冬葵子活性蛋白的制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種中草藥冬葵子活性蛋白的制備方法，以及該蛋白在抗腫瘤藥物中的應用。制備方法：將中藥冬葵子研磨粉碎，加入蛋白提取液PBS溶解液攪拌過夜浸泡，隨后加入預冷的丙酮低溫沉淀蛋白，得到冬葵子粗蛋白。將此冬葵子粗蛋白100℃水煮30min,低溫離心后將上清液過陰離子交換層析柱，收集穿透液，即得到冬葵子活性純蛋白。該蛋白經(jīng)體外抗腫瘤活性檢測，具有良好的抗結腸癌細胞的活性，對結腸癌細胞增殖有明顯的抑制作用，而對正常細胞沒有明顯毒副作用。
【專利說明】冬葵子活性蛋白的制備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及植物蛋白的制備和應用，具體屬于一種中藥冬葵子活性蛋白的制備方法，以及該蛋白在制備抗腫瘤藥物中的應用。
【背景技術】
[0002]冬葵子，又名葵子、葵菜子。系蒙古族習用藥材，為錦葵科植物冬葵的干燥成熟果實。原植物分布于東北、華北、西北、日本、朝鮮、蒙古、蘇聯(lián)，在歐洲與北美洲也有分布。主產(chǎn)于黑龍江、吉林、遼寧、內蒙古、河北、山西、寧夏等地。夏、秋二季果實成熟時采收，除去雜質，陰干。
[0003]冬葵子作為蒙藥“莎日木格-占巴”始載于《認藥白晶鑒》中，后《無誤蒙藥鑒》等歷代文獻均有記載。目前蒙醫(yī)臨床和蒙藥生產(chǎn)企業(yè)使用的“莎日木格-占巴”均為冬葵子。冬葵子具有清熱利尿、消腫之功效，能通脈、利尿、清燥膿、消水腫。主治腎熱、膀胱熱、淋病、尿閉、膀胱結石、口渴、瘡瘍等。 [0004]近年來，冬葵子逐步在臨床中得到較多的應用?，F(xiàn)有技術的文獻檢索發(fā)現(xiàn)，目前國內外關于冬葵子的研究報道仍然較少，更未見關于冬葵子抗腫瘤活性蛋白的報道。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種中藥冬葵子活性蛋白的制備方法，以及該蛋白在抗腫瘤藥物中的應用。
[0006]本發(fā)明提供的一種冬葵子活性蛋白的制備方法，包括如下步驟:
[0007]第一步:取中藥冬葵子，研磨粉碎后，加入預冷的蛋白提取液，4°C下浸泡并攪拌12-16小時，離心后取上清液，即為冬葵子蛋白粗提液；離心后的濾渣可按此法再提取1-2次；
[0008]所述的蛋白提取液為PBS緩沖液，IL緩沖液體系里含8g NaCI,0.2g KC1、
3.63gNa2HP04.12Η20、0.24g KH2PO4, ρΗ7.4 ；
[0009]所述冬葵子和蛋白提取液的料液比(重量體積比)為1:4-6，優(yōu)選1:5 ;
[0010]第二步:在冬葵子蛋白粗提液中加入1.5-2倍體積的_20°C預冷的丙酮，沉淀蛋白
0.5-1小時，4°C離心，收集沉淀，在_20°C下放置30-40min，使丙酮完全揮發(fā)，冷凍干燥，得到冬葵子粗蛋白；
[0011]第三步:將冬葵子粗蛋白用pH7.4的PBS緩沖液冰上溶解，離心后取上清液，將上清液100°C水煮30min，4°C離心后取上清液；
[0012]第四步:將上述上清液過Q陰離子交換層析柱，于紫外檢測儀280nm波長處，收集穿透峰得到冬葵子活性蛋白，于4°C條件下保存。
[0013]采用SDS-PAGE凝膠電泳技術，通過與標準分子量對比，預計冬葵子抗腫瘤活性蛋白的分子量為14kDa。
[0014]經(jīng)體外抗腫瘤活性檢測顯示，該冬葵子蛋白可特異性的抑制結腸癌細胞的增殖。用該蛋白分別處理結腸癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、宮頸癌和正常細胞48小時，其中處理結腸癌和膀胱癌細胞后，平均致死率分別約為33%、24%，而對正常細胞幾乎無毒副作用。該蛋白具有良好的抗腫瘤藥物應用前景。
[0015]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明獲得的冬葵子蛋白經(jīng)體外抗腫瘤活性檢測，具有良好的抗結腸癌細胞的活性，對結腸癌細胞增殖有明顯的抑制作用，而對正常細胞沒有明顯毒副作用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1實施例1制備的冬葵子活性蛋白的SDS-PAGE電泳圖(經(jīng)Q柱純化后所得純蛋白樣品，上樣量為10μ g ;D:目的蛋白；Marker:標準分子量)
[0017]圖2冬葵子粗蛋白對五種癌細胞和兩種正常細胞生長的影響
