一種蛋白質(zhì)定點(diǎn)修飾的新方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)定點(diǎn)修飾領(lǐng)域，涉及一種新的蛋白質(zhì)定點(diǎn)標(biāo)記新方法，可廣泛適用于蛋白質(zhì)光譜學(xué)研究領(lǐng)域，也適用于生物核磁研究，涉及含砜基（苯砜基，甲砜基）、硝基的順磁標(biāo)簽PyMTA，DPA類似物T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8的合成，這些順磁標(biāo)簽對(duì)巰基具有明顯的活性及反應(yīng)的專一性。在溫和的條件下（室溫，中性，水溶液），首次通過親核取代反應(yīng)將順磁標(biāo)簽與蛋白質(zhì)進(jìn)行連接，連接產(chǎn)率接近100%。PyMTA類似物通過硫醚鍵直接與蛋白質(zhì)連接，增強(qiáng)了標(biāo)簽的剛性，獲得很好的PCS，而且硫醚鍵在還原性和高pH條件下非常穩(wěn)定，并能長(zhǎng)期穩(wěn)定存在。
【專利說明】一種蛋白質(zhì)定點(diǎn)修飾的新方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)化學(xué)修飾領(lǐng)域特別適用于蛋白質(zhì)定點(diǎn)修飾熒光或功能基團(tuán)，涉及一種新的蛋白質(zhì)修飾和順磁標(biāo)記方法。
【背景技術(shù)】
[0002]蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)是其生物功能的基礎(chǔ)，蛋白質(zhì)定點(diǎn)修飾通過引入小分子探針可以更好地了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。高場(chǎng)液相核磁共振技術(shù)(NMR)作為解析具有原子分辨率的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的兩大主要手段之一，在近二十多年得到了迅速的發(fā)展。另一種主要手段是X-射線晶體衍射，到目前為止，X-射線晶體衍射技術(shù)是直觀說明生物大分子空間結(jié)構(gòu)信息的最主要技術(shù)手段，它為分子生物學(xué)的發(fā)展做出了非常杰出的貢獻(xiàn)。但是這一技術(shù)其自身也有一定的局限性:(1)要求樣品必須是晶體，但并不是所有的樣品都容易結(jié)晶，并且晶體狀態(tài)在生理?xiàng)l件下(pH，鹽濃度，溫度等)不易得到；(2)蛋白質(zhì)樣品在溶液中的結(jié)構(gòu)其實(shí)是一個(gè)不斷變化的過程，而一旦結(jié)晶僅僅是蛋白質(zhì)的其中一個(gè)形態(tài)，并不能真實(shí)的反映出蛋白質(zhì)在溶液中的具體形態(tài)；(3)雖然X-射線晶體衍射儀測(cè)出的溫度因子可以反映生物大分子的柔性，但是不能反映出其動(dòng)態(tài)變化的快慢。
[0003]利用核磁共振研究蛋白質(zhì)溶液結(jié)構(gòu)及功能的傳統(tǒng)方法是奧沃豪斯效應(yīng)(NuclearOverhauser Effect, NOE)和二面角等限制性約束條件,但是它們只能提供短程的信息。
[0004]與傳統(tǒng)的核磁共振相比，順磁核磁共振能夠提供長(zhǎng)程的結(jié)構(gòu)限制信息，在解決大分子量蛋白質(zhì)的溶液結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，蛋白質(zhì)-核酸相互作用等方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)。
[0005]物質(zhì)中具有不成對(duì)電子的分子、原子或離子時(shí)，存在電子的自旋角動(dòng)量和軌道角動(dòng)量，也就存在自旋磁矩和軌道磁矩，在外加磁場(chǎng)的作用下，原來取向雜亂的磁矩將定向，從而表現(xiàn)出順磁性。順磁性是一種物質(zhì)的磁性狀態(tài)，與順磁性相反的現(xiàn)象是逆磁性或稱抗磁性。具有順磁性的物質(zhì)在外磁場(chǎng)條件下產(chǎn)生的磁矩與處在同一磁場(chǎng)中的自旋核相互作用，從而使該自旋核的弛豫時(shí)間、化學(xué)位移、譜峰寬度等發(fā)生變化，這種效應(yīng)稱為順磁效應(yīng)。
[0006]用順磁標(biāo)簽位點(diǎn)專一的標(biāo)記蛋白質(zhì)和寡核苷酸可以在生物大分子中產(chǎn)生明顯的順磁效應(yīng)，主要有三種效應(yīng)可以提供長(zhǎng)程的結(jié)構(gòu)信息O； Biomol.NMR, 2010, 46: 101 -112):( I)順磁弛豫增強(qiáng)(paramagnetic relaxation enhancement, PRE)； (2)贋接觸化學(xué)位移(pseudocon tact shifts,PCS); (3)殘余偶極稱合(residual dipolar couplings,RDC)。
[0007]順磁核磁共振作為一種新興的核磁共振技術(shù)，在結(jié)構(gòu)生物學(xué)中起著越來越重要的作用，它提供的長(zhǎng)程的結(jié)構(gòu)限制信息，使研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、多個(gè)結(jié)構(gòu)域間的相對(duì)取向，蛋白質(zhì)溶液結(jié)構(gòu)的細(xì)化等變得更加方便。此外，基于片段的藥物篩選與設(shè)計(jì)在過去10年開始出現(xiàn)并獲得了重要的應(yīng)用，數(shù)十種基于片段的藥物已經(jīng)進(jìn)入臨床測(cè)試期。源于靶標(biāo)蛋白和小分子片段本質(zhì)上的弱相互作用，現(xiàn)代核磁技術(shù)在其中發(fā)揮著無(wú)可替代的作用。近些年來出現(xiàn)的一些核磁新技術(shù)，例如順磁弛豫增強(qiáng)(PRE)、贋接觸化學(xué)位移(PCS)、殘余偶極耦合(RDC)等能夠更為準(zhǔn)確的提供蛋白/片段之間的取向和距離信息，這些新技術(shù)的應(yīng)用有望為基于片段的藥物發(fā)現(xiàn)(FBDD)帶來新的突破(波譜學(xué)雜志.2012，29，163 - 181)。而順磁標(biāo)簽的設(shè)計(jì)則起著舉足輕重的作用，一個(gè)好的順磁標(biāo)簽將非常有利于生物順磁核磁共振的研究。如何把順磁標(biāo)簽弓丨入到蛋白質(zhì)中，一般的方法是合成具有雙功能團(tuán)的小分子化合物，一端用于順磁金屬離子的螯合，另一端與蛋白質(zhì)進(jìn)行連接，標(biāo)簽與蛋白質(zhì)的連接方式有以下幾種:(1)二硫鍵連接；(2)蛋白質(zhì)中的半胱氨酸與烷基鹵或缺電子烯烴的烷基化形成硫醚鍵；(3)點(diǎn)擊化學(xué)；(4)非天然氨基酸的插入。
[0008]圖1為已經(jīng)報(bào)道的以二硫鍵方式連接的順磁標(biāo)簽，化合物1、12 O； Am.Chem.Soc., 2009，131: 14761 - 14767)是巰基吡啶活化的標(biāo)簽；化合物 2、3、4、5、6、10、11 O；Biomol.NMR, 2002，24: 143 - 148; J.Biomol.NMR, 2004，29: 351 - 361; Chem.Eur.J., 2005，11: 3342 - 3348; Org.Lett., 2006，8: 1275 - 1278)是甲基硫代磺酸活化的標(biāo)簽；化合物 7、8 O； Am.Chem.Soc., 2008, 130: 10486 - 10487 -,Chem.Eur.J., 2010，16: 3827 - 3832)需要 Ellman’s 試劑 5，5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)先和蛋白質(zhì)的巰基反應(yīng)形成活化的二硫鍵，然后上述活化二硫鍵與7、8發(fā)生二硫鍵交換反應(yīng)生成新的二硫鍵；化合物9 (泛￡?.Eur.J., 2011, 17: 6830 - 6836)是一個(gè)二聚體，它可以直接與蛋白質(zhì)的半胱氨酸巰基反應(yīng)。二硫鍵連接是對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定點(diǎn)標(biāo)記的一種最常用方式，但是二硫鍵不穩(wěn)定，很容易被還原劑(如DTT，TCEP)破壞，而且在堿性環(huán)境下不穩(wěn)定。
[0009]圖2為已經(jīng)報(bào)道的以硫醚鍵方式連接的順磁標(biāo)簽，化合物13、14、15 (.Chem.Commun., 2012，48: 2704 - 2706; Chem.Eur.J., 2013，19: 1097 - 1103)與蛋白質(zhì)的巰基發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)生成穩(wěn)定的硫醚鍵，它在還原性環(huán)境和堿性條件下均能穩(wěn)定存在。
