專利名稱：一種新的嵌合體轉(zhuǎn)化生長因子-β的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種簡稱為TGF-β1/β2的新的嵌合體轉(zhuǎn)化因子-β，編碼TGF-β1/β2的核苷酸順序和表達載體，以及生產(chǎn)TGF-β1/β2的方法。本發(fā)明是通過在用編碼嵌合TGF-β1/β2前體基因所轉(zhuǎn)染的CHO細胞中TGF-β1/β2的產(chǎn)生和分泌為例加以描述的。該嵌合體基因產(chǎn)物具有TGF-β的生物學(xué)活性。
轉(zhuǎn)化生長因子β(TGFβ)是近年發(fā)現(xiàn)的控制細胞分化和增殖的多肽家族的一個成員。該多肽家族中的其他成員包括穆勒氏(Mullerian)抑制物質(zhì)(Cate等，1986，Cell45∶685-698)、抑制素(Mason等，1985，Nature318∶659-663)及由果蠅十五效性基因復(fù)合物(decapentaplegicgenecomplex)之轉(zhuǎn)錄本推測的蛋白質(zhì)(Padgett等，1987，Nature325∶81-84)。
已經(jīng)識別出四種TGF-β，并分別稱為TGF-β1、TGF-β2、TGF-β1.2和TGF-β3。首先描述的TGF-β1是由兩個有相同分子量為13，000道爾頓，且以二硫鍵結(jié)合的亞單位組成的(Assoian等，1983，J.Biol.Chem.258∶7160;Frolik等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80∶3676-3680;Frolik等，1983，1984，J.Biol.Chem.260∶10995-11000)。已經(jīng)由包括胎盤(Frolik等，1983，Nature325∶81-84)、血小板(Childs等，1982，Proc.Natl.Acad.SciUSA79∶5312-5316;Assoian等，1983，J.Biol.Chem.258∶7155-7160)、腎臟(Roberts等，1983，Biochemistry22∶5692-5698)和去礦物質(zhì)骨(Seyedin等，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82∶119-123)中純化了TGF-β1。已分離了編碼人(Derynck等，1985，Nature316∶701-705)、小鼠(Derynck等，1986，J.Biol.Chem.261∶4377-4379)和猿猴(Sharples等，1987，DNA6∶239-244)TGF-β1的cDNA克隆。對這些克隆的DNA順序分析表明，TGF-β1是作一個大的前體多肽合成的，其羧基端被裂解后產(chǎn)生了成熟的TGF-β單體。已發(fā)現(xiàn)上述所有來源的TGF-β1前體蛋白質(zhì)間有著很強的順序同源性。
當(dāng)存在10%血清和表皮生長因子時，TGF-β1可促進正常大鼠腎成纖維細胞的錨地依賴性生長(Robert等，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA78∶5339-5343;Robert等，1982，Nature295∶417-419;Twardzik等，1985，J.Cell.Biochem.28∶289-297);當(dāng)只有10%血清時，它能夠誘導(dǎo)AKR-2B成纖維細胞的集落形成(Tucker等，1983，CancerRes.43∶1518-1586)。也已表明，TGF-β可刺激大鼠胎兒肌肉間質(zhì)細胞分化并繼而產(chǎn)生軟骨特異性大分子(Seyedin等，1986，J.Biol.Chem.261∶5693-5695)。
與其細胞增殖作用相反，已發(fā)現(xiàn)由人血小板中純化的TGF-β1可抑制某些培養(yǎng)之細胞的生長(Tucker等，1984，Science226∶705-707)。也已表明，TGF-β1能抑制幾種人類腫瘤細胞系的生長(Roberts等，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82∶119-123)。TGF-β1的這種抑制/刺激功能，可能與包括細胞類型和細胞生理狀態(tài)在內(nèi)的多種因素有關(guān)(Sporn等，1986，Science233∶532-534)。
TGF-β2與TGF-β1一樣，是一種由兩個靠二硫鍵結(jié)合之同樣的13，000道爾頓亞單位構(gòu)成的分子量為26，000道爾頓的多肽(Cheifetz等，1987，Cell48∶409-415;Ikeda等，1987，Biochemistry26∶2406-2410)，并已經(jīng)從牛脫礦物質(zhì)骨(Seydin等，1987，J.Biol.Chem.262∶1946-1949)、豬血小板(Cheifetz等，1987，48∶409-415)、人前列腺腺癌細胞系，PC-3(Ikeda等，1987，Biochemistry26∶2406-2410)和人成膠質(zhì)瘤細胞系(Wrann等，1987，EMBO6∶1633-1636)中分離了TGF-β2。已分離了編碼人和猿猴TGF-β2的cDNA克隆(Madisen等，1988，DNA7∶1-8;bebb等，1988，DNA7∶493-497)?？捎蓛蓚€較大的前體多肽之一裂解得到成熟的TGF-β2單體，其mRNA則可通過分化接切而產(chǎn)生(Webb等，1988，DNA7∶493-497)。
