專利名稱：復方免疫增強劑、禽用滅活疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及復方免疫增強劑、禽用滅活疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
畜禽各類傳染病的滅活疫苗，對防控這些疫病發(fā)揮了重要作用。使用滅活疫苗希望能夠達到消除性免疫，即在接受某種疫苗免疫后，完全保護機體免受此類疫病的感染發(fā)發(fā)病，或者在感染后不排毒，不將病毒傳播給其它動物。但現(xiàn)有疫苗在應用中仍存在一定的缺陷,疫苗質(zhì)量有待于進一步改善。這些缺陷包括以下方面?，F(xiàn)有滅活疫苗免疫機體后抗體產(chǎn)生較慢，抗體持續(xù)期較短，抗體水平整齊度差。常 規(guī)滅活疫苗免疫后3周，才能對同型病毒的攻擊提供保護。由于動物個體間的抗體水相差較大，導致群體抗體離散度大。在規(guī)?；B(yǎng)殖條件下，群體中少部分動物因抗體水平較低而發(fā)病，可能會波及整群發(fā)病，帶來災難性的后果。臨床生產(chǎn)中常規(guī)疫苗抗體持續(xù)期約為3-4個月。為了使抗體水平整齊度較好，同時使維持較高的抗體水平，一般需多次免疫。這將加大人力投入，同時增加對動物的應激反應，影響生產(chǎn)性能和飼料報酬。通常，獸用滅活疫苗配制中抗原用量較多。一方面，疫苗抗原純化工藝不成熟，表現(xiàn)在疫苗抗原中雜蛋白較多，導致副反應較大。另外一方面，現(xiàn)有禽用滅活多聯(lián)疫苗在配制時需進行抗原濃縮，以保證疫苗中的抗原含量和疫苗的免疫效果，但增加疫苗的生產(chǎn)成本。臨床生產(chǎn)亟需通過合適的技術(shù)方法，在保證較好的抗體水平情況下，有效降低抗原用量，降低副反應。禽用細菌滅活苗存在免疫原性較弱，激發(fā)機體產(chǎn)生抗體效價低等缺陷。由副雞嗜血桿菌為抗原制備的雞傳染性鼻炎疫苗也存在此類缺陷。但單純從提高由副雞嗜血桿菌抗原量來提高抗體效價，不但使得生產(chǎn)成本提高，也導致疫苗副反應增大，難以吸收。臨床應用中需要一種技術(shù)克服以上缺點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種復方免疫增強劑，該復方免疫增強劑能夠縮短現(xiàn)有疫苗免疫窗口期，顯著提高抗體效價，提高抗體整齊度，延長抗體持續(xù)期，有效降低抗原用量和產(chǎn)生消除性免疫。本發(fā)明的目的之二是提供復方免疫增強劑的制備方法，該方法簡單易操作。本發(fā)明的目的之三是提供禽用疫苗，該禽用疫苗含有上述復方免疫增強劑，疫苗的免疫窗口期縮短，抗體效價高，抗體整齊度高，抗體持續(xù)期長，抗原用量降低，并且能夠產(chǎn)生消除性免疫。本發(fā)明的目的之四是提供所述禽用疫苗的制備方法，該方法簡單易操作。采用如下技術(shù)方案實現(xiàn)實現(xiàn)上述目的
一種復方免疫增強劑，含有0. 5 100 u g/mL的含CpG基序的核酸序列、0. 5 1000V- g/mL的a -半乳糖基神經(jīng)酰胺、5 2000 u g /mL的P -葡聚糖和5 2000 u g /mL的左旋咪唑，所述含CpG基序的核酸序列如SEQ ID NO. I所示。該復方免疫增強劑含有0. 5 5 i! g/mL的含CpG基序的核酸序列、0. 5 100 y g/mL的a -半乳糖基神經(jīng)酰胺、5 200 u g/mL的P -葡聚糖和5 10 y g/mL的左旋咪唑。該復方免疫增強劑含有5 IOOii g/mL的含CpG基序的核酸序列、100 1000 ii g/mL的a -半乳糖基神經(jīng)酰胺、200 2000 u g /mL的P -葡聚糖和10 2000 u g /mL的左旋咪唑。一種制備所述復方免疫增強劑的方法，包括下述步驟