[0010]Loh等)\XBioconjugate chem.，2013, 24: 260 - 268)通過點(diǎn)擊化學(xué)的方法成功地將DOTA衍生物，即圖3中的16定點(diǎn)標(biāo)記到蛋白質(zhì)上，具體方法是把非天然氨基酸/7-疊氮基-L-苯丙氨酸(AzF)引入到蛋白質(zhì)中，Cu(I)作為催化劑，標(biāo)簽16和AzF發(fā)生環(huán)加成反應(yīng)共價(jià)連接到蛋白質(zhì)上。和常用的二硫鍵linker相比，三唑環(huán)有更好的剛性和化學(xué)穩(wěn)定性，但是這個(gè)反應(yīng)需要在無(wú)氧條件下進(jìn)行，增大了實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜性，而且催化劑Cu(I)會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)樣品沉淀。
[0011]Nguyen 等人(如職#.Chem., 2011, 123: 718 - 720)報(bào)道了一種非天然氨基酸聯(lián)吡啶丙氨酸(BpyAla) 17,他們通過體外無(wú)細(xì)胞表達(dá)技術(shù)(cell-free)把化合物17引入到蛋白質(zhì)中，因?yàn)榛衔?7只能和過渡金屬離子配位，在過渡金屬離子中只有Co2+等少數(shù)金屬離子具有順磁性，能測(cè)得明顯的PCS，所以，測(cè)得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)比較少，一定程度上限制了17的應(yīng)用。由于稀土金屬離子具有較多的配位數(shù)，引入一個(gè)螯合能力強(qiáng)的非天然氨基酸具有非常大的挑戰(zhàn)性，另外非天然氨基酸的引入是否對(duì)蛋白質(zhì)的折疊引起額外的影響也需要考慮。
[0012]Gempf 等人Commun., 2013, 49: 9104 - 9106)報(bào)道了一種 4-硝基吡唳鑭
系絡(luò)合物18，它可以和多肽或蛋白質(zhì)的半胱氨酸巰基發(fā)生反應(yīng)，生成更短的硫醚鍵，用于熒光研究。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0013]本發(fā)明的目的是提供一種新的使用合成的順磁標(biāo)簽進(jìn)行蛋白質(zhì)定點(diǎn)修飾方法，可以廣泛應(yīng)用到蛋白質(zhì)定點(diǎn)修飾的領(lǐng)域，也可用于生物核磁共振研究。
[0014]本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)定點(diǎn)修飾的新方法，其特征是，包括以下步驟:
(I)定量稱取合成標(biāo)簽加入到MQ超純水中配置成50 mM的合成標(biāo)簽溶液，(2)向蛋白質(zhì)ubiquitin E18C中加入1.5倍量的TCEP，并調(diào)節(jié)pH為7.5，靜置，(3)將蛋白質(zhì)ubiquitinE18C逐滴加入到5-10倍體積量的合成標(biāo)簽溶液中，并保證滴加過程及最終pH為7.5左右。
(4)采集反應(yīng)不同時(shí)間之后混合物的1H-15N HSQC譜圖，對(duì)反應(yīng)進(jìn)程進(jìn)行檢測(cè)，直到反應(yīng)完全為止。(5)反應(yīng)完全后，通過roio脫鹽柱或者陰離子交換柱進(jìn)行產(chǎn)物分離，將多余的標(biāo)簽與新生成的小分子物質(zhì)除去，修飾完成；
上述合成標(biāo)簽涉及圖4所示的含砜基(苯砜基，甲砜基)、硝基的PyMTA，DPA類似物Tl、T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8。
[0015]本發(fā)明所涉及的化合物Tl、Τ2、Τ3、Τ4、Τ5、Τ6、Τ7和Τ8中:R1為苯砜基、甲砜基、硝基；R2為溴、氫。
[0016]其具體合成步驟如下:
(一)3-溴-4-苯砜基-2，6-吡啶二甲氨基-N，N，N、N'-四乙酸(Tl)的合成路線如圖5所示
(I) 3-溴-2，6-二甲基吡啶，即圖5中化合物20的合成
將2，6- 二甲基吡啶，溴素依次滴加到發(fā)煙硫酸中，上述三者的體積比為1: 0.18:5，滴加完畢后，加熱4-5h至溶液上方紅棕色蒸汽基本消失，停止反應(yīng)，冷至室溫，將其緩慢倒入過量冰水中，冰水浴下用NaOH固體調(diào)pH，用過量乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗滌有機(jī)層，無(wú)水硫酸鈉干燥，過濾，旋干，得黃色油狀物。
[0017](2) 3-溴-2，6- 二甲基吡啶-N-氧化物，即圖5中化合物21的合成
將3-溴-2，6- 二甲基吡啶20，乙酸，30%H202混合，上述三者的質(zhì)量體積比為1:10:1.85,加熱至70-90°C，反應(yīng)12h，冷至室溫，將反應(yīng)液濃縮，稀釋至過量水中，用NaOH固體調(diào)pH，過量乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗滌有機(jī)層，無(wú)水硫酸鈉干燥，過濾，旋干，過柱子，得白色固體。
[0018](3) 3-溴-4-硝基2，6- 二甲基吡啶-N-氧化物，即圖5中化合物22的合成
將21，濃硫酸，發(fā)煙硝酸混合，上述三者的質(zhì)量體積比為1:2.82:3.45，加熱10h，冷至室溫，將其稀釋至過量冰水中，用NaOH固體調(diào)pH，過量乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗滌有機(jī)層，無(wú)水硫酸鈉干燥，過濾，旋干，得黃色粉末。
[0019](4) 3，4- 二溴-2，6- 二甲基吡啶-N-氧化物，即圖5中化合物23的合成
將乙酰溴滴加到22和冰乙酸的混合物中，上述三者的質(zhì)量體積比為1:0.12:1，黃色澄清體系，加熱8-10h，冷至室溫，將其倒入過量冰水中，冰水浴下用碳酸鈉固體調(diào)pH，過量乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗滌有機(jī)層，無(wú)水硫酸鈉干燥，過濾，旋干得白色粉末。
[0020](5) 2-羥甲基-3，4- 二溴-6-甲基吡唆，即圖5中化合物24的合成
將23，二氯甲烷，三氟乙酸酐(TFAA)混合，上述三者的質(zhì)量體積比為1:2.56:4.87，加熱4-6h，旋干溶劑，用飽和NaHCO3溶液調(diào)節(jié)pH，加入過量乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗滌有機(jī)層，無(wú)水硫酸鈉干燥，過柱子，得白色固體。
[0021] (6) 2-溴甲基-3，4- 二溴-6-甲基吡唆，即圖5中化合物25的合成將PBr3滴加到24和氯仿的混合物中，上述三者的質(zhì)量體積比為1: 1.9:41，滴加完畢后，加熱6h，冷至室溫，將其倒入過量冰水中，用NaHCO3固體調(diào)節(jié)pH，過量二氯甲烷萃取，飽和食鹽水洗滌有機(jī)層，無(wú)水硫酸鈉干燥，過濾，旋干得淺黃色粉末。
[0022](7) 2，6- 二溴甲基-3，4_ 二溴吡啶，即圖5中化合物27的合成
將N-溴代丁二酰亞胺分批加入到25和CCl4的混合物中，上述三者的質(zhì)量體積比為1:0.19:3，每次加的時(shí)候加入毫克級(jí)的過氧化苯甲酰(Bz2O2)作為引發(fā)劑，加熱34-38h，冷至室溫，過濾，二氯甲烷洗滌濾餅，濾液用飽和NaHCO3溶液洗滌，飽和食鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥。過濾，旋干得到多個(gè)溴代的中間體26，將其加入質(zhì)量體積比為2:0.35:0.27的THF，N, N-二異丙基乙胺，亞磷酸二乙酯混合物中，深棕黃色體系，攪拌18h，將其倒入過量冰水中，過量無(wú)水乙醚萃取，飽和食鹽水洗滌有機(jī)層，無(wú)水硫酸鈉干燥，過濾，旋干，過柱子得淺黃色粉末。 [0023](8)3，4-二溴-2，6-二 [N, N'-二(乙氧羰基甲基)氨基亞甲基]吡啶，即圖5中化合物28的合成
將27，MeCN,亞氨基二乙酸二乙酯，DIEA混合，上述四者的質(zhì)量體積比為1:18.2:1.1:1.2，加熱反應(yīng)10h，冷至室溫，旋干溶劑，加入過量乙酸乙酯溶解產(chǎn)物，飽和食鹽水洗滌有機(jī)層，無(wú)水硫酸鈉干燥，過柱子，得無(wú)色油狀物。
[0024](9)3-溴-4-苯砜基-2，6-二 [N，N、二(乙氧羰基甲基)氨基亞甲基]吡唆，即圖5中化合物29的合成
將28，乙腈，苯亞磺酸鈉，四丁基溴化銨混合，上述四者的質(zhì)量體積比為1:34.5:0.53:0.05，白色渾濁體系，加熱反應(yīng)12h，冷至室溫，旋干溶劑，加入過量水，過量乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗滌有機(jī)層，無(wú)水硫酸鈉干燥，過濾，旋干得淺黃色油狀物。