TGF-β1和TGF-β2在其成熟區(qū)有71%氨基酸順序相同，而在其前體結(jié)構(gòu)中則有41%完全相同。最近已根據(jù)cDNA克隆推斷出TGF-β3的氨基酸順序，其似乎含有與TGF-β1和TGF-β2的成熟單體約有80%同源性的C末端112氨基酸順序(Dijke等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85∶4715-4719)。TGF-β1.2則是含有由二硫鍵結(jié)合之β1和β2亞單位的異二聚體形式(Chifetz等，1987，Cell48∶409-415)。
人、嚙齒動物和猴來源的TGF-β1，在其前體區(qū)的氨基部分呈現(xiàn)了高度的同源性(Derynck等，1985，Nature316∶701-705;Derynck等，1986，J.Biol.Chem.261∶4377-4379;Sharples等，1987，DNA6∶239-244)，此提文其重要生物學(xué)功能可能與分子的這個部分有關(guān)聯(lián)。最近的研究表明，TGF-β1前體的這個部分是已糖基化和磷酸化了的，因為有一個可能的假定支持這一論點即如果不是針對某一特定功能，細胞將不會為完成這些次要的修飾作用而付出代價(Brunner等，1988，Mol.Cell.Biol.8∶2229-2232)。這些修飾作用對于前體的二聚化或使其進入細胞外可能是很重要的。這一點顯然提示前體的糖基化作用參予了TGF-β1向細胞外的運輸(Purchio等，1988，J.Biol.Chem.263∶14211-14215)。
已有報導(dǎo)指出，可能存在在參予表達猴TGF-β1基因的CHO細胞內(nèi)加工及表達人工產(chǎn)品的中間前體復(fù)合物(Gentry等，1988，Mol.Cell.Biol.8∶4162-4168，待出版;Gentry等，1987，Mol.Cell.Biol.17∶3118-3427)。這些研究揭示，由轉(zhuǎn)染的CHO細胞合成的TGF-β1前體包含了由二硫鍵結(jié)合的前TGF-β1、成熟TGF-β1以及前體的前區(qū)。也已在分離的潛在形式TGF-β1中觀察到這種二硫鍵結(jié)合的前體復(fù)合物(Miyazano等，1988，J.Cell.Biochem.Suppl.12(A)∶200;Wakefield等，1987，J.Biol.Chem.Suppl.11(A)∶46)。
Gentry等人(1988，Mol.Cell.Biol.8∶4162-4168)提出了在轉(zhuǎn)染的CHO細胞中加工早期前TGF-β1下述方案(所引用的氨基酸位置編號參照了已公開的猴TGF-β1(Sharples等，1987，DNA6∶239-244)的順序編號)。按照這一方案，第一步涉及在Gly-29/Leu-30肽鍵上進行信號肽裂解。該裂解過程很可能是當(dāng)前體通過粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜運輸時同步發(fā)生的(BlobelandDobberstein，1975，J.Cell.Biol.67∶835-851;Walter等，1984，Cell38∶5-8)。隨著信號肽的裂解，核心糖基化單元(Robert等，1978，Cell15∶1447-1454)在位于Asn-82、Asn-136和Asn-176處的三個預(yù)定的N-糖基化位點被加到前TGF-β1上。然后在通過高爾基體運輸時使核心糖基化的前TGF-β1相續(xù)被加工，以產(chǎn)生含有復(fù)合的、唾液酸化之寡糖的磷酸化糖蛋白。在合成或運輸?shù)哪承╇A段，可發(fā)生二元殘基上的蛋白水解及二硫化物異構(gòu)化途徑，從而釋放出成熟的TGF-β1。
在最近的另一研究中，已在TGF-β1前體中鑒定了6-磷酸甘露糖的存在。6-磷酸甘露糖是一種磷酸化的糖類似物，其可能在溶酶體酶的細胞間交換及針對性運輸中起到重要作用(vonFigura，1986，Ann.Rev.Biochem.55∶167-193)。已鑒定了能識別溶酶體酶之6-磷酸甘露糖殘基的特異受體，并證明其為運輸系統(tǒng)的基本成分。已在含有這些組織培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基中鑒定了已分泌的、含有6-磷酸甘露糖的溶酶體蛋白(GalandGottesmar，1986，J.Biol.Chem.261∶1760-1765;Capony等，1981，J.CellBiol.104∶253-262;Baumbach等，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85∶2985-2989;SahagianandGottesmar，1982，J.Biol.Chem.257∶11145-11150)。可能TGF-β1前體的6-磷酸甘露糖殘基指引前TGF-β1進入溶酶體，進行蛋白水解性加工，以產(chǎn)生成熟的TGF-β1。另外，也可能是6-磷酸甘露糖殘基使裂解的TGF-β1前體進入溶酶體，以便進一步降解。
本發(fā)明涉及由真核細胞大量生產(chǎn)稱為TGF-β1/β2的新的嵌合TGF-β的方法，所說的真核細胞是用含有處于表達調(diào)節(jié)元件控制下之TGF-β1/β2前體編碼順序的重組DNA載體轉(zhuǎn)化的。已修飾了猴TGF-βcDNA(Sharples等，1987，DNA6∶239-244)。使其中編碼成熟的TGF-β1順序之氨基酸殘基9-13、17、19、25和26的核苷酸改變?yōu)榫幋a成熟TGF-β2結(jié)構(gòu)之相應(yīng)氨基酸的核苷酸(保留了猴密碼子的序號)。
