一種Fmoc法固相合成胸腺五肽的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種Fmoc法固相合成胸腺五肽的方法，該方法以Fmoc保護的氨基酸為單體，將氨基酸按順序連接到樹脂上，在合成五肽時，加入的氨基酸Fmoc-Arg(Pbf)-OH溶液的溶劑為DMF和THF混合液，采用哌嗪溶液脫除所有Fmoc保護基，最后除去樹脂和側鏈保護基得胸腺五肽。本發(fā)明首次以哌嗪為脫Fmoc的脫保護劑，取代了傳統(tǒng)的吡啶，是一類不受“危險化學品”、“制毒化學品”管制的物質，廉價易得，且化學性質穩(wěn)定；哌嗪在常溫下為白色針狀晶體，而哌啶為液體，故哌嗪更便于運輸和儲存；相同濃度下，哌嗪脫Fmoc效率高于哌啶；可見哌嗪在胸腺五肽合成中具有很多優(yōu)越性，對多肽的生產、研究也具有很大的促進意義。
【專利說明】—種Fmoc法固相合成胸腺五肽的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及多肽類藥物的制備，具體其涉及一種固相合成胸腺五肽的方法，屬于多肽固相合成【技術領域】。
【背景技術】
[0002]胸腺五肽，其英文名稱為thymopentin，簡稱TP-5，中文名“胸腺五肽”是其意譯名。胸腺五肽是一種化學合成的五肽化合物(精氨酸-賴氨酸-天冬氨酸-纈氨酸-酪氨酸)，為胸腺多肽激素胸腺生成素(thymopoietin)的第32_36位的氨基酸殘基片段，它的基本序列為H-Arg-Lys- Asp-Val-Tyr-OH,保留了胸腺生成素的有效生物活性。胸腺五肽為細胞免疫調節(jié)藥物，具有誘導T細胞分化，促進T淋巴細胞亞群發(fā)育并活化的功能，可用于治療惡性腫瘤、肝炎、自身免疫性疾病等,對免疫系統(tǒng)具有和其母體多肽化合物胸腺生成素相同的生理功能和藥效。
[0003]多肽的化學合成方法主要有液相合成法和固相合成法。在溶液中進行的多肽合成稱為液相合成法，反之，多肽固相合成是在固相載體上逐一地重復連接特定的氨基酸的過程。固相合成法是在一個反應器內完成合成多肽的步驟，沒有中間體轉移導致的損失，通過簡單的洗滌除去未連接到固相上的反應物和雜質，簡化了每步中間體的純化和縮短了純化的時間。
[0004]固相合成一般從C端(羧基端)向N端(氨基端)的順序合成。側鏈和氨基分別保護的氨基酸通過羧基經 偶合反應連接到固相載體上；連接到固體上的保護氨基酸的氨基保護基除去后，接著進行下一個保護氨基酸的偶合反應，照此循環(huán)重復完成目標多肽的合成。多肽的固相合成方法中氨基通常采用兩種保護基保護，Fmoc (9-芴甲氧羰基)和t-Boc (叔丁氧羰基)。相應的合成方法稱為Fmoc法和Boc法。由于Fmoc比t-Boc脫保護的條件溫和，使得Fmoc法普遍被采用。Fmoc法合成,其中Fmoc脫保護基團的原理為Fmoc基團的荷環(huán)系的吸電子作用使9-H具有酸性，可被堿除去，反應條件溫和。雖然理論上看，任何堿性物質都可以用于Fmoc基團的脫保護，迄今為止，根據Fmoc法合成多肽的實驗結果，只有哌啶(六氫吡啶)溶液被認為是可以接受的脫去氨基酸氨基上的Fmoc保護基的試劑。
[0005]固相合成的步驟包括:
①將多肽C末端的氨基酸的氨基和側鏈分別保護后鍵合到固相載體上，以使肽鏈延長。
[0006]②對暫不參與形成化學鍵的基團加以保護，反應完成后再脫除保護基。
[0007]③對參與形成酰胺鍵的羧基進行活化。
[0008]④用適合的試劑，將目標從載體上切割下來。
[0009]具體合成由下列幾個循環(huán)組成:
①去保護=Fmoc保護的含有氨基的載體必須用一種堿性溶劑去除氨基的保護基團。
