一種雙酶法從小麥麩皮中制備阿魏酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種雙酶法從小麥麩皮中制備阿魏酸的方法。利用來(lái)源于本實(shí)驗(yàn)室的重組阿魏酸酯酶(reAorFaeA)和重組木聚糖酶(reAoXynllA)協(xié)同作用對(duì)小麥麩皮進(jìn)行酶解，釋放阿魏酸，得到阿魏酸粗提液。采用HPD-300弱極性大孔樹脂對(duì)阿魏酸粗提液進(jìn)行純化，將純化得到的含有阿魏酸的餾分進(jìn)行真空干燥得到阿魏酸產(chǎn)品。采用本發(fā)明提取制備阿魏酸原料廉價(jià)易得，產(chǎn)物純度較高，制備工藝簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便易行，環(huán)境友好，適用于工業(yè)化放大生產(chǎn)。
【專利說(shuō)明】一種雙酶法從小麥麩皮中制備阿魏酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種利用生物酶從小麥麩皮中制備阿魏酸的方法，屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]我國(guó)是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)大國(guó)，每年麥麩、玉米芯、米糠等農(nóng)副產(chǎn)品細(xì)胞壁物質(zhì)產(chǎn)量約為3000萬(wàn)噸，多被丟棄或用作動(dòng)物飼料，綜合利用率低，且經(jīng)濟(jì)價(jià)值不高。阿魏酸(ferulicacid)的化學(xué)名稱為4-羥基-3-甲氧基肉桂酸，是桂皮酸的衍生物之一，在麥麩、米糠、蔗渣等谷物中含量較高，它是一種天然的抗氧化劑，具有抑制血小板聚集，促進(jìn)血小板溶解，抗血栓的形成，抗氧化，抗腫瘤等生理作用，在醫(yī)藥及食品等行業(yè)受到重視。從小麥麩皮中提取制備阿魏酸既可以延長(zhǎng)小麥產(chǎn)業(yè)鏈條，提高小麥的附加值，同時(shí)又可以得到有藥用價(jià)值和保健功能的游離阿魏酸，其經(jīng)濟(jì)意義、社會(huì)意義巨大。 [0003]目前阿魏酸的生產(chǎn)方法主要包括化學(xué)合成和堿解法，但這兩種方法均存在一定的缺陷。化學(xué)合成法反應(yīng)步驟多、周期長(zhǎng)；堿解法的原料谷維素在米糠中含量低，產(chǎn)量受限；此外，這兩種方法都具有污染性，因此酶法生產(chǎn)阿魏酸具有較大優(yōu)勢(shì)。阿魏酸酯酶作為羧酸酯水解酶的一個(gè)亞類，可以水解植物細(xì)胞壁中多糖與阿魏酸連接的酯鍵，并釋放出游離的阿魏酸單體或二聚體。單一使用阿魏酸酯酶，酶與纖維素酯鍵不能充分反應(yīng)，導(dǎo)致水解率低。如果采用阿魏酸酯酶和多糖水解酶共同作用于細(xì)胞壁，同時(shí)打斷阿魏酸酯鍵和糖苷鍵，無(wú)疑將使低聚糖的水解產(chǎn)率得到提高，同時(shí)又可生產(chǎn)阿魏酸。然而，酶解液是一個(gè)復(fù)雜的體系，從中分離出阿魏酸仍比較困難。尋找合適的阿魏酸的純化工藝也是實(shí)現(xiàn)阿魏酸工業(yè)化生產(chǎn)所需要突破的一個(gè)瓶頸。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是在于提供一種從小麥麩皮中提取制備阿魏酸，并且環(huán)保安全，周期短，操作簡(jiǎn)單的工藝，為阿魏酸的酶法生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案:
[0006]利用重組阿魏酸酯酶(reAorFaeA)和重組木聚糖酶(reAoXynllA)雙酶法水解小麥麩皮，得到阿魏酸粗提液，經(jīng)HPD-300大孔樹脂純化制備高純度的阿魏酸產(chǎn)品。
[0007]所涉及到的具有重組阿魏酸酯酶(reAorFaeA)和重組木聚糖酶(reAoXynllA)活性的工程菌株 GS115/AorfaeA(專利申請(qǐng)?zhí)?201210562540.X)和 GS115/AoxynllA(AnnMicrobiol,2013,63:1109-1120)由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存。
[0008]所述的阿魏酸的分析測(cè)定方法:
[0009]高效液相(HPLC)分析阿魏酸的釋放量。具體操作為:準(zhǔn)確稱取5mg反式阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品，加入適量乙醇溶解后定容至50mL，即得0.lmg/mL的反式阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。用緩沖液將阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成不同濃度，用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定峰面積。以阿魏酸含量為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將樣品過(guò)膜(0.45μπι)后進(jìn)行HPLC分析。色譜條件:戴安UltiMate-3000高效液相色譜儀，ZW&A-C18反相色譜柱，紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)320nm，柱溫為30°C，流動(dòng)相為甲醇和I %乙酸二步梯度洗脫(O-1Omin內(nèi)甲醇濃度由20 %上升為50 %，10-20min內(nèi)甲醇濃度由50 %上升為80 % )，流速為lmL/min，進(jìn)樣量為20 μ L0根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算阿魏酸含量。
[0010]所述的雙酶法提取小麥麩皮中的阿魏酸:
[0011](I)稱取50g小麥麩皮，向其中加入適量0.3% (w/v)的醋酸鉀溶液，于95°C浸泡30min后，用大量蒸餾水反復(fù)沖洗，并在105°C烘干至恒重，粉碎，過(guò)60目篩備用。
[0012](2)準(zhǔn)確稱取0.5g去淀粉麩皮于IOOmL錐形瓶中，加入8mL reAorFaeA酶液(約16.88U)和 0.5mL reAorXynllA 酶液(約 72.5515U)，用 0.lmmol/L、pH5.0 的磷酸鹽緩沖液定容至30mL，于40°C酶解10h，煮沸5min滅酶活，離心收集上清液即為阿魏酸粗提液。粗提液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮到ImL后真空干燥，得到阿魏酸粗提產(chǎn)品，HPLC法分析阿魏酸的含量。
[0013]所述的大孔樹脂純化阿魏酸粗提液:
[0014](I)將阿魏酸粗提液濃縮至阿魏酸質(zhì)量濃度為0.lmg/mL，濃縮液調(diào)pH至4.0，選用HPD-300型大孔樹脂，室溫下，樹脂裝填量為20mL。將處理好的阿魏酸粗提液IOOmL以lmL/min上柱動(dòng)態(tài)吸附后，靜置2h，水洗柱子至流出液為無(wú)色，用100mL50%乙醇以lmL/min的流速洗脫，定量收集。
[0015](2)收集到的餾分經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮到ImL后真空干燥，得到阿魏酸產(chǎn)品，HPLC法分析阿魏酸的含量(圖1)。
[0016]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明提供了一種從農(nóng)業(yè)廢棄物小麥麩皮中提取制備阿魏酸的方法。實(shí)現(xiàn)了雙酶法協(xié)同作用水解小麥麩皮提取阿魏酸，避免了以往堿法制備阿魏酸的種種弊端，同時(shí)利用大孔型弱極性吸附樹脂和在合適濃度的低級(jí)醇條件下能夠洗脫出阿魏酸的原理，對(duì)所產(chǎn)阿魏酸進(jìn)行了進(jìn)一步的吸附分離，有效的富集了阿魏酸，成本低，周期短，無(wú)污染。為進(jìn)一步工業(yè)化綠色生產(chǎn)阿`魏酸奠定了基礎(chǔ)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0017]圖1:阿魏酸產(chǎn)品的HPLC檢測(cè)圖譜【具體實(shí)施方式】
[0018]以下結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明的操作方法。但是這些實(shí)施例僅用于詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0019]實(shí)施例1雙酶法提取小麥麩皮中的阿魏酸
[0020]準(zhǔn)確稱取0.5g小麥麩皮,置于IOOmL錐形瓶中。加入8mL reAorFaeA酶液(約16.88U)和 0.5mL reAorXynllA 酶液(約 72.5515U)，用 0.lmmol/L、pH5.0 的磷酸鹽緩沖液定容至30mL，于40°C酶解10h，煮沸5min滅酶活，離心收集上清液為阿魏酸粗提液，粗提液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至lmL，真空干燥得到阿魏酸粗提粉末，稱重為1.75g，經(jīng)HPLC檢測(cè)，阿魏酸含量為0.13%。
[0021 ] 實(shí)施例2大孔樹脂純化阿魏酸粗提液
[0022]將阿魏酸粗提液濃縮至阿魏酸質(zhì)量濃度為0.lmg/mL，濃縮液調(diào)pH至4.0,選用HPD-300型大孔樹脂，樹脂濕法裝柱20mL，將處理好的阿魏酸粗提液IOOmL以lmL/min上柱動(dòng)態(tài)吸附后，靜置2h，水洗柱子至流出液為無(wú)色，用100mL50%乙醇以lmL/min的流速洗脫，洗脫液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至lmL，真空干燥成粉末，稱重為431mg，經(jīng)HPLC檢測(cè)，阿魏酸含量為22.5%，回收 率為97%。
【權(quán)利要求】
1.一種從小麥麩皮中制備阿魏酸的方法，其特征在于以小麥麩皮為原料以阿魏酸酯酶和木聚糖酶雙酶法協(xié)同作用提取阿魏酸: (1)預(yù)處理:稱取50g小麥麩皮，向其中加入適量0.3% (w/v)的醋酸鉀溶液，于95°C浸泡30min后，用大量蒸餾水反復(fù)沖洗，并在105°C烘干至恒重，粉碎，過(guò)60目篩備用； (2)酶處理:準(zhǔn)確稱取0.5g去淀粉麩皮于IOOmL錐形瓶中，加入8mL reAorFaeA酶液(約 16.9U)和 0.5mL reAorXynllA 酶液(約 72.6U)，用 0.lmmol/L、pH5.0 的磷酸鹽緩沖液定容至30mL，于40°C酶解10h，煮沸5min滅酶活，離心收集上清液即為阿魏酸粗提液。
2.利用大孔型弱極性吸附樹脂和在合適濃度的低級(jí)醇條件下能夠洗脫出阿魏酸的原理，制備高純度阿魏酸的方法: (1)純化:將阿魏酸粗提液濃縮至阿魏酸質(zhì)量濃度為0.lmg/mL，濃縮液調(diào)pH至4.0,選用HPD-300型大孔樹脂，室溫下，樹脂裝填量為20mL，將處理好的阿魏酸粗提液IOOmL以lmL/min上柱動(dòng)態(tài)吸附后，靜置2h，水洗柱子至流出液為無(wú)色，用100mL50%乙醇以lmL/min的流速洗脫，定量收集； (2)干燥:收集到的餾分真空濃縮到ImL后真空干燥，得到阿魏酸產(chǎn)品，稱重為431mg，經(jīng)HPLC檢測(cè)， 阿魏酸含量為22.5%，回收率為97%。
【文檔編號(hào)】C07C51/47GK103642851SQ201310666358
【公開日】2014年3月19日 申請(qǐng)日期:2013年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月10日
【發(fā)明者】鄔敏辰, 曾妍, 王春娟, 殷欣, 李劍芳 申請(qǐng)人:江南大學(xué)