從植物中提取泛素及類泛素的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種從植物中提取泛素及類泛素的方法，包含如下步驟：1）將植物根莖、葉、種子或果實經清洗、消毒、洗滌去除消毒劑，得到原料；2）將原料粉碎，使其滿足膠體磨的使用條件；3）若原料是植物種子，那么先經浸泡再用膠體磨進行濕磨；若是植物根莖、葉或果實則直接進行濕磨，得到植物粗漿液；4）利用纖維素酶處理植物粗漿液，得到粗漿處理液；5）將粗漿處理液細磨為細漿；6）將細漿離心分離，收集上清液得到粗蛋白液；7）將粗蛋白液多次用不同孔徑膜過濾，得到泛素及類泛素。該方法工藝簡單，操作過程中不引入不安全物質，減少能源消耗；同時綜合利用植物；其制得的蛋白質即泛素及類泛素，具有較高的利用價值。
【專利說明】從植物中提取泛素及類泛素的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術領域】，特別是涉及一種從植物中提取泛素及類泛素的方法?！颈尘凹夹g】
[0002]泛素功能非常多樣，廣泛存在于各種生物體內，這種小蛋白參與了各種細胞過程，包括細胞分裂，DNA修復以及細胞程序化死亡，它還可以作為一種負責開放或關閉基因的蛋白質的秒表。泛素的一個最著名的功能就是幫助清理細胞。泛素連接酶能將一串泛素分子連接到無用的蛋白質上，其可激活蛋白酶體復合物，蛋白酶體復合物吞噬蛋白。轉錄因子在完成基因功能之后，也會被連接上泛素分子而被清除掉，因此泛素可以有效地關閉基因。同時類泛素蛋白(Ubls)作為信號使者控制著多種細胞功能，諸如細胞增殖、凋亡、細胞周期及DNA修復，且泛素在人體自我修復功能系統(tǒng)中扮演著重要的角色。
[0003]自1975年泛素在小牛胰臟中分離出來，目前國內外已對泛素及類泛素作用的機理、純化、應用作出了大量研究。但對其制造方法的研究很少，目前利用植物提取蛋白的方法中，多數(shù)僅僅局限于一般植物的總蛋白的提取，所提取的蛋白質的功能針對性較小，僅局限于補充人體蛋白，所以導致在市場上的競爭力不強。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的目的在于:提供一種從植物中提取泛素及類泛素的方法，該方法能直接提取營養(yǎng)價值高的泛素及類泛素，且工藝簡單，操作過程中不引入不安全物質，減少能源消耗；同時綜合利用植物。
[0005]為此，本發(fā)明的技術方案在于:
[0006]一種從植物中提取泛素及類泛素的方法，包含如下步驟:
[0007]1)將植物根莖、葉、種子或果實經清洗、消毒、洗滌去除消毒劑，得到原料；
[0008]2 )對原料進行粉碎，使其滿足膠體磨的使用條件；
[0009]3)如果經步驟2)處理后的原料是植物種子，那么先將植物種子置于24~30°C溫水中浸泡24~48h，然后將浸泡后的植物種子或未浸泡的植物根莖、葉或果實置于膠體磨中進行研磨，研磨過程中加入pH=7.6~8.0,50~65毫摩爾(mMol)的磷酸鹽緩沖液，優(yōu)選磷酸氫二鈉緩沖液或磷酸二氫鈉緩沖液，所述緩沖液為所述原料質量的I~5倍，得到植物粗漿液；
[0010]4)將所述植物粗漿液裝入儲罐，加入酶活大于2000u/g的纖維素酶，所述纖維素酶質量為所述原料質量的0.2~0.5%，攪拌均勻，在28~42°C條件下放置0.5~1.5h，得到粗漿處理液；
[0011]5)將所述粗漿處理液利用膠體磨磨成細度為50~150目的細漿；
[0012]6)將所述細漿利用離心分離，收集上清液得到粗蛋白液；
