專利名稱：檸條錦雞兒提取物制備治療和預(yù)防皮膚癬病藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及檸條錦雞兒提取物制備治療和預(yù)防皮膚癬病藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
皮膚癬病是指由皮膚癬菌引起的表皮、毛發(fā)、甲板等組織的淺表性真菌感染，包括手足癬、體股癬、頭癬、甲癬等。皮膚癬病是ー種常見的傳染性皮膚疾病，如果不及時治療，一般會在病損部位擴大，傳染給身體的其它部位，甚至傳染給其他人。全世界約有1/4的人ロ正遭受此病侵?jǐn)_。目前市場上治療皮膚癬病的產(chǎn)品主要有鹽酸特比萘芬、酮康唑、硝酸 咪康唑、硝酸益康唑等，多為化學(xué)合成類藥物、刺激性較大，或毒副作用較大、且易產(chǎn)生耐藥性。因此，研制天然的、無毒無刺激的治療皮膚癬病的藥物將具有重要的現(xiàn)實意義及開發(fā)潛力。朽1條錦雞兒 iCaragana Korshinskii Kom.)是豆科(Iegumiimsae')蝶形花亞科(Tabaceae)錦雞兒屬ifaragana)的ー種多年生落葉灌木。由于朽1條錦雞兒的根系強大、入土深、固沙能力強、抗鹽堿、抗旱，因此是青海、甘肅、內(nèi)蒙等西北地區(qū)用于防風(fēng)固沙、攔泥蓄水、保持水土的優(yōu)勢造林樹種。檸條錦雞兒不僅是ー種被廣泛用于水土保持的生態(tài)植物資源，而且是一種常見的飼料及藥用植物資源。中國專利CN101347180A公開了ー種用檸條生產(chǎn)生物飼料的方法，用該方法生產(chǎn)的檸條飼料具有牛羊增產(chǎn)和改善肉奶品質(zhì)的功效。公開號CN101810701A的中國專利發(fā)明了一種以檸條的花和桃花、白果葉等植物配伍的具有滋陰養(yǎng)血、活血降壓、消除頭痛功效的藥茶。又如公開號CN1382463A的中國專利發(fā)明了ー種以檸條的根和何首烏、羅布麻等植物配伍的用于治療心腦血管疾病的中藥囊劑。然而，將從檸條錦雞兒的種籽中通過超臨界流體萃取法制取得到檸條錦雞兒提取物作為制備用于預(yù)防和治療皮膚癬病藥物中的用途，迄今尚未見有公開報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種檸條錦雞兒提取物制備治療和預(yù)防皮膚癬病藥物中的應(yīng)用。為解決上述問題，本發(fā)明所述的檸條錦雞兒提取物制備治療和預(yù)防皮膚癬病藥物中的應(yīng)用，其特征在于該檸條錦雞兒提取物是指從豆科蝶形花亞科錦雞兒屬檸條錦雞兒種的植物種籽中采用常規(guī)超臨界流體萃取法獲得的提取物，其在治療和預(yù)防皮膚癬病藥物的各種劑型中至少包含有該檸條錦雞兒提取物。所述皮膚癬病是指由犬小孢子菌、須癬毛癬菌、紅色毛癬菌三種常見的皮膚癬菌中的至少ー種感染而引起的病癥。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點
I、本發(fā)明所述檸條錦雞兒提取物是ー種純天然的、植物源的、無毒無刺激的可顯著抑制皮膚癬菌的活性成分。
