一種麥角甾醇人工抗原的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種麥角甾醇人工抗原的制備方法，以麥角甾醇和琥珀酸酐為原料，催化合成麥角甾醇琥珀酸單酯作為半抗原，然后采用活潑酯法將生成的麥角甾醇琥珀酸單酯與載體蛋白偶聯(lián)，制備麥角甾醇人工抗原；合成步驟簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件容易實(shí)現(xiàn)，操作方便，尤其后處理分離方法簡(jiǎn)便，產(chǎn)物的產(chǎn)率和純度都較高；并且偶聯(lián)比在n=4~10之間，該偶聯(lián)比區(qū)間的BSA人工抗原通常具有良好的免疫活性，適合用作抗原免疫制備抗體。
【專利說明】一種麥角留醇人工抗原的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種人工抗原制備方法，具體為高免疫活性的麥角留醇人工抗原制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]麥角甾醇，(3β)_麥角-5，7，22-三烯甘油_3_醇，又稱麥角固醇，為甾類化合物，是真菌細(xì)胞膜的重要組成成分，對(duì)真菌細(xì)胞膜和其他細(xì)胞成分的形成起重要的作用。由于植物不能合成麥角留醇，因此它可以作為真菌的特有成分，其含量的多少直接反映了食品、煙草等農(nóng)產(chǎn)品原料受真菌侵染發(fā)霉的程度，反映了這些原料是否發(fā)生真菌侵染霉變，對(duì)該物質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確的檢測(cè)分析對(duì)及時(shí)發(fā)現(xiàn)真菌侵染霉變，保障食品、煙草等農(nóng)產(chǎn)品原料安全具有非常重要的意義。
[0003]麥角留醇的分析方法包括比色法，氣相色譜法，紫外光譜法及液相色譜法，這些方法分析測(cè)定麥角留醇時(shí)需對(duì)樣品進(jìn)行復(fù)雜的前處理，耗時(shí)較長(zhǎng)，且儀器昂貴，操作復(fù)雜，無法進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)分析；考慮到我國(guó)的國(guó)情，需要發(fā)展麥角留醇的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)技術(shù)，在我國(guó)推廣應(yīng)用能及時(shí)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)農(nóng)產(chǎn)品原料的霉變，保障農(nóng)產(chǎn)品安全。因此必須發(fā)展檢測(cè)成本低，快速，結(jié)果準(zhǔn)確，方法通用性強(qiáng)的酶聯(lián)免疫技術(shù)方法。為了得到特異性強(qiáng)，靈敏度高、價(jià)格低廉的高效抗體，這就需要合成能產(chǎn)生特異性抗體的免疫抗原。但由于麥角留醇自身化學(xué)結(jié)構(gòu)的特殊性，其不含有直接能與蛋白偶聯(lián)的活性基團(tuán)，因此首先需要對(duì)其結(jié)構(gòu)上的活性官能團(tuán)(羥基基團(tuán))進(jìn)行化學(xué)衍生，用琥珀酸酐與醇羥基發(fā)生酯化反應(yīng)生成琥珀酸酐單酯，進(jìn)一步提高留醇的親水能力，獲得含有活性羧基的半抗原修飾物，再通過碳化二亞胺法、活潑酯法或氯甲酸酯法對(duì)羧基進(jìn)行活化后與生物高分子載體蛋白BSA等進(jìn)行的偶聯(lián)，經(jīng)透析純化，冷凍干燥后通過高分辨率質(zhì)譜、以及紫外分光等技術(shù)計(jì)算出半抗原小分子在載體蛋白上的偶聯(lián)數(shù)，獲得具有較高免疫原性的麥角留醇人工抗原。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種麥角留醇人工抗原的制備方法，所制備的高活性抗原可用于免疫產(chǎn)生針對(duì)麥角留醇的特異性抗體，為建立酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法檢測(cè)麥角留醇奠定基礎(chǔ)。