[0018]圖3冬葵子抗腫瘤活性蛋白對結腸癌細胞生長的影響
【具體實施方式】
[0019]冬葵子活性蛋白的制備
[0020]實施例1:
[0021](I)取50g中藥冬葵子，研磨粉碎后，加入250mL預冷的蛋白提取液(pH7.4的PBS緩沖液，IL 緩沖液中含 8g NaCI,0.2g KC1、3.63g Na2HP04.12Η20、0.24g KH2PO4)。于 4°C冰箱里浸泡并攪拌12-16小時，4°C，11，OOOrpm離心10min后取上清液，即為冬葵子蛋白粗提液。離心后的濾渣再次加入250mL蛋白提取液，同上操作，合并上清液即為冬葵子粗蛋白提取液。
[0022](2)將(I)中獲得的冬葵子蛋白粗提液中緩慢加入500mL的_20°C預冷的丙酮，邊加邊攪拌，將其置于4°C冰箱放置I小時沉淀。4°C，11，OOOrpm離心10min，棄上清，收集沉淀，將沉淀置于_20°C中30min，使丙酮完全揮發(fā)。進一步將沉淀冷凍干燥，獲得120mg的冬葵子粗蛋白。
[0023](3)將⑵中提取的冬葵子粗蛋白用50mL的pH7.4的PBS緩沖液溶解，11，OOOrpm離心10min，取上清。將沉淀再用50mL的PBS緩沖液溶解，離心后取上清。合并上清液。將該上清液于水浴鍋中100°C煮30min，12，OOOrpm離心后取上清液。
[0024](4)將(3)中的上清液進行Q陰離子交換柱層析，用ρΗ7.4的PBS緩沖液洗脫，紫外檢測儀于280nm波長處檢測，收集穿透峰，濃縮后獲得0.98mg/mL冬葵子抗腫瘤活性蛋白2.94mg, SDS-PAGE 電泳圖見圖1。
[0025]實施例2:
[0026](I)取50g中藥冬葵子，研磨粉碎后，加入200mL預冷的蛋白提取液(pH7.4的PBS緩沖液，IL 緩沖液中含 8g NaCI,0.2g KC1、3.63g Na2HP04.12Η20、0.24g KH2PO4)。于 4°C冰箱里浸泡并攪拌12-16小時，4°C，11，OOOrpm離心10min后取上清液，即為冬葵子蛋白粗提液。離心后的濾渣再次加入200mL蛋白提取液，同上操作，合并上清液即為冬葵子粗蛋白提取液。
[0027](2)將(I)中獲得的冬葵子蛋白粗提液中緩慢加入400mL的_20°C預冷的丙酮，邊加邊攪拌，將其置于4°C冰箱放置I小時沉淀。4°C，11，OOOrpm離心10min，棄上清，收集沉淀，將沉淀置于_20°C中30min，使丙酮完全揮發(fā)。進一步將沉淀冷凍干燥，獲得IOOmg的冬葵子粗蛋白。
[0028](3)將⑵中提取的冬葵子粗蛋白用40mL的pH7.4的PBS緩沖液溶解，11，OOOrpm離心10min，取上清。將沉淀再用40mL的PBS緩沖液溶解，離心后取上清。合并上清液。將該上清液于水浴鍋中100°C煮30min，12，OOOrpm離心后取上清液。
[0029](4)將(3)中的上清液進行Q陰離子交換柱層析，用ρΗ7.4的PBS緩沖液洗脫，紫外檢測儀于280nm波長處檢測，收集穿透峰，濃縮后獲得0.78mg/mL冬葵子抗腫瘤活性蛋白
2.34mg0
[0030]實施例3:
[0031](I)取50g中藥冬葵子，研磨粉碎后，加入300mL預冷的蛋白提取液(pH7.4的PBS緩沖液，IL 緩沖液中含 8g NaCI,0.2g KC1、3.63g Na2HP04.12Η20、0.24g KH2PO4)。于 4°C冰箱里浸泡并攪拌12-16小時，4°C，11，OOOrpm離心10min后取上清液，即為冬葵子蛋白粗提液。離心后的濾渣再次加入300mL蛋白提取液，同上操作，合并上清液即為冬葵子粗蛋白提取液。
[0032](2)將(I)中獲得的冬葵子蛋白粗提液中緩慢加入600mL的_20°C預冷的丙酮，邊加邊攪拌，將其置于4°C冰箱放置I小時沉淀。4°C，11，OOOrpm離心10min，棄上清，收集沉淀，將沉淀置于_20°C中30min，使丙酮完全揮發(fā)。進一步將沉淀冷凍干燥，獲得125mg的冬葵子粗蛋白。
[0033](3)將⑵中提取的冬葵子粗蛋白用50mL的pH7.4的PBS緩沖液溶解，11，OOOrpm離心10min，取上清。將沉淀再用50mL的PBS緩沖液溶解，離心后取上清。合并上清液。將該上清液于水浴鍋中100°C煮30min，12，OOOrpm離心后取上清液。
[0034](4)將(3)中的上清液進行Q陰離子交換柱層析，用ρΗ7.4的PBS緩沖液洗脫，紫外檢測儀于280nm波長處檢測，收集穿透峰，濃縮后獲得0.89mg/mL冬葵子抗腫瘤活性蛋白
2.67mg0
[0035]實施例4:冬葵子粗蛋白對七種細胞生長的影響