2、本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明所述檸條錦雞兒提取物對由犬小孢子菌、須癬毛癬菌、紅色毛癬菌三種常見的皮膚癬菌的抑菌活性比檸條錦雞兒籽冷榨油的抑菌活性平均高出3倍。3、麥角留醇是真菌細(xì)胞膜的重要結(jié)構(gòu)組成成分，一旦麥角留醇缺乏，必將引起真菌細(xì)胞膜功能異常，導(dǎo)致真菌細(xì)胞破裂。本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，用本發(fā)明所述檸條錦雞兒提取物干預(yù)的各種皮膚癬菌(真菌)的細(xì)胞膜中，麥角留醇的含量與其生長對照菌相比明顯降低，且具有劑量依賴性，由此可知，檸條錦雞兒提取物是通過影響麥角留醇的生物合成從而達(dá)到抑制皮膚癬菌生長的作用。因此，本發(fā)明所述檸條錦雞兒提取物作為抗皮膚癬病的活性成分，具有良好的抑制皮膚癬菌的作用，并且其功效顯著、作用機理清楚、靶點明確，符合藥物制劑開發(fā)的要求。下述⑴ ⑶中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
下述⑴ ⑶中所用材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述⑴ ⑶中所用的本發(fā)明所述檸條錦雞兒提取物的具體制取方法為將干燥后的檸條錦雞兒種籽粉碎稱重，然后裝料于超臨界萃取裝置(江蘇南通華安超臨界萃取有限公司，HA221-50-06型)的萃取釜中，設(shè)定超臨界的萃取溫度為45°C，萃取壓カ為25MPa，ニ氧化碳流量為40 kg/h,萃取時間為60min。下述⑴ ⑶中所用的檸條錦雞兒籽冷搾油的具體制取方法為將干燥后的檸條錦雞兒種籽粉碎稱重，然后裝料于全自動螺旋搾油機(河南新象機械有限公司，6YL-90型)，設(shè)定榨螺轉(zhuǎn)速為45 r/min，將初榨后的毛油過濾。⑴對犬小孢子菌的抑制活性及作用機制的研究與實驗結(jié)果。最低抑菌濃度MIC值的測定分別準(zhǔn)確稱取檸條錦雞兒提取物和檸條錦雞兒籽冷榨油，分別用ニ甲基亞砜將其溶解制成儲備液。取無菌試管，將儲備液用RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco公司)連續(xù)倍比稀釋至2倍終濃度(4yg/mL)。根據(jù)美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會CLSI推薦的《M38-A實驗方案，將犬小孢子菌iMicrosporum can is, M. cards, 00287,由北京大學(xué)第一附屬醫(yī)》院皮膚科真菌室提供)接種于馬鈴薯培養(yǎng)基(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)上，于28°C恒溫培養(yǎng)(DHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海ー恒科學(xué)儀器有限公司)14天后，用無菌鹽水制備含有犬小孢子菌的菌絲及孢子的菌懸液。分別取100 μ L終濃度的檸條錦雞兒提取物和檸條錦雞兒籽冷榨油的稀釋液，由高濃度到低濃度分別加入到無菌96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的第I孔至第10孔中，并分別加入100 μ L犬小孢子菌懸液，使每ー濃度的受試樣稀釋液和犬小孢子菌懸液分別被1:1稀釋到終濃度。第11孔作為生長對照孔僅加犬小孢子菌懸液100 μ L和培養(yǎng)基100 μし第12孔作為空白對照孔僅加培養(yǎng)基200 μし將接種后的細(xì)胞培養(yǎng)板置于28°C恒溫培養(yǎng)(ZHWY-100B恒溫振蕩培養(yǎng)箱，上海智城分析儀器制造有限公司)，培養(yǎng)14天后，根據(jù)MIC值的判定標(biāo)準(zhǔn)(O :肉眼清晰；1 :略模糊，80%受抑制；2 :濁度顯著降低，50%受抑制；3 :濁度輕度降低；4 :濁度未降低)五個判定點中的I或2作為判定終點，在不攪動的情況下與對照孔對比，可發(fā)現(xiàn)檸條錦雞兒提取物對犬小孢子菌的最低抑菌濃度MIC的范圍值為64飛12 μ g/mL ;檸條錦雞兒籽冷榨油對犬小孢子菌的最低抑菌濃度MIC的范圍值為128 1024 μ g/mL。