[0005]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0006]一種麥角留醇人工抗原的制備方法，以麥角留醇和琥珀酸酐為原料，催化合成麥角甾醇琥珀酸單酯作為半抗原，然后采用活潑酯法將生成的麥角留醇琥珀酸單酯與載體蛋白偶聯(lián)，制備麥角留醇人工抗原。
[0007]制得的麥角留醇人工抗原可利用基質(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜儀測(cè)定其分子量，將人工抗原與載體蛋白分子質(zhì)量進(jìn)行比較，根據(jù)所得差值和半抗原分子量計(jì)算偶聯(lián)比，從而為免疫產(chǎn)生針對(duì)麥角留醇的特異性抗體、建立酶聯(lián)免疫快速檢測(cè)方法奠定基礎(chǔ)。
[0008]一種麥角留醇人工抗原的制備方法，具體包括以下步驟:[0009](I)將琥珀酸酐溶于溶劑中，加入催化劑，加熱至接近回流時(shí)加入麥角留醇，回流條件下反應(yīng)生成麥角留醇琥珀酸單酯作為半抗原；
[0010](2)分別配制麥角甾醇琥珀酸單酯的N，N_ 二甲基甲酰胺(DMF)溶液、以及N，N_ 二環(huán)己基碳二酰亞胺(DCC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液，然后將兩種溶液攪拌混合反應(yīng)生成麥角留醇琥珀酸單酯的活潑酯反應(yīng)中間體；
[0011](3)反應(yīng)完全后靜置，然后離心分離獲得活潑酯上清液；
[0012](4)取載體蛋白溶于PBS緩沖溶液中，然后緩慢滴加步驟(3)分離得到的上清液，冰水浴攪拌條件下發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，制得麥角留醇人工抗原。
[0013]其中，
[0014]優(yōu)選的，步驟⑴中，所述溶劑選自甲苯、二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺，更優(yōu)選甲苯。
[0015]優(yōu)選的，步驟⑴中，所述催化劑選自吡啶、三正丁胺和三乙胺，更優(yōu)選吡啶。
[0016]優(yōu)選的，步驟(1)中，所述琥珀酸酐、麥角甾醇、溶劑和催化劑的質(zhì)量比例為0.5~1:1 ~3:20 ~50:0.5 ~2。
[0017]優(yōu)選的，步驟(1)中，所述回流反應(yīng)的時(shí)間為10~14小時(shí)。
[0018]優(yōu)選的，步驟 (1)中，反應(yīng)過程中采用薄層色譜(TLC)檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，展開溶劑為乙酸乙酯和正己烷的混合溶液，乙酸乙酯和正己烷質(zhì)量之比為1:2。
[0019]優(yōu)選的，步驟(1)反應(yīng)結(jié)束后，還包括麥角留醇琥珀酸單酯的分離過程:首先，減壓蒸除溶劑，然后將剩余的產(chǎn)物混合物先用無水乙醇洗滌再用溫水洗滌，繼而將得到的固體物質(zhì)真空干燥，即得到麥角留醇琥珀酸單酯。麥角留醇琥珀酸單酯的定性分析，可用液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定其分子量的方法。
[0020]優(yōu)選的，所述無水乙醇洗滌的次數(shù)為3~5次、所述溫水洗滌的次數(shù)為3~5次；所述溫水的溫度為30-40°C;所述真空干燥的溫度為40~50°C，真空干燥的時(shí)間為8_12小時(shí)。
[0021]優(yōu)選的，步驟(2)中，采用超聲溶解的方式制備所述的麥角留醇琥珀酸單酯的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液、以及N，N-二環(huán)己基碳二酰亞胺(DCC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液。
[0022]優(yōu)選的，所述麥角甾醇琥珀酸單酯的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中麥角甾醇琥珀酸單酯與N，N- 二甲基甲酰胺的質(zhì)量之比為0.2~0.6:2~5 ;所述N，N- 二環(huán)己基碳二酰亞胺(DCC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)溶液中N，N- 二環(huán)己基碳二酰亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺和N，N-二甲基甲酰胺的質(zhì)量之比為0.1~0.2:
0.1~0.2:2~5 ;兩種混合溶液按麥角甾醇琥珀酸單酯與N，N- 二環(huán)己基碳二酰亞胺質(zhì)量之比0.2~0.6:0.1~0.2進(jìn)行攪拌混合。
[0023]優(yōu)選的，步驟(2)中，所述攪拌混合反應(yīng)在室溫(25°C )下進(jìn)行；攪拌混合反應(yīng)的時(shí)間為8~10小時(shí)。
[0024]優(yōu)選的，步驟⑵中，攪拌反應(yīng)過程中，采用薄層色譜(TLC)檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，展開溶劑為乙酸乙酯和正己烷的混合溶液，乙酸乙酯和正己烷質(zhì)量之比為1:1。
[0025]優(yōu)選的，步驟(3)中，所述靜置的溫度為0_25°C，更優(yōu)選為4°C;靜置的時(shí)間為8-12小時(shí)，更優(yōu)選為10小時(shí)。[0026]優(yōu)選的，步驟(3)中，離心分離的轉(zhuǎn)速為5000-8000rpm，更優(yōu)選為7000rpm ;離心的時(shí)間為5-20min，更優(yōu)選為lOmin。
[0027]優(yōu)選的，步驟(4)中，所述載體蛋白選用容易產(chǎn)生抗原效應(yīng)的牛血清白蛋白(BSA)。所述載體蛋白也可以是人血清白蛋白(HSA)、兔血清白蛋白(RSA)、卵清白蛋白(OVA)、鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)等。
[0028]優(yōu)選的，步驟(4)中，所述PBS緩沖液的pH = 7.2-7.4，包括以下濃度的組分:NaCl為 137mmol/L，KCl 為 2.7mmol/L, Na2HPO4 為 10mmol/L，KH2PO4 為 2mmol/L，其余為水。
[0029]優(yōu)選的，步驟⑷中，采用超聲溶解的方式將載體蛋白溶解于PBS緩沖液中；載體蛋白、PBS緩沖溶液與活潑酯上清液的質(zhì)量之比為0.2~0.5:3~9:5~8。
[0030]優(yōu)選的，步驟(4)中，所述偶聯(lián)反應(yīng)的時(shí)間為5~9小時(shí)。
[0031]優(yōu)選的，步驟(4)反應(yīng)結(jié)束后，還包括麥角留醇人工抗原的分離過程:(a)取透析袋并進(jìn)行前處理，去除甘油以及有害雜質(zhì)；(b)將步驟(4)偶聯(lián)反應(yīng)制得的麥角留醇人工抗原混合液移入處理后的透析袋中，然后將透析袋置于PBS緩沖液中進(jìn)行第一次攪拌透析處理，之后再置于去離子水中進(jìn)行第二次攪拌透析處理；(c)透析結(jié)束后，將透析袋中的人工抗原溶液冷凍處理，然后冷凍干燥，制得麥角留醇人工抗原白色粉末。
[0032]優(yōu)選的，所述透析袋的前處理過程為:取寬度為10~15cm規(guī)格的透析袋，置于含2wt%的碳酸氫鈉和lmmol/L的EDTA混合水溶液中煮沸IOmin,取出透析袋用蒸懼水沖洗干凈；取lmmol/L EDTA水溶液并用稀NaOH溶液調(diào)pH為8左右，然后將透析袋置于其中再次煮沸l(wèi)Omin，最后用去離子水浸泡洗凈后放在4°C冰箱中備用。
[0033]優(yōu)選的，所述第一次攪拌透析處理的溫度為0_5°C，透析的時(shí)間為24~36小時(shí)；第二次攪拌透析的溫度為0-5°C，透析的時(shí)間為6~8小時(shí)。
[0034]優(yōu)選的，所述第一次攪拌透析處理的溫度為4°C，第二次攪拌透析的溫度為4°C。
[0035]優(yōu)選的，所述冷凍處理的溫度為_40°C，冷凍處理的時(shí)間為12-24小時(shí)。
[0036]優(yōu)選的，所述冷凍干燥的時(shí)間為12-24小時(shí)，更優(yōu)選為24小時(shí)。
[0037]以牛血清白蛋白(BSA)為載體蛋白，步驟⑷所述偶聯(lián)反應(yīng)過程可表示如下:
[0038]
【權(quán)利要求】
1.一種麥角留醇人工抗原的制備方法，以麥角留醇和琥珀酸酐為原料，催化合成麥角甾醇琥珀酸單酯作為半抗原，然后采用活潑酯法將生成的麥角留醇琥珀酸單酯與載體蛋白偶聯(lián)，制備麥角留醇人工抗原。