[0013]7)將所述粗蛋白液通過孔徑0.65~1.2 μ m的微濾膜收集一次濾過液；將所述一次濾過液通過0.22~0.45 μ m的微濾膜收集二次濾過液；一次、二次過濾是為了除去粗蛋白液中的微粒、細菌；將所述二次濾過液通過截留分子量為14000的超濾膜并收集三次濾過液，將所述三次濾過液通過截留分子量為6000的超濾膜收集截留液，所述截留液即為所述泛素及類泛素。
[0014]還包括步驟8):將所述泛素及類泛素用截留分子量為6000的超濾膜進行濃縮，得到濃縮液，將所述濃縮液在-18~_22°C進行保存。
[0015]所述植物根莖為木薯、馬鈴薯、甘薯、山藥、芋頭、菊芋、半夏、甘露子、蘿卜、竹筍、油菜、蓮藕、土豆、紅薯或荸薺的根莖；
[0016]所述植物葉為?？啤⑥伎?、寥科、莧科、十字花科、豆科、旋花科、茄科、菊科、葫蘆科或雨久花科植物的葉子；
[0017]所述植物種子為杏仁、腰果、榛子、核桃、松子、板栗、白果、開心果、夏威夷果、花生、葵花子、南瓜子、西瓜子，稻米、小麥、玉米或大豆；
[0018]所述植物果實為葡萄、草莓、香蕉、番石榴、木瓜、蘋果、梨、柑桔、柿子、山楂、桃、梅、李、杏、龍眼、蒸枝、樓桃、率或芒果。
[0019]本發(fā)明以植物的果實、根、莖、葉為主要原料提取泛素及類泛素蛋白，經過粉碎、研磨、離心、超濾等步驟，從植物中提取泛素及類泛素，不僅加工工藝簡單，而且操作過程中不引入不安全物質，減少能源消耗。同時提高植物的綜合利用加工效益，所提取的泛素及類泛素蛋白更具有經濟效益和社會效益及實用價值。
[0020]本發(fā)明 [0021]I)工藝簡單，不運用有毒不安全和造成污染的方式提取泛素及類泛素，安全無污染，工藝簡單，耗能少，生產的泛素及類泛素蛋白的功能性更強，獲得的效益高；
[0022]2)植物的種子、根、莖、葉等均可用此工藝生產。副產物主要是淀粉和纖維素，可生產各種淀粉制品和食用纖維素，其產值不亞于主產品，是一項可持續(xù)發(fā)展的農業(yè)產業(yè)化技術。
【具體實施方式】
[0023]以下結合實施例對本發(fā)明的技術方案進行詳細描述。
[0024]實施例1
[0025]從玉米中提取泛素及類泛素的方法，包括以下步驟:
[0026]I)將玉米清洗干凈、消毒后，去除消毒劑，得到原料；
[0027]2)對原料進行粉碎，使其滿足膠體磨的使用條件；
[0028]3)將經步驟2)處理后的玉米置于24°C溫水中浸泡48h，然后將浸泡后的玉米置于膠體磨中進行研磨，研磨過程中加入pH=8.0,60mMol的磷酸氫二鈉緩沖液，所述緩沖液為所述原料質量的5倍，得到植物粗漿液；
[0029]4)將所述植物粗漿液裝入儲罐，加入酶活大于2000u/g的纖維素酶，所述纖維素酶質量為所述原料質量的0.5%，攪拌均勻，在28°C下放置1.5h，得到粗漿處理液；
[0030]5)將所述粗漿處理液利用膠體磨磨成細度為150目的細漿；
[0031]6)將所述細漿利用離心分離，收集上清液得到粗蛋白液；
[0032]7)將所述粗蛋白液通過孔徑0.65~1.2 μ m的微濾膜收集一次濾過液；將所述一次濾過液通過0.22~0.45 μ m的微濾膜收集二次濾過液；一次、二次過濾是為了除去粗蛋白液中的微粒、細菌；將所述二次濾過液通過截留分子量為14000的超濾膜并收集三次濾過液，將所述三次濾過液通過截留分子量為6000的超濾膜收集截留液，所述截留液即為所述泛素及類泛素。
[0033]制得的泛素及類泛素可經以下步驟制得蛋白粉:
[0034]還可將所述泛素及類泛素用截留分子量為6000的超濾膜進行濃縮，得到滿足噴霧干燥所需濃度的濃縮液，將所述濃縮液進行干燥制得泛素及類泛素蛋白粉。