[0025](10)3-溴-4-苯砜基-2，6-吡啶二甲氨基-N，N，NW-四乙酸，即圖5中化合物Tl的合成
將29加入到乙醇，NaOH，水的混合物中，上述四者的質(zhì)量體積比為1:17.5:0.45:17.5，攪拌3-5h，分批加入H+離子交換樹脂調(diào)pH至酸性，過濾，旋干濾液得白色粉末。1H-NMRC400MHz，90%H20+10%D20，pH > 12) 5 ppm:7.95 (lH，s)，7.81 (2H，d，/= 7.0Hz)，7.63 (lH，t，/ = 6.8Hz)，7.49 (2H，t，/ = 7.0Hz),3.92 (2H，s)，3.96 (2H，s)，3.12 (4H，s)，3.08 (4H,s) ； 13C-NMR (100 MHz,90%H20+10%D20, pH > 12) δ ppm: 179.20，159.86，159.03，147.46，136.59，135.07，129.52，128.63，122.19，115.73，58.76，58.40，58.34，58.14。MS-ESI (-):586.0，588.00
[0026](二)3-溴-4-甲砜基-2，6-吡啶二甲氨基-隊(duì)隊(duì)^，^-四乙酸(了2)的合成路線如圖6所示
用相似的方法合成化合物T2，其核磁數(shù)據(jù)如下=1H-NMR (400 MHz,90%H20+10%D20,pH > 12) δ ppm:7.79 (1H, s)，4.08 (2H, s)，3.82 (2H, s)，3.36 (3H, s)，3.12 (4H, s),
3.08 (4H,s)；13C-NMR (100 MHz,90%H20+10%D20,pH > 12) δ ppm:179.26,179.19,159.66,159.16，147.22，121.94，115.63,58.68,58.36，58.17,41.42。MS-ESI ( - ):524.0，526.0。
[0027](三)3-溴-4-硝基-2，6-吡啶二甲氨基-N，N，N'N'-四乙酸(T3)的合成路線如圖7所示
(I) 2-羥甲基-3-溴-4-硝基-6-甲基吡啶，即圖7中化合物31的合成將三氟乙酸酐(TFAA)滴加到22和二氯甲烷的混合物中，上述三者的質(zhì)量體積比為1:0.58:3.84,滴加完畢后，加熱7h，旋干溶劑，用飽和NaHCO3溶液調(diào)節(jié)pH，加入過量乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗滌有機(jī)層，無(wú)水硫酸鈉干燥，過柱子，得白色固體。
[0028](2) 2-溴甲基-3-溴-4-硝基_6_甲基吡啶，即圖7中化合物32的合成
將PBr3滴加到31和氯仿的混合物中，上述三者的質(zhì)量體積比為1:4.2:50，滴加完畢后，加熱4-6h，冷至室溫，用NaHCO3固體調(diào)節(jié)pH，過量二氯甲烷萃取，飽和食鹽水洗滌有機(jī)層，無(wú)水硫酸鈉干燥，過濾，旋干過柱子得白色粉末。
[0029](3) 2，6- 二溴甲基-3-溴_4_硝基吡啶，即圖7中化合物33的合成
將N-溴代丁二酰亞胺分批加入到32和CCl4的混合物中，上述三者的質(zhì)量體積比為1:0.17:3.7，每次加的時(shí)候加入毫克級(jí)的偶氮二異丁腈(AIBN)作為引發(fā)劑，加熱30_36h，冷至室溫，過濾，二氯甲烷洗滌濾餅，濾液用飽和NaHCO3溶液洗滌，飽和食鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥。過柱子，旋干得淺黃色油狀物。
[0030](4)3-溴-4-硝基-2，6- 二 [N，N、二(叔丁氧羰基甲基)氨基亞甲基]吡唆，即圖7中化合物34的合成
將33，亞氨基二 乙酸二叔丁酯，乙腈，DIEA混合，上述四者的質(zhì)量體積比為1: 1.4:60:1.2，加熱7-9h，旋干溶劑，加入過量水，過量乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗滌有機(jī)層，無(wú)水硫酸鈉干燥，過柱子，得淺黃色油狀物。
[0031](5)3-溴-4-硝基-2，6-吡啶二甲氨基-Ν，Ν，Π-四乙酸，即圖7中化合物Τ3的合成
將三氟乙酸滴加到34和二氯甲烷的混合物中，上述三者的質(zhì)量體積比為1:0.05:0.8，攪拌24h，旋干溶劑，得黃色油狀物，加入過量無(wú)水乙醚，立刻析出白色沉淀，過濾，得到白色粉末，為產(chǎn)物的三氟乙酸鹽。1H-NmruoomHz, 90%H20+10%D20，pH > 12)5 ppm:7.60(1H,s)，4.07 (2H，s)，3.80 (2H，s)，3.16 (4H，s)，3.10 (4H, s)；13C-NMR (100 MHz, 90%H20+10%D20,pH > 12) δ ppm:179.23，179.18，159.94，159.79，156.63，116.62，109.10,58.52，58.33，58.28。MS-ESI ( - ):491.0,493.0。
[0032](四)4-苯砜基-2，6-吡啶二甲氨基-隊(duì)隊(duì)^^-四乙酸(了4)的合成路線如圖8所示
(1)4-溴吡啶-2，6- 二羧酸二乙酯，即圖8中化合物36的合成將白屈氨酸，五溴化磷混合，上述兩者的質(zhì)量比為1:3.3，加熱反應(yīng)4h，冷至室溫，然后加入過量氯仿，攪拌萃取，過濾，滴加質(zhì)量體積比為1:10的無(wú)水乙醇，室溫?cái)嚢?h，旋干，用過量正己烷重結(jié)晶得白色針狀晶體。
[0033](2) 4-溴吡啶-2，6- 二甲醇，即圖8中化合物37的合成
將36，無(wú)水乙醇混合，上述兩者的質(zhì)量體積比為1:7.7，分批加入質(zhì)量體積比為1:0.67的NaBH4,加熱6-8h，冷至室溫，旋干溶劑，加入過量飽和NaHCO3溶液，攪拌2h，過量乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗滌有機(jī)層，無(wú)水硫酸鈉干燥，過濾，旋干，得白色粉末。
[0034](3) 2，6- 二溴甲基-4-溴吡唆，即圖8中化合物38的合成
將PBr3滴加到37和氯仿的混合物中，上述三者的質(zhì)量體積比為1:0.2:3.7，滴加完畢后，加熱10h，冷至室溫，將其倒入冰水中，用NaHCO3固體調(diào)節(jié)pH，過量二氯甲烷萃取，飽和食鹽水洗滌有機(jī)層，無(wú)水硫酸鈉干燥，過濾，旋干得白色粉末。[0035](4)4-溴-2，6-二 [N，N、二(乙氧羰基甲基)氨基亞甲基]吡啶，即圖8中化合物39的合成
將38，MeCN,亞氨基二乙酸二乙酯，無(wú)水K2CO3混合，上述四者的質(zhì)量體積比為1:20:1.3: 2，加熱反應(yīng)7h，冷至室溫，旋干溶劑，加入過量乙酸乙酯溶解產(chǎn)物，飽和食鹽水洗滌有機(jī)層，無(wú)水硫酸鈉干燥，過柱子，得淺黃色油狀物。
[0036](5)4-苯砜基-2，6-二 [N，N、二(乙氧羰基甲基)氨基亞甲基]吡啶，即圖8中化合物40的合成
將39，乙腈，苯亞磺酸鈉，四丁基溴化銨混合，上述四者的質(zhì)量體積比為1:37.5:0.6:0.06，加熱反應(yīng)12h，冷至室溫，旋干溶劑，加入過量水，過量乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗滌有機(jī)層，無(wú)水硫酸鈉干燥，過濾，旋干得淺黃色油狀物。
[0037](6)4-苯砜基-2，6-吡啶二甲氨基-N，NH-四乙酸，即圖8中化合物T4的合成 將40加入到乙醇，NaOH，水的混合物中，上述四者的質(zhì)量體積比為1:16.1:0.53:16.1，攪拌3-5h，分批加入H+離子交換樹脂調(diào)pH至酸性，過濾，旋干濾液，得淺黃色粉末。1H-NMR(400 MHz, 90%H20+10%D20, pH > 12) δ ppm -J.93 (2H，d，/= 7.7Hz),7.83 (2H，s)，7.66(1H, t, / = 7.4Hz)，7.56 (2H, t, / = 7.7Hz)，3.84 (4H, s)，3.07 (8H, s) ； 13C-NMR (100MHz,90%H20+10%D20, pH > 12) δ ppm:179.16,161.16,149.88,137.90,134.95,129.98,127.83,118.70,58.98,57.97。MS-ESI( - ):586.0,588.0。MS-ESI( - ):508.2。
[0038](五)4-硝基-2，6-吡啶二甲氨基-N，N，N:N'-四乙酸(T5)的合成路線如圖9所示
化合物4-硝基-2，6-吡啶二甲氨基-N，N, NW-四乙酸(Τ5)的合成方法和化合物Τ3的合成方法類似，4-硝基-2，6-吡啶二甲氨基-N，N，N、N、四乙酸(Τ5)的核磁數(shù)據(jù)如下:1H-NMR (400 MHz, 90%H20+10%D20,pH > 12) δ ppm:8.05 (2H，s)，3.88 (4H，s)，3.12 (8H,s) ； 13C-NMR (100 MHz,90%H20+10%D20, pH > 12) δ ppm:179.26，161.79，155.13，115.08，59.11,58.25。MS-ESI ( - ):413.1。