真菌細(xì)胞顯微形態(tài)觀察在光學(xué)顯微鏡(XDS3C電腦型倒置生物顯微鏡，上海萬衡精密儀器有限公司)下觀察犬小孢子菌干預(yù)前后其細(xì)胞和菌絲的形態(tài)變化，可發(fā)現(xiàn)檸條錦雞兒提取物干預(yù)后犬小孢子菌80%受抑制(參見圖廣2);檸條錦雞兒籽冷搾油干預(yù)后犬小孢子菌50%受抑制(參見圖3)。留醇成分變化的檢測及活性作用機制研究挑取細(xì)胞培養(yǎng)板孔中犬小孢子菌的菌絲，用PBS緩沖液洗滌后精密稱取濕菌O. Ig,加入O. I g/mL KOH的甲醇溶液15mL后于80°C水浴皂化90min，再加石油醚15mL進(jìn)行提取，提取3次后合并提取液，再加入純水15mL萃取分層，取醚層于60°C水浴揮干，得未皂化酷。將未皂化酯用甲醇溶解定容至10ιΛ，0.45μπι濾膜過濾后采用高效液相色譜法(安捷倫1100型，色譜柱4. 6mmX 150mm, 5 μ m ;柱溫30°C ；流動相為色譜甲醇；檢測波長為282nm ;流速為I. OmL/min ;進(jìn)樣量為10 μ L)檢測犬小孢子菌被干預(yù)前后細(xì)胞濾液中麥角留醇含量的變化，其結(jié)果為
犬小孢子菌被干預(yù)前細(xì)胞中的麥角留醇含量為O. 025μ g/10mL (檢測結(jié)果見圖4);檸條錦雞兒提取物干預(yù)后犬小孢子菌細(xì)胞中的麥角甾醇含量為O. 011 μ g/10mL (檢測結(jié)果見圖5);檸條錦雞兒籽冷榨油干預(yù)后犬小孢子菌細(xì)胞中的麥角甾醇含量為O. 023μ g/10mL(檢測結(jié)果見圖6)。 上述實驗結(jié)果表明，檸條錦雞兒提取物對犬小孢子菌這種典型的皮膚癬菌具有明顯的抑制作用，并且該提取物是通過影響犬小孢子菌細(xì)胞中麥角留醇的生物合成從而達(dá)到抑制犬小孢子菌這種典型的皮膚癬菌生長的作用。因此，檸條錦雞兒提取物可用于制備治療和預(yù)防皮膚癬病的藥物。⑵對紅色毛癬菌的抑制活性及作用機制的研究與實驗結(jié)果。最低抑菌濃度MIC值的測定分別準(zhǔn)確稱取檸條錦雞兒提取物和檸條錦雞兒籽冷搾油，采用⑴中的相同方法分別溶解制成儲備液并連續(xù)倍比稀釋至2倍終濃度(4μ g/mL)。根據(jù)美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會CLSI推薦的《M38-A實驗方案》，將紅色毛癬菌{Trichophyton rubrum, T. rubrum, 31441，由北京大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科真菌室提供)接種于馬鈴薯培養(yǎng)基(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)上，于28°C恒溫培養(yǎng)(DHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海ー恒科學(xué)儀器有限公司)14天后，用無菌鹽水制備含有紅色毛癬菌的菌絲及孢子的菌懸液。