[0010]②活化和偶合:下一個氨基酸的羧基被一種活化劑所活化?；罨膯误w與固相載體上的游離氨基發(fā)生反應形成肽鍵。在此步驟使用過量的反應物驅使反應快速完成。循環(huán)①②這兩步反應反復循環(huán)直到合成完成。
[0011]③裂解和脫保護:多肽從載體上裂解下來，同時，所有保護基團被裂解液脫除去，得到多肽粗品。
[0012]迄今為止，報道使用Fmoc保護氨基酸策略制備胸腺五肽的前景資料主要有:
①南京工業(yè)大學宋明媚的碩士學位論文《胸腺五肽固相合成的工藝優(yōu)化與放大》采用
工藝為:使用取代率為I毫摩爾/g的Wang樹脂，DIC/HOBt/DMAP法連接Tyr與樹脂，溶劑為45%DMF/THF，反應5h ;肽鏈延長過程中每個氨基酸的連接均使用DIC/HOBt法，溶劑為45%DMF/THF,反應lh。切割試劑采用95%TFA/TIS/H20，反應3.5h，溫度24°C，樹脂洗滌液為95% TFA/DCM。胸腺五肽的產率為86.7%，純度為88.9%。
[0013]②南京林業(yè)大學化學工程學院歐陽嘉等人論文《Fmoc (9_芴甲氧羰基)法固相合成胸腺五肽》所用的方法為:采用對堿敏感的Fmoc法α-氨基保護策略固相合成了胸腺五肽，并討論了胸腺五肽 不同固相載體、不同活化試劑對胸腺五肽固相合成的影響。試驗結果表明Fmoc合成策略中各步的縮合率均在90%以上，同時對產品進行色譜分析純度達到83%。
[0014]③中國專利申請200510060558Χ《胸腺五肽合成工藝方法》，其以Fmoc-Tyr (tBu)-OH和Wang樹脂為起始物料,然后用保護氨基酸Fmoc-Val-OH, Fmoc-Asp (otBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc) -OH依次接二肽、三肽和四肽，其特征在于其后以保護氨基酸Boc-Arg-OH -HCl接五肽，接肽工作完成后充分洗滌，然后切肽、后處理即得胸腺五肽粗品。
[0015]④中國專利CN 1865279B《固相多肽合成胸腺五肽的制備方法》揭示胸腺五肽的固相合成方法為:(I)以CTC樹脂或Wang樹脂為起始原料，以Fmoc保護的氨基酸為單體，以TBTU/HOBt或HBTU/HOBt為縮合劑，逐個接上氨基酸，最后一個肽鏈采用Boc-Arg-OH; (2)將切肽試劑加入步驟(1)的產物中進行切肽，加入乙醚沉淀，收集粗品；(3)將步驟(2)的粗品采用C18或CS柱進行分離純化，獲得目標產物。每步接肽收率約為98，最后一個肽鏈采用Boc-Arg-OH的方法，切肽后乙醚沉淀粗品，避免使用劇毒的氟化氫，三廢污染少。采用C18柱進行分離純化，避免使用三氟乙酸，減小三廢，純化收率> 50%，每步接肽收率均在98%以上；切肽后收率為88%，分離純化收率為52%，總收率約為44 %。
在上述的專利和文獻報道中是用哌啶(六氫吡啶)脫去氨基酸單體上的Fmoc保護基合成胸腺五肽，然而，使用哌啶在現實工業(yè)生產和科學研究中有多方面的缺點:
①根據《危險化學品安全管理條例》、《易制毒化學品管理條例》規(guī)定哌啶為易制毒-2類化學品，該品受公安部門的嚴格管制，因此在日常的科學研究中不容易獲得，大大降低科學研究的方便性。
[0016]②在制藥企業(yè)中需要有購買和使用哌啶的資格證書方能進行使用，使用過程中要有嚴格的記錄檔案，并且定期要接受公安和有關部門的檢查，對制藥企業(yè)也照成了一定的不便性。
[0017]③哌啶為無色液體，有吸濕性，能隨水蒸氣揮發(fā)，對二氧化碳敏感，其溶液很容易發(fā)生變質成為淺黃色液體，使用前需要重新蒸餾，這些性質促使了運輸和儲存成本增加。
[0018]因此，在固相合成胸腺五肽中需要一種簡單、有效、成本低、原料易得的脫保護劑除去氨基酸上的Fmoc保護基。

