一種水黃皮耐逆相關(guān)基因MpZFP及其編碼的蛋白與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，提供了一種水黃皮耐逆相關(guān)基因MpZFP，其堿基序列如SEQ?ID?NO：1所示。構(gòu)建MpZFP重組植物表達載體，用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得轉(zhuǎn)MpZFP基因擬南芥，結(jié)果表明MpZFP基因在擬南芥中超表達，提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性，證明MpZFP基因具有提高植物耐逆性的作用。
【專利說明】一種水黃皮耐逆相關(guān)基因MpZFP及其編碼的蛋白與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，尤其涉及一種水黃皮耐逆相關(guān)基因MpZFP及其編碼的蛋白質(zhì)與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]鹽堿、干旱等非生物脅迫影響著農(nóng)作物的生長發(fā)育，嚴重時甚至導(dǎo)致作物死亡。為了提高農(nóng)作物產(chǎn)量，培育耐逆性作物品種是主要的應(yīng)對方法之一。目前，通過基因工程的方法育種已經(jīng)成為培育耐逆性作物的重要方法之一。高等植物可以通過多種途徑來應(yīng)對環(huán)境中的這些不利因素，其中的轉(zhuǎn)錄因子由于能夠調(diào)節(jié)多個下游基因的表達，因而成為研究植物耐逆性的關(guān)鍵點之一?，F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多類與植物耐逆性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，如鋅指蛋白類、bZIP類、MYB類、AP2-ERF類等等。
[0003]鋅指蛋白(zinc finger protein,ZFP)是具有“手指”狀結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子。其特點是通過半胱氨酸(C)殘基和組氨酸(H)殘基來結(jié)合游離Zn2+，形成一種具有“手指”狀的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。根據(jù)半胱氨酸殘基(C)和組氨酸殘基(H)的不同組合又可以分為C2H2、C4和C6等亞類。ZFP類轉(zhuǎn)錄因子主要是通過與DNA相互作用來調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達，在植物耐鹽、干旱、冷、熱、病蟲害以及生長發(fā)育等方面都發(fā)揮著重要作用。該類轉(zhuǎn)錄因子有鋅參與時才具備轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性，α螺旋和一個反向平行的β片層的基部以鋅原子為中心，通過與一對半胱氨酸和一對組氨酸之間形成配位鍵相連接，鋅指環(huán)上突出的賴氨酸、精氨酸參與DNA結(jié)合。人們從擬南芥、大豆、水稻等作物中都克隆到了鋅指蛋白類轉(zhuǎn)錄因子，然而尚未從耐鹽的非模式植物水黃皮中克隆到與逆境脅迫相關(guān)的該類轉(zhuǎn)錄因子。
[0004]水黃皮為典型的半紅樹植物，既能生長于海岸或沿河的灘涂地區(qū)，又可在遠離海邊的陸地上生長，對土壤鹽度表現(xiàn)出廣泛的適應(yīng)性，因而是研究植物耐逆性的良好材料。同時，作為豆科植物，水黃皮的基因資源將可通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用于大豆或其它農(nóng)作物的品種改良。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種水黃皮耐逆相關(guān)基因MpZFP，其堿基序列如SEQ IDNO:1所示。在本發(fā)明中，所述水黃皮耐逆相關(guān)基因MpZFP的具體堿基序列長度為543bp，如SEQ ID NO:1 所示:
[0006]atgaagagag aaagggaagg tgatagcata accatggcca attacttgat gttgctttct 60
[0007]cgtggaagtg aatttgagag caacaacaat ttcttcaact cttccaacaa ccgtgtcttc 120
[0008]gagtgcaaga catgtaaccg ccaattccaa tcgtttcaag cattgggagg gcaccgtgca 180
[0009]agccataaga agccaaggtt gatgggtgat ggccaagtat tgaatgacga tgattcacca 240
[0010]ccaaagccta aaacacatga gtgttcaatt tgtggattgg aatttgctgt aggacaagct 300
[0011]ttgggaggcc acatgaggag acatagaaag gaagcttcaa atggaaacat aaagagttct 360
[0012]aataatttta tgactatgag tggaagtact agtggcggta gtagtgttga tacttcaaca 420[0013]aaaagaggga acaatagcaa gagatcaatt ttgtttcccg atttgaattt gacaccttta 480
