專利名稱：一種以鏈霉菌中制備胰島素前體的方法
已經(jīng)提出過一種制備融合蛋白的方法(西德專利DE3714866A1或歐洲專利EP0，289，936A2)，該方法包括將結(jié)構(gòu)基因的C端偶聯(lián)到自由修飾過的串聯(lián)基因(tendamistat)上以獲得所需蛋白，并于鏈霉菌宿主細(xì)胞中表達(dá)此結(jié)構(gòu)基因，以及從培養(yǎng)液上清中分離所分泌的融合蛋白。這一較早的申請(qǐng)還涉及將編碼另一蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因的C端偶聯(lián)到任意修飾過的串聯(lián)基因上而構(gòu)成的基因結(jié)構(gòu)、含有此種類型基因結(jié)構(gòu)的載體、含有此類載體的鏈霉菌細(xì)胞，以及包括修飾或未修飾過的串聯(lián)基因編碼蛋白的N端部分。這一較早的申請(qǐng)包括一些融合蛋白的實(shí)例，在這些融合蛋白中，串連基因的氨基酸順序通過一種橋式連接部分而和猴胰島素原偶聯(lián)。
作為本發(fā)明對(duì)上述概念的進(jìn)一步發(fā)展，本方法特別適用于制備串聯(lián)基因部分接有一縮短了的胰島素原的融合蛋白，這種胰島素原的C鏈僅含一或二個(gè)賴氨酸殘基。該胰島素原能特異地、直接地、而且經(jīng)濟(jì)地轉(zhuǎn)化成人胰島素。
具體來說，本發(fā)明涉及擴(kuò)增和表達(dá)編碼融合蛋白之基因的優(yōu)越的基因結(jié)構(gòu)。本發(fā)明更具體的實(shí)例將在下文解釋并于專利權(quán)利要求中定義。依據(jù)本發(fā)明使用的基因結(jié)構(gòu)的有利方面是以合成基因?yàn)榛A(chǔ)的。合成基因編碼的是縮短了的胰島素原衍生物。合成法能夠方便地選用適合鏈霉菌的特定密碼子來構(gòu)建該基因，因而使融合蛋白的產(chǎn)量得以增加。
該方法也有利于在合成基因中引進(jìn)一個(gè)終止子序列，從而使合成速度也有所增加。
依據(jù)本發(fā)明提供的方法的一大優(yōu)點(diǎn)是有可能用平板測(cè)定法鑒定融合蛋白。該法已在歐洲專利EPA10，161，629實(shí)施例3和西德專利公開3，536，182號(hào)中介紹過。這不僅將有利于篩選目的克隆，而且能夠很容易地確定與產(chǎn)率有關(guān)的各種參數(shù)，從而有利于提高工作效率。
依據(jù)本發(fā)明得到的融合蛋白顯然具有相當(dāng)于(或最少類似于)成熟胰島素的構(gòu)型，這不僅極大地有利于將它進(jìn)一步加工成胰島素，而且可以在足夠長(zhǎng)的發(fā)酵時(shí)間里獲得滿意的產(chǎn)量;同時(shí)令人驚異的是，沒有發(fā)現(xiàn)分泌到發(fā)酵液中的蛋白酶的明顯作用。
依據(jù)本發(fā)明修飾的胰島素原具有縮短了的C鏈，使用羥胺進(jìn)行化學(xué)切割和/或使用胰蛋白酶，最好是賴氨酸內(nèi)切蛋白酶進(jìn)行酶切割，能夠直接將它加工成人胰島素。最好使用酶切法。賴氨酸內(nèi)切蛋白酶切斷賴氨酸羧基端。依據(jù)本發(fā)明獲得的融合蛋白中，A鏈和B鏈的適當(dāng)排列是指當(dāng)上述酶作用于胰島素原時(shí)，能令人驚異地使其中的二硫橋正確地連結(jié)起來。
在構(gòu)建基因時(shí)，能夠很方便地在串聯(lián)部分和胰島素原分子的起始部分間提供一橋式連接部分。該橋式連接部分使胰島素原衍生物能夠被酶從串聯(lián)部分切割下來。所用的酶是將胰島素原衍生物切割成二條胰島素鏈的同一種酶。
依據(jù)本發(fā)明用賴氨酸內(nèi)切割融合蛋白產(chǎn)生(依據(jù)修改過的C鏈的結(jié)構(gòu)而不同)de-B30胰島素(它能夠經(jīng)轉(zhuǎn)肽作用轉(zhuǎn)化成人胰島素)或B31-Lys-胰島素或B31-Lys-B32-Lys-胰島素。這些衍生物均可在羧肽酶B的作用下轉(zhuǎn)化為人胰島素。
當(dāng)使用較短的串聯(lián)基因來進(jìn)行基因構(gòu)建時(shí)，能獲得特高產(chǎn)量的所需蛋白。依據(jù)本發(fā)明的具體方法具有這種突出的優(yōu)點(diǎn)，即修飾過的胰島素部分占融合蛋白的一半，因而使附加部分相當(dāng)少。融合蛋白的正確折疊并不因串聯(lián)部分縮短而受影響，因而依據(jù)本發(fā)明使用較小的融合蛋白仍然有可能獲得良好的工作效率。這一優(yōu)點(diǎn)并不是因損害了宿主細(xì)胞內(nèi)部的蛋白酶造成的降解速率的增加而獲得的。事實(shí)上，出乎預(yù)料之外，融合蛋白對(duì)這類蛋白酶的穩(wěn)定性反而增加了。