(1)配制水相溶液在磷酸鹽緩沖液中加入含CpG基序的核酸序列、a-半乳糖基神經(jīng)酰胺、P -葡聚糖和左旋咪唑，然后加入吐溫-80，配制成水相溶液；
(2)配制油相溶液在白油中加入司盤-80配制成油相溶液；將所述水相溶液與油相溶·液充分混合，即得所述復方免疫增強劑。所述禽用疫苗含有0. 5 100 u g/mL的含CpG基序的核酸序列、0. 5 1000 u g/mL的a -半乳糖基神經(jīng)酰胺、5 2000 u g/mL的P -葡聚糖、5 2000 u g /mL的左旋咪唑和滅活疫苗抗原；所述含CpG基序的核酸序列如SEQ ID NO. I所示。所述禽用疫苗優(yōu)選含有0. 5 5 ii g/mL的含CpG基序的核酸序列、0. 5 100 y g/mL的a -半乳糖基神經(jīng)酰胺、5 200 u g /mL的P -葡聚糖和5 10 y g/mL的左旋咪唑和滅活疫苗抗原。所述禽用疫苗優(yōu)選含有5 IOOii g/mL的含CpG基序的核酸序列、100 1000 Ii g/mL的a -半乳糖基神經(jīng)酰胺、200 2000 u g /mL的P -葡聚糖和10 2000 u g/mL的左旋咪唑和滅活疫苗抗原。所述禽用疫苗為H9亞型禽流感疫苗或新城疫、傳染性支氣管炎、H9亞型禽流感、產(chǎn)蛋下降綜合癥四聯(lián)滅活疫苗或新城疫、傳染性支氣管炎、傳染性法氏囊三聯(lián)滅活疫苗或雞傳染性鼻炎滅活疫苗。一種制備所述禽用疫苗的方法，包括下述步驟
(1)在磷酸鹽緩沖液中加入含CpG基序的核酸序列、a-半乳糖基神經(jīng)酰胺、P -葡聚糖和左旋咪唑，然后加入吐溫-80，配制成水相溶液；
(2)在所述水相溶液中加入滅活疫苗抗原，混勻后得到滅活抗原溶液；
(3)在白油中加司盤-80配制成油相溶液；
(4)將所述滅活抗原溶液與油相溶液充分混合，即得所述復方免疫增強劑。有益效果本發(fā)明復方免疫增強劑，由于其各成分的協(xié)同作用，使疫苗的免疫窗口期縮短，顯著提高抗體效價，延長抗體持續(xù)期，產(chǎn)生針對同型毒株攻毒提供消除性免疫保護，降低抗原用量。本發(fā)明復方免疫增強劑與H9亞型禽流感滅活疫苗混合使用免疫雞，與常規(guī)疫苗比較，抗體產(chǎn)生提前2周，即免疫窗口期縮短2周，將抗體持續(xù)期延長8周。本發(fā)明復方免疫增強劑與1/10的H9亞型禽流感滅活疫苗抗原配伍使用即可達到與H9亞型禽流感常規(guī)疫苗的免疫效果。本發(fā)明含有該復方免疫增強劑的H9亞型禽流感滅活疫苗能夠提供消除性免疫。本發(fā)明提供的復方免疫增強劑亦對新城疫、傳染性支氣管炎、H9亞型禽流感、產(chǎn)蛋下降綜合癥四聯(lián)滅活疫苗和新城疫、傳染性支氣管炎、傳染性法氏囊三聯(lián)滅活疫苗中的各抗原均有顯著免疫增強作用。本發(fā)明提供的復方免疫增強劑亦對細菌性滅活疫苗雞傳染性鼻炎滅活疫苗具有顯著免疫增強作用。本發(fā)明所述禽用疫苗的制備方法，簡單易操作。


圖I顯示各組免疫后血清針對H9檢測抗原的HI抗體效價。圖2顯示各組免疫后針對H9檢測抗原的HI抗體持續(xù)期。圖3顯示各組免疫后針對H9檢測抗原的HI抗體效價
圖4顯示免疫后4周各免疫組對ND、IB、H9和EDS檢測抗原的抗體效價。 圖5顯示免疫后4周各免疫組針對三聯(lián)苗中的ND和IB檢測抗原的抗體。圖6顯示免疫后4周各免疫組針對三聯(lián)苗中的IBD檢測抗原的抗體。圖7免疫后4周各免疫組對雞傳染性鼻炎的抗體效價。
具體實施例方式實施例I復方免疫增強劑、禽用疫苗的配制 (I) 試驗材料