構(gòu)建了含有處于猿猴病毒40(SV40)表達調(diào)節(jié)元件控制下之嵌合TGF-β1/β2前體編碼順序的表達載體，并用以轉(zhuǎn)染中國倉鼠卵(CHO)細胞。得到了能高水平合成并分泌成熟TGF-β1/β2的CHO轉(zhuǎn)染體。用氨甲喋呤放大TGF-β1/β2表達，經(jīng)擴增的轉(zhuǎn)染體可分泌多達1mg/L的成熟TGF-β1/β2。對CHO轉(zhuǎn)染體之條件培養(yǎng)基進行酸化處理，可產(chǎn)生最大水平的生物活性TGF-β1/β2?？梢哉J為，轉(zhuǎn)染的CHO細胞高水平分泌成熟的TGF-β1/β2是對嵌合前體蛋白之蛋白水解加工的不尋常效率而導(dǎo)致的。這種提高的加工效率本身又是因申請人在成熟TGF-β結(jié)構(gòu)的氨基末端區(qū)中結(jié)合了TGF-β1和TGF-β2氨基酸順序，進而影響其結(jié)構(gòu)特性而造成的。


圖1顯示由表達質(zhì)粒p5β/dhfr編碼的TGF-β1/β2嵌合蛋白質(zhì)的核苷酸編碼順序及由之推斷的氨基酸順序。
圖2顯示5β41，2.5細胞之條件培養(yǎng)基的生物學(xué)活性。該生物學(xué)活性是用對CCL-64水貂肺上皮細胞的生長抑制檢測法檢測的。(A)5β41，2.5細胞的無血清條件培養(yǎng)基對0.2M醋酸透析24小時，并用下文所述方法進行分析;(B)TGF-β1的標(biāo)準(zhǔn)生長抑制曲線。
圖3顯示對5β41，2.5細胞分泌之蛋白質(zhì)的免疫印跡分析。使5β41，2.5細胞生長匯合;將培養(yǎng)基對0.2M醋酸透析并使用抗TGF-β1369-381抗血清于非還原(泳道1)或還原(泳道2)條件下按下文所述方法進行免疫印跡分析。
本發(fā)明涉及TGF-β1/β2、編碼TGF-β1和TGF-β1/β2前體的核苷酸順序、以及生產(chǎn)TGF-β1/β2的重組DMA方法。新的嵌合轉(zhuǎn)化生長因子-β即TGF-β1/β2，在用于檢測TGF-β1生物學(xué)活性的標(biāo)準(zhǔn)試驗中呈現(xiàn)生物學(xué)活性，并對TGF-β1特異性抗體有免疫反應(yīng)活性。作為結(jié)構(gòu)上結(jié)合有TGF-β1和TGF-β2氨基酸順序的嵌合體，本發(fā)明的TGF-β1/β2可能攜帶新的生物學(xué)活性，其中有的可能相似或幾乎相同于由其親代分子所表現(xiàn)的活性，有的則可能是TGF-β1/β2所特有的。就相似或幾乎相同于TGF-β1和TGF-β2的這些生物活性來說，這種新的因子為誘導(dǎo)相應(yīng)的生物學(xué)反應(yīng)提供更為有效的誘導(dǎo)物，因而可在各種能預(yù)見的醫(yī)藥學(xué)應(yīng)用中替代TGF-β1和TGF-β2。其應(yīng)用包括但不僅限于誘導(dǎo)或加速細胞增殖與分化，以及抑制細胞分裂。因此，TGF-β1/β2可用于治療腫瘤和促進傷口愈合。
為了便于描述，可將本發(fā)明的方法分為下列幾個步驟(a)產(chǎn)生TGF-β1/β2前體的編碼順序，(b)構(gòu)建用于指導(dǎo)TGF-β1/β2編碼順序之表達的表達載體;(c)轉(zhuǎn)染能夠復(fù)制、表達基因并加工基因產(chǎn)物以產(chǎn)生成熟TGF-β1/β2和/或TGF-β1/β2前體的適當(dāng)宿主細胞;以及(d)鑒定并純化TGF-β1/β2前體和成熟的有生物學(xué)活性的TGF-β1/β2。
一旦鑒定了高水平表達TGF-β1/β2前體和/或成熟TGF-β1/β2的轉(zhuǎn)染體，下一步即可擴增該克隆并分離被表達的基因產(chǎn)物。
本文借助實施例進一步驗證本發(fā)明的方法，其中猴TGF-β1前體cDNA(Sharples等，1987，DNA6∶239-244)已被修飾，使編碼成熟猴TGF-β1順序之氨基酸殘基9-13、17、19、25和26的核苷酸改變?yōu)榫幋a成熟TGF-β2結(jié)構(gòu)中相應(yīng)氨基酸的核苷酸，其中保留了猴密碼子的慣用符號。然后即可用所得嵌合TGF-β1/β2前體編碼順序構(gòu)建能夠指導(dǎo)成熟TGF-β1/β2產(chǎn)物合成的表達載體。
下列實施例旨在進一步詳細描述本發(fā)明方法的各個方面。
圖1中顯示了嵌合TGF-β1/β2的核苷酸編碼順序。在本發(fā)明方法的實施中，可用該核苷酸順序或其功能等同物產(chǎn)生能指導(dǎo)TGF-β1/β2產(chǎn)物表達的重組分子。由于核苷酸編碼順序的簡併性，也可用圖1中所示的其他DNA順序?qū)崿F(xiàn)本發(fā)明。圖1之核苷酸順序的這類改變包括不同核苷酸殘基的缺失、加入或取代，從而產(chǎn)生編碼相同或功能上等同之基因產(chǎn)物的順序。所得基因產(chǎn)物可包括順序內(nèi)氨基酸殘基的缺失、加入或取代，從而能產(chǎn)生生物學(xué)活性產(chǎn)物的沉默改變。這樣的氨基酸取代可基于有關(guān)殘基之極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性和/或兩親性性質(zhì)的相類而達到。例如，帶負電荷氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸;帶正電荷氨基酸包括賴氨酸和精氨酸;具有不帶電荷極性頭部基團或有相似親水值之非極性頭部基團的氨基酸包括亮氨酸、異容氨酸、纈氨酸;甘氨酸、丙氨酸;天冬酰胺、谷氨酰胺;絲氨酸、蘇氨酸;苯丙氨酸，酪氨酸。
可由猴細胞來源得到編碼猴TGF-β1的核苷酸順序(Sharples等，1989，DNA6∶239-244)，并可按已知方法制備如圖1所示嵌合TGF-β1/β2的核苷酸順序，其中包括但不僅限于使用DNA限制酶、合成的寡核苷酸以及DNA連接酶。另外，可以使用本領(lǐng)域已知的方法全部或部分合成如圖1所示的編碼順序。