[0039](六)4-苯砜基吡啶-2，6-二羧酸(T6)的合成路線如圖10所示 (I) 4-苯砜基吡啶-2，6-二羧酸二乙酯，即圖10中化合物47的合成
將36，苯亞磺酸鈉，乙腈，四丁基溴化銨混合，上述四者的質(zhì)量體積比為1:1.11:30:0.1，加熱反應(yīng)36h，冷至室溫，旋干溶劑，加入過量水，過量乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗滌有機(jī)層，無(wú)水硫酸鈉干燥，過柱子得白色粉末，回收未反應(yīng)完的原料36。
[0040](2)4-苯砜基吡啶-2，6- 二羧酸，即圖10中化合物T6的合成
將47加入到乙醇，NaOH，水的混合物中，上述四者的質(zhì)量體積比為1:13.6:0.43:13.6，攪拌10h，用濃鹽酸調(diào)pH至強(qiáng)酸性，有白色固體析出，過濾，冷水洗滌濾餅，紅外干燥，得白色粉末。1H-NMR (400 MHz,90%H20+10%D20,pH > 12) δ ppm:8.33 (2H，s)，7.96 (2H，d，/ =8.1Ηz)，7.66(lH，t，/ = 7.5Hz)，7.56(2H，t，/ = 8.1Hz)；13C-NMR( 100 MHz, 90%H20+10%D20,pH > 12) δ ppm:170.61，154.97，150.58，137.53，135.21，130.05，128.07，121.66。
[0041](七)4-甲砜基吡啶-2，6-二羧酸(T7)的合成路線如圖10所示
用與Τ6類似的方法合成4-甲砜基吡啶-2，6-二羧酸(Τ7)，其核磁數(shù)據(jù)如下=1H-NMR(400 MHz, 90%H20+10%D20,pH > 12) δ ppm:8.35 (2H，s)，3.26 (3H, s)；13C-NMR (100 MHz,90%H20+10%D20, pH > 12) δ ppm:170.71，154.99，149.37，121.58，42.55。
[0042](A) 4-硝基吡啶-2，6- 二羧酸(T8)的合成路線如圖11所示
將三氧化鉻分批加入到濃硫酸和43的混合物中，上述三者的質(zhì)量體積比為1:3.55:0.25,加熱，反應(yīng)2h，冷至室溫，倒入過量冰水中，過濾，用冷水洗滌濾餅，得白色固體，紅外干燥，得白色粉末。1H-NMR (400 MHz,90%H20+10%D20,pH > 12) δ ppm:8.54 (2H,s) ； 13C-NMR (100 MHz,90%H20+10%D20, pH > 12) δ ppm:170.47，155.73，155.65，117.66。
[0043]上述順磁標(biāo)簽與蛋白質(zhì)上的巰基發(fā)生親核取代反應(yīng)之后生成穩(wěn)定的硫醚鍵，該反應(yīng)具有明顯的活性和專一性，上述標(biāo)簽的優(yōu)點(diǎn)有以下幾個(gè)方面:(1)體積較??；(2)不存在手性；(3)連接過程簡(jiǎn)便，反應(yīng)速度快；(4)與蛋白質(zhì)不存在非特異性作用；(5)在高pH及還原性環(huán)境下均能穩(wěn)定存在。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0044]圖1為以二硫鍵方式連接的順磁標(biāo)簽；
圖2為以硫醚鍵方式連接的順磁標(biāo)簽；
圖3為其它方式連接的標(biāo)簽； 圖4為以PyMTA，DPA為骨架的順磁標(biāo)簽；
圖5為Tl的合成路線；
圖6為T2的合成路線；
圖7為T3的合成路線；
圖8為T4的合成路線；
圖9為T5的合成路線；
圖10為T6、T7的合成路線；
圖11為Τ8的合成路線；
圖12為化合物Τ1-Τ8與L-半胱氨酸的反應(yīng)式；
圖13為20°C，ρΗ=7.5時(shí)Tl與L-半胱氨酸混合后在不同時(shí)刻的1H-NMR譜圖；
圖14為20°C，ρΗ=7.5時(shí)Τ2與L-半胱氨酸混合后在不同時(shí)刻的1H-NMR譜圖；
圖15為20°C，ρΗ=7.5時(shí)Τ3與L-半胱氨酸混合后在不同時(shí)刻的1H-NMR譜圖；
圖16為20°C，pH=7.5時(shí)T4與L-半胱氨酸混合后在不同時(shí)刻的1H-NMR譜圖；
圖17為20°C，ρΗ=7.5時(shí)Τ5與L-半胱氨酸混合后在不同時(shí)刻的1H-NMR譜圖；
圖18為20°C，ρΗ=7.5時(shí)Τ6與L-半胱氨酸混合后在不同時(shí)刻的1H-NMR譜圖；
圖19為20°C，ρΗ=7.5時(shí)Τ7與L-半胱氨酸混合后在不同時(shí)刻的1H-NMR譜圖；
圖20為20°C，pH=7.5時(shí)T8與L-半胱氨酸混合后在不同時(shí)刻的1H-NMR譜圖；
圖21為蛋白質(zhì)與順磁標(biāo)簽Tl的連接方式；
圖22為25°C，pH=6.4條件下，1.0倍量的順磁或逆磁金屬離子分別滴加到0.10 mM的復(fù)合物ubiquitin E18C-T1蛋白質(zhì)中的1H-15N HSQC重疊譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0045]實(shí)施例1 合成標(biāo)簽 T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8。
[0046](一)3-溴-4-苯砜基-2，6-吡啶二甲氨基-N，N，N、N、四乙酸(Tl)的合成路線如圖5所示
(I)3-溴-2，6-二甲基吡啶，即圖5中化合物20的合成
將發(fā)煙硫酸125.0ml加入500ml三口瓶中，滴加2，6- 二甲基吡啶25.0ml (0.22mol),溶液為淺黃色，溶液上方為白色霧狀，接著滴加溴素4.5ml (0.09mol),滴加完畢后,體系為紅棕色，移去冰源，加熱4-5h至溶液上方紅棕色蒸汽基本消失，停止反應(yīng)，冷至室溫，將其緩慢倒入冰水中，冰水浴下用NaOH固體調(diào)pH，用乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗滌有機(jī)層，無(wú)水硫酸鈉干燥，過濾，旋干，得黃色油狀物19.30g，產(chǎn)率:48.6%。1H-NMR (400 MHz ADCl3) δppm:7.67 (1H, ?, J = 8.1Ηz)，6.86 (1Η, ?, J = 8.1Ηz)，2.63 (3Η, s)，2.48 (3Η, S)。
[0047](2) 3-溴-2，6- 二甲基吡啶_N_氧化物，即圖5中化合物21的合成
將 3-溴-2，6- 二甲基吡啶 20 13.0Og (70.28mmol),乙酸 130.0ml 加入 500ml 三口瓶中，無(wú)色澄清溶液，加熱至70-90°C，加入30%H202 24.0ml，反應(yīng)12h，冷至室溫，將反應(yīng)液濃縮，稀釋至水中，用NaOH固體調(diào)pH，乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗滌有機(jī)層，無(wú)水硫酸鈉干燥，過濾，旋干，過柱子，得白色固體10.00g，產(chǎn)率71.1%。1H-NMR (400 MHz，CDCl3) 5 ppm:7.35 (1H, d，/ = 8.4Ηζ)，7.02 (1Η, d，/ = 8.4Ηζ)，2.72 (3Η, s)，2.48 (3Η, S)。
[0048](3) 3-溴-4-硝基2，6_ 二甲基吡啶-N-氧化物，即圖5中化合物22的合成
將21 9.56g (47.56mmol)加入250ml三口燒瓶中，滴加濃硫酸27.0ml，滴加完畢后，再滴加發(fā)煙硝酸33.0ml，黃色澄清體系，加熱10h，冷至室溫，將其稀釋至冰水中，用NaOH固體調(diào)pH，乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗滌有機(jī)層，無(wú)水硫酸鈉干燥，過濾，旋干，得黃色粉末10.26g，產(chǎn)率:87.7%。1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm -J.74 (1H, s),2.81 (3H, s),2.53(3H,s)。
[0049](4) 3，4- 二溴-2，6_ 二甲基吡啶_N_氧化物，即圖5中化合物23的合成
將22 3.50g(14.23mmol)，冰乙酸28.0ml加入250ml三口瓶中，黃色澄清體系，滴加乙酰溴28.0ml，加熱8-10h，反應(yīng)過程中由紅色體系變?yōu)榱咙S色澄清體系，冷至室溫，將其倒入冰水中，冰水浴下用碳酸鈉固體調(diào)pH至弱堿性，乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗滌有機(jī)層，無(wú)水硫酸鈉干燥，過濾，旋干得白色粉末3.80g，產(chǎn)率:95.7%。1H-NMR (400 MHz，⑶Cl3) δppm:7.48 (lH，s)，2.84 (3H，s)，2.49 (3H，s)。
[0050](5) 2-羥甲基-3，4- 二溴-6-甲基吡唆，即圖5中化合物24的合成