含CpG基序的核酸序列如SEQ ID NO. I所示，具體為5’ - GTTCCTGACGTTGGTGCATCGATGCAGGGGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTGGGGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTGGGGGGTCGTCGTITTGTCGITITGTCGITGGGGGGGCTAGACGTTAGCGT-3’，由。葡聚糖，a -半乳糖基神經(jīng)酰胺(a -galactosylceramide,簡稱 a-GC)購自 Invivogen。左旋咪唑購自 SIGMA 公司。白油購自法國埃索公司，吐溫-80和司盤-80購自廣東肇慶超能實業(yè)有限公司。配制磷酸鹽緩沖液的無機鹽購自國藥集團化學試劑有限公司。(2) 試驗方法
①_備復方免疫增強劑
水相溶液的配制首先配制磷酸鹽(PBS)緩沖液，含I. 44g/L的Na2HPO4，I. 44g/L的KH2PO4，8g/L的NaCl，0. 2g/L的KCl，pH為7. 0，滅菌后備用。然后在所述PBS緩沖液中加入含CpG基序的核酸序列、a -GC、P -葡聚糖和左旋咪唑，經(jīng)混勻后加入吐溫-80，配制成水相溶液，所述吐溫-80在水相溶液的體積百分含量為4%。其中含CpG基序的核酸序列、a -GC、^ -葡聚糖和左旋咪唑均是免疫增強劑。油相溶液的配制在白油中加入司盤-80，配制成油相溶液。司盤-80在油相溶液中的體積百分含量為4%。將所述水相溶液和油相溶液按照體積比為1:3混合均勻，即得到復方免疫增強劑。該復方免疫增強劑，含有0.5 100 U g/mL的含CpG基序的核酸序列、0.5 1000V- g/mL的a -半乳糖基神經(jīng)酰胺、5 2000 u g /mL的P -葡聚糖和5 2000 u g /mL的左旋咪唑，所述含CpG基序的核酸序列如SEQ ID NO. I所示。該復方免疫增強劑的優(yōu)選配方為含有0.5 g/mL的含CpG基序的核酸序列、0. 5 100 V- g/mL的a -半乳糖基神經(jīng)酰胺、5 200 u g/mL的P -葡聚糖和5 10 y g/mL的左旋咪唑。該復方免疫增強劑的另一優(yōu)選配方為含有5 100 y g/mL的含CpG基序的核酸序列、100 1000 Ii g/mL的Ct -半乳糖基神經(jīng)酰胺、200 2000 ii g /mL的3 -葡聚糖和10 2000 u g /mL的左旋咪唑。(D禽用疫苗及其配制方法
禽用疫苗，含有0.5 IOOii g/mL的含CpG基序的核酸序列、0. 5 1000 y g/mL的a -半乳糖基神經(jīng)酰胺、5 2000 u g/mL的P -葡聚糖、5 2000 u g /mL的左旋咪唑和滅活疫苗抗原；所述含CpG基序的核酸序列如SEQ ID NO. I所示。禽用疫苗優(yōu)選配方，含有0. 5 g 5 g/mL的含CpG基序的核酸序列、0. 5 100 u g /mL的a -半乳糖基神經(jīng)酰胺、5 200 u g /mL的P -葡聚糖、5 10 y g/mL的左旋咪唑和滅活疫苗抗原。禽用疫苗另一優(yōu)選配方，含有5 100 V- g/mL的含CpG基序的核酸序列、100 1000 ii g/mL的a -半乳糖基神經(jīng)酰胺、200 2000 ii g /mL的P -葡聚糖、10 2000 y g /mL的左旋咪唑和滅活疫苗抗原。 該禽用疫苗含有上述復方免疫增強劑。為了與現(xiàn)有疫苗相區(qū)分，以下實施例中將該禽用疫苗均稱為含有復方免疫增強劑的禽用疫苗。所述禽用疫苗為H9亞型禽流感疫苗或新城疫、傳染性支氣管炎、H9亞型禽流感、產(chǎn)蛋下降綜合癥四聯(lián)滅活疫苗或新城疫、傳染性支氣管炎、傳染性法氏囊三聯(lián)滅活疫苗或雞傳染性鼻炎滅活疫苗。制備禽用疫苗的方法
