一組hrp5類似物及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體而言涉及一組HRP5類似物及其制備方法。本發(fā)明所涉及的HRP5類似物的氨基酸序列通式如SEQ ID NO:2所示：Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Leu-Xaa11-Lys-Tyr-Leu-Arg-Xaa16-Xaa17-Xaa18。體外活性測定表明，本發(fā)明提供的多肽對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌及真菌均具有顯著的殺菌效果，對臨床上分離的耐藥性革蘭氏陽性菌、耐藥性革蘭氏陰性菌及耐藥性真菌同樣具有顯著的殺菌效果，具有廣譜、高效的特點。
【專利說明】-組HRP5類似物及其制備方法
[0001] 本申請是申請?zhí)枮?01110116643. 9,申請日為2011年5月6日，發(fā)明名稱為"一 組新型的HRP5類似物及其制備方法"的分案申請。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體而言涉及一組新型的具有廣譜抗菌活性的HRP5類似 物及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0003] 自從青霉素發(fā)現(xiàn)以來，抗生素一直是人類治療病原微生物感染的有力武器，但隨 著傳統(tǒng)抗生素的濫用，越來越多的病原菌開始對傳統(tǒng)抗生素產(chǎn)生耐藥性，所以急需尋找一 類全新的抗菌藥物來替代抗生素進行使用。
[0004] 陽離子抗菌肽（cationic antimicrobial peptides)是植物和動物產(chǎn)生的一般由 12-50個氨基酸殘基組成的陽離子型（富含精氨酸及賴氨酸）多肽，能夠保護宿主不受外界 病原微生物感染。陽離子抗菌肽的抗菌譜比傳統(tǒng)抗生素寬，來自昆蟲、豬、蛙以及人的陽離 子抗菌肽不僅對革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌有抗菌作用，而且還具有抗真菌及抗病毒活 性。傳統(tǒng)抗生素通過消除微生物生長或生存必不可少的條件，如使酶變性，來達到殺菌的目 的，但細(xì)菌只要一種基因突變后就可以抵抗此類抗生素的攻擊。而陽離子抗菌肽則通過中 和電荷的方法與細(xì)菌細(xì)胞膜相互作用，以此穿透殺死細(xì)菌，極大地減少了細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性 的可能。但天然的陽離子抗菌肽并非完美無缺，部分抗菌肽對真核生物有一定的毒性，對病 原物高殺滅活性的同時往往伴隨著對真核生物的溶血作用。因此如何提高其活性并最大程 度降低其毒性是目前抗菌肽藥物開發(fā)的難點和希望所在。目前的研究主要將a-螺旋的兩 性抗菌肽作為研究對象，圍繞陽離子氨基酸以及疏水性氨基酸數(shù)量及位置，對抗菌肽進行 結(jié)構(gòu)改造，如殘基替換、截取天然抗菌肽的部分序列以及增加肽鏈的正電荷含量等，取得了 較大進展。
[0005] 富組蛋白（histidine rich protein, HRPs 或 histatins)是一類存在于靈 長類動物腮腺和頜下腺分泌物中富含組氨酸的陽離子多肽?，F(xiàn)已分離出至少12種人 HRPs(HRPl-12)，其中HRPUHRP3及HRP5是主要富組蛋白，占總HRPs的85% -90%，分別由 38,32,24個氨基酸組成。111^1和111^3由不同的基因編碼，111^5是111^3經(jīng)蛋白酶水解的 產(chǎn)物，包含在HRP3的N末端24個殘基中。編碼HRPl，3的基因已被測序且定位于人類第4 號染色體ql3上?，F(xiàn)有研究表明：HRPs具有多種活躍的生物學(xué)功能，其抗微生物作用尤為 重要，如抑制、殺滅變形鏈球菌和白色念珠菌等。