[0035]實施例2
[0036]從桑葉中提取泛素及類泛素的方法，包含如下步驟:
[0037]1)首先將桑葉清洗干凈、消毒后，去除消毒劑，得到原料；
[0038]2)對原料進行粉碎，使其滿足膠體磨的使用條件；
[0039]3)將經步驟2)處理后的桑葉置于膠體磨中進行研磨,研磨過程中加入pH=8.0,65mMol的磷酸鹽緩沖液，所述緩沖液為所述原料質量的I倍，得到桑葉漿液；
[0040]4)將所述桑葉粗漿液裝入儲罐，加入酶活大于2000u/g的纖維素酶，所述纖維素酶質量為所述原料質量的0.5%，攪拌均勻，在36°C下放置1.0h，得到粗漿處理液；
[0041]5)將所述粗漿處理液利用膠體磨磨成細度為50目的細漿；
[0042]6)將所述細漿利用離心分離，收集上清液得到粗蛋白液；
[0043]7)將所述粗蛋白液通過孔徑0.65~1.2 μ m的微濾膜收集一次濾過液；將所述一次濾過液通過0.22~0.45 μ m的微濾膜收集二次濾過液；一次、二次過濾是為了除去粗蛋白液中的微粒、細菌；將所述二次濾過液通過截留分子量為14000的超濾膜并收集三次濾過液，將所述三次濾過液通過截留分子量為6000的超濾膜收集截留液，所述截留液即為所述泛素及類泛素。
[0044]制得的泛素及類泛素可經以下步驟制得膠囊或片劑:
[0045]將上述泛素及類泛素，加入其重量10%的可溶性淀粉或藥用淀粉，攪勻，在噴霧干燥機內調節(jié)適宜溫度噴制成細粉，將粉進行膠囊包裝或制片裝瓶包裝、殺菌。
[0046]實施例3
[0047]從山楂中提取泛素及類泛素的方法，包含如下步驟:
[0048]1)首先將山楂清洗干凈、消毒后，去除消毒劑，得到原料；
[0049]2)對所述原料進行粉碎，使其滿足膠體磨的使用條件；
[0050]3)將經步驟2)處理的山楂果實置于膠體磨中進行研磨，研磨過程中加入pH=7.6~8.0,50mMol的磷酸鹽緩沖液，所述緩沖液為所述原料質量的3倍，得到山楂粗漿液；
[0051]4)將所述植物粗漿液裝入儲罐，加入酶活大于2000u/g的纖維素酶，所述纖維素酶質量為所述原料質量的0.2%，攪拌均勻，在37°C下放置0.5h，得到粗漿處理液；
[0052]5)將所述粗漿處理液利用膠體磨磨成細度為80目的細漿；
[0053]6)將所述細漿利用離心分離，收集上清液得到粗蛋白液；
[0054]7)將所述粗蛋白液通過孔徑0.65~1.2 μ m的微濾膜收集一次濾過液；將所述一次濾過液通過0.22~0.45 μ m的微濾膜收集二次濾過液；一次、二次過濾是為了除去粗蛋白液中的微粒、細菌；將所述二次濾過液通過截留分子量為14000的超濾膜并收集三次濾過液，將所述三次濾過液通過截留分子量為6000的超濾膜收集截留液，所述截留液即為所述泛素及類泛素。
[0055]制得的泛素及類泛素可經以下步驟制得膠囊或片劑:
[0056]將上述泛素及類泛素，加入其重量10%的可溶性淀粉或藥用淀粉，攪勻，在噴霧干燥機內調節(jié)適宜溫度噴制成細粉，將粉進行膠囊包裝或制片裝瓶包裝、殺菌。
[0057]性能測試:
[0058](I)泛素及類泛素對小鼠脾淋巴細胞活性影響試驗
[0059]取實例1、2中提取的泛素及類泛素蛋白，選取小白鼠進行試驗。
[0060]試驗方法:將小鼠處死，無菌取脾臟，用鑷子輕輕將脾磨碎，用Hank’s液洗滌兩次，在1000r/min條件下離心IOmin收集細胞，用含血清的RPM1-1640培養(yǎng)液制成單個細胞懸液。然后調整細胞濃度為4X IO6個/mL。將細胞懸液加入96孔培養(yǎng)板中，150 μ L/孔，白對照加入不含血清的RPM1-1640培養(yǎng)液50 μ L，其他各組加入用不含血清的RPM1-1640培養(yǎng)液配置成的蛋白質溶液50 μ L，每個樣品做三個平行，置37°C、含有5%C02的CO2孵箱中培養(yǎng) 72h。