[0014]gagaatgatt tggagttttt gaagattgga aaaccaactc ctttggttca ttgtttcaat 540
[0015]tga543
[0016]在本發(fā)明中，將SEQ ID NO:1所示的基因序列命名為MpZFP。
[0017]本發(fā)明的第二個目的在于提供一種水黃皮耐逆相關(guān)基因MpZFP編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。在本發(fā)明中，水黃皮耐逆相關(guān)基因MpZFP編碼的蛋白質(zhì)的具體長度為180aa，如SEQ ID NO:2所示:
[0018]
Met Lys Arg Glu Arg Glu Gly Asp Ser He Thr Met Ala Asn Tyr Leu Met Leu Leu
IKIΠI R
IOIvi iJ
Ser Gly Ser Gtu Phe Glu Ser Asn Asn Asn Phc Phe Λκn Ser Ser- km Asn Arg20253035
Viil Glu Cys Lys Thr Cvs Asn Arg G!n Phc GIn Scr Fhc ΙΠ n Ala Leu (iIy illy
40455055
His Arg Ala Ser His Lys Lys Pro Arg Leu Met Gly Asp Gly Gln VnJ Leu Asn Asp
60857075
Asp Asp Ser Pro Pro Lys Pro Lys Thr Ilis (Hu Cvs Ser He Cys Gly Lcu Ciiu Fhe
80859095
AIa Val GIy GIn Ala Leu GIy Gly His Met Arg Arg His Arg Lys Clu AIa Ser Am
100105HO
Cly Asn He Lys Ser St'r Asn Asn Phe Met Thr Mei Ser Cly Ser Thr Ser Gly Cly115120125130
Ser Ser Val Asp Thr Ser Thr Lys Arg Gly Asn Asn Ser Lys Arg Ser Ila Leu Plia
135140145150
Pro Asp Lvu Asn Leu Thr Fro Leu Glu Asn Asp Ixm Clu Phe Leu Lys I Ie €1y Lys
155160165170
Pro Thr Pro l,eu VaI His Cys Fhe Asn
175180
[0019]本發(fā)明的第三個目的在于提供一種含有所述水黃皮耐逆相關(guān)基因MpZFP的重組載體。
[0020]所述重組載體為重組植物表達載體。所述重組載體可以通過將上述水黃皮耐逆相關(guān)基因MpZFP插入到克隆載體或表達載體而得到。
[0021]適于構(gòu)建本發(fā)明所述重組載體的克隆載體包括但不限于，例如pMDlS-T、pMD19_T、pMD20-T 、pMD19-T Simple Vecter、pUC18、pUC19、pUC118、pUC119 等。
[0022]適于構(gòu)建本發(fā)明所述的表達載體包括但不限于，例如:pBI121、pl3W4、pGEM等。[0023]重組植物表達載體包括但不限于雙元農(nóng)桿菌表達載體、可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)?；?如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3’端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。
[0024]使用MpZFP構(gòu)建重組植物表達載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種組成型啟動子，如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動子、玉米的泛素啟動子(Ubiquitin)，它們可單獨使用或與其它植物啟動子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉(zhuǎn)錄增強子，這些增強子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。
[0025]為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入可在植物中表達的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因,直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。
[0026]本發(fā)明的第四個目的在于提供含有本發(fā)明所述重組載體的重組細胞。所述重組細胞可以通過將含有水黃皮耐逆相關(guān)基因MpZFP的重組載體轉(zhuǎn)化至宿主細胞而得到。
[0027]適于構(gòu)建本發(fā)明所述重組細胞的宿主細胞包括但不限于，例如:根癌農(nóng)桿菌細胞LBA4404、EHA105、GV3101 等。
[0028]在本發(fā)明的一個實施方案中，所述重組細胞為根癌農(nóng)桿菌細胞LBA4404_MpZFP。
[0029]本發(fā)明的第五個目的在于提供所述水黃皮耐逆相關(guān)基因MpZFP及其編碼的蛋白質(zhì)在提高植物耐逆性中的應(yīng)用，尤其在提高作物耐逆性中的應(yīng)用。
