)例3β，β-二氟谷氨酸雙-L-丁酯3a.2，2-二氟戊-4-烯酰胺將2，2-二氟戊-4-烯酸(27.2g，0.2mol)的己烷(200ml)溶液置于裝有回流冷凝器和氮?dú)膺M(jìn)氣管的三頸燒瓶中，在攪拌下向其中加入DMF(20滴，催化劑)和草酰氯(20ml，0.23mol)。將混合物在室溫下攪拌2小時(shí)，此時(shí)不再看見氣體逸出。溶液在冰/鹽浴中冷卻，氮?dú)膺M(jìn)氣管用空的CaCl2管代替(防止固體物質(zhì)從燒瓶中被氣流沖出)，并向燒瓶中通入NH3氣。在開始的劇烈反應(yīng)減緩后保持氣流30分鐘。然后將混合物倒入H2O(1l)和Et2O(0.5l)中。用H2O和Et2O洗滌玻璃儀器，并將洗滌液加入上述混合物中。加入硅藻土，并濾除不溶物。使水相和有機(jī)相分離。用鹽水將Et2O洗滌1次，經(jīng)Na2So4干燥并濃縮之。水相用CH2Cl2萃取2次。合并的萃取液用鹽水洗滌1次，經(jīng)Na2So4干燥，再與醚相殘余物合并，并濃縮。殘余物經(jīng)蒸餾后得到標(biāo)題酰胺化合物(20.6g，76%)，bp.100～110℃/10乇，為淡黃色油狀物，經(jīng)冷卻后固化，mp.33～35℃。1HNMR(CDCl3)δ7.0～6.0(2H，br.d)，5.75(1H，ddt，J＝18，9，6Hz)，5.3(2H，m)，2.87(2H，dt，J＝6，17Hz)。19F NMR(δC6F6＝0)δ-56.0(t，J＝17Hz)。
元素分析，C5H7F2NO計(jì)算值C，44.45;H，5.22;N，10.37。實(shí)測(cè)值C，42.03;H，4.74;N，9.33。
3b.2，2-二氟戊-4-烯基腈將上述酰胺(3a)(20.6g，0.152mol)的無水吡啶(25ml，0.31mol)溶液置于冰/鹽浴中，在N2氣流下向其中滴加三氟乙酸酐(TFAA，23.5ml，0.166mol)，在1 1/2 小時(shí)內(nèi)滴加完畢。反應(yīng)混合物變成固體，并在室溫下放置4小時(shí)。然后將燒瓶裝成在N2氣流下的蒸餾裝置，并在油浴中加熱(最終為130℃)蒸餾。收集蒸餾液，得到17.7g無色油狀物，該油狀物在空氣中冒煙，bp.70～80℃/760乇。經(jīng)NMR分析表明，蒸餾液的成分為腈∶TFAA∶吡啶＝80∶12∶8。因此腈的產(chǎn)率為0.116mol(76%)。1H NMR(CDCl3)6.0～5.5(1H，m)，5.4(2H，m)，2.93(2H，dt，J＝6，15Hz)。19F NMR(δC6F6＝0)δ-71.7(t，J＝15Hz)。
3c.4，4-二氟辛-1，6-二烯-5-基胺鹽酸鹽向鎂屑(5.47g，0.225mol)中加入1-丙烯基溴(27.22g，0.225mol)的THF(225ml)溶液，控制加入的速度，使混合物保持溫?zé)岬环序v，制得溴化丙烯基鎂。加畢，將混合物攪拌20分鐘，然后用THF(300ml)稀釋并冷卻至-15℃。向該混合物中加入由實(shí)例3b制得的腈(0.116mmol)在THF(80ml)中的溶液，控制加入的速度，使反應(yīng)混合物的溫度在-15＜T＜-10℃的范圍內(nèi)。在該溫度范圍內(nèi)將混合物再攪拌1小時(shí)，然后冷卻至-40℃。將NaBH4(6.4g，0.169mol)在MeOH(650ml)和水(30ml)中的冷卻溶液(-40℃)一次加入。除去冷卻浴并將混合物攪拌2小時(shí)，然后倒入6N HCl(800ml)中。