[0061]培養(yǎng)結束前4h，加入XTT-PMS30 μ L/孔，培養(yǎng)結束后，在酶標儀上測450nm波長條件下各孔的光吸收值，以此值表示細胞增殖程度。
[0062]實驗結果:下表為不同蛋白質對小鼠脾淋巴細胞增殖的直接影響?？梢?-5組空白對照組相比有顯著差異，實例中獲取的蛋白質均能促進脾淋巴細胞的增殖，實例中獲得泛素及類泛素蛋白與普通蛋白相比更加能促進脾淋巴細胞的增殖。
[0063]
【權利要求】
1.一種從植物中提取泛素及類泛素的方法，其特征在于包含如下步驟: 1)將植物根莖、葉、種子或果實經清洗、消毒、洗滌去除消毒劑，得到原料； 2)對原料進行粉碎，使其滿足膠體磨的使用條件； 3)如果經步驟2)處理后的原料是植物種子，那么先將植物種子置于24~30°C溫水中浸泡24~48h，然后將浸泡后的植物種子或未浸泡的植物根莖、葉或果實置于膠體磨中進行研磨，研磨過程中加入PH=7.6~8.0、50~65毫摩爾的磷酸鹽緩沖液，所述緩沖液為所述原料質量的1~5倍，得到植物粗漿液； 4)將所述植物粗漿液裝入儲罐，加入酶活大于2000u/g的纖維素酶，所述纖維素酶質量為所述原料質量的0.2~0.5%，攪拌均勻，在28~42°C條件下放置0.5~1.5h，得到粗漿處理液； 5)將所述粗漿處理液利用膠體磨磨成細度為50~150目的細漿； 6)將所述細漿利用離心分離，收集上清液得到粗蛋白液； 7)將所述粗蛋白液通過孔徑0.65~1.2 μ m的微濾膜收集一次濾過液；將所述一次濾過液通過0.22~0.45 μ m的微濾膜收集二次濾過液；將所述二次濾過液通過截留分子量為14000的超濾膜并收集三次濾過液，將所述三次濾過液通過截留分子量為6000的超濾膜收集截留液，所述截留液即為所述泛素及類泛素。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于:所述植物根莖為木薯、馬鈴薯、甘薯、山藥、芋頭、菊芋、半夏、甘露子、蘿卜、竹筍、油菜、蓮藕、土豆、紅薯或荸薺的根莖； 所述植物葉為?？?、藜科、寥科、莧科、十字花科、豆科、旋花科、茄科、菊科、葫蘆科或雨久花科植物的葉子； 所述植物種子為杏仁、腰果、榛子、核桃、松子、板栗、白果、開心果、夏威夷果、花生、葵花子、南瓜子、西瓜子，稻米、小麥、玉米或大豆； 所述植物果實為葡萄、草莓、香蕉、番石榴、木瓜、蘋果、梨、柑桔、柿子、山楂、桃、梅、李、杏、龍眼、荔枝、櫻桃、棗或芒果。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于:磷酸鹽緩沖液為磷酸氫二鈉緩沖液或磷酸二氫鈉緩沖液。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于:還包括步驟8)將步驟7制得的泛素及類泛素用截留分子量為6000的超濾膜進行濃縮，得到濃縮液，將所述濃縮液在-18~-22°C進行保存。
【文檔編號】C07K1/34GK103788174SQ201410071662
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年2月28日 優(yōu)先權日:2014年2月28日
【發(fā)明者】趙金梁, 趙發(fā) 申請人:天津替代醫(yī)學科技有限公司