2.如權(quán)利要求1所述的一種麥角留醇人工抗原的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)將琥珀酸酐溶于溶劑中，加入催化劑，加熱至接近回流時(shí)加入麥角留醇，回流條件下反應(yīng)生成麥角留醇琥珀酸單酯作為半抗原； (2)分別配制麥角甾醇琥珀酸單酯的N，N-二甲基甲 酰胺溶液、以及N，N-二環(huán)己基碳二酰亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺的N，N- 二甲基甲酰胺溶液，然后將兩種溶液攪拌混合反應(yīng)生成麥角留醇琥珀酸單酯的活潑酯反應(yīng)中間體； (3)反應(yīng)完全后靜置，然后離心分離獲得活潑酯上清液； (4)取載體蛋白溶于PBS緩沖溶液中，然后緩慢滴加步驟(3)分離得到的上清液，冰水浴攪拌條件下發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，制得麥角留醇人工抗原。
3.如權(quán)利要求2所述的一種麥角留醇人工抗原的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，所述溶劑選自甲苯、二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺；所述催化劑選自吡啶、三正丁胺和三乙胺。
4.如權(quán)利要求2所述的一種麥角留醇人工抗原的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，所述琥珀酸酐、麥角甾醇、溶劑和催化劑的質(zhì)量比例為0.5~1:1~3:20~50:0.5~2。
5.如權(quán)利要求2所述的一種麥角留醇人工抗原的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，所述回流反應(yīng)的時(shí)間為10~14小時(shí)。
6.如權(quán)利要求2所述的一種麥角留醇人工抗原的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，反應(yīng)過程中采用薄層色譜檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，展開溶劑為乙酸乙酯和正己烷的混合溶液，乙酸乙酯和正己烷質(zhì)量之比為1:2。
7.如權(quán)利要求2所述的一種麥角留醇人工抗原的制備方法，其特征在于，步驟(1)反應(yīng)結(jié)束后，還包括麥角留醇琥珀酸單酯的分離過程:首先，減壓蒸除溶劑，然后將剩余的產(chǎn)物混合物先用無水乙醇洗滌再用溫水洗滌，繼而將得到的固體物質(zhì)真空干燥，即得到麥角甾醇琥珀酸單酯。
8.如權(quán)利要求7所述的一種麥角留醇人工抗原的制備方法，其特征在于，所述無水乙醇洗滌的次數(shù)為3~5次、所述溫水洗滌的次數(shù)為3~5次；所述溫水的溫度為30-40°C ；所述真空干燥的溫度為40~50°C，真空干燥的時(shí)間為8-12小時(shí)。
9.如權(quán)利要求2所述的一種麥角留醇人工抗原的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，采用超聲溶解的方式制備所述的麥角甾醇琥珀酸單酯的N，N-二甲基甲酰胺溶液、以及N，N- 二環(huán)己基碳二酰亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺的N，N- 二甲基甲酰胺溶液。
10.如權(quán)利要求2所述的一種麥角留醇人工抗原的制備方法，其特征在于，所述麥角甾醇琥珀酸單酯的N，N-二甲基甲酰胺溶液中麥角甾醇琥珀酸單酯與N，N-二甲基甲酰胺的質(zhì)量之比為0.2~0.6:2~5 ;所述N，N- 二環(huán)己基碳二酰亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺的N，N- 二甲基甲酰胺溶液中N，N- 二環(huán)己基碳二酰亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺和N，N- 二甲基甲酰胺的質(zhì)量之比為0.1~0.2:0.1~0.2:2~5 ;兩種混合溶液按麥角甾醇琥珀酸單酯與N，N- 二環(huán)己基碳二酰亞胺質(zhì)量之比0.2~0.6:0.1~0.2進(jìn)行攪拌混合。