[0006] HRP5含有24個氨基酸殘基，分子量為3037D。其氨基酸序列為Asp-Ser-His-Ala -Lys-Arg-His-His-Gly-Tyr-Lys-Arg-Lys-Phe-His-Glu-Lys-His-His-Ser-His-Arg-Gly-Tyr (SEQ ID NO: 1)。Raj等學(xué)者認(rèn)為HRP5抗白色念珠菌的特性與其氨基酸序列有關(guān)，他們 分別將HRP5及其殘基片段N16 (1-16位氨基酸）、C16 (9-24位氨基酸）、C14 (11-24位氨基 酸）、C12 (13-24位氨基酸）、ClO (15-24位氨基酸）和MlO (7-16位氨基酸）分別與不同濃 度的白色念球菌作用，檢測其抗白色念球菌的能力。試驗結(jié)果表明C16和C14有較強的抑 制白色念珠菌生長的能力，而且HRP5與C16的抗白色念球菌的活性基本一致，而同樣含有 16個氨基酸的N16抗白色念珠菌的活性遠遠低于C16。這一結(jié)果提示HRP5的抗白色念珠 菌的功能區(qū)位于羧基端。為了進一步研究HRP5的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，許多學(xué)者通過殘基替 換得到了一系列的變異體，其中較重要的是dhvarl、dhvar2、dhvar4、dhvar5。它們是HRP5 活性區(qū)（11-24位氨基酸）變異體。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 多肽或其藥用鹽，所述多肽具有如下氨基酸序列：
[0008] Xaal-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Leu-XaaIl-Lys-Tyr-Leu-Ar g-Xaal6-Xaal7-Xaal8(SEQ ID NO:2)
[0009] 其中Xaal為Cys或缺失；
[0010] Xaa2 為 Lys、D_Lys、Arg、D_Arg、HoR 或缺失；
[0011] Xaa3 為 Leu、lie、Nle、Val、Trp、Phe、D_Phe、Thi 或缺失；
[0012] Xaa4 為 Lys、D_Lys、Arg、D_Arg、Aib 或 HoR ;
[0013] Xaa5 為 Lys、D_Lys、Arg、D-Arg 或 HoR ;
[0014] Xaa6 為 Leu、lie、Nle、Val、Trp、Phe、D-Phe 或 Thi ;
[0015] Xaa7 為 Leu、lie、Nle、Val、Trp、Phe、D-Phe 或 Thi ;
[0016] Xaa8 為 Lys、D_Lys、Arg、D-Arg 或 HoR ;
[0017] Xaa9 為 Lys、D_Lys、Arg、D-Arg 或 HoR ;
[0018] Xaall 為 Leu、lie、Nle、Val、Trp、Phe、D-Phe 或 Thi ;
[0019] Xaal6 為 Lys、D_Lys、Arg、D-Arg 或 HoR ;
[0020] Xaal7 為 Leu、lie、Nle、Val、Trp、Phe、D-Phe 或 Thi ;
[0021] Xaal8為Cys或缺失，當(dāng)Xaal與Xaal8同為Cys時，該多肽可以形成環(huán)肽。
[0022] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方案Xaal與Xaal8同為Cys或同時缺失；Xaa2優(yōu)選Arg、 D-Arg 或缺失；Xaa3 優(yōu)選 Phe、D-Phe 或缺失；Xaa4 優(yōu)選 Lys、D_Lys、Arg、Aib 或 HoR ;Xaa5 優(yōu)選 Lys、Arg 或 D-Arg ;Xaa6 優(yōu)選 Leu、Ile 或 Nle ;Xaa7 優(yōu)選 Trp、Phe、D_Phe 或 Thi ;Xaa8 優(yōu)選 Lys、D_Lys 或 Arg ;Xaa9 優(yōu)選 Lys、D_Lys 或 Arg ;Xaall 優(yōu)選 Leu、D_Phe 或 Phe ;Xaal6 優(yōu)選 Lys、D-Lys 或 Arg ;Xaal7 優(yōu)選 Trp、Phe、D-Phe 或 Thi。
[0023] 本發(fā)明所涉及的氨基酸殘基既包括天然氨基酸，也包括非天然氨基酸。本發(fā)明所 涉及的天然氨基酸所對應(yīng)的三字母代碼表如表1所示，本發(fā)明所涉及的非天然氨基酸所對 應(yīng)的三字母代碼表及結(jié)構(gòu)如表2所示。
[0024] 本發(fā)明所涉及的所有氨基酸殘基若不特別限定其構(gòu)型，代表L型氨基酸。
[0025] 本發(fā)明所涉及的多肽，既可以是線性肽，也可以是環(huán)肽。當(dāng)Xaal與XaalS同為Cys 時，可以通過加入氧化劑使得Xaal與Xaal8之間形成二硫鍵，此時該肽由線性肽變成環(huán)肽。
[0026] 本發(fā)明所涉及的多肽為線性肽時，其C末端既可以是羧酸的形式，也可以是酰胺 的形式，優(yōu)選以酰胺的形式存在。
[0027] 表1 :天然氨基酸三字母代碼表
[0028]

【權(quán)利要求】
1. 多肽或其藥用鹽，其氨基酸序列為： Lys-Arg-Leu-Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2, Lys-Arg-Leu-Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-D-Lys-D-Phe-NH2, D-Lys-D-Arg-Leu-Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-D-Lys-D-Phe_NH 2 或 D-Lys-D-Arg-Leu-Phe-D-Lys-D-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-D-Lys-D-Phe-NH 2〇
2. 權(quán)利要求1的多肽，其氨基酸序列為： Lys-Arg-Leu-Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2〇
3. 權(quán)利要求1-2中任一項的多肽的制備方法，其包括以下步驟： (1) 在樹脂上固相合成多肽； (2) 將步驟（1)的產(chǎn)物在三氟乙酸或氫氟酸中進行裂解，加入側(cè)鏈保護基清除劑，并與 5-20倍體積比的冰乙醚混合，沉淀多肽，離心，干燥得到粗肽。
4. 權(quán)利要求3的制備方法，其中步驟（1)是在液相環(huán)境中進行，具體包括：浸泡樹脂一 脫除氨基保護基一洗滌一偶聯(lián)氨基酸一監(jiān)測一洗滌一脫除氨基保護基一順序連接其余氨 基酸一干燥樹脂。
5. 權(quán)利要求4的制備方法，其中所述氨基保護基選自叔丁氧羰基、芐氧羰基或9-芴 基-甲基撰基。
6. 權(quán)利要求4的制備方法，其中所述液相環(huán)境所使用的溶劑選自二甲基甲酰胺或二氯 甲烷。
7. 權(quán)利要求4的制備方法，其中偶聯(lián)氨基酸所使用的偶聯(lián)試劑選自碳二亞胺型試劑與 1-羥基苯并三唑，或者苯并三氮唑鎗鹽型試劑與1-羥基苯并三唑。
8. 權(quán)利要求7的制備方法，其中所述偶聯(lián)試劑選自二異丙基碳二亞胺與1-羥基苯并三 唑，或者2- (1H-苯并三偶氮L-1-基）-1，1，3, 3-四甲基脲四氟硼酸酯與1-羥基苯并三唑。
9. 權(quán)利要求3的制備方法，其進一步包括將粗肽純化的步驟，其中純化方法選自反相 色譜法或離子交換色譜法。
10. 權(quán)利要求1-2中任一項的多肽在制備抗細(xì)菌及抗真菌藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】C07K1/06GK104292324SQ201410524880
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2011年5月6日 優(yōu)先權(quán)日:2011年5月6日
【發(fā)明者】馮軍, 路建光, 張喜全, 徐宏江, 吳勇, 朱裕輝, 楊潔 申請人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院, 正大天晴藥業(yè)集團股份有限公司