將23 3.90g (13.93mmol)，二氯甲烷10.0ml加入100mL單口瓶中，滴加三氟乙酸酐19.0ml (TFAA)，滴加完畢后，加熱4_6h，旋干溶劑，用飽和NaHCO3溶液調(diào)節(jié)pH，有白色固體析出，加入乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗滌有機(jī)層，無(wú)水硫酸鈉干燥，過柱子，得白色固體 3.05g，產(chǎn)率:78.2%。1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm -J.43 (1H, s),4.72 (2H, ?, J =
4.4Ηζ)，4.48 (1Η, t,J = 4.4Ηζ)，2.55 (3Η, S)。
[0051](6) 2-溴甲基-3，4- 二溴-6-甲基吡唆，即圖5中化合物25的合成
將24 2.1Og (7.50mmol)，氯仿40.0ml加入100mL三口瓶中，淺黃色澄清體系，滴加溶有PBr3 1.1ml (11.25mmol)的氯仿5.0ml，滴加完畢后，加熱6h，冷至室溫，將其倒入冰水中，用NaHCO3固體調(diào)節(jié)pH，二氯甲烷萃取，飽和食鹽水洗滌有機(jī)層，無(wú)水硫酸鈉干燥，過濾，旋干得淺黃色粉末 2.17g，產(chǎn)率:85.1%。1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm:7.38 (1H, s),4.73 (2H, s)，2.49 (3H, S)。
[0052](7) 2，6- 二溴甲基-3，4_ 二溴吡啶，即圖5中化合物27的合成將25 1.91g (5.60mmol), CCl4 30ml加入100mL三口瓶中，淺黃色澄清體系，加熱34-38h，加熱過程中分批加入N-溴代丁二酰亞胺(NBS，每批1.0Og),每次加的時(shí)候加入毫克級(jí)的過氧化苯甲酰(Bz2O2)作為引發(fā)劑，冷至室溫，過濾，二氯甲烷洗滌濾餅，濾液用飽和NaHCO3溶液洗滌，飽和食鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥。過濾，旋干得到多個(gè)溴代的中間體26，用20.0ml THF溶解，黃色澄清體系，加入N，N-二異丙基乙胺3.5ml (DIEA，21.12mmol )，亞磷酸二乙酯2.7ml[ HPO (OEt)2, 21.12mmol ]，深棕黃色體系，攪拌18h，反應(yīng)過程中有白色沉淀析出，將其倒入冰水中，無(wú)水乙醚萃取，飽和食鹽水洗滌有機(jī)層，無(wú)水硫酸鈉干燥，過濾，旋干，過柱子得淺黃色粉末 1.65g，產(chǎn)率:70.5%。1H-NMR (400 MHz，CDCl3) 5 ppm:7.68(lH，s)，4.77 (2H，s)，4.47 (2H，s)。
[0053](8)3，4-二溴-2，6-二 [N, ΝΛ-二(乙氧羰基甲基)氨基亞甲基]吡啶，即圖5中化合物28的合成
將 27 1.65g (3.94mmol),MeCN 30.0ml,亞氛基二乙酸二乙酷 1.8ml (9.85mmol),DIEA
2.0ml (11.82mmol)，加入100mL三口瓶中，加熱反應(yīng)10h，冷至室溫，旋干溶劑，加入乙酸乙酯溶解產(chǎn)物，飽和食鹽水洗滌有機(jī)層，無(wú)水硫酸鈉干燥，過柱子，得無(wú)色油狀物1.44g，產(chǎn)率:57.6%。1H-NMR (400 MHz，CDCl3) δ ppm -J.86 (lH，s)，4.25 (2H，s)，4.14 (8H，m)，3.94(2H，s)，3.71 (4H，s)，3.57 (4H, s), 1.25 (12H，q，/= 14.4Hz)。
[0054](9)3-溴-4-苯砜基-2，6-二 [N，N'- 二(乙氧羰基甲基)氨基亞甲基]吡唆，即圖5中化合物29的合成
將 28 0.87g (1.36mmol),乙腈 30.0ml,苯亞磺酸鈉 0.46g (2.72mmol),四丁基溴化銨43.52mg加入100mL三口瓶中，白色渾濁體系，加熱反應(yīng)12h，冷至室溫，旋干溶劑，加入水，乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗滌有機(jī)層，無(wú)水硫酸鈉干燥，過濾，旋干得淺黃色油狀物 0.94g，產(chǎn)率:98.9%。1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm:8.49 (1H, s),7.99 (2H, ?, J =7.8Ηζ)，7.65 (1Η, t,J = 7.4Ηζ)，7.54 (2Η, t,J = 7.8Ηζ)，4.26 (2Η, s)，4.17 (10Η, m),
3.70 (4H，s)，3.65 (4Η, s), 1.27 (12H，m)。
[0055](10)3-溴-4-苯砜基-2，6-吡啶二甲氨基-N，N，NW-四乙酸，即圖5中化合物Tl的合成
用乙醇10.0ml將29 0.57g (0.81 mmol)溶解在100mL單口瓶中，無(wú)色澄清體系，接著加入溶有NaOH 0.26g (6.48mmol)的水10.0ml，攪拌3_5h，分批加入H+離子交換樹脂調(diào)pH至酸性，過濾，旋干濾液得白色粉末0.25g，產(chǎn)率:53.2%。1H-NMR (400 MHz,90%H20+10%D20,pH > 12) δ ppm:7.95 (1H, s)，7.81 (2H, ?, J = 7.0Hz),7.63 (1H, t，/ = 6.8Ηζ)，7.49(2H，t，/= 7.0Η ζ)，3.92 (2H，s)，3.96 (2H，s)，3.12 (4H，s)，3.08 (4H, s) ； 13C-NMR (100MHz,90%H20+10%D20, pH > 12) δ ppm:179.20,159.86,159.03,147.46,136.59,135.07,129.52，128.63，122.19，115.73，58.76，58.40，58.34，58.14。MS-ESI( - ):586.0，588.0。
[0056](二)3-溴-4-甲砜基-2，6-吡啶二甲氨基-隊(duì)隊(duì)^，^-四乙酸(了2)的合成路線如圖6所示
用相似的方法合成化合物T2，其核磁數(shù)據(jù)如下=1H-NMR (400 MHz,90%H20+10%D20,pH > 12) δ ppm:7.79 (1H, s)，4.08 (2H, s)，3.82 (2H, s)，3.36 (3H, s)，3.12 (4H, s),
3.08 (4H,s)；13C-NMR (100 MHz,90%H20+10%D20,pH > 12) δ ppm:179.26,179.19,159.66,159.16，147.22，121.94，115.63,58.68,58.36，58.17,41.42。MS-ESI ( - ):524.0，526.0。[0057](三)3-溴-4-硝基-2，6-吡啶二甲氨基-N，N，N'K -四乙酸(T3)的合成路線如圖7所示
(I) 2-羥甲基-3-溴-4-硝基-6-甲基吡啶，即圖7中化合物31的合成 將22 6.0Og (24.40mmol)，二氯甲烷40.0ml加入100mL單口瓶中，滴加三氟乙酸酐
10.4ml (TFAA)，滴加完畢后，加熱7h，旋干溶劑，用飽和NaHCO3溶液調(diào)節(jié)pH，加入乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗滌有機(jī)層，無(wú)水硫酸鈉干燥，過柱子，得白色固體2.1Og,產(chǎn)率:35.0%。1H-NMR (400 MHz，CDCl3) δ ppm -J.42 (lH，s)，4.84 (2H，d，/= 4.6Hz),4.30 (lH，t，/ =
4.6Hz)，2.69 (3H, s)。
[0058](2) 2-溴甲基-3-溴-4-硝基_6_甲基吡啶，即圖7中化合物32的合成
將31 2.1Og (8.50mmol)，氯仿20.0ml加入100mL三口瓶中，淺黃色澄清體系，滴加溶有PBr3 0.5ml (4.80mmol)的氯仿5.0ml，滴加過程中有白色沉淀析出，滴加完畢后，加熱4-6h，冷至室溫，用NaHCO3固體調(diào)節(jié)pH，二氯甲烷萃取，飽和食鹽水洗滌有機(jī)層，無(wú)水硫酸鈉干燥，過濾，旋干過柱子得白色粉末0.90g，產(chǎn)率:34.5%。1H-NMR (400 MHz，CDC13) δ ppm:7.35 (lH，s)，4 .78 (2H，s)，2.65 (3H，s)。
[0059](3) 2，6- 二溴甲基-3-溴_4_硝基吡啶，即圖7中化合物33的合成
將32 0.93g (3.02mmol), CCl4 20ml加入100mL三口瓶中，無(wú)色澄清體系，加熱30h，加熱過程中分批加入N-溴代丁二酰亞胺(NBS，每批0.54g)，每次加的時(shí)候加入毫克級(jí)的偶氮二異丁腈(AIBN)作為引發(fā)劑，冷至室溫，過濾，二氯甲烷洗滌濾餅，濾液用飽和NaHCO3溶液洗滌，飽和食鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥。過柱子，旋干得淺黃色油狀物0.25g，產(chǎn)率:21.6%。1H-NMR (400 MHz，CDC13)5 ppm:7.67 (lH，s)，4.79 (2H，s)，4.56 (2H, s)；13C-NMR(100 MHz, CDCl3) δ ppm:158.80，157.93，117.44，110.46,32.18,31.04。