在本發(fā)明的一個特定實施例中，可由得自非洲綠猴細胞系BSC-40(Sharples等，1987，上述文獻)的全長cDNA克隆得到猴TGF-β1的編碼順序。然后使用基因構(gòu)建技術(shù)，用成熟TGF-β2分子(Madisen等，1988，DNA7∶1-8)之氨基酸殘基9、10、11、12、13、17、19、25和26的編碼順序取代成熟TGF-β1分子之氨基酸殘基9、10、11、12、13、17、19、25和26的編碼順序，由猴TGF-β2cDNA衍生出圖1所示的嵌合TGF-β1/β2的編碼順序。
為了表達有生物學(xué)活性的成熟TGF-β1/β2，應(yīng)選擇即可高水平轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯，又可正確加工基因產(chǎn)物的表達載體/宿主系統(tǒng)。當(dāng)在表達構(gòu)建物中使用嵌合TGF-β1/β2前體的完整編碼順序時，這一點特別重要，因為據(jù)信同TGF-β1和TGF-β2一樣，成熟嵌合TGF-β1/β2也是通過細胞加工過程由前體分子或分子的復(fù)合物衍生的。另外，可望有一個能夠為產(chǎn)物的分泌提供條件的表達/宿主細胞系統(tǒng)。
具體地說，成熟TGF-β1/β2是通過細胞內(nèi)加工過程形成的每單位有112個氨基酸之二硫鍵合的同聚物，據(jù)信各亞單位均相似于形成TGF-β1和TGF-β2的亞單位。TGF-β1/β2前體在其前區(qū)內(nèi)有三個潛在的N-糖基化位點(Sharples等，1987，DNA6∶239-244)。涉及TGF-β1的研究已經(jīng)認定，TGF-β1之前區(qū)中的N-糖基化和磷酸化作用發(fā)生在被轉(zhuǎn)染的CHO細胞內(nèi)，其在成熟分子的細胞合成及釋放或分泌中，對前體起著重要的功能性作用(Brunner等，1988，Mol.Cell.Biol.8∶2229-2232)。TGF-β1前體中6-磷酸甘露糖的存在也支持這樣的推測，即前體分子具有獨立的功能活性(Purchio等，1988，J.Biol.Chem.263∶14211-14215)。因為嵌合TGF-β1/β2前體含有猴TGF-β1前區(qū)，故申請人相信TGF-β1/β2前體是有功能活性的，并且對于正確加工成熟的TGF-β1/β2分子是很重要的。因此，用于表達系統(tǒng)中的宿主細胞正確表達和加工嵌合TGF-β1/β2的能力，對于成熟的，生物學(xué)活性產(chǎn)物的產(chǎn)生是很重要的。
本發(fā)明的一個具體實例中，在中國倉鼠卵(CHO)宿主細胞系統(tǒng)中使用猿猴病毒40(SV40)表達控制元件已成功地產(chǎn)生了成熟的生物活性TGF-β1/β2。但也可以使用多種其他動物宿主/表達載體系統(tǒng)(即含有適于在適當(dāng)宿主細胞中復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯TGF-β1/β2編碼順序之必要元件的載體)。它們包括但不僅限于病毒表達載體/哺乳動物宿主細胞系統(tǒng)(如細胞巨化病毒、牛痘病毒、腺病毒等);昆蟲病毒表達載體/昆蟲細胞系統(tǒng)(如桿狀病毒);或得自哺乳動物細胞基因組的非病毒啟動子表達系統(tǒng)(如小鼠金屬硫因啟動子)。
這些載體的表達元件在其強度和特異性上有所差異。根據(jù)所使用的宿主/載體系統(tǒng)，可使用任何一個適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯元件。例如，當(dāng)在哺乳動物細胞系統(tǒng)內(nèi)克隆時，可使用由哺乳動物細胞基因組中分離的啟動子(如小鼠金屬硫因啟動子)，或由生長于這些細胞內(nèi)的病毒中分離的啟動子(如牛痘病毒7.5K啟動子)。也可以使用以重組DNA或合成技術(shù)產(chǎn)生的啟動子，以確保被插入順序的轉(zhuǎn)錄。
為了充分轉(zhuǎn)譯被插入的蛋白質(zhì)編碼順序，還需要有特異的起始信號。這些信號包括ATG起始密碼子及相鄰順序。例如，當(dāng)只有TGF-β1/β2編碼順序的一部分被插入時，就必須提供包括ATG起始密碼子的外源轉(zhuǎn)譯控制信號。此外，起始信號必須與TGF-β2編碼順序的讀碼同時協(xié)調(diào)存在，以確保整個插入段的轉(zhuǎn)譯。這些外源轉(zhuǎn)譯控制信號和起始密碼子可以是有不同來源的，且可以是天然的或合成的?？赏ㄟ^加入轉(zhuǎn)錄衰減順序、增強子元件等來提高表達的效率。
可使用以前介紹的任何將DNA片段插入載體內(nèi)的方法來構(gòu)建包含TGF-β1/β2基因及適當(dāng)轉(zhuǎn)錄/轉(zhuǎn)譯控制信號的表達載體。這些方法可包括體外DNA重組技術(shù)、合成技術(shù)及體內(nèi)重組(遺傳重組)方法。
當(dāng)使用腺病毒作表達載體時，可將TGF-β1/β2編碼順序連接到腺病毒轉(zhuǎn)錄/轉(zhuǎn)譯控制復(fù)合體如晚期啟動子和三聯(lián)體先導(dǎo)順序上。然后用體外或體內(nèi)重組法將該嵌合基因插入腺病毒基因組內(nèi)。在病毒基因組的非必需區(qū)域(如E1或E3區(qū)域)將會產(chǎn)生存活的，能在被感染的宿主內(nèi)表達嵌合TGF-β1/β2的重組病毒。同樣地，可使用牛痘病毒7.5K啟動子。
可用于表達TGF-β1/β2的另一個表達系統(tǒng)是昆蟲系統(tǒng)。在該系統(tǒng)中，使用了Autographacalifornica核多角體病毒(AcNPV)作為表達外來基因的載體。該病毒生長于Spodopterafrugiperda細胞中。可將TGF-β1/β2編碼順序克隆到病毒的非必需區(qū)域(例如多角體基因)中并置于AcNPV啟動子(例如，多角體啟動子)的控制下。成功地插入TGF-β1/β2編碼順序?qū)?dǎo)致多角體基因的失活及未包裹之重組病毒(即缺乏由多角體基因編碼之蛋白質(zhì)被膜的病毒)的產(chǎn)生。然后用這些重組病毒感染Spodopterafrugiperda細胞，以在其中表達插入的基因。