第一種方法，配制母液，所述母液的成分與所述復方免疫增強劑相同，所述母液中含CpG基序的核酸序列、a-GC、￠-葡聚糖和左旋咪唑濃度為禽用疫苗中相應物質(zhì)濃度的10倍；將所述母液與現(xiàn)有疫苗按照體積比為1:9混合均勻，即得到禽用疫苗。飼養(yǎng)戶在實際操作過程中，能夠?qū)⒃搹头矫庖咴鰪妱┡c各種現(xiàn)有疫苗混合使用，操作方便，靈活。第二種方法，包括如下步驟(I)配制水相溶液在磷酸鹽緩沖液中加入含CpG基序的核酸序列、a -GC、^ -葡聚糖和左旋咪唑，然后加入吐溫-80，配制成水相溶液；所述吐溫-80在水相溶液的體積百分含量為4%。(2)在所述水相溶液中加入滅活疫苗抗原，混勻后得到滅活抗原溶液；(3)配制油相溶液在白油中加入司盤-80，配制成油相溶液，司盤-80在油相溶液的體積百分含量為4% ；(4)將所述滅活抗原溶液與油相溶液按照體積比為1:3充分混合，即得禽用疫苗。這種方法，對于疫苗生產(chǎn)企業(yè)來說，操作更加的方便易行。采用上述兩種方法制備的相同配方的禽用疫苗，在免疫效果上相同。特別列舉出兩種方法，是為了滿足不同用戶操作方便的需要。配制禽用疫苗①H9亞型禽流感疫苗②新城疫、傳染性支氣管炎、H9亞型禽流感、產(chǎn)蛋下降綜合癥四聯(lián)滅活疫苗⑤新城疫、傳染性支氣管炎、傳染性法氏囊三聯(lián)滅活疫苗④雞傳染性鼻炎滅活疫苗。各種禽用疫苗分別配制三種配方禽用疫苗A、B和C。禽用疫苗A含有0. g /mL的含CpG基序的核酸序列、0. 5 ii g/mL的a_GC、5iig/mL的P -葡聚糖和5 u g/mL的左旋咪唑和滅活疫苗抗原，將禽用疫苗A簡稱為A-VA2。禽用疫苗B含有5 U g/mL的含CpG基序的核酸序列、100 U g/mL的a -GC, 200 U g/mL的P -葡聚糖和10 u g/mL的左旋咪唑和滅活疫苗抗原，將禽用疫苗B簡稱為B-VA2。禽用疫苗C含有100 ii g/mL的含CpG基序的核酸序列、lmg/mL的a -GC、2mg/mL的3 -葡聚糖和2mg/mL的左旋咪唑和滅活疫苗抗原，將禽用疫苗C簡稱為C-VA2。本實施例中，免疫增強劑的各組分可以在給出的配比范圍內(nèi)靈活進行組合，在此不例舉。實施例2復方免疫增強劑對H9亞型禽流感疫苗免疫效力和抗體持續(xù)期的影響 (I)試驗材料
H9亞型禽流感疫苗和H9亞型禽流感標準檢測抗原均購自南京天邦生物科技有限公司。制苗用白油購自法國埃索公司(Esso, Marcol 52)，吐溫-80和司盤-80購自廣東肇慶超能實業(yè)有限公司。無特定病原體(Specific Pathogen Free, SPF)雞系從北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司購買雞胚，經(jīng)自行孵化后于隔離器內(nèi)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)至28日齡待用。采用現(xiàn)有的H9亞型禽流感疫苗，按照實施例I第一種方法制備含復方免疫增強劑 的 H9 亞型禽流感疫苗 A-VA2、B-VA2 和 C-VA2，分別縮寫為 A-VA2-H9、B-VA2-H9、C-VA2-H9。為了證明本發(fā)明復方免疫增強劑包含的四種免疫增強劑之間存在協(xié)同效應，參照實施例I中配制禽用疫苗的方法(先配制含單一免疫增強劑的油乳劑，然后將其與H9亞型禽流感疫苗混合)，配制含單一免疫增強劑成分H9亞型禽流感疫苗僅含100 U g/mL含CpG基序的核酸序列的H9亞型禽流感單苗，簡稱為CpG-H9 ;僅含lmg/mL a -GC的H9亞型禽流感單苗，簡稱為a -GC-H9 ;僅含2mg/mL ^ -葡聚糖的H9亞型禽流感單苗，簡稱為P -葡聚糖-H9 ;僅含2mg/mL左旋咪唑的H9亞型禽流感單苗，簡稱為左旋咪唑-H9。(2)試驗方法