[0060](4)3-溴-4-硝基-2，6- 二 [N，N'_ 二(叔丁氧羰基甲基)氨基亞甲基]吡唆，即圖7中化合物34的合成
將 33 0.25g (0.65mmol),亞氨基二乙酸二叔丁酯 0.35g (1.43mmol),乙臆 15.0ml,DIEA 0.3ml(l.63mmol)加入100mL三口瓶中，黃色澄清體系，加熱7_9h，旋干溶劑，加入水，乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗滌有機(jī)層，無(wú)水硫酸鈉干燥，過柱子，得淺黃色油狀物0.25g，產(chǎn)率:54.3%。1H-NMR (400 MHz，CDCl3) δ ppm -J.93 (lH，s)，4.32 (2H，s)，4.11 (2H，s)，3.63 (4H，s)，3.48 (4H, s), 1.48 (18H, s), 1.46 (18H，s)。
[0061](5)3-溴-4-硝基-2，6-吡啶二甲氨基-N，NH-四乙酸，即圖7中化合物T3的合成
將34 0.25g(0.35mmol)，二氯甲烷4.0ml加入100mL單口瓶中，滴加三氟乙酸5.0ml，滴加完畢后，無(wú)色澄清體系，攪拌24h，旋干溶劑，得黃色油狀物，加入15.0ml無(wú)水乙醚，立刻析出白色沉淀，過濾，無(wú)水乙醚洗滌，得到白色粉末0.21g，為產(chǎn)物的三氟乙酸鹽，產(chǎn)率:77.8%。1H-NMR (400 MHz, 90%H20+10%D20, pH > 12) δ ppm -J.60 (lH，s)，4.07 (2H, s),
3.80 (2H, s)，3.16 (4H, s)，3.10 (4H, s) ； 13C-NMR (100 MHz,90%H20+10%D20, pH > 12)δ ppm:179.23，179.18，159.94，159.79，156.63,116.62，109.10,58.52,58.33,58.28。MS-ESI ( - ):491.0,493.0。
[0062](四)4-苯砜基-2，6-吡啶二甲氨基-隊(duì)隊(duì)^^-四乙酸(了4)的合成路線如圖8所示(1)4-溴吡啶-2，6- 二羧酸二乙酯，即圖8中化合物36的合成將白屈氨酸15.0Og (81.96臟01)，五溴化磷50.0(^ (117.49mmol)加入250ml三口瓶中，加熱反應(yīng)4h，冷至室溫，然后加入氯仿，攪拌萃取，過濾，滴加150.0ml無(wú)水乙醇，滴加完畢后，室溫?cái)嚢?h，旋干，用正己烷重結(jié)晶得白色針狀晶體12.80g，產(chǎn)率:52.(Fc)tj1H-NMRUOOMHz, CDCl3) δ ppm:8.45 (2H, s)，4.52 (4H, q，/ = 7.1Hz), 1.48 (6H, t,J = 7.1Hz)。
[0063](2) 4-溴吡啶-2，6- 二甲醇，即圖8中化合物37的合成
將36 19.45g (64.62mmol)，無(wú)水乙醇150.0ml加入500ml三口瓶中，分批加入NaBH412.97g(341.32mmol )，加熱6_8h，冷至室溫，旋干溶劑，加入飽和NaHCO3溶液，攪拌2h，乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗滌有機(jī)層，無(wú)水硫酸鈉干燥，過濾，旋干，得白色粉末12.00g，產(chǎn)率:85.7%。1H-NMR (400 MHz, DMS0-d6) δ ppm -J.50 (2H, s),5.66 (2H，t，/= 5.9Hz),4.53(4H, d，/ = 5.9Hz)。 [0064](3) 2，6- 二溴甲基-4-溴吡唆，即圖8中化合物38的合成
將 37 12.00g(55.31mmol)，氯仿 120.0ml 加入 500ml 三口瓶中，滴加溶有 PBr3 60.0ml的氯仿100.0ml，滴加完畢后，加熱10h，冷至室溫，將其倒入冰水中，用NaHCO3固體調(diào)節(jié)pH，二氯甲烷萃取，飽和食鹽水洗滌有機(jī)層，無(wú)水硫酸鈉干燥，過濾，旋干得白色粉末18.00g，產(chǎn)率:97.3%。1H-NMR (400 MHz，CDCl3) δ ppm -J.55 (2H，s)，4.48 (4H，S)。
[0065](4)4-溴-2，6-二 [N, N'-二(乙氧羰基甲基)氨基亞甲基]吡啶，即圖8中化合物39的合成
將 38 1.0Og (2.93mmol), MeCN 20.0ml,亞氛基二乙酸二乙酷 1.3ml (7.1Immol),無(wú)水K2CO3 2.0Og (14.50mmol)，加入100mL三口瓶中，加熱反應(yīng)7h，冷至室溫，旋干溶劑，加入乙酸乙酯溶解產(chǎn)物，飽和食鹽水洗滌有機(jī)層，無(wú)水硫酸鈉干燥，過柱子，得淺黃色油狀物 1.50g，產(chǎn)率:91.5%。1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm -J.72 (2H, s),4.17 (8H, q, / =
7.1Ηz)，4.01 (4H, s)，3.59 (8H, s), 1.27 (12H, t,J = 7.1 Hz)。
[0066](5)4-苯砜基-2，6-二 [N，N: 二(乙氧羰基甲基)氨基亞甲基]吡啶，即圖8中化合物40的合成
將 39 0.80g (1.43mmol),乙腈 30.0ml,苯亞磺酸鈉 0.48g (2.86mmol),四丁基溴化銨45.76mg加入100mL三口瓶中，白色渾濁體系，加熱反應(yīng)12h，冷至室溫，旋干溶劑，加入水，乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗滌有機(jī)層，無(wú)水硫酸鈉干燥，過濾，旋干得淺黃色油狀物
0.62g，產(chǎn)率:69.7%。1H-NMR (400 MHz，CDCl3) 5 ppm:8.04 (4H，d，/= 5.4Hz),7.63 (1H,t,J = 7.1Ηz)，7.56 (2H，t，/ = 7.5Ηζ)，4.18 (8H，q，/ = 7.1Ηz)，4.12 (4H，s)，3.60 (8H,s), 1.28 (12H, t,J = 7.1Hz)。
[0067](6)4-苯砜基-2，6-吡啶二甲氨基-N，NH-四乙酸，即圖8中化合物T4的合成
用乙醇10.0ml將40 0.62g(1.00 mmol)溶解在100ml單口瓶中，淺黃色澄清體系，接著加入溶有NaOH 0.33g(8.30mmol)的水10.0ml，攪拌3_5h，分批加入H+離子交換樹脂調(diào)pH至酸性，過濾，旋干濾液，得淺黃色粉末0.41g，產(chǎn)率:80.6%。1H-NMRC400 MHz, 90%H20+10%D20,pH > 12) δ ppm:7.93 (2H, ?, J = 7.7Ηζ)，7.83 (2Η, s)，7.66 (1Η, t，/ = 7.4Ηζ)，7.56(2H，t，/ = 7.7Hz),3.84 (4H，s)，3.07 (8H，s);13C_NMR (100 MHz, 90%H20+10%D20,pH > 12)δ ppm:179.16，161.16，149.88，137.90，134.95，129.98，127.83,118.70,58.98,57.97。MS-ESI( - ):586.0,588.0。MS-ESI( - ):508.2。
[0068](五)4-硝基-2，6-吡啶二甲氨基-N，N，N^-四乙酸(T5)的合成路線如圖9所示
化合物4-硝基-2，6-吡啶二甲氨基-N，N, NW-四乙酸(T5)的合成方法和化合物T3的合成方法類似，4-硝基-2，6-吡啶二甲氨基-N，N，N' N、四乙酸(T5)的核磁數(shù)據(jù)如下:1H-NMR (400 MHz, 90%H20+10%D20,pH > 12) δ ppm:8.05 (2H，s)，3.88 (4H，s)，3.12 (8H,s) ； 13C-NMR (100 MHz,90%H20+10%D20, pH > 12) δ ppm:179.26，161.79，155.13，115.08，59.11,58.25。MS-ESI ( - ):413.1。
[0069](六)4-苯砜基吡啶-2，6-二羧酸(T6)的合成路線如圖10所示
(1)4-苯砜基吡啶-2，6-二羧酸二乙酯，即圖10中化合物47的合成
將 36 1.0Og (3.32mmol),苯亞磺酸鈉 1.1lg (6.64mmol),乙腈 30.0ml,四丁基溴化銨106.24mg加入100mL三口瓶中，白色渾濁體系，加熱反應(yīng)36h，冷至室溫，旋干溶劑，加入水，乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗滌有機(jī)層，無(wú)水硫酸鈉干燥，過柱子得白色粉末0.44g，回收未反應(yīng)完的原料 36，產(chǎn)率:36.7%。1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm:8.68 (2H, s),8.04(2H, d，/ = 7.5Ηζ)，7.70 (1H, t,J = 7.4Ηζ)，7.56 (2H, t,J = 7.5Ηζ)，4.52 (4H, q，/ =7.1Hz), 1.48 (6H, t,J = 7.1Hz)。