另外，可選擇能調(diào)節(jié)被插入順序之表達或以特定方式修飾與加工基因產(chǎn)生的宿主細胞株?？稍谀承┱T導(dǎo)劑(如用于誘導(dǎo)金屬硫因啟動子的鋅或鎘離子)存在下提高由某些啟動子開始的表達。因此，基因工程化TGF-β2的表達是可以控制的。如果外來基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物對宿主細胞是致死性的，這一點便尤為重要。再者，蛋白質(zhì)產(chǎn)物的修飾(如糖基化)和加工過程(如對蛋白質(zhì)產(chǎn)物的水解作用)對于蛋白質(zhì)的功能可能是很重要的。就蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)譯后加工和修飾來說，不同的宿主細胞有不同特征和特異性機制?？蛇x擇適當(dāng)?shù)募毎祷蛩拗飨到y(tǒng)以確保正確地修飾并加工被表達的外源蛋白質(zhì)。
在本發(fā)明的一個特定實例中，構(gòu)建了含有處于SV40調(diào)節(jié)順序控制下并與小鼠二氫葉酸還原酶基因(dhfr)串聯(lián)之TGF-β1/β2編碼順序的表達載體，并用于轉(zhuǎn)染dhfr缺陷性CHO細胞。通過在選擇的培養(yǎng)基中增殖，分離出可表達dhfr表型的CHO轉(zhuǎn)染體。為了提高TGF-β1/β2的表達水平，可將轉(zhuǎn)染體暴露于漸增濃度的氨甲喋呤中，以分離出能轉(zhuǎn)錄放大了TGF-β1/β2的mRNA水平的克隆?？捎萌芤弘s交法(Uhler等，1986，Proc.Natl.Acad.SciUSA83∶1300-1304)在放大的不同階段檢測TGF-β1/β2mRNA水平。
至少可用下述四種通用方法鑒定含有TGF-β1/β2編碼順序并表達生物學(xué)活性成熟產(chǎn)物的宿主細胞(a)DNA-DNA雜交;(b)存在或不存在“標(biāo)志”基因功能;(c)檢測TGF-β1/β2mRNA轉(zhuǎn)錄本在宿主細胞內(nèi)的表達，以估計轉(zhuǎn)錄的水平;以及(d)進行免疫分析及最后的生物學(xué)活性檢測以鑒定成熟的基因產(chǎn)物。
在第一種方法中，可使用含有基本上與圖1所示TGF-β1/β2編碼順序或其部分或衍生物同源之核苷酸順序的探針，以DNA-DNA雜交法確定是否存在已插入到表達載體內(nèi)的TGF-β1/β2編碼順序。
在第二種方法中，可基于存在或不存在某些“標(biāo)志”基因功能(如胸苷激酶活性、抗生素抗性、氨甲喋呤抗性、轉(zhuǎn)化表型、桿狀病毒中包涵體的形成等)來鑒定和選擇重組表達載體/宿主系統(tǒng)。例如，如果TGF-β1/β2編碼順序已插入到載體的標(biāo)志基因順序中，即可根據(jù)不存在標(biāo)志基因功能來鑒定含有TGF-β1/β2編碼順序的重組體。另外，也可使標(biāo)志基因與TGF-β1/β2順序串聯(lián)并置于用來控制TGF-β1/β2編碼順序之表達的相同或不同啟動子的控制下。在對誘導(dǎo)或選擇作用的反應(yīng)中表達該標(biāo)志，即可證明TGF-β1/β2編碼順序的表達。
在第三種方法中，可用雜交法估計TGF-β1/β2編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄活性。例如，可分離聚腺苷酸化RNA并使用與TGF-β1/β2編碼順序或其特定部分同源的探針，以Northern印跡法分析之。另外，可提取宿主細胞的總核酸，并與上述探針進行雜交分析。
在第四種方法中，可用免疫學(xué)手段，如Western印跡法、免疫印跡法、放射免疫沉淀法、酶聯(lián)免疫法等來檢測成熟蛋白質(zhì)產(chǎn)物的表達。但有關(guān)表達系統(tǒng)是否成功的最終試驗，應(yīng)包括對生物學(xué)活性TGF-β1/β2基因產(chǎn)物的檢定。當(dāng)宿主細胞能分泌基團產(chǎn)物時，可檢測得自培養(yǎng)之轉(zhuǎn)化體宿主細胞的無細胞培養(yǎng)基中是否有TGF-β1/β2活性。如基因產(chǎn)物未被分泌時，則可檢測溶胞產(chǎn)物中有無TGF-β1/β2活性。在兩種情況下，均可使用如本文所述的生長抑制法及類似方法進行生物學(xué)檢測。
一旦鑒定了產(chǎn)生高水平成熟TGF-β1/β2的克隆，即可擴增該克隆并使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)純化TGF-β1/β2。這類方法包括免疫親和純化法，及包括高效液相層析法在內(nèi)的各種層析法等。
實施例在中國倉鼠卵細胞中表達以生產(chǎn)TGF-β1/β2構(gòu)建編碼TGF-β1前體的重組質(zhì)粒，但其中成熟TGF-β1順序的氨基酸9、10、11、12、13、17、19、25和26被成熟TGF-β2順序的相應(yīng)氨基酸所取代。具體地說，即成熟TGF-β1的氨基酸9(絲氨酸)被精氨酸取代、氨基酸10(絲氨基)被天冬酰胺取代、氨基酸11(蘇氨酸)被纈氨酸取代，氨基酸12(谷氨酸)被谷氨酰胺取代，氨基酸13(賴氨酸)被天冬氨酸取代，氨基酸17(纈氨酸)被亮氨酸取代，氨基酸19(谷氨酰胺)被脯氨酸取代、氨基酸25(天冬酰胺)被賴氨酸取代，氨基酸26(賴氨酸)被天冬酰胺取代。用該構(gòu)建物轉(zhuǎn)染CHO細胞，然后分離可產(chǎn)生并分泌成熟的生物學(xué)活性嵌合TGF-β1/β1的轉(zhuǎn)染體。
