一種檸條錦雞兒轉錄因子CkMYB4及其基因的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種新的CkMYB4轉錄因子及其基因。該基因來源于豆科錦雞屬灌木檸條錦雞兒(Caragana?korshinskii?Kom.)，編碼R2R3類MYB轉錄因子。該基因全長cDNA序列1106bp，包括798bp的開放閱讀框，編碼266個氨基酸。利用所克隆到的cDNA序列，構建植物表達載體，轉化野生型擬南芥，獲得了轉基因植物。針對轉基因擬南芥木質素合成酶基因及木質素含量的檢測表明，該基因可以改變植物木質素合成基因的表達以及木質素的含量。
【專利說明】-種朽3條錦雞兒轉錄因子CkMYB4及其基因 【技術領域】
[〇〇〇1] 本發(fā)明涉及一種MYB類轉錄因子。具體的說明，本發(fā)明涉及到一種來源于豆科灌 木植物朽1條錦雞兒（Caragana korshinskii Kom.)的編碼MYB類轉錄因子的基因，命名為 CkMYB4。本發(fā)明還涉及該基因編碼的轉錄因子的氨基酸序列，以及含有這類基因的載體，以 及利用這類基因在木質素基因工程中的應用。 【背景技術】
[0002] 木質素是維管植物中廣泛存在芳香族多聚物，主要由羥基肉桂醇衍生而來，廣泛 分布于維管植物中。維管植物生物量的20% -30%是木質素，是含量僅次于纖維素的第二 大類有機物質，也是最大的一類次生代謝物質。木質素主要存在于植物的次生壁中，它與纖 維素、半纖維素共價結合在一起，增加了細胞壁的強度和剛性，使得植物能夠直立生長；木 質素的疏水性有利于水分的運輸，增強輸導組織強度；此外，木質素能夠幫助植物抵抗病原 菌和微生物、抵抗機械損傷、抵抗紫外福射等。
[0003] 木質素的合成及調控成為植物基因工程研究的熱點，主要是因為以下原因：過高 的木質素影響造紙工業(yè)中的出漿率，化學的方法除去木質素又會造成成本增加和環(huán)境污 染；飼草中木質素含量過高影響牲畜的消化和營養(yǎng)吸收，甚至導致疾病發(fā)生；生物燃料乙 醇生產過程也會因為木質素而導致發(fā)酵效率降低。因此，使植物的木質素含量減少或變得 更容易去除是木質素基因工程的目的。近些年來發(fā)現很多木質素合成調控有關的轉錄因 子，例如負調控木質素合成的AtMYB4,正調控木質素合成的AtMYB58和AtMYB63,以及其它 植物中發(fā)現的相關轉錄因子，這也為木質素調控的基因工程提供了新的研究方向。
[0004] 檸條錦雞兒是一種具有極大生態(tài)價值和經濟價值的灌木，作為豆科植物，同其它 豆科飼草一樣具有很高的營養(yǎng)價值，是我國北方地區(qū)重要的飼草。極強的抗逆性又使得檸 條錦雞兒具備了其它飼用植物沒有的優(yōu)良特性，可以在干旱荒漠地區(qū)進行生態(tài)造林的同時 利用在飼料和工業(yè)生產中去，產生巨大的經濟價值。但是檸條錦雞兒莖桿粗硬，G型木質素 比例過大，使其在工業(yè)制漿及飼用方面的價值受到了影響。
[0005] 本發(fā)明從朽1條錦雞兒（Caragana korshinskii Kom.)克隆得到MYB類轉錄因子， 命名為CkMYB4。構建植物表達載體，在模式植物擬南芥中過量表達該基因后導致轉基因植 物木質素合成酶基因表達量上調、木質素含量升高，說明該轉錄因子可以對植物木質素的 合成進行調控。該基因可能被利用于植物木質素合成基因工程中，對植物木質素合成進行 調控。
【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明提供一個可以對植物木質素合成進行調控的CkMYB4,該基因來源于檸條錦 雞兒（Caragana korshinskii Kom.)，其核苷酸序列和氨基酸序列不于SEQ ID N0 :1和SEQ ID N0 :2。