[0030]本發(fā)明的第六個目的在于提供一種提高植物耐逆性的方法，將水黃皮耐逆相關(guān)基因MpZFP導(dǎo)入植物組織或細胞，得到耐逆性提高的植物，所述水黃皮耐逆相關(guān)基因MpZFP是下述核苷酸序列之一:
[0031]1) SEQ ID NO:1 所示 DNA 序列；
[0032]2)編碼SEQ ID NO:2所示氨基酸殘基序列的DNA序列。
[0033]所述水黃皮耐逆相關(guān)基因MpZFP通過含有所述水黃皮耐逆相關(guān)基因MpZFP的重組植物表達載體導(dǎo)入植物組織或細胞。
[0034]所述重組植物表達載體為PBI121_MpZFP。
[0035]本發(fā)明又一方面，還涉及一種制備本發(fā)明所述水黃皮耐逆相關(guān)基因MpZFP的方法，包括如下步驟:利用分子生物學(xué)方法從水黃皮中克隆耐逆相關(guān)基因，命名為MpZFP。
[0036]所述水黃皮耐逆相關(guān)基因MpZFP還可以通過人工合成的方法制備，例如:利用核酸合成儀，根據(jù)SEQ ID NO:1所示堿基，人工合成水黃皮耐逆相關(guān)基因MpZFP。
[0037]本發(fā)明的技術(shù)路線為:
[0038]1)利用分子生物學(xué)方法從水黃皮中克隆耐逆相關(guān)基因，命名為MpZFP ；
[0039]2)構(gòu)建MpZFP重組植物表達載體PBI121_MpZFP，用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得轉(zhuǎn)MpZFP基因擬南芥；
[0040]3)結(jié)果表明=MpZFP基因在擬南芥中超表達，提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性。
[0041]本發(fā)明克隆了一種水黃皮耐逆相關(guān)基因MpZFP，構(gòu)建MpZFP重組植物表達載體，用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得轉(zhuǎn)MpZFP基因擬南芥，結(jié)果表明MpZFP基因在擬南芥中超表達，提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性。證明MpZFP基因具有提高植物耐逆性的作用。
【專利附圖】

【附圖說明】[0042]圖1為實時熒光定量PCR分析MpZFP基因在鹽脅迫處理下的表達特征圖；[0043]圖2MpZFP重組植物表達載體PBI121-MpZFP構(gòu)建流程圖；[0044]圖3為MpZFP基因在轉(zhuǎn)MpZFP基因擬南芥植株中的表達量RT-PCR檢測圖；[0045]圖4為野生型植株和轉(zhuǎn)MpZFP基因植株在鹽脅迫下的相對根長測定及表型觀察圖，注:(a)縱坐標(biāo)相對根長用小數(shù)表不作圖,兩個星號表不P〈0.01 ；[0046]圖5為野生型植株和轉(zhuǎn)MpZFP基因植株在鹽脅迫下的生長比較圖，注:(a)轉(zhuǎn)基因擬南芥在150mM NaCl脅迫10天后恢復(fù)10天和30天表型觀察；(b)轉(zhuǎn)基因擬南芥在150mMNaCl脅迫10天后恢復(fù)10天的存活率統(tǒng)計；(c)轉(zhuǎn)基因擬南芥在150mM NaCl脅迫10天后恢復(fù)30天的干重統(tǒng)計；(d)轉(zhuǎn)基因擬南芥在150mM NaCl脅迫10天后恢復(fù)30天統(tǒng)計主莖高；一個星號表不P〈0.05,兩個星號表不P〈0.01。
【具體實施方式】
[0047]以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)路線做進一步詳細說明。
[0048]實施例1水黃皮耐逆性相關(guān)蛋白MpZFP編碼基因的篩選及其全長cDNA克隆
[0049]用海水(相當(dāng)于30%。NaCl)和淡水處理水黃皮一月齡植株，然后選取處理2、4和8小時的根和葉樣品分別進行RNA提取，再將三個時間點的RNA等量混合，構(gòu)建得到四個文庫(即根淡水處理、根海水處理、葉淡水處理和葉海水處理)后進行Illumina測序。最后，將測序結(jié)果進行組裝和拼接，得到十萬多條unigene序列。根據(jù)以下三個原則選擇基因:首先，該基因在鹽脅迫后表達顯著上調(diào)表達；其次，該基因同源性最高的序列來自于豆科物種；再次，與該基因相似性最大的幾個基因在植物耐鹽和干旱機制方面的還未見研究報道。根據(jù)以上三原則得到一個水黃皮基因，其表達受鹽脅迫誘導(dǎo)。
[0050]提取水黃皮幼苗總RNA，通過RACE技術(shù)獲取全長cDNA。將水黃皮總RNA分別經(jīng)5’和3’RACE所用化學(xué)試劑處理，然后進行巢式PCR，將得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的片段。將該回收片段與PMD18-T載體連接，把連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10感受態(tài)，通過PMD18-T載體上的氨芐青霉素抗性標(biāo)記篩選陽性克隆，得到回收片段的重組質(zhì)粒。以該重組質(zhì)粒載體上的M13-47和RV-M序列引物進行測序。將測序結(jié)果用GeneTool軟件進行拼接并分析，又將拼接后序列與轉(zhuǎn)錄組測序獲得的序列進行比對，并且將拼接后序列與NCBI數(shù)據(jù)庫比對。比對結(jié)果表明，RACE所獲得的序列在5’端具有帽子結(