材料和方法DNA轉(zhuǎn)染在100mm平皿上接種106個dhfr缺陷性CHO細胞，約24小時后用1μg經(jīng)NdeⅠ切成線性的p5β/dhfr質(zhì)粒(以其磷酸鈣沉淀物)轉(zhuǎn)染培養(yǎng)物，且轉(zhuǎn)染時加入19μg小牛胸腺DNA作為載體(Wigler，M.等，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76∶1373-1376)。簡單地說，即將加有載體DNA的20μg質(zhì)粒加到1 ml 250mM無菌CaCl2中伴隨鼓泡將DNA溶液(1ml)逐滴加到1ml 2×HEPES溶液(280mM NaCl，50mMHEPES，1.5mM磷酸鈉，pH7.1)中，并將混合物在冰上放置30分鐘。然后將沉淀物逐滴散布于含10ml F12′培養(yǎng)基(Gibco)的細胞上。37℃保溫4小時后，除去培養(yǎng)基并換成含25%甘油的F12培養(yǎng)基，繼續(xù)于室溫下保溫90秒鐘。用20ml F12培養(yǎng)基沖洗細胞并在非選擇性F12培養(yǎng)基(20ml)中保溫48小時。將培養(yǎng)基換成添加了10%已透析之FBS(Gibco)及15μg/ml L-脯氨酸的DMEM培養(yǎng)基，以選擇表達dhfr的轉(zhuǎn)染體。在選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)10-14天后觀察細胞集落。
氨甲喋呤抗性細胞的選擇基本上按已述方法(Gasser，C.S.and Schimke，R.T.，1986，J.Biol.Chem.261∶6938-6946)由初級轉(zhuǎn)染體得到二氫葉酸還原酶(dhfr)擴增的細胞。擴充后，將105個細胞接種在100mm平皿上并用漸增濃度的氨甲喋呤(100nM;500nM;2，500nM;10，000nM;20，000nM)馴化之。氨甲喋呤的初始濃度為100nM。用胰蛋白酶消化含可見集落的平皿并馴化至氨甲喋呤濃度至少可再作兩次1∶5細胞傳代。然后將細胞(105)接種在含下一最高濃度氨甲喋呤的100mm平皿上。再次用胰蛋白酶消化含可見集落的平皿并在含氨甲喋呤的培養(yǎng)基中馴化之。在含有40%FBS、10%二甲亞砜和50%DMEM的培養(yǎng)基中，于擴增的不同階段冷凍細胞。冷凍培養(yǎng)基中不包含氨甲喋呤。
生長抑制試驗利用對TGF-β極其敏感的水貂肺上皮細胞Mv 1 Lu(美國典型培養(yǎng)物保藏中心，登記號CCL-64)進行生長抑制試驗。使用胸苷類似物5′-〔125Ⅰ〕-碘代-2′脫氧尿苷(125ⅠdU)進行檢測以估計DNA合成量。將與未處理的CCL-64細胞相比，可抑制50%125ⅠdU摻入所需要的量定為一個活性單位。
為檢測轉(zhuǎn)染的細胞是否分泌活性TGF-β1/β2，由細胞的24小時匯合培養(yǎng)物中收集無血清上清液，并對0.2M醋酸廣泛透析。將樣品稀釋到無菌的完全培養(yǎng)基中以備檢測。
肽合成及抗體的產(chǎn)生在Beckman990型自動合成儀上，用固相技術(shù)合成肽鏈并按已知方法(Gentry等，1983，J.Biol.Chem.258∶11219-11228;GentryL.E.andLawton，A.，1986，Virology152∶421-431)由樹脂上裂解之。用高效液相層析法純化。并經(jīng)氨基酸分析確定肽的組成。
基本上按已述方法(GentryandLawton，1986，上述文獻)使合成的肽通過半胱氨酸殘基偶聯(lián)到牛r球蛋白上。肽結(jié)合的效率為每分子r球蛋白共價連接8至26分子肽。
使用在完全弗氏佐劑中乳化的肽結(jié)合物(相當(dāng)于100μg肽)，于3至6個部位經(jīng)皮下和皮內(nèi)注射免疫新西蘭白兔。然后以2-3周間隔進行加強免疫。加強免疫后7-14天采血。
使用合成肽作免疫原在兔體內(nèi)產(chǎn)生抗TGF-β1分子內(nèi)肽順序的抗肽抗體(Gentry等，1987，Mol.Gell.Biol.7∶3418-3427)。抗體之一(抗TGF-β1369-381)是針對成熟TGF-β生長因子內(nèi)抗原決定基的。另外兩種抗體(抗TGF-β181-84和抗TGF-β1225-236)是前體特異的并且是只針對TGF-β1前體分子內(nèi)肽順序的。
免疫印跡分析在7.5-17.5%梯度SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分級分離蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移到未改性的硝酸纖維素濾膜(0.45μm，SchleicherandSchuell)上，于4℃24伏電壓下保持1小時(Burnette，W.N.，1981，Anal.Biochem112∶195-203)。加入溶于含0.2%NP-40之磷酸緩沖鹽水(PBS)的2.5%BLOTTO(Johnson，D.A.等，1984，Gene.Anal.Techn.1∶3-8)進行保溫，以阻斷硝酸纖維素的過度結(jié)合能力。在2.5%BLOTTO中稀釋兔抗血清(1∶75)并于室溫下與封閉的硝酸纖維素膜保溫2小時。在2.5%TLOTTO中洗滌5次每次5分鐘，洗去硝酸纖維素膜上的過量抗體，然后與在2.5%BLOTTO中1∶500稀釋的堿性磷酸酶結(jié)合的蛋白A一起保溫。保溫2小時后，在含有0.2%NP-40的PBS中將硝酸纖維素膜洗5次(每次5分鐘)，并顯色(Leary等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80∶4045-4049)。