[0007] 本發(fā)明所提供的CkMYB4來源于檸條錦雞兒，是MYB轉錄因子家族中的一個，具有 SEQID NO :2氨基酸序列的蛋白質，或者是將SEQ ID NO :2氨基酸序列經過一個或者幾個氨 基酸的取代、缺失或者添加且具有與序列表中的蛋白質相同活性的由序列衍生的蛋白質序 列，表中氨基酸殘基序列是由266個氨基酸殘基組成的蛋白質，分子量約29. 87KD，等電點 8. 31，基因全長1106bp，擁有SEQ ID N0:1所示的全長cDNA序列，包括完整讀碼框801bp和 lllbp 的 3'及 194bp 的 5' UTR 區(qū)。
[0008] 本發(fā)明還提供了一種分離的多核苷酸在植物木質素合成基因工程中的應用，其中 所述多核苷酸的序列如SEQ ID No :1所示。其中，植物優(yōu)選為擬南芥。 【專利附圖】

【附圖說明】
[0009] 圖1 :CkMYB4-0E轉基因植物RT-PCR檢測
[0010] 圖2 :CkMYB4-0E轉基因植物T2代株系基因相對表達量 [〇〇11] 圖3轉基因擬南芥中木質素合成酶基因表達檢測
[0012] 圖4 :轉基因擬南芥中木質素含量檢測 【具體實施方式】
[0013] 以下結合【具體實施方式】對本發(fā)明的實驗步驟進行詳細說明：
[0014] 實施例1.檸條錦雞兒CkMYB4基因的克隆
[0015] 取檸條錦雞兒一個月苗齡小苗用于實驗，剪取檸條苗的葉片置于1.5mL離心管 中，液氮速凍，保存于_80°C冰箱備用。利用TRIzole法（Invitrogen)提取樣品總RNA，利 用反轉錄試劑反轉錄獲得cDNA (具體操作見Kit DRR019A，TaKaRa，寶生物工程大連有限公 司）。取上述反轉錄的cDNA產物以以下引物進行巢式PCR。
[0016] MYB4-1ATGGGMMGGTCHCCKTGY
[0017] MYB4-2GTGTTCCARTARTTCTTWATYTCRTTR
[0018] MYB4-3CTCACACAAACAAAGGDGCRT
[0019] MYB4-4TTCCAATAGTTCTTDATYTCRTTRT
[0020] PCR擴增條件：
[0021] MYB4-1、MYB4-2 為引物做第 1 輪 PCR。
[0022]
【權利要求】
1. 一種編碼MYB類轉錄因子的基因 CkMYB4，其核苷酸序列選自SEQIDN0:l所示的核 苷酸序列或在SEQ ID No :1所示的核苷酸序列的基礎上進行一個或者多個核苷酸的保守型 替換、缺失、添加或修飾所得到的具有相同功能的核苷酸序列。
2. 來源于檸條錦雞兒的MYB類轉錄因子CkMYB4,其氨基酸序列選白SEQ ID N〇:2所示 的氨基酸序列或SEQ ID No :2所示的氨基酸序列的基礎上進行一個或者多個氨基酸的保守 型替換、缺失、添加或修飾所得到的具有相同功能的氨基酸序列。
3. 含有權利要求1所述基因的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。
4. 權利要求1所述的基因在植物木質素基因工程中的應用。
5. 權利要求3所述的重組表達載體、表達盒或重組菌在植物木質素基因工程中的應 用。
6. -種分離的多核苷酸在植物木質素合成基因工程中的應用，其中所述多核苷酸的序 列如SEQ ID No :1所示。
7. 根據權利要求6的應用，其特征在于：所述植物為擬南芥。
【文檔編號】C07K14/415GK104087597SQ201410152593
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年4月10日 優(yōu)先權日:2014年4月10日
【發(fā)明者】李國婧, 李高, 王瑞剛, 楊杞, 齊力旺 申請人:內蒙古農業(yè)大學