[0070](2)4-苯砜基吡啶-2，6- 二羧酸，即圖10中化合物T6的合成
將 47 0.44g (1.21 mmol),NaOH 0.19g (4.84mmol),乙醇 6.0ml,水 6.0ml 加入 100ml單口瓶中，白色渾濁體系，攪拌10h，用濃鹽酸調(diào)pH至強(qiáng)酸性，有白色固體析出，過濾，冷水洗滌濾餅，紅外干燥，得白色粉末0.28g，產(chǎn)率:75.7%。1H-NMR (400 MHz, 90%H20+10%D20,pH > 12) δ ppm:8.33 (2H, s)，7.96 (2H, d，/ = 8.1Ηz)，7.66 (1H, t，/ = 7.5Hz)，7.56(2H, t，/ = 8.1Hz) ； 13C-NMR (100 MHz, 90%H20+10%D20, pH > 12) δ ppm:170.61，154.97，150.58，137.53，135.21，130.05，128.07，121.66。
[0071](七)4-甲砜基吡啶-2，6-二羧酸(T7)的合成路線如圖10所示
用與Τ6類似的方法合成4-甲砜基吡啶-2，6-二羧酸(Τ7)，其核磁數(shù)據(jù)如下=1H-NMR(400 MHz, 90%H20+10%D20,pH > 12) δ ppm:8.35 (2H，s)，3.26 (3H, s)；13C-NMR (100 MHz,90%H20+10%D20, pH > 12) δ ppm:170.71，154.99，149.37，121.58，42.55。
[0072](A) 4-硝基吡啶-2，6- 二羧酸(T8)的合成路線如圖11所示
將濃硫酸7.0ml加入100mL三口瓶中，分批加入43 0.50g (3.29mmol)，加熱，分批加入三氧化鉻1.97g (19.74mmol),墨綠色渾池體系,反應(yīng)2h,冷至室溫,倒入冰水中，過濾,用冷水洗滌濾餅，得白色固體，紅外干燥，得白色粉末0.38g，產(chǎn)率54.3%。1H-NMR (400 MHz,90%H20+10%D20,pH > 12) δ ppm:8.54 (2H, s)；13C-NMR (100 MHz, 90%H20+10%D20,pH > 12)δ ppm:170.47，155.73，155.65，117.66。
[0073]實(shí)施例2化合物T1-T8與L-半胱氨酸反應(yīng)
分別配制50.0 mM的T1-T8溶液，稀釋成1.0 mM的T1-T8溶液(用磷酸鹽緩沖液配制，含20%D20)，調(diào)pH至7.5，用Bruker-600 MHz超導(dǎo)核磁共振譜儀采樣，接著分別加入100.0mM pH=7.5的L-半胱氨酸(6 equiv)充分混合，間隔30 min采樣。
[0074]圖12為化合物T1-T8與L-半胱氨酸的反應(yīng)式，L-半胱氨酸的巰基與化合物T1-T8在溫和條件下(室溫，中性，水溶液)發(fā)生親核取代反應(yīng)，生成穩(wěn)定的硫醚鍵。[0075]圖13為20°C，pH=7.5時(shí)化合物Tl與L-半胱氨酸混合后不同時(shí)刻的1H-NMR譜圖。(A):1.0 mM 的 Tl ；(B):550.0 ul 1.0 mM 的 Tl (I equiv)與 35.0 ul 100.0 mM 的 L-半胱氨酸(6 equiv)混合后5 min ； (C):混合后30 min ； (D):混合后I h ； (E)混合后2 h。從譜圖中可以看出，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，Tl吡啶環(huán)上氫(1H-NMR δ ppm:8.31)的峰強(qiáng)度逐漸減弱，產(chǎn)物吡啶環(huán)上氫(1H-NMR δ ppm:7.40)的峰強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，2 h后，反應(yīng)完全。
[0076]圖14為20°C，pH=7.5時(shí)化合物T2與L-半胱氨酸混合后不同時(shí)刻的1H-NMR譜圖。(A):1.0 mM 的 T2 ；(B):550.0 ul 1.0 mM 的 T2 (I equiv)與 35.0 ul 100.0 mM 的 L-半胱氨酸(6 equiv)混合后5 min ； (C):混合后30 min ； (D):混合后I h ； (E)混合后3 h。從譜圖中可以看出，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，T2吡啶環(huán)上氫(1H-NMR δ ppm:8.11)的峰強(qiáng)度逐漸減弱，產(chǎn)物吡啶環(huán)上氫(1H-NMR δ ppm:7.40)的峰強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，混合3 h后，反應(yīng)基本進(jìn)行完全。
[0077]圖15為20°C，pH=7.5時(shí)化合物T3與L-半胱氨酸混合后不同時(shí)刻的1H-NMR譜圖。(A):1.0 mM 的 T3 ；(B):550.0 ul 1.0 mM 的 T3 (I equiv)與 35.0 ul 100.0 mM 的 L-半胱氨酸(6 equiv)混合后5 min ； (C):混合后I h ； (D):混合后3 h ； (E)混合后5 h。從譜圖中可以看出，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，T3吡啶環(huán)上氫(1H-NMR δ ppm:7.95)的峰強(qiáng)度逐漸減弱，產(chǎn)物吡啶環(huán)上氫(1H-NMR δ ppm:7.40)的峰強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，混合5 h后，反應(yīng)基本進(jìn)行完全。
[0078]圖16為20°C，pH=7.5時(shí)化合物T4與L-半胱氨酸混合后不同時(shí)刻的1H-NMR譜圖。(A):1.0 mM 的 T4 ；(B):550.0 ul 1.0 mM 的 T4 (I equiv)與 35.0 ul 100.0 mM 的 L-半胱氨酸(6 equiv)混合后5 min; (C):混合后I h; (D):混合后4 h; (E)混合后6 h。從譜圖中可以看出，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，T4吡啶環(huán)上氫(1H-NMR δ ppm:7.90)的峰強(qiáng)度逐漸減弱，產(chǎn)物吡啶環(huán)上氫(1H-NMR δ ppm:7.36)的峰強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，混合6 h后，反應(yīng)基本進(jìn)行完全。
[0079]圖17為20°C，pH=7.5時(shí)化合物T5與L-半胱氨酸混合后不同時(shí)刻的1H-NMR譜圖。(A):1.0 mM 的 T5 ；(B):550.0 ul 1.0 mM 的 T5 (I equiv)與 35.0 ul 100.0 mM 的 L-半胱氨酸(6 equiv)混合后5 min; (C):混合后I h; (D):混合后3 h; (E)混合后6 h。從譜圖中可以看出，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，T5吡啶環(huán)上氫(1H-NMR δ ppm:8.15)的峰強(qiáng)度逐漸減弱，產(chǎn)物吡啶環(huán)上氫(1H-NMR δ ppm:7.36)的峰強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，混合6 h后，反應(yīng)進(jìn)行48.1%，反應(yīng)速率明顯比Tl、T2、T3、T4低。
[0080]圖18為20°C，pH=7.5時(shí)化合物T6與L-半胱氨酸混合后不同時(shí)刻的1H-NMR譜圖。(A):1.0 mM 的 T6 ；(B):550.0 ul 1.0 mM 的 T6 (I equiv)與 35.0 ul 100.0 mM 的 L-半胱氨酸(6 equiv)混合后5 min;(C):混合后I h;(D):混合后3 h;(E)混合后5 h。從譜圖中可以看出，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，T6吡啶環(huán)上氫(1H-NMR δ ppm:8.28)的峰強(qiáng)度逐漸減弱，產(chǎn)物吡啶環(huán)上氫(1H-NMR δ ppm:7.77)的峰強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，混合5 h后，反應(yīng)進(jìn)行88.5%。