指導(dǎo)TGF-β1/β2合成之質(zhì)粒的構(gòu)建按下述方法構(gòu)建指導(dǎo)嵌合TGF-β1/β2蛋白合成的質(zhì)粒p5β/dhfr。用BamHI和EcoRI消化衍生于pAc373(Miyamoto等，1985，Mol.Cell.Biol5∶2860-2865;Madisen等，1987，Virology158∶248-250)的桿狀病毒載體pAcβTGF-1-該載體包含克隆到pAc611(Miyamoto等，1985，Mol.Cell.Biol.5∶2860-2865;Madison等，1987，Virology158∶248-250)之PstⅠ-EcoRⅠ位點中的TGF-β1(Sharples等，1987，DNA6∶239-244)1.4KbTstⅠ-EcoRⅠ編碼順序，并分離TGF-β1編碼順序的375bp片段(片段1)。用ApaⅠ和EcoRI消化PSV2-βTGF(Gentry等，1987，Mol.Cell.Biol.7∶3418-3427)并分離3.5Kb片段(片段2)。
使用Applied Biosystems寡核苷酸合成儀合成有下示順序的互補寡核苷酸，并使用丙烯酰胺凝膠純化之。用T4激酶使之磷酸化并與等摩爾量經(jīng)激酶處理的寡核苷酸退火。然后將退火的雙股合成DNA連接到上述片段1和2上。用此連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌并分離5βPSV2(Hpa-Eco+)。
用EcoRⅠ消化5βPSV2(Hpa-Eco+)、用Klenow酶充填末端，再用HindⅢ消化并分離含嵌合TGF-β1/β2編碼順序的1.4Kb片段(片段3)。將片段3連接到事先已用HindⅢ和HpaⅠ消化過除去了neo基因的PSV2，neo中，得到5βPSV2。
用EcoRⅠ消化5βPSV2，用Klenow酶充填末端、用NdeⅠ消化，分離2.6KbNdeⅠ-EcoRⅠ(平頭)片段并連接到已用NdeⅠ和PvuⅡ消化過的PSV2/dhfr(Gentry等，1987，Mol.Cell.Biol.7∶3718-3727)中。用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌并分離P5β/dhfr。圖1中顯示了由P5β/dhfr編碼之嵌合TGF-β1/β2分子的核苷酸和由之推斷的氨基酸順序。
TGF-β1/β2在CHO細胞中的表達將P5β/dhfr轉(zhuǎn)染到CHO細胞中，并按上文所述用氨甲喋呤擴增單個克隆。選擇一個如此擴增的克隆CHO-5β41，2.5，用于進一步檢測分析。
使CHO-5β41，2.5細胞在2.5μM氨甲喋呤中生長匯合。將培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)基，24小時后收集之并對0.2M醋酸透析48小時。按上文所述方法，根據(jù)對CCL-64細胞DNA合成的抑制，檢測經(jīng)透析之條件上清液的生物學(xué)活性。CHO-5β45β41，2.5細胞約分泌2mg/L生物學(xué)活性嵌合TGF-β1/β2(圖2)。
按上文所述，使用針對成熟TGF-β1的抗肽抗體，以免疫印跡法分析這些細胞分泌的TGF-β相關(guān)蛋白質(zhì)。圖3顯示當(dāng)于非還原條件下在SDS-PAGE上分析時，CHO-5β41，2.5細胞分泌相當(dāng)于90-100千道爾頓和24千道爾頓的免疫反應(yīng)性蛋白質(zhì)(圖3，泳道1)。24千道爾頓帶代表成熟TGF-β1/β2二聚體，90-100千道爾頓蛋白質(zhì)則可能代表通過二硫鍵與前體順序結(jié)合的成熟TGF-β1/β2(Gentry等，1987，Mol，Cell，Biol.7∶34118-3427)。
于還原條件下(圖3，泳道2)，大部分蛋白質(zhì)在24千道爾頓帶處，其代表了成熟的TGF-β1/β2單體。用相似方法分析由編碼猴TGF-β1基因之質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的CHO細胞表達的重組蛋白質(zhì)，結(jié)果在45至55千道爾頓范圍內(nèi)沒有見到免疫反應(yīng)性材料(Gentry等，1987Mol.Cell.Biol.7∶3418-3427)，此提示嵌合TGF-β1/β2比親代分子TGF-β1更有效地受到蛋白水解性加工處理。另外，CHO-5β41，2.5細胞約比表達TGF-β1的細胞(Gentry等，1987，上述文獻)多分泌2.5倍的生物活性成熟產(chǎn)物。雖然有關(guān)這些觀察結(jié)果的基礎(chǔ)目前尚不清楚，但是嵌合TGF-β1/β2前體的二級結(jié)構(gòu)可能明顯地不同于TGF-β1的二級結(jié)構(gòu)，這種差異即可使得嵌合TGF-β1/β2經(jīng)受到不同強度或性質(zhì)的分子加工過程。例如，TGF-β1/β2前體對于參予TGF-β加工的因子來說可能是更為有利的底物。另外，TGF-β1/β2的二級結(jié)構(gòu)特征可使之得以與其他不易影響TGF-β1的加工因子或途徑相互作用。
下列微生物轉(zhuǎn)染株已寄存在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollectionRockville，MD)(轉(zhuǎn)染體)/(CHO-5β41，2.5CL5) (質(zhì)粒)/(p5β/dhfr) (登記號)/()本發(fā)明不僅限于已保藏的細胞系及本文所公開的實施方案這些不過是作為舉例來說明本發(fā)明的一個方面，它的功能上的等同物也應(yīng)包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。事實上，除本文所描述者1外，根據(jù)本說明書所作的各種改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，均應(yīng)是顯而易見的。這些改動也將落入本發(fā)明待批權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