11.如權(quán)利要求2所述的一種麥角留醇人工抗原的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，所述攪拌混合反應(yīng)在室溫下進(jìn)行；攪拌混合反應(yīng)的時(shí)間為8~10小時(shí)。
12.如權(quán)利要求2所述的一種麥角留醇人工抗原的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，攪拌反應(yīng)過程中，采用薄層色譜檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，展開溶劑為乙酸乙酯和正己烷的混合溶液，乙酸乙酯和正己烷質(zhì)量之比為1:1。
13.如權(quán)利要求2所述的一種麥角留醇人工抗原的制備方法，其特征在于，步驟(3)中，所述靜置的溫度為0-25°C ;靜置的時(shí)間為8-12小時(shí)；離心分離的轉(zhuǎn)速為5000-8000rpm，離心的時(shí)間為5-20min。
14.如權(quán)利要求1或2所述的一種麥角留醇人工抗原的制備方法，其特征在于，所述載體蛋白選自牛血清白蛋白。
15.如權(quán)利要求2所述的一種麥角留醇人工抗原的制備方法，其特征在于，步驟(4)中，所述PBS緩沖液的pH = 7.2-7.4，包括以下濃度的組分=NaCl為137mmol/L，KCl為2.7mmol/L, Na2HPO4 為 10mmol/L，KH2PO4 為 2mmol/L，其余為水。
16.如權(quán)利要求2所述的一種麥角留醇人工抗原的制備方法，其特征在于，步驟(4)中，采用超聲溶解的方式將載體蛋白溶解于PBS緩沖液中。
17.如權(quán)利要求2所述的一種麥角留醇人工抗原的制備方法，其特征在于，步驟(4)中，載體蛋白、PBS緩沖溶液與活潑酯上清液的質(zhì)量之比為0.2~0.5:3~9:5~8。
18.如權(quán)利要求2所述的一種麥角留醇人工抗原的制備方法，其特征在于，步驟(4)中，所述偶聯(lián)反應(yīng)的時(shí)間為5~9小時(shí)。
19.如權(quán)利要求2所述的一種麥角留醇人工抗原的制備方法，其特征在于，步驟(4)反應(yīng)結(jié)束后，還包括麥角留醇人工抗原的分離過程:(a)取透析袋并進(jìn)行前處理，去除甘油以及有害雜質(zhì)；(b)將步驟(4)偶聯(lián)反應(yīng)制得的麥角留醇人工抗原混合液移入處理后的透析袋中，然后將透析袋置于PBS緩沖液中進(jìn)行第一次攪拌透析處理，之后再置于去離子水中進(jìn)行第二次攪拌透析處理；(C)透析結(jié)束后，將透析袋中的人工抗原溶液冷凍處理，然后冷凍干燥，制得麥角留醇人工抗原白色粉末。
20.如權(quán)利要求19所述的一種麥角留醇人工抗原的制備方法，其特征在于，所述透析袋的前處理過程為:取寬度為10~15cm規(guī)格的透析袋,置于含2wt%的碳酸氫鈉和Immol/L的EDTA混合水溶液中煮沸l(wèi)Omin，取出透析袋用蒸餾水沖洗干凈；取ImmoI/LEDTA水溶液并用稀NaOH溶液調(diào)pH為8左右，然后將透析袋置于其中再次煮沸l(wèi)Omin，最后用去離子水浸泡洗凈后放在4°C冰箱中備用。
21.如權(quán)利要求19所述的一種麥角留醇人工抗原的制備方法，其特征在于，所述第一次攪拌透析處理的溫度為0-5°C，透析的時(shí)間為24~36小時(shí)；第二次攪拌透析的溫度為0_5°C，透析的時(shí)間為6~8小時(shí)；所述冷凍處理的溫度為_40°C，冷凍處理的時(shí)間為12-24小時(shí)；所述冷凍干燥的時(shí)間為12-24小時(shí)。
22.如權(quán)利要求1或2所述的一種麥角留醇人工抗原的制備方法制得的的麥角留醇人工抗原。
【文檔編號(hào)】C07K1/107GK103951746SQ201410182342
【公開日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2014年4月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月30日
【發(fā)明者】林華清, 沙云菲, 劉百戰(zhàn) 申請(qǐng)人:上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司