【發(fā)明內容】
[0019]本發(fā)明的目的在于提供一種Fmoc法固相合成胸腺五肽的方法。
[0020]本發(fā)明所采取的技術方案是:
一種Fmoc法固相合成胸腺五肽的方法，該方法中Fmoc脫保護劑采用哌嗪溶液。
[0021]進一步的，上述哌嗪溶液的溶劑為偶極非質子溶劑。
[0022]進一步的，上述偶極非質子溶劑選自DMF、NMP, THF、DMS0。
[0023]進一步的，上述哌嗪溶液的濃度為0.1~lmol/L。
[0024]—種Fmoc法固相合成胸腺五肽的方法,該方法中第5個氨基酸Fmoc-Arg (Pbf) -OH溶液中的溶劑是體積比為(1.8~2.2):1的DMF和THF的混合液。
[0025]本發(fā)明的有益效果是:
本發(fā)明采用哌嗪作為脫保護劑，屬于路易斯(lewis)堿，能夠脫除氨基酸氨基的Fmoc保護基，不同于哌啶。哌嗪是一類不受《危險化學品安全管理條例》、《易制毒化學品管理條例》管制的化學物品，無論是科研單位還是企業(yè)在購買和使用過程中都很方便獲得，價格相對哌啶便宜；哌嗪比哌啶在常溫下的化學性質更穩(wěn)定；哌嗪在常溫下為白色針狀晶體，而哌啶為液體，故哌嗪也更便于運輸和儲存，降低成本。
[0026]本發(fā)明以哌嗪法能夠制備與傳統(tǒng)的哌啶法一樣的多肽產物，二者的實驗操作過程沒有明顯差異，在脫Fmoc過程中，當哌嗪濃度高于0.5mol/L所用時間比2mol/L的哌唳要短，哌嗪法得到的胸腺五肽的純度為77%~80%略高于哌啶法得到的胸腺五肽的純度74%，說明哌嗪法在固相合成胸腺五肽中具有很多優(yōu)越性，并且在多肽實際生產、科學研究中也具有很大的促進意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1 Fmoc的標準曲線；
圖2不同濃度胸腺五肽HPLC圖譜；
圖3胸腺五肽的標準曲線；
圖4哌嗪法和哌啶法合成胸腺五肽過程中脫除Fmoc保護基反應的茚三酮檢測，二者檢測后的顏色均為深藍色，說明兩種方法都可脫除Fmoc保護基；
圖5哌嗪法和哌啶法合成胸腺五肽過程中氨基酸縮合反應的茚三酮檢測，二者檢測后的顏色均為淺黃色，說明二者的縮合反應都進行完全；
圖6哌嗪法和哌啶法合成胸腺五肽過程中二肽中間體(H-Val-Tyr-OH)的HPLC圖譜對
昭.圖7哌嗪法和哌啶法合成胸腺五肽過程中三肽中間體(H-Asp-Val-Tyr-OH)的HPLC圖譜對照；
圖8哌嗪法和哌唳法合成胸腺五肽過程中四肽中間體(H-Lys-Asp-Val-Tyr-OH)的HPLC圖譜對照；
圖9哌嗪法和哌啶法合成的胸腺五肽(H-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH)的HPLC圖譜對
昭.圖10哌嗪法和哌啶法合成的二肽中間體、三肽中間體、四肽中間體、胸腺五肽的HPLC圖譜對照；
圖11哌嗪法和哌啶法合成胸腺五肽過程中三肽中間體(H-Asp-Val-Tyr-OH)質譜圖對照，A為哌啶法合成的三肽中間體質譜圖，B為哌嗪法合成的三肽中間體質譜圖；
圖12哌嗪法和哌唳法合成胸腺五肽過程中四肽中間體(H-Lys-Asp-Val-Tyr-OH)質譜圖對照，A為哌啶法合成的四肽中間體質譜圖，B為哌嗪法合成的四肽中間體質譜圖；
圖13哌嗪法和哌唳法合成的胸腺五肽(H-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH)質譜圖對照,A為哌啶法合成的胸腺五肽質譜圖，B為哌嗪法合成的胸腺五肽質譜圖。
【具體實施方式】
[0028]下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但并不局限于此。