按照⑴中的相同方法分別將檸條錦雞兒提取物的稀釋液、檸條錦雞兒籽冷搾油的稀釋液和紅色毛癬菌懸液接種于細(xì)胞培養(yǎng)板并培養(yǎng)14天后，根據(jù)MIC值的判定標(biāo)準(zhǔn)(O :肉眼清晰；1 :略模糊，80%受抑制；2 :濁度顯著降低，50%受抑制；3 :濁度輕度降低；4 :濁度未降低)五個判定點中的I或2作為判定終點，在不攪動的情況下與對照孔對比，可發(fā)現(xiàn)檸條錦雞兒提取物對紅色毛癬菌的最低抑菌濃度MIC的范圍值為64 512μ g/mL ;檸條錦雞兒籽冷榨油對紅色毛癬菌的最低抑菌濃度MIC的范圍值為128 1024 μ g/mL。真菌細(xì)胞顯微形態(tài)觀察在光學(xué)顯微鏡(XDS3C電腦型倒置生物顯微鏡，上海萬衡精密儀器有限公司)下觀察紅色毛癬菌干預(yù)前后其細(xì)胞和菌絲的形態(tài)變化，可發(fā)現(xiàn)檸條錦雞兒提取物干預(yù)后紅色毛癬菌80%受抑制(參見圖7 8);檸條錦雞兒籽冷搾油干預(yù)后紅色毛癬菌50%受抑制(參見圖9)。留醇成分變化的檢測及活性作用機制研究挑取細(xì)胞培養(yǎng)板孔中紅色毛癬菌的菌絲，采用⑴中的相同方法檢測紅色毛癬菌被干預(yù)前后細(xì)胞濾液中麥角留醇含量的變化，其結(jié)果為紅色毛癬菌被干預(yù)前細(xì)胞中的麥角甾醇含量為O. 019 μ g/10mL (檢測結(jié)果見圖10);檸條錦雞兒提取物干預(yù)后紅色毛癬菌細(xì)胞中的麥角甾醇含量為O. 005μ g/10mL (檢測結(jié)果見圖11);檸條錦雞兒籽冷榨油干預(yù)后紅色毛癬菌細(xì)胞中的麥角甾醇含量為O. 016μ g/10mL(檢測結(jié)果見圖12)。上述實驗結(jié)果表明，檸條錦雞兒提取物對紅色毛癬菌這種典型的皮膚癬菌具有明顯的抑制作用，并且該提取物是通過影響紅色毛癬菌細(xì)胞中麥角留醇的生物合成從而達(dá)到抑制紅色毛癬菌這種典型的皮膚癬菌生長的作用。因此，檸條錦雞兒提取物可用于制備治療和預(yù)防皮膚癬病的藥物。⑶對須癬毛癬菌的抑制活性及作用機制的研究與實驗結(jié)果。最低抑菌濃度MIC值的測定分別準(zhǔn)確稱取檸條錦雞兒提取物和檸條錦雞兒籽冷搾油，采用⑴中的相同方法分別溶解制成儲備液并連續(xù)倍比稀釋至2倍終濃度(4μ g/mL)。根據(jù)美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會CLSI推薦的《M38-A實驗方案》，將須癬毛癬菌{Trichophyton mentagrophytes, T. mentagrophytes, 60050,由北京大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科真菌室提供)接種于馬鈴薯培養(yǎng)基(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)上，于28°C恒溫培養(yǎng)(DHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海ー恒科學(xué)儀器有限公司)14天后，用無菌鹽水制 備含有須癬毛癬菌的菌絲及孢子的菌懸液。按照⑴中的相同方法分別將檸條錦雞兒提取物的稀釋液、檸條錦雞兒籽冷搾油的稀釋液和須癬毛癬菌懸液接種于細(xì)胞培養(yǎng)板并培養(yǎng)14天后，根據(jù)MIC值的判定標(biāo)準(zhǔn)(O :肉眼清晰；1 :略模糊，80%受抑制；2 :濁度顯著降低，50%受抑制；3 :濁度輕度降低；4 :濁度未降低)五個判定點中的I或2作為判定終點，在不攪動的情況下與對照孔對比，可發(fā)現(xiàn)檸條錦雞兒提取物對須癬毛癬菌的最低抑菌濃度MIC的范圍值為32飛12 μ g/mL ;檸條錦雞兒籽冷榨油對須癬毛癬菌的最低抑菌濃度MIC的范圍值為128 1024 μ g/mL。