免疫和分組根據(jù)《獸用生物制品質(zhì)量標準匯編(2006-2008)》，簡稱“規(guī)程”，4周齡雞免疫0. 3mL/雞，5周齡以上的雞按0. 5mL/雞免疫，免疫途徑為肌肉或皮下注射。本次試驗取35日齡雞，經(jīng)頸部皮下途徑按0. 5mL/雞免疫，設(shè)立含復方免疫增強劑的A-VA2-H9、B-VA2-H9和C-VA2-H9疫苗組；含單一免疫增強劑成分的H9亞型禽流感疫苗組，包括CpG-H9、a -GC-H9、^ -葡聚糖-H9和左旋咪唑_H9，H9亞型禽流感疫苗組(免疫現(xiàn)有疫苗，縮寫為H9常規(guī)苗組)、以及空白對照組(不免疫)，共9組，各疫苗免疫組設(shè)40只雞/組，空白對照組20只雞。(3)復方免疫增強劑對H9亞型禽流感疫苗免疫效力的影響
①采血和抗體效價檢測免疫后第2周和第4周經(jīng)靜脈采血，分離血清，用H9亞型禽流感標準檢測抗原，采用微量血凝抑制試驗(HI)檢測血清抗體效價，HI檢測方法參考2010年版《中國獸藥典》。根據(jù)每組雞的幾何平均抗體效價(GMT)和方差(SD)，比較復方免疫增強劑對現(xiàn)有H9亞型禽流感疫苗的免疫增強效果。@ 結(jié)果
在免疫后2周，含復方免疫增強劑的疫苗組的抗體效價高于常規(guī)疫苗效價至少
I.51og2，高于規(guī)程要求的常規(guī)疫苗免疫后4周的合格抗體效價(71og2)。即含復方免疫增強劑的疫苗能將免疫窗口期縮短2周。含復方免疫增強劑疫苗組的抗體效價亦高于含單一免疫增強劑成分H9亞型疫苗組的抗體效價。同時，可以看出復方免疫增強劑顯著提高了 H9亞型禽流感疫苗(現(xiàn)有疫苗)免疫后的抗體效價，大于單一免疫增強劑對H9亞型禽流感疫苗抗體效價提高之和，也就是說復方免疫增強劑包含的各免疫增強劑之間存在協(xié)同效應。免疫后4周，含免疫復方增強劑的疫苗組的抗體效價均高于常規(guī)疫苗組抗體效價，含免疫復方增強劑疫苗組之間的幾何平均抗體效價相當，遠高于常規(guī)疫苗抗體效價，亦高于含單一免疫增強劑成分的H9亞型疫苗組的抗體效價。經(jīng)Two-Way ANOVA分析，表明含復方免疫增強劑疫苗的抗體效價與常規(guī)疫苗組抗體效價比較，差異顯著(P < 0. 05)，在圖I中以*表示。含復方免疫增強劑的疫苗在免疫后產(chǎn)生的抗體離散度小于常規(guī)苗。即，含免疫增強劑疫苗免疫后抗體效價整齊度優(yōu)于常規(guī)疫苗。詳見圖I。同時，可以看出，復方免疫增強劑顯著提高了 H9亞型禽流感疫苗(現(xiàn)有疫苗)免疫后的抗體效價，大于單一免疫增強劑對H9亞型禽流感疫苗免疫后抗體效價提高之和，也就是說復方免疫增強劑包含的各免疫增強劑之間存在協(xié)同效應。試驗結(jié)果表明，不同劑量的復方免疫增強劑配方均能提高H9亞型禽流感疫苗抗體效價，具有明顯的免疫增強作用，與常規(guī)疫苗相比較能縮短免疫窗口期，含復方免疫增強劑疫苗組的抗體離散度遠小于常規(guī)疫苗離散度，即，抗體整齊度優(yōu)于常規(guī)疫苗。結(jié)果提示，各免疫增強劑成分經(jīng)合適搭配之后成為復方佐劑，具有顯著的協(xié)同增強作用。(4)復方免疫增強劑對H9亞型禽流感疫苗的抗體持續(xù)期的影響 ①乂血和抗體效價檢測免疫后第2、4、8、12、16、20、24和28周經(jīng)靜脈采血，分離血清，用H9亞型禽流感標準檢測抗原，采用微量血凝抑制試驗(HI)檢測血清抗體效價。②結(jié)果和結(jié)論