[0029]實施例1:
(I)第I個氨基酸與樹脂的連接:
①稱取樹脂:取4gWang樹脂(取代度1.02mmol/g)于編號為I號的80ml反應器(反應前準確稱其重量)中，Wang樹脂的總取代量為取代度乘以質量，即4.08 mmol ；
②樹脂與氨基酸進行鍵合反應:準確稱量4.08mmol (1874.90 mg) Fmoc-Tyr (tBu) -OH置于50ml離心管中，加入30ml DCM (二氯甲烷)斡旋溶解后加入I號反應器中，使樹脂溶脹均勻，溶脹時間約30min ;同時在另外一只50ml的離心管中加入4.08mmol (841.826mg) DCC (二環(huán)己基碳二亞胺)、0.408mmol (49.845mg) DMAP (4-二甲氛基吡卩定)和 IOmLDCM,斡旋溶解后快速倒入I號反應器，斡旋均勻，與溶脹均勻的樹脂振蕩反應約4h，獲得Fmoc-Tyr(tBu)-Wang ；
③樹脂擔載量的測定:對②中反應后的樹脂先用DMF洗至洗滌流出液中性，再用IPA(異丙醇)洗四遍，抽其極干，取2mg樹脂于1.5ml離心管中，加 Iml 2.00mol/L哌唳的DMF(隊^二甲基甲酰胺)溶液搖擺處理2011^11，取其0.1ml用IOmlDMF稀釋10倍，測其吸光度，根據Fmoc的標準曲線如圖1所示計算其擔載量，其擔載量為0.6216mmol/g,要大于0.5mmol/g,即IgWang樹脂中與0.6216mmol的氨基酸發(fā)生了鍵合反應,可以說明上該產物可用于后續(xù)的多肽合成，具體的測定方法見下面“一、Wang樹脂擔載量的測定”。
[0030](2)過剩樹脂的封頭
①封頭反應:將I號反應器內抽干的Fmoc-Tyr(tBu)-Wang中加入30ml含40.8mmol(3915.06 μ I)醋酐和40.8mmol (3303.23 μ I)吡啶的DMF溶液，混勻，振蕩反應60min，對未與氨基酸結合的樹脂進行乙酰化封閉，獲得封頭的未與氨基酸結合的樹脂，從而防止其與后續(xù)的氨基酸發(fā)生鍵合；
②洗漆與分裝:將經過封頭處理的Fmoc-Tyr(tBu)-Wang樹脂用DMF洗至洗漆流出液中性，再用IPA洗四遍，抽其極干，分成質量相等的兩份，分別置于I號反應器和2號反應器(反應前準確稱其重量)中。
[0031]在接下來的反應條件中，I號和2號反應器唯一不一樣的地方是I號反應器用
0.5mol/L哌嗪的DMF溶液為脫保護劑，2號反應器用2.0mol/L哌啶的DMF溶液為脫保護劑，其余條件都一樣，下面只對哌嗪法的操作進行描述。
[0032](3)脫除第I個氨基酸的Fmoc保護基
①保護基的脫除反應:在I號反應器內倒入30ml0.5mol/L哌嗪的DMF脫保護溶液，振蕩反應20min,脫除Fmoc保護基；
②洗滌與檢測:將反應后的產物用DMF洗至洗滌流出液中性，再用IPA洗四遍，抽極其干，取極少樹脂進行茚三酮檢測，若為深藍色，(如圖4所示，為哌嗪法和哌啶法合成胸腺五肽過程中每一步脫除Fmoc保護基反應的茚三酮檢測，檢測后的顏色均為深藍色，說明兩種方法均可脫除Fmoc保護基。)則說明獲得了 H-Tyr (tBu)-Wang，可進行接下來的反應，若為淺色，則重新用30ml 0.5mol/L哌嗪的DMF溶液處理30min。
[0033](4) 二肽-樹脂的合成
①二妝的縮合反應:準確稱量4.08mmol (1384.75mg) Fmoc-Val-OH于50ml的離心管中，用20mL的DMF作溶劑，斡旋溶解后，再加入4.08mmol (1555.45mg) HBTU (苯并三氮唑-N, N, N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯)作為縮合劑，斡旋溶解完全，再加入4.08mmol(718.08uL)DIEA (N, N- 二異丙基乙胺)，斡旋混勻，立即倒入裝有H-Tyr (tBu)-Wang的I號反應器中，振蕩反應約4h,獲得Fmoc-Val-Tyr (OtBu) -Wang ；