經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，將水溶液用CH2Cl2洗滌2次。然后用顆粒狀NaOH將溶液鹼化至PH10(需要用冰冷卻)，并用NaCl飽和之。加入硅藻土，濾除析出的Mg(OH)2。固體殘余物用CH2Cl2洗滌。濾液用CH2Cl2萃取3次，將萃取液和殘余物洗滌液合并，經(jīng)Na2So4干燥，過濾，用Et2O/HCl酸化，經(jīng)蒸發(fā)得到標(biāo)題胺鹽化合物，其為淡黃色固體(3g)。這一步驟中不需要將該物質(zhì)純化。
3d.N-(叔丁氧基羰基)-4，4-二氟辛-1，6-二烯-5-基胺將上述實(shí)例3c制得的粗制鹽(35g)溶于水(200ml)和二噁烷(200ml)中。加入固體KHCO3，得到對(duì)PH試紙呈中性的混合物，再向混合物中加入KHCO3(12g，0.12mol)和二叔丁基二碳酸酯(34g，0.156mol)?；旌衔镌谑覝叵聰嚢柽^夜，再用NaCl飽和。分離水相和有機(jī)相。水相用己烷萃取(x3)。萃取液和有機(jī)相合并，用水洗滌(x3)。合并的水洗滌液用己烷萃取1次。該萃取液和有機(jī)相合并，然后用鹽水洗滌，經(jīng)Na2So4干燥，濃縮，殘余物經(jīng)快速層析純化(用CH2Cl2/戊烷(1/1)洗脫)，得到標(biāo)題化合物氨基甲酸酯(19g，65%)，Rf0.29，為油狀物，靜置后固化。1H NMR(CDCl3)δ6.0～5.5(2H，m);5.5～4.5(5H，m);2.67(2H，dt，J＝7，16Hz);1.73(3H，dd＊，J＝7，1Hz);1.47(9H，S)。19F NMR(δC6F6＝O)δ-53.2(m)。
3e.β，β-二氟谷氨酸鹽酸鹽向冰冷卻的KMnO4(52.56g，0.33mol)的水(1.2l)溶液中加入由實(shí)例3d制備的氨基甲酸酯(10.95g，0.042mol)的AcOH(160ml)溶液?；旌衔镌谑覝叵聰嚢柽^夜，在該期間析出棕色固體。加入固體焦性亞硫酸鈉使混合物脫色，隨后加入濃HCl，得到PH為2的溶液。該溶液用Et2O萃取(3×500ml)，然后用NaCl飽和，再用Et2O萃取2次。合并的有機(jī)相用鹽水洗滌1次并濃縮。殘余物溶于1N HCl(500ml)中并濃縮。再次將殘余物溶于1N HCl中，將混合物加溫，并加入活性炭。將混合物攪拌10分鐘，過濾并將濾液蒸發(fā)至干。殘余物用熱的異丙醇萃取，得到粗制的氨基酸(2.22g)再用EtOH進(jìn)一步萃取異丙醇不溶的物質(zhì)，沒有得到任何有用的物質(zhì)。19F NMR(D2OδCF3CO2H＝O)δ+23(ddt，J＝280，S，21Hz)，+27(ddt，J＝280，22，9Hz);+28(t);積分比例5∶5∶3。
3f.β，β-二氟谷氨酸雙叔丁酯將由實(shí)例3e制得的粗制酸(2.22g)懸浮于叔乙酸叔丁酯(500ml)中，向混合物中加入HCl4(2.16ml70%的水溶液，25mmol)?；旌衔镌谑覝叵聰嚢?8小時(shí)，然后用H2O萃取(2×200ml)。合併的萃取液用CH2cl洗滌(2×100ml)，再用4N NaoH鹼化至PH10。該溶液用CH2cl2萃取(3×100ml)。合併的萃取液用鹽水洗滌，經(jīng)Na2So4干燥，并濃縮至其體積的 1/3 。該溶液不需作進(jìn)一步處理即可用于下一步驟。蒸發(fā)比較徹底的樣品顯示出如下的核磁共振譜1H NMR(CDcl3)δ4.10(1H，t，J＝14Hz)，3.10(1H，t，J＝15Hz)，3.00(1H，t，J＝15Hz)，1.5(18H，2S);19F NMR(δC6F6＝0)δ-58.7(dt，J＝14，15Hz)。