從免疫后2周開始檢測抗體，含復方免疫增強劑的H9亞型禽流感疫苗在免疫后的抗體均高于常規(guī)疫苗組，達到“規(guī)程”要求的71og2以上。A-VA2-H9疫苗組在免疫后4 20周抗體效價在81og2以上，直至第20周抗體效價低于7 log2。B-VA2-H9疫苗組在免疫后4 20周抗體效價在91og2以上，直至第28周抗體效價低于7 log2。C-VA2-H9疫苗組在免疫后4^20周抗體效價均在91og2以上，直至第28周抗體效價低于7 log2。而常規(guī)疫苗免疫后僅在第4周到第12周抗體效價維持在71og2以上，此后抗體效價持續(xù)下降，至第28周時抗體效價為5. 321og2。含單一免疫增強劑成分的H9亞型禽流感疫苗，其抗體持續(xù)期與常規(guī)疫苗無明顯差異，遠短于含復方免疫增強劑成分H9亞型禽流感疫苗組。詳見圖2。試驗結(jié)果表明，本發(fā)明中的復方免疫增強劑能縮短現(xiàn)有H9亞型禽流感疫苗免疫窗口期2周，提高H9亞型禽流感疫苗抗體效價，并在后續(xù)的抗體持續(xù)期中比常規(guī)疫苗維持較高的效價長達4-8周，具有顯著的免疫增強作用。含復方免疫增強劑成分H9亞型禽流感疫苗組其抗體持續(xù)期遠優(yōu)于含單一免疫增強劑成分的H9亞型禽流感疫苗，各免疫增強劑成分經(jīng)合適搭配之后，具有顯著的協(xié)同效應。(4)復方免疫增強劑對同型H9亞型禽流感攻毒后抑制排毒的影響
①攻毒和排毒檢測免疫后第4周，從各組取一半的雞用于攻毒。即，各疫苗免疫組20只，空白對照組10只。攻毒毒株為H9亞型禽流感病毒NJ/02株，購自南京天邦生物科技有限公司。攻毒劑量為107_%ID5(I (雞胚半數(shù)感染量)/0. lmL，經(jīng)點眼滴鼻途徑攻毒。攻毒后第3天、5天、7天和10天，分別從喉氣管和泄殖腔采取棉拭子。將此棉拭子浸于含5%小牛血清和5000U卡那霉素及5000U慶大霉素的PBS (pH7. 0)中。每一棉拭經(jīng)擠壓后，12000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘。將離心所得上清液按0. ImL/胚，接種10日齡SPF雞胚，每一棉拭子樣品接種3枚雞胚，用于分離病毒。雞胚接種后，置37°C溫箱中，每天照胚2次，棄去24小時內(nèi)死亡的雞胚，觀察至接種后120小時,及時將死亡雞胚取出，檢測血凝(Heamagglutinin,HA)效價。以3個胚中的I個或以上測出HA效價高于41og2者判為病毒分離陽性。@結(jié)果和結(jié)論
在攻毒后第3天、5天、7天和10天的喉氣管和泄殖腔棉拭子樣品檢測中，含復方免疫增強劑的疫苗組均未分離到病毒。而常規(guī)疫苗免疫組和含免疫增強劑單一成分疫苗組在攻毒后第3天、5天、7天從部分免疫雞的喉氣管分離到病毒，泄殖腔則在攻毒后第3天、5天分離到病毒。未免疫的所有對照雞在攻毒后第3天、5天、7天從喉氣管和泄殖腔均能分離到病毒，在攻毒后第10天，從部分雞喉氣管和泄殖腔均能分離到病毒。詳見表I。試驗結(jié)果表明，本發(fā)明中的復方免疫增強劑能對與疫苗抗原相同的病毒攻擊完全抑制排毒，即可提供消除性免疫保護，這為將來某類傳染病的消滅提供有力的技術(shù)支持。含復方免疫增強劑疫苗組在抑制排毒的能力方面遠優(yōu)于單一免疫增強劑成分疫苗。表I不同免疫組在攻毒后的病毒分離率
權(quán)利要求
1.一種復方免疫增強劑，其特征在于該復方免疫增強劑含有O. 5 100 μ g/mL的含CpG基序的核酸序列、O. 5 1000 μ g/mL的α -半乳糖基神經(jīng)酰胺、5 2000 μ g /mL的β -葡聚糖和5 2000 μ g /mL的左旋咪唑，所述含CpG基序的核酸序列如SEQ ID NO. I所
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的復方免疫增強劑，其特征在于該復方免疫增強劑含有O.5 5μ g/mL的含CpG基序的核酸序列、O. 5 100 μ g/mL的α -半乳糖基神經(jīng)酰胺、5 200 μ g/mL的β -葡聚糖和5 10 μ g/mL的左旋咪唑。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的復方免疫增強劑，其特征在于該復方免疫增強劑含有5 100 μ g/mL的含CpG基序的核酸序列、100 1000 μ g/mL的α -半乳糖基神經(jīng)酰胺、200 2000 μ g /mL的β -葡聚糖和10 2000 μ g /mL的左旋咪唑。