②洗滌與檢測:將Fmoc-Val-Tyr(OtBu)-Wang用DMF洗四遍至洗滌流出液中性，再用IPA洗四遍，抽其極干，置于I號反應器內，取極少反應產物進行茚三酮檢測:如果測試液體和樹脂微球顯無色、或淺黃色，說明縮合反應進行完全，可繼續(xù)下面的反應；如有藍色、或淺紫色，則重新進行上一步①中的反應；
③脫除保護基的脫除反應:在I號反應器內倒入20mL0.5mol/L哌嗪的DMF溶液振蕩反應20min,脫除保護基Fmoc ；
④洗滌與檢測:脫除反應后，用DMF清洗I號反應器中的產物至洗滌流出液中性，再用IPA洗四遍，抽極其干，得H-Val-Tyr (OtBu) -Wang 二肽-樹脂中間產物，取極少量產物進行卻三酮檢測，如為深藍色 ，則進行接下來的反應，如淺色，則重新用20mL 0.5mol/L哌嗪DMF進行脫除保護基Fmoc反應。
[0034]( 5 )三肽-樹脂的合成
按照步驟(4)的操作，將二肽-樹脂與20mL含4.08mmol Fmoc-Asp (OtBu) -OH的DMF溶液進行縮合反應獲得H-Asp (OtBu) -Val-Tyr (OtBu) -Wang三肽-樹脂中間產物。
[0035](6)四肽-樹脂的合成
按照步驟(4)的操作，將三肽-樹脂與20mL含4.08mmol Fmoc-Lys (tBu) -OH的DMF溶液進行縮合反應獲得H-Lys (tBu ) -Asp (OtBu) -Val-Tyr (OtBu) -Wang四肽-樹脂中間產物。
[0036](7)五肽-樹脂的合成
按照步驟(4)的操作，將四肽-樹脂與20mL含4.08mmol Fmoc-Arg(Pbf) -OH的溶液進行縮合反應獲得 H-Arg(Pbf)-Lys (tBu ) -Asp (OtBu) -Val-Tyr (OtBu) -Wang 五肽-樹脂產物，其中不同的是，該步驟中溶解Fmoc-Arg(Pbf)-OH的溶劑為體積比為2:1的DMF和THF的混合溶液，其他操作均不變。
[0037](8)脫除側鏈保護基及肽鏈上的樹脂
①將五肽-樹脂產物(或其他多肽-樹脂中間產物)置于IOml反應器中，加入五肽-樹脂體積10~30倍的裂解液，所用裂解液按體積百分比含有95%TFA (三氟乙酸)、2.5% TIS(三異丙基硅烷)和2.5%水，裂解3次，裂解的時間依次約為30min、60min、90min，過濾除樹月旨，收集合并三次濾液于50mL離心管中；
②往濾液中加入約30mL放置于_20°C冷凍儲存的冰凍乙醚，混勻，靜置直到沉淀產生完全(大約2h)(在本發(fā)明中四肽中間體和五肽產物有白色沉淀產生，而二肽中間體、三肽中間體并沒有白色沉淀產生，因此對二肽中間體、三肽中間體進行減壓旋蒸處理得到樣品不再進行離心處理)，然后進行減壓旋蒸至少量乙醚存在，再用乙醚對樣品進行清洗，重復再減壓旋蒸2~3次，最后產物用氬氣吹干，可獲得二肽中間體、三肽中間體)；
③對含有五肽產物或四肽中間體沉淀的溶液進行離心(5min,10000 rpm),倒出上清液，再加入約20ml乙醚,對沉淀進行斡旋搖勻，再離心(5min, 10000 rpm),重復3遍,用気氣吹干即可獲得胸腺五肽或四肽中間體；
④對經過脫除側鏈保護基和樹脂處理的二肽中間體、三肽中間體、四肽中間體、胸腺五肽的樣品，用超純水溶解，進行冷凍干燥處理，這樣就得到用于HPLC和質譜檢測的多肽樣品O