[0081]圖19為20°C，pH=7.5時(shí)化合物T7與L-半胱氨酸混合后不同時(shí)刻的1H-NMR譜圖。(A):1.0 mM 的 T7 ；(B):550.0 ul 1.0 mM 的 T7 (I equiv)與 35.0 ul 100.0 mM 的 L-半胱氨酸(6 equiv)混合后5 min;(C):混合后I h;(D):混合后3 h;(E)混合后5 h。從譜圖中可以看出，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，T7吡啶環(huán)上氫(1H-NMR δ ppm:8.30)的峰強(qiáng)度逐漸減弱，產(chǎn)物吡啶環(huán)上氫(1H-NMR δ ppm:7.77)的峰強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，混合5 h后，反應(yīng)進(jìn)行87.6%。[0082]圖20為20°C，pH=7.5時(shí)化合物T8與L-半胱氨酸混合后不同時(shí)刻的1H-NMR譜圖。(A):1.0 mM 的 T8 ；(B):550.0 ul 1.0 mM 的 T8 (I equiv)與 35.0 ul 100.0 mM 的 L-半胱氨酸(6 equiv)混合后5 min;(C):混合后I h;(D):混合后3 h;(E)混合后5 h。從譜圖中可以看出，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，T8吡啶環(huán)上氫(1H-NMR δ ppm:8.50)的峰強(qiáng)度逐漸減弱，產(chǎn)物吡啶環(huán)上氫(1H-NMR δ ppm:7.77)的峰強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，混合5 h后，反應(yīng)進(jìn)行67.8%。
[0083]同時(shí)研究了 PyMTA，DPA系列中Tl、T6在pH=7.5條件下與賴氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、甲硫氨酸(Met)、酪氨酸(Tyr)、絲氨酸(Ser)、色氨酸(Trp)、組氨酸(His)的反應(yīng)情況，結(jié)果顯示，混合48 h后，也不發(fā)生反應(yīng)，說明了 T1-T8與L-半胱氨酸反應(yīng)的專一性。
[0084]實(shí)施例3 Tl與蛋白質(zhì)的連接
圖21為Tl與蛋白質(zhì)的連接示意圖，用來連接標(biāo)簽的蛋白質(zhì)是15N標(biāo)記的人體泛素蛋白質(zhì) ubiquitin (Ubi)的突變體:ubiquitin E18C。
[0085]連接過程:(1)配置50 mM的Tl標(biāo)簽溶液:定量稱取，加入MQ超純水，溶液呈無(wú)色。
(2)采集蛋白質(zhì)ubiquitin E18C在ρΗ=7.5時(shí)的1H-15N HSQC譜圖作為空白對(duì)照。(3)向蛋白質(zhì)ubiquitin E18C中加入1.5倍量的1^^?，并調(diào)節(jié)？!1為7.5，放置一段時(shí)間。(4)將蛋白質(zhì)ubiquitin E18C逐滴加入到5_10倍量的標(biāo)簽中，并保證滴加過程及最終pH為7.5左右。(5)采集反應(yīng)不同時(shí)間之后混合物的1H-15N HSQC譜圖，對(duì)反應(yīng)進(jìn)程進(jìn)行檢測(cè)，直到反應(yīng)完全為止。(6)反應(yīng) 完全后，通過roio脫鹽柱進(jìn)行產(chǎn)物分離，將多余的標(biāo)簽與新生成的小分子物質(zhì)除去，若標(biāo)簽無(wú)法除干凈，可以通過陰離子交換柱進(jìn)行分離，最終得到目標(biāo)產(chǎn)物。
[0086]圖22為25°C，pH=6.4條件下，1.0倍量的順磁或逆磁金屬離子分別滴加到0.10 mM的復(fù)合物ubiquitin E18C-T1蛋白質(zhì)中的1H-15N HSQC重疊譜圖，灰色表示加入的逆磁Y3+，黑色表示加入的順磁Tb3+。灰色峰和黑色峰在H維的差值即為贗接觸化學(xué)位移值(PCS)，從譜圖中可以看出，有比較大的PCS。
[0087]可以看出化學(xué)探針Tl通過親核取代反應(yīng)與蛋白質(zhì)進(jìn)行連接，連接產(chǎn)率接近100%。硫醚鍵直接與蛋白質(zhì)連接，增強(qiáng)了標(biāo)簽的剛性，可以廣泛應(yīng)用到熒光能量共振轉(zhuǎn)移和生物核磁研究中，并且硫醚鍵在還原性和高PH條件下非常穩(wěn)定，并能長(zhǎng)期穩(wěn)定存在。
【權(quán)利要求】
1.一種蛋白質(zhì)定點(diǎn)修飾的新方法，其特征是，包括以下步驟: (I)定量稱取合成標(biāo)簽加入到MQ超純水中配置成50 mM的合成標(biāo)簽溶液，(2)向蛋白質(zhì)ubiquitin E18C中加入1.5倍量的TCEP，并調(diào)節(jié)pH為7.5，靜置，(3)將蛋白質(zhì)ubiquitinE18C逐滴加入到5-10倍體積量的合成標(biāo)簽溶液中，并保證滴加過程及最終pH為7.5左右，(4)采集反應(yīng)不同時(shí)間之后混合物的1H-15N HSQC譜圖，對(duì)反應(yīng)進(jìn)程進(jìn)行檢測(cè)，直到反應(yīng)完全為止，(5)反應(yīng)完全后，通過roio脫鹽柱或者陰離子交換柱進(jìn)行產(chǎn)物分離，將多余的標(biāo)簽與新生成的小分子物質(zhì)除去，修飾完成；
其中合成標(biāo)簽包括具有雙功能基團(tuán)的順磁標(biāo)簽Tl、T2、T3、T4、T5、T6、T7和T8，其結(jié)構(gòu)式如下:
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)定點(diǎn)修飾的新方法，其特征是，所述的Tl的合成方法為2，6- 二甲基吡啶通過溴素溴化在吡啶環(huán)3位上一個(gè)溴原子，雙氧水氧化得到吡啶氮氧化物，接著硝化得到第一中間體22，溴化，去氮氧化物，溴代，用NBS進(jìn)行第二次溴代，然后和亞氨基二乙酸二乙酯反應(yīng)生成第二中間體28，最后與苯亞磺酸鈉反應(yīng)，水解得到Tl。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)定點(diǎn)修飾的新方法，其特征是，所述的T2的合成方法為2，6- 二甲基吡啶通過溴素溴化在吡啶環(huán)3位上一個(gè)溴原子，雙氧水氧化得到吡啶氮氧化物，接著硝化得到第一中間體22，溴化，去氮氧化物，溴代，用NBS進(jìn)行第二次溴代，然后和亞氨基二乙酸二乙酯反應(yīng)生成第二中間體28，最后與甲基亞磺酸鈉反應(yīng)，水解得到T2。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)定點(diǎn)修飾的新方法，其特征是，所述的T3的合成方法為2，6- 二甲基吡啶通過溴素溴化在吡啶環(huán)3位上一個(gè)溴原子，雙氧水氧化得到吡啶氮氧化物，接著硝化得到第一中間體22，去氮氧化物，溴代，用NBS進(jìn)行第二次溴代，然后和亞氨基二乙酸二叔丁酯反應(yīng)，最后用三氟乙酸水解得到T3。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)定點(diǎn)修飾的新方法，其特征是，所述的T4的合成方法為白屈氨酸溴化，酯化得到第三中間體36，接著用硼氫化鈉還原，溴代，和亞氨基二乙酸二乙酯反應(yīng)，最后與苯亞磺酸鈉反應(yīng)，水解得到T4。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)定點(diǎn)修飾的新方法，其特征是，所述的T5的合成方法為2，6- 二甲基吡啶通過雙氧水氧化得到吡啶氮氧化物，接著硝化，去氮氧化物得到第四中間體43，用NBS進(jìn)行溴代，然后和亞氨基二乙酸二叔丁酯反應(yīng)，最后用三氟乙酸水解得到T5。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)定點(diǎn)修飾的新方法，其特征是，所述的T6的合成方法為白屈氨酸溴化，酯化得到第三中間體36與苯亞磺酸鈉反應(yīng)，水解得到T6。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)定點(diǎn)修飾的新方法，其特征是，所述的T7的合成方法為白屈氨酸溴化，酯化得到第三中間體36與甲基亞磺酸鈉反應(yīng)，水解得到T7。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)定點(diǎn)修飾的新方法，其特征是，所述的T8的合成方法為2，6- 二甲基吡啶通過雙氧水氧化得到吡啶氮氧化物，接著硝化，去氮氧化物得到第四中 間體43用三氧化鉻氧化得到T8。
【文檔編號(hào)】C07K1/107GK103923161SQ201410173848
【公開日】2014年7月16日 申請(qǐng)日期:2014年4月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月25日
【發(fā)明者】蘇循成, 王金濤, 劉洪開, 裴瑩瑩, 李慶鋒 申請(qǐng)人:南開大學(xué)