因此，本發(fā)明的基因構(gòu)建具有一系列的優(yōu)越性，其結(jié)果是使胰島素前體能夠很容易與融合蛋白的“附加重物部分”分開。這種直接的工作方式更進(jìn)一步改進(jìn)了人胰島素的產(chǎn)量。
從培養(yǎng)基中分離融合蛋白，將融合蛋白進(jìn)一步加工成胰島素前體，以及隨后轉(zhuǎn)化成人胰島素均可用已知的方法進(jìn)行。因此，融合蛋白能夠順利地應(yīng)用吸附或離子交換層析和/或凝膠過濾法分離。能夠用化學(xué)法或更先進(jìn)的酶學(xué)方法切割胰島素原部分。橋式連接部分的構(gòu)建為普遍了解和描述過的方法(如參見歐洲專利EP-A20，229，998)。
EP-B0，089，007中公開了胰島素前體原或胰島素原的類似物。該類似物前體鏈的C端(或胰島素原的N端)帶有Lys或Arg(這兩個(gè)氨基酸亦優(yōu)選用于依照本發(fā)明進(jìn)行的構(gòu)建)，這些前體的B鏈末端為B29-Lys，而該處的C肽能夠縮短是僅為L(zhǎng)ys或Arg，因而在胰島素原結(jié)構(gòu)中B29-Lys后面僅跟有Lys或Arg，其后再連上A鏈，這是最簡(jiǎn)單的情形。在胰蛋白酶或類似胰蛋白酶的內(nèi)切多肽酶的作用下，以及在合適部位帶有保護(hù)基因的一種天然氨基酸酯的幫助下，這些化合物可作為胰島素的前體被用來制備胰島素。
胰島素前體中B鏈和A鏈經(jīng)橋式連接部分-X-Y-而連接，其中X和Y可以代表相同的或不同的Lys或Arg這兩個(gè)氨基酸。這樣的胰島素前體已在EP-A0，195，691中公開。這些前體在酵母中表達(dá)，然后經(jīng)酶促轉(zhuǎn)化作用轉(zhuǎn)化成人胰島素。
EP-A0，163，529中還公開了帶有縮短了的C鏈的胰島素前體。
EP-B0，132，769和0，132，770中則描述了胰島素衍生物和含有這些衍生物的藥物制劑。
下述實(shí)施例將詳細(xì)闡述本發(fā)明。除特別指出者外，百分?jǐn)?shù)均為重量百分?jǐn)?shù)。
附圖
表示依據(jù)本發(fā)明實(shí)施例1進(jìn)行的基因構(gòu)建。圖中的比例不是按實(shí)際比例給出的。
實(shí)施例1表1中描述的合成基因(1)是按已知的磷酸亞胺法化學(xué)合成的。在選擇密碼子時(shí)，注意選用適合鏈霉菌的堿基C和G。如同較早那份申請(qǐng)中的編碼猴胰島素原的基因(表2所示)一樣，表1所示基因(1)也在5′端加有一段含限制酶EcoRⅠ特定順序的延伸序列。結(jié)構(gòu)基因后面是二個(gè)終止密碼子和一段帶有限制酶SalⅠ識(shí)別位點(diǎn)的接頭序列。在3′端加有限制酶HindⅢ的延伸序列。
用內(nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ切割市場(chǎng)上夠得的質(zhì)粒pUC19，并將表1所示的合成基因(1)連接在其中，結(jié)果得到質(zhì)粒pⅠ1(2)。擴(kuò)增后，用內(nèi)切酶EcoRⅠ和SalⅠ將合成基因切成片段(3)并用于下面描述的構(gòu)建過程。
用SmaⅠ完全消化質(zhì)粒pUC19并與表2中描述之終止順序(4)連接。將含有終止子序列正確指向的質(zhì)粒稱為pT1(5)。用EcoRⅠ打開此質(zhì)粒(5)，并用DNA聚合酶(Klenow片段)將切點(diǎn)補(bǔ)平，重新連接得到質(zhì)粒pT2(6)。用酶SalⅠ和SphⅠ打開該質(zhì)粒，并分離其中的大片段(7)。
用SphⅠ和EcoRⅠ切割質(zhì)粒pKK400(8)(參見較早的申請(qǐng)，圖4，(20))，并將帶有串聯(lián)基因的小片段(9)分離出來。
連接片段(3)、(7)和(9)，結(jié)果得到質(zhì)粒pKK500(10)，其中串聯(lián)序列后面帶有橋式連接部分PheAsnAlaNetAlaThrGlyAsnSerAsnGlyLysTTCAATGCGATGGCCACCGGGATTTCGAACGGCAAGAAG TTA CGC TAC CGG TGGCCC TAAAGC TTG CCG TTCEcoRI此部分編碼12個(gè)氨基酸，其后是編碼按本發(fā)明修飾過的胰島素原的基因。使用SphⅠ和SstⅠ切割來檢測(cè)排列是否正確，切割結(jié)果應(yīng)為從大約3500堿基大小的質(zhì)粒上切下一833堿基的片段。用雙脫氧法進(jìn)行DNA序列分析以證實(shí)序列的正確性。