[0038]經過上述同樣的操作方法，也分別獲得經哌啶脫除Fmoc保護基的二肽中間體、三肽中間體、四肽中間體、胸腺五肽的樣品，也進行HPLC和質譜的檢測，并分別與哌啶脫除Fmoc保護基的多肽進行對比(詳細情況見下面“二、根據國家藥典對胸腺五肽進行HPLC檢測”)。
[0039]實施例2:
(I)第I個氨基酸與樹脂的連接:
①稱取樹脂:取4gWang樹脂(取代度1.02mmol/g)于反應器(反應前準確稱其重量)中，Wang樹脂的總取代量為取代度乘以質量，即4.08 mmol ；
②樹脂與氨基酸進行鍵合反應:準確稱量3.627~4.488mmol Fmoc-Tyr (tBu) -OH置于離心管中，加入30ml DCM斡旋溶解后加入反應器中，使樹脂溶脹均勻，溶脹時間約30min ；同時在另外一只離心管中加入3.627~4.488mmol DCC、0.3627~0.4488mmol DMAP和IOmL DCM,斡旋溶解后快速`倒入反應器，斡旋均勻，與溶脹均勻的樹脂振蕩反應約4h，獲得Fmoc-Tyr(tBu)-Wang0
[0040](2)過剩樹脂的封頭
①封頭反應:將反應器內的所有樹脂先用DMF洗至洗滌流出液中性，再用IPA洗四遍，抽其極干，加入30~40mL含4.08~44.88mmol醋酐和4.08~44.88mmol吡啶的DMF溶液，混勻，振蕩反應60~70min,對未與氨基酸結合的樹脂進行乙酰化封閉，獲得封頭的未與氨基酸結合的樹脂，從而防止其與后續(xù)的氨基酸發(fā)生鍵合；
②洗滌與分裝:將經過封頭處理的所有樹脂用DMF洗至洗滌流出液中性，再用IPA洗四遍，抽其極干，置于反應器中。
[0041](3)脫除第I個氨基酸的Fmoc保護基
①保護基的脫除反應:在反應器內倒入60ml0.5mol/L哌嗪的DMF脫保護溶液，振蕩反應20min,脫除Fmoc保護基；
②洗滌與檢測:將反應后的產物用DMF洗至洗滌流出液中性，再用IPA洗四遍，抽極其干，取極少樹脂進行茚三酮檢測，若為深藍色，則說明獲得了 H-Tyr (tBu) -ffang,可進行接下來的反應，若為淺色，則重新用60ml 0.5mol/L哌嗪的DMF溶液處理30min。
[0042](4) 二肽-樹脂的合成
①二肽的縮合反應:準確稱量4.08~8.16mmol Fmoc-Val-OH于50ml的離心管中，用20~40mL的DMF作溶劑，斡旋溶解后，再加入4.08~8.16mmol HBTU作為縮合劑，斡旋溶解完全，再加入4.08~8.16mmol DIEA，斡旋混勻，立即倒入裝有H-Tyr (tBu) -Wang的反應器中，振蕩反應約 4h,獲得 Fmoc-Val-Tyr (OtBu) -Wang ；②洗滌與檢測:將Fmoc-Val-Tyr(OtBu)-Wang用DMF洗四遍至洗滌流出液中性，再用IPA洗四遍，抽其極干，置于反應器內，取極少反應產物進行茚三酮檢測，如果無顏色，可進行接下來的反應，如有顏色，則重新進行上一步①中的反應； ③脫除保護基的脫除反應:在反應器內倒入40~60mL0.5mol/L哌嗪的DMF溶液振蕩反應20min,脫除保護基Fmoc ；
④洗滌與檢測:脫除反應后，用DMF清洗反應器中的產物至pH值為洗滌流出液中性，再用IPA洗四遍，抽極其干，得H-Val-Tyr (OtBu) -Wang 二肽-樹脂中間產物，取極少量產物進行茚三酮檢測，如為深藍色，則進行接下來的反應，如淺色，則重新用40~60mL 0.5mol/L哌嗪DMF進行脫除保護基Fmoc反應。
[0043]( 5 )三肽-樹脂的合成
按照步驟(4)的操作，將二肽-樹脂與20~40mL含4.08~8.16mmol Fmoc-Asp (OtBu)-OH的DMF溶液進行縮合反應獲得H-Asp (OtBu) -Val-Tyr (OtBu) -Wang三肽-樹脂中間產物。
[0044](6)四肽-樹脂的合成