真菌細(xì)胞顯微形態(tài)觀察在光學(xué)顯微鏡(XDS3C電腦型倒置生物顯微鏡，上海萬衡精密儀器有限公司)下觀察須癬毛癬菌干預(yù)前后其細(xì)胞和菌絲的形態(tài)變化，可發(fā)現(xiàn)檸條錦雞兒提取物干預(yù)后須癬毛癬菌80%受抑制(參見圖13 14);檸條錦雞兒籽冷榨油干預(yù)后須癬毛癬菌50%受抑制(參見圖15)。留醇成分變化的檢測及活性作用機制研究挑取細(xì)胞培養(yǎng)板孔中須癬毛癬菌的菌絲，采用⑴中的相同方法檢測須癬毛癬菌被干預(yù)前后細(xì)胞濾液中麥角留醇含量的變化，其結(jié)果為須癬毛癬菌被干預(yù)前細(xì)胞中的麥角甾醇含量為O. 014μ g/10mL (檢測結(jié)果見圖16);檸條錦雞兒提取物干預(yù)后須癬毛癬菌細(xì)胞中的麥角甾醇含量為O. 002μ g/10mL (檢測結(jié)果見圖17);檸條錦雞兒籽冷榨油干預(yù)后須癬毛癬菌細(xì)胞中的麥角甾醇含量為O. 011 μ g/10mL(檢測結(jié)果見圖18)。上述實驗結(jié)果表明，檸條錦雞兒提取物對須癬毛癬菌這種典型的皮膚癬菌具有明顯的抑制作用，并且該提取物是通過影響須癬毛癬菌細(xì)胞中麥角留醇的生物合成從而達(dá)到抑制須癬毛癬菌這種典型的皮膚癬菌生長的作用。因此，檸條錦雞兒提取物可用于制備治療和預(yù)防皮膚癬病的藥物。4、作為水土保持的優(yōu)勢造林樹種，檸條錦雞兒植物的資源十分豐富，開發(fā)成本低，具有較好的應(yīng)用前景。除了現(xiàn)有的生態(tài)價值和飼用價值以外，本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)既開拓了檸條錦雞兒植物資源的新功效及藥用價值，又豐富了抗皮膚癬病天然活性成分的來源。


下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式
作進(jìn)ー步詳細(xì)的說明。
圖I為本發(fā)明犬小孢子菌被干預(yù)前的細(xì)胞形態(tài)顯微圖。圖2為本發(fā)明檸條錦雞兒提取物對犬小孢子菌干預(yù)后的細(xì)胞形態(tài)顯微圖。圖3為本發(fā)明檸條錦雞兒籽冷榨油對犬小孢子菌干預(yù)后的細(xì)胞形態(tài)顯微圖。圖4為本發(fā)明犬小孢子菌被干預(yù)前的細(xì)胞中麥角甾醇含量HPLC檢測圖。圖5為本發(fā)明檸條錦雞兒提取物對犬小孢子菌干預(yù)后的細(xì)胞中麥角留醇含量HPLC檢測圖。圖6為本發(fā)明檸條錦雞兒籽冷榨油對犬小孢子菌干預(yù)后的細(xì)胞中麥角留醇含量HPLC檢測圖。圖I為本發(fā)明紅色毛癬菌被干預(yù)前的細(xì)胞形態(tài)顯微圖?！D8為本發(fā)明檸條錦雞兒提取物對紅色毛癬菌干預(yù)后的細(xì)胞形態(tài)顯微圖。圖9為本發(fā)明檸條錦雞兒籽冷榨油對紅色毛癬菌干預(yù)后的細(xì)胞形態(tài)顯微圖。圖10為本發(fā)明紅色毛癬菌被干預(yù)前的細(xì)胞中麥角甾醇含量HPLC檢測圖。圖11為本發(fā)明檸條錦雞兒提取物對紅色毛癬菌干預(yù)后的細(xì)胞中麥角留醇含量HPLC檢測圖。圖12為本發(fā)明檸條錦雞兒籽冷榨油對紅色毛癬菌干預(yù)后的細(xì)胞中麥角留醇含量HPLC檢測圖。圖13為本發(fā)明須癬毛癬菌被干預(yù)前的細(xì)胞形態(tài)顯微圖。圖14為本發(fā)明檸條錦雞兒提取物對須癬毛癬菌干預(yù)后的細(xì)胞形態(tài)顯微圖。圖15為本發(fā)明檸條錦雞兒籽冷榨油對須癬毛癬菌干預(yù)后的細(xì)胞形態(tài)顯微圖。圖16為本發(fā)明須癬毛癬菌被干預(yù)前的細(xì)胞中麥角甾醇含量HPLC檢測圖。圖17為本發(fā)明檸條錦雞兒提取物對須癬毛癬菌干預(yù)后的細(xì)胞中麥角留醇含量HPLC檢測圖。圖18為本發(fā)明檸條錦雞兒籽冷榨油對須癬毛癬菌干預(yù)后的細(xì)胞中麥角留醇含量HPLC檢測圖。