還應(yīng)說明的是，本文給出的堿基對和氨基酸數(shù)目及核苷酸和肽的大小都是近似數(shù)值，并且只是為了便于描述而給出的。
權(quán)利要求
1.一種包含基本上如圖1所示之約從氨基酸279至氨基酸390之氨基酸順序的嵌合轉(zhuǎn)化生長因子-β1/β2。
2.含有基本上如圖1所示約從核苷酸殘基836至核苷酸殘基1170之編碼嵌合轉(zhuǎn)化生長因子-β1/β2的核苷酸編碼順序。
3.含有基本上如圖1所示約從核苷酸殘基1至核苷酸殘基1170之編碼嵌合轉(zhuǎn)化生長因子-β1/β2的核苷酸編碼順序。
4.含有基本上如圖1所示約從核苷酸836至核苷酸1170之嵌合轉(zhuǎn)化生長因子-β1/β2編碼順序的細胞。
5.含有基本上如圖1所示約從核苷酸1至核苷酸1170之嵌合轉(zhuǎn)化生長因子-β1/β2編碼順序的細胞。
6.含有基本上如圖1所示約從核苷酸836至核苷酸1170之嵌合轉(zhuǎn)化生長因子-β1/β2編碼順序的細胞，其中編碼順序處于能調(diào)節(jié)基因表達的第二個核苷酸順序的控制之下，從而細胞可產(chǎn)生嵌合轉(zhuǎn)化生長因子-β1/β2。
7.含有基本上如圖1所示約從核苷酸1至核苷酸1170之嵌合轉(zhuǎn)化生長因子編碼順序的細胞，其中編碼順序處于能調(diào)節(jié)基團表達的第二個核苷酸順序的控制之下，從而細胞可產(chǎn)生嵌合轉(zhuǎn)化生長因子-β1/β2。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7的細胞，其包括中國倉鼠卵細胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求6或7的細胞，其中調(diào)節(jié)基因表達的第二個核苷酸順序包括SV40啟動子。
10.根據(jù)權(quán)利要求6或7的細胞，其中第二個順序包括啟動子和可選擇標(biāo)志的編碼順序。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的細胞，其中可選擇標(biāo)志包括二氫葉酸還原酶。
12.包括寄存于美國典型培養(yǎng)物保藏中心登記號為_之CHO-5β41，2.5CL5的細胞系。
13.生產(chǎn)嵌合轉(zhuǎn)化生長因子-β1/β2的方法，其包括(a)培養(yǎng)包含基本上如圖1所示約從核苷酸836至核苷酸1170之嵌合轉(zhuǎn)化生長因子-β1/β2編碼順序的宿主細胞，其中所說的核苷酸編碼順序處于第二個能調(diào)節(jié)基因表達之核苷酸順序的控制下，從而由該宿主細胞產(chǎn)生具有嵌合轉(zhuǎn)化生長因子-β1/β2活性的肽或蛋白質(zhì);(b)由培養(yǎng)物中回收嵌合轉(zhuǎn)化生長因子-β1/β2。
14.制備嵌合轉(zhuǎn)化生長因子-β1/β2的方法，其包括(a)培養(yǎng)含有基本上如圖1所示約從核苷酸1至核苷酸1170之嵌合轉(zhuǎn)化生長因子-β1/β2編碼順序的宿主細胞，其中所說的核苷酸編碼順序處于第二個能調(diào)節(jié)基因表達之核苷酸順序的控制下，從而由該宿主細胞產(chǎn)生具有嵌合轉(zhuǎn)化生長因子-β1/β2活性的肽或蛋白質(zhì);(b)由培養(yǎng)物中回收嵌合轉(zhuǎn)化生長因子-β1/β2。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14的方法，其中宿主細胞包括中國倉鼠卵細胞。
16.根據(jù)權(quán)利要求13或14的方法，其中調(diào)節(jié)基因表達的第二個核苷酸順序包括SV40啟動子。
17.根據(jù)權(quán)利要求13或14的方法，其中第二個核苷酸順序包括啟動子和編碼該宿主缺乏之可選擇標(biāo)志的編碼順序，從而可鑒定含有嵌合轉(zhuǎn)化生長因子-β1/β2編碼順序的宿主細胞。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中可選擇標(biāo)志包括二氫葉酸還原酶。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其進一步包括使宿主細胞與氨甲喋呤接觸，從而可選擇出含有放大水平之二氫葉酸還原酶和嵌合轉(zhuǎn)化生長因子-β1/β2編碼順序的抗性集落。
20.生產(chǎn)嵌合轉(zhuǎn)化生長因子-β1/β2的方法，其包括(a)培養(yǎng)已寄存于美國典型培養(yǎng)物保藏中心且登記號為_的轉(zhuǎn)染株CHO-5β41，2.5CL5;(b)由培養(yǎng)物中回收嵌合轉(zhuǎn)化生長因子-β1/β2。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中轉(zhuǎn)化體是在氨甲喋呤存在下培養(yǎng)的。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種稱為TGF-β1/β2的新的嵌合體轉(zhuǎn)化因子-β，編碼TGF-β1/β2的核苷酸順序和表達載體，以及生產(chǎn)TGF-β1/β2的方法。本發(fā)明是通過構(gòu)建含有編碼嵌合TGF-β1/β2前體基因的表達載體，轉(zhuǎn)染真核細胞—CHO細胞，得能高水平合成并分泌成熟TGF-β1/β2的CHO轉(zhuǎn)染體。該嵌合體基因產(chǎn)物具有TGF-β的生物學(xué)活性。
文檔編號C07K19/00GK1045994SQ8910935
公開日1990年10月10日 申請日期1989年12月15日 優(yōu)先權(quán)日1988年12月15日
發(fā)明者安東尼·F·珀切爾, 琳達·麥迪遜 申請人:安柯金兩合公司