按照步驟(4)的操作，將三肽-樹脂與20~40mL含4.08~8.16mmol Fmoc-Lys (tBu) -OH的DMF溶液進行縮合反應獲得H-Lys (tBu ) -Asp (OtBu) -Val-Tyr (OtBu) -Wang四肽-樹脂中間產物。
[0045]( 7 )五肽-樹脂的合成
按照步驟(4)的操作，將四肽-樹脂與20~40mL含4.08~8.16mmol Fmoc-Arg(Pbf) -OH的溶液進行縮合反應獲得 H-Arg (Pbf) -Lys (tBu ) -Asp (OtBu) -Val-Tyr (OtBu) -Wang 五肽-樹脂產物，其中不同的是，該步驟中溶解Fmoc-Arg(Pbf)-OH的溶劑為體積比為(1.8~2.2):1的DMF和THF的混合溶液，其他操作均不變。
[0046](8)脫除側鏈保護基及肽鏈上的樹脂
①將五肽-樹脂產物置于反應器中，加入五肽-樹脂體積10~30倍的裂解液，所用裂解液按體積百分比含有94~96% TFA,2.4~3.4% TIS和2.4~3.4%水，裂解3次，裂解的時間依次約為30min、60min、90min,過濾除樹脂,收集三次濾液于50mL離心管中；
②往濾液中加入-4~_20°C的乙醚，體積為濾液5~10倍，混勻，靜置直到沉淀產生完全,離心5min, 1000Orpm,去上清,將沉淀進行減壓旋蒸,減壓旋蒸的產物用乙醚清洗后離心去上清得沉淀，再將沉淀重復減壓旋蒸2~3次后，最后產物用氬氣吹干，即可獲得胸腺五肽。
[0047]實施例3:
本發(fā)明還選用了濃度分別為0.lmol/L、0.25 mol/L、0.75 mol/LU mol/L哌嗪的DMF溶液作為脫保護劑，其中哌嗪溶液的溶劑還選用了 NMP(N-甲基吡咯烷酮)、THF(四氫呋喃)、DMSO(二甲基亞砜)等偶極非質子溶劑，參照實施例2的操作方法，同樣也能制備出相應的二肽、三肽、四肽中間體，以及胸腺五肽。
[0048]下面對實施例中制備的多肽中間體和胸腺五肽進行檢測，并與使用傳統(tǒng)脫保護劑哌啶制備的相應產物進行比較。
[0049]一、Wang樹脂擔載量的測定
(I)制作Fmoc標準曲線
①以Fmoc-Ala為標準物質,準確稱量Fmoc-Ala-OH 39.5mg,用Iml 20%pip/NMP處理20min，取其中0.1ml用NMP稀釋到1ml0
[0050]②配置成濃度為21，42，63，85，106，127 μ mol/L的標準溶液，測的吸光度分別為:
0.18，0.34，0.5，0.67，0.82，0.98，如表 1所示。
[0051]表1 Fmoc-Ala標準溶液的配制表
【權利要求】
1.一種Fmoc法固相合成胸腺五肽的方法，其特征在于:該方法中Fmoc脫保護劑采用哌嗪溶液。
2.根據權利要求1所述的一種固相合成胸腺五肽的方法，其特征在于:所述的哌嗪溶液的溶劑為偶極非質子溶劑。
3.根據權利要求2所述的一種固相合成胸腺五肽的方法，其特征在于:所述的偶極非質子溶劑選自DMF、NMP, THF、DMS0。
4.根據權利要求1所述的一種固相合成胸腺五肽的方法，其特征在于:所有所述的哌嗪溶液的濃度為0.1~lmol/L。
5.根據權利要求1所述的一種固相合成胸腺五肽的方法，其特征在于:第5個氨基酸Fmoc-Arg (Pb f) -OH溶液中的溶劑是體積比為(1.8~2.2):1的DMF和THF的混合液。
【文檔編號】C07K7/06GK103709233SQ201310746262
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月30日 優(yōu)先權日:2013年12月30日
【發(fā)明者】張響, 胡碧煌, 楊頂建 申請人:海南大學