4.一種制備權(quán)利要求I所述復方免疫增強劑的方法，包括下述步驟 配制水相溶液在磷酸鹽緩沖液中加入含CpG基序的核酸序列、α -半乳糖基神經(jīng)酰胺、β -葡聚糖和左旋咪唑，然后加入吐溫-80，配制成水相溶液； 配制油相溶液在白油中加入司盤-80配制成油相溶液；將所述水相溶液與油相溶液充分混合，即得所述復方免疫增強劑。
5.一種禽用疫苗，其特征在于所述禽用疫苗含有O. 5 100 μ g/mL的含CpG基序的核酸序列、O. 5 1000 μ g/mL的α -半乳糖基神經(jīng)酰胺、5 2000 μ g/mL的β _葡聚糖、5 2000 μ g /mL的左旋咪唑和滅活疫苗抗原；所述含CpG基序的核酸序列如SEQ ID NO. I所
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述禽用疫苗，其特征在于含有O.5 5 μ g/mL的含CpG基序的核酸序列、O. 5 100 μ g /mL的α -半乳糖基神經(jīng)酰胺、5 200 μ g /mL的β_葡聚糖和5 10 μ g/mL的左旋咪唑和滅活疫苗抗原。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述禽用疫苗，其特征在于含有5 100μ g/mL的含CpG基序的核酸序列、100 1000 μ g/mL的α -半乳糖基神經(jīng)酰胺、200 2000 μ g /mL的β _葡聚糖和10 2000 μ g /mL的左旋咪唑和滅活疫苗抗原。
8.根據(jù)權(quán)利要求5或6或7所述禽用疫苗，其特征在于所述禽用疫苗為H9亞型禽流感疫苗或新城疫、傳染性支氣管炎、H9亞型禽流感、產(chǎn)蛋下降綜合癥四聯(lián)滅活疫苗或新城疫、傳染性支氣管炎、傳染性法氏囊三聯(lián)滅活疫苗或雞傳染性鼻炎滅活疫苗。
9.一種制備權(quán)利要求5所述禽用疫苗的方法，包括下述步驟 (1)在磷酸鹽緩沖液中加入含CpG基序的核酸序列、α-半乳糖基神經(jīng)酰胺、β -葡聚糖和左旋咪唑，然后加入吐溫-80，配制成水相溶液； (2)在所述水相溶液中加入滅活疫苗抗原，混勻后得到滅活抗原溶液； (3)在白油中加司盤-80配制成油相溶液； (4)將所述滅活抗原溶液與油相溶液充分混合，即得所述復方免疫增強劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及復方免疫增強劑及其在制備獸用疫苗中的應用。復方免疫增強劑含有0.5～100μg/mL的含CpG基序的核酸序列、0.5～1000μg/mL的α-半乳糖基神經(jīng)酰胺、5～2000μg/mL的β-葡聚糖和5～2000μg/mL的左旋咪唑，所述含CpG基序的核酸序列如SEQIDNO.1所示。本發(fā)明復方免疫增強劑與H9亞型禽流感滅活疫苗混合，可縮短免疫窗口期2周，抗體持續(xù)期延長8周，對H9亞型同型毒株攻擊產(chǎn)生消除性免疫保護，降低配制疫苗用的抗原含量。
文檔編號A61P31/14GK102793920SQ20121029803
公開日2012年11月28日 申請日期2012年8月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月21日
發(fā)明者唐應華, 陸吉虎, 吳培培, 劉振興, 田震, 何家惠, 侯繼波 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學院