具體實施例方式檸條錦雞兒提取物制備治療和預(yù)防皮膚癬病藥物中的應(yīng)用，該檸條錦雞兒提取物是指從豆科蝶形花亞科錦雞兒屬檸條錦雞兒種的植物種籽中采用常規(guī)超臨界流體萃取法獲得的提取物，其在治療和預(yù)防皮膚癬病藥物的各種劑型中至少包含有該檸條錦雞兒提取物。其中皮膚癬病是指由犬小孢子菌、須癬毛癬菌、紅色毛癬菌三種常見的皮膚癬菌中的至少一種感染而引起的病癥。實施例檸條錦雞兒提取物制備治療和預(yù)防皮膚癬病藥物中的應(yīng)用，該檸條錦雞兒提取物以10%的添加量與總添加量為90%的賦形劑(甘油、三乙醇胺等)制備成可治療和預(yù)防皮膚癬病的外用凝膠制劑。該制劑的具體制法為取5 mL甘油加入I g卡波姆置研缽中研磨細(xì)膩后，加入2 4mL蒸餾水使其充分溶脹，然后將10 mL檸條錦雞兒提取物和3 mL吐溫-80混合均勻后，加入到前處理的卡波姆基質(zhì)中，攪拌均勻，加入2 mL三乙醇胺，調(diào)至pH6. 8^7. 2，再加蒸餾水至100 mL，即制成凝膠制劑。
上述實施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步詳細(xì)說明，但不意味著對本發(fā)明的任何限制。在不脫離本發(fā)明上述思想的情況下，根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)知識和常規(guī) 手段做出的各種替換方式或變更，均包含在本發(fā)明之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.檸條錦雞兒提取物制備治療和預(yù)防皮膚癬病藥物中的應(yīng)用，其特征在干該檸條錦雞兒提取物是指從豆科蝶形花亞科錦雞兒屬檸條錦雞兒種的植物種籽中采用常規(guī)超臨界流體萃取法獲得的提取物，其在治療和預(yù)防皮膚癬病藥物的各種劑型中至少包含有該檸條錦雞兒提取物。
2.如權(quán)利要求I所述的檸條錦雞兒提取物制備治療和預(yù)防皮膚癬病藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述皮膚癬病是指由犬小孢子菌、須癬毛癬菌、紅色毛癬菌三種常見的皮膚癬菌中的至少ー種感染而引起的病癥。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檸條錦雞兒提取物制備治療和預(yù)防皮膚癬病藥物中的應(yīng)用,其特征在于該檸條錦雞兒提取物是指從豆科蝶形花亞科錦雞兒屬檸條錦雞兒種的植物種籽中采用常規(guī)超臨界流體萃取法獲得的提取物，其在治療和預(yù)防皮膚癬病藥物的各種劑型中至少包含有該檸條錦雞兒提取物。本發(fā)明中的檸條錦雞兒提取物是可顯著抑制犬小孢子菌、須癬毛癬菌、紅色毛癬菌三種常見的皮膚癬菌的活性成分。
文檔編號A61P17/00GK102772477SQ20121029841
公開日2012年11月14日 申請日期2012年8月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月21日
發(fā)明者周昌范, 尤進(jìn)茂, 強偉, 王小艷, 王洪倫, 索有瑞 申請人:中國科學(xué)院西北高原生物研究所