實(shí)例4β，β-二氟谷氨酸鹽酸鹽向?qū)嵗?之BOC-雙-酯(300mg，0.76mmol)的無水Et2O(10ml)溶液中加入飽和的Et2O/HCl(3ml)?；旌衔镌谑覝叵聰嚢?天(CaCl2管防護(hù))。收集析出的白色固體并用Et2O洗滌。經(jīng)TLC和NMR分析表明酯的裂解不完全。將該物質(zhì)溶于1N HCl(5ml)中，并在室溫下攪拌過夜。反應(yīng)仍不完全。加入幾滴濃HCl并將混合物攪拌3天。真空下除去水，殘余物和ccl4一起經(jīng)共沸蒸餾干燥。加二異丙醚(x2)一起研磨，得到淡綠色粉末，收集并經(jīng)P2O5干燥，得到標(biāo)題氨基酸化合物(175mg，100%)。1H NMR(D2O)分析表明，有溶劑的模糊信號(hào)。19F NMR(δ CF3CO2H＝0)δ+23(ddt，J＝280，5，21Hz)，+27(ddt，J＝280，22，9Hz)。MS(CI，NH3)m/e184(MH+，100%)，140(75%)，120(40%)，102(40%)。Rf(HoAc/H2O/BuOH 1/1/3)0.19。
元素分析，C5H7F2NO4·HCl計(jì)算值C，27.35;H，3.67;N，6.38。實(shí)測(cè)值C，28.13;H，3.58;N，6.52。
權(quán)利要求
1.下式化合物或其藥學(xué)上適用的鹽，
R2為-NH2或-OH，R3為H、(C1～C4)烷基、烯丙基或炔丙基，X、Y和Z各自獨(dú)立地為氮原子或CH基團(tuán)。
2.權(quán)利要求1所述的化合物，其中R1和R2各自為-NH2基團(tuán)，R3為甲基，并且X、Y和Z各自為氮原子。
3.權(quán)利要求1所述的化合物，其中R1為-NH2基團(tuán)，R2為-OH基團(tuán)，R3為H，X和Z各自為CH基團(tuán)，并且Y為氮原子。
4.治療需要治療之腫瘤性疾病患者的方法，該方法包括給患者服用有效量的下式化合物或其藥學(xué)上適用的鹽，
R2為-NH2或-OH，R3為H、(C1～C4)烷基、烯丙基或炔丙基，且X、Y和Z各自獨(dú)立地為氮原子或CH基團(tuán)。
5.權(quán)利要求4所述的方法，其中所述化合物的R1和R2各自為-NH2基團(tuán)，R3為甲基，X、Y和Z各自為氮原子。
6.權(quán)利要求4所述的方法，其中所述化合物的R1為-NH2基團(tuán)，R2為-OH基團(tuán)，R3為H，X和Z各自為CH基團(tuán)，并且Y為氮原子。
全文摘要
本發(fā)明涉及某些葉酸類化合物和抗葉酸劑與二氟谷氨酸的結(jié)合物，該結(jié)合物可用于治療患有某些腫瘤(包括白血病、黑素瘤、癌、肉癌和混合腫瘤)的患者。
文檔編號(hào)C07D239/88GK1057653SQ9110229
公開日1992年1月8日 申請(qǐng)日期1991年4月11日 優(yōu)先權(quán)日1990年4月12日
發(fā)明者菲利蒲·貝, 詹姆斯·K·考華德, 約翰·J·莫古里 申請(qǐng)人:健康研究公司, 默里爾多藥物公司密執(zhí)安大學(xué)董事會(huì)