依據(jù)本發(fā)明，起C肽作用的Lys增添了另一個(gè)Lys，同樣用類似的方法進(jìn)行基因構(gòu)建。為此目的，使Lys的三連密碼子AAG重復(fù)一次。質(zhì)粒pⅠ2以及載體pKK600均按類似方法獲得。
實(shí)施例2類似于先前提出的申請(qǐng)中的載體pGFI，從載體pKK500和pKK600中制得pGF2和pGF3表達(dá)質(zhì)粒。用SphⅠ和SstⅠ雙重消化載體pKK500和pKK600，分別分離823和826堿基對(duì)的插入片段，并將這些DNA片段連接到用同樣兩種酶切開的表達(dá)質(zhì)粒pIJ702中。將此連接混合物轉(zhuǎn)化到變鉛青鏈霉菌(S.Iividans)TK24中，并從顯示有串聯(lián)基因活性(平板試驗(yàn))的硫鏈絲菌肽(thiostrepton)抗性轉(zhuǎn)化株中分離質(zhì)粒DNA。所有的陽(yáng)性克隆均含有來自pKK500和pKK600的插入片段。
用已知方法表達(dá)已編碼的融合蛋白。假如在28℃搖瓶中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化株變鉛青鏈霉菌TK24四天，并從培養(yǎng)液中分離菌絲體，則可按下述方法檢測(cè)在上清液中的融合蛋白將20至200微升15%濃度的三氟醋酸加于10至100微升上述溶液中，離心濃縮沉淀的蛋白質(zhì)，洗滌后用含SDS的樣品緩沖液(U.Laemmli，Nature227(1970)680-685)溶液之。于90℃保溫2分鐘，再于10-17%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離，得到一分子量為15千道爾頓的蛋白質(zhì)，也就是說，其在串聯(lián)基因和胰島素前體組成的融合蛋白的分子量范圍內(nèi)。該融合蛋白既和抗串聯(lián)基因蛋白的抗體反應(yīng)，亦與抗胰島素抗體反應(yīng)。
實(shí)施例3用限制酶EcoRⅠ和SstⅠ消化表達(dá)質(zhì)粒pTF2(DE3714866A1，實(shí)施例4)，并除去編碼猴胰島素原的片段。將大小為5，650堿基對(duì)的片段用于下述連接反應(yīng)。
用同樣的限制酶從質(zhì)粒pKK550(實(shí)施例1)中切割一大小為285堿基對(duì)的DNA片段，該片段含有縮短了的胰島素原基因以及終止子序列。
連接從pTF2中獲得的5，650堿基對(duì)大小的片段和從pKK500中獲得的285堿基對(duì)的片段，得到表達(dá)質(zhì)粒pTF3。
用連接混合液轉(zhuǎn)化變鉛青鏈霉菌TK24的原生質(zhì)體，結(jié)果得到有硫鏈絲菌肽抗性并能分泌可與抗胰島素原抗體反應(yīng)之融合蛋白的克隆。這種融合蛋白含有串聯(lián)基因編碼的前41個(gè)氨基酸、橋式連接部分Pro-Ser-Leu-Asn-Ser-Asn-Gly-Lys以及縮短了的胰島素原。
權(quán)利要求
1.一種制備融合蛋白的方法，該方法包括將編碼胰島素原衍生物的結(jié)構(gòu)基因偶聯(lián)于串聯(lián)基因的C端，其中所述的胰島素原衍生物的B鏈?zhǔn)峭ㄟ^一個(gè)編瑪Lys或Lys-Lys的橋式連接部分與A鏈相連接的，然后在鏈霉菌宿主細(xì)胞中表達(dá)這一結(jié)構(gòu)基因并從上清液中分離分泌的融合蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中串聯(lián)基因是經(jīng)過修飾的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和2的方法，其中串聯(lián)基因是縮短了的。
全文摘要
將一個(gè)編碼縮短了的胰島素原(其中胰島素B鏈僅通過Lys或Lys-Lys與A鏈相連)的基因偶聯(lián)于串聯(lián)基因上，將該基因構(gòu)建物引入一表達(dá)載體中，然后用于轉(zhuǎn)化鏈霉菌宿主細(xì)胞，從而表達(dá)和分泌相應(yīng)的融合蛋白。此融合蛋白能夠容易地經(jīng)切割而成為胰島素前體。
文檔編號(hào)C07K19/00GK1042378SQ89108320
公開日1990年5月23日 申請(qǐng)日期1989年11月3日 優(yōu)先權(quán)日1988年11月3日
發(fā)明者克勞斯-皮特·庫(kù)勒, 京特·約翰內(nèi)斯·里思, 歐根·烏爾曼, 霍爾格·瓦爾麥 申請(qǐng)人:赫徹斯特股份公司