[0036]將對數(shù)生長期的DLD1、T24、MCF-7、H印G2、HeLa, FHC, HL-7702 細胞，以 8X IO3 個孔傳入96孔培養(yǎng)板。37°C，含5%的C02培養(yǎng)箱孵育24h后，分別加入實施例1的終濃度分別為 0.24μ g/μ L、0.32μ g/μ L、0.60μ g/μ L、0.80 μ g/μ LU.0 μ g/μ L 的冬葵子粗蛋白20 μ L，設六個復孔，并用相同體積的PH7.4的PBS緩沖液作為對照。孵育48h后吸棄孔內液體，PBS洗滌2次后加入新培養(yǎng)基，每孔加入MTT溶液(5mg/mL) 20 μ L，繼續(xù)孵育4h后終止培養(yǎng)。小心吸棄孔內培養(yǎng)上清液，每孔加150 μ L DMSO，振蕩lOmin，使結晶物充分融解。在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上492nm波長處，測定各孔光吸收值。
[0037]本發(fā)明所得的冬葵子抗腫瘤活性粗蛋白，對幾種人源癌細胞進行上述體外抗腫瘤活性檢測。結果表明:當?shù)鞍捉K濃度為1.0yg/μ L時，對DLDl細胞生長的抑制率約為33%，對Τ24細胞生長抑制率約為24%，對MCF-7、H印G2、HeLa細胞無明顯抑制作用，對正常腸細胞FHC、HL-7702肝細胞生長基本無影響(如圖2所示)。
[0038]實施例5:冬葵子抗腫瘤活性純蛋白對DLDl細胞生長的影響
[0039]將對數(shù)生長期的DLDl細胞，以8Χ IO3個孔傳入96孔培養(yǎng)板。37°C，含5%的CO2培養(yǎng)箱孵育24h后，分別加入實施例1的終濃度分別為0.24 μ g/ μ L、0.32 μ g/ μ L、0.60 μ g/μ L、0.80 μ g/ μ L、l.0 μ g/ μ L的冬葵子抗腫瘤活性純蛋白20 μ L。設六個復孔，并用相同體積的PH7.4的PBS緩沖液作為對照。孵育48h后吸棄孔內液體，PBS洗滌2次后加入新培養(yǎng)基，每孔加入MTT溶液(5mg/mL) 20 μ L，繼續(xù)孵育4h后終止培養(yǎng)。小心吸棄孔內培養(yǎng)上清液，每孔加150 μ L DMSO，振蕩lOmin，使結晶物充分融解。在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上492nm波長處，測定各孔光吸收值。
[0040]本發(fā)明所得的冬葵子抗腫瘤活性純蛋白，對人結腸癌DLDl進行上述體外抗腫瘤活性檢測，結果表明 :當?shù)鞍捉K濃度為1.0yg/μ L時，對DLDl細胞生長的抑制率約為33%(如圖3所示)。
【權利要求】
1.一種冬葵子活性蛋白的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: 第一步:取冬葵子，研磨粉碎后，加入預冷的蛋白提取液，4°c下浸泡并攪拌12-16小時，離心后取上清液，即為冬葵子蛋白粗提液；離心后的濾渣可按此法再提取1-2次； 所述的蛋白提取液為PBS緩沖液，IL緩沖液含8g NaCI,0.2g KC1、3.63gNa2HP04.12Η20、0.24g KH2PO4, pH7.4 ； 所述冬葵子和蛋白提取液的料液比為1:4-6 ; 第二步:在冬葵子蛋白粗提液中加入1.5-2倍體積的-20°C預冷的丙酮，沉淀蛋白0.5-1小時，4°C離心，收集沉淀，在_20°C下放置30-40min，使丙酮完全揮發(fā)，冷凍干燥，得到冬葵子粗蛋白； 第三步:將冬葵子粗蛋白用PH7.4的PBS緩沖液冰上溶解，離心后取上清液，將上清液100°C水煮30min，4°C離心后取上清液； 第四步:將上述上清液過Q陰離子 交換層析柱，于紫外檢測儀280nm波長處，收集穿透峰得到冬葵子活性蛋白，于4°C條件下保存。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種冬葵子活性蛋白的制備方法，其特征在于，所述的冬葵子和蛋白提取液的料液比為1:5。
3.根據(jù)權利要求1所述的制備方法制得的冬葵子活性蛋白在制備抗腫瘤藥物中的應用。
【文檔編號】C07K1/18GK103980355SQ201410238318
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月30日 優(yōu)先權日:2014年5月30日
【發(fā)明者】李卓玉, 陳美蘭, 宋莉, 晉曉婷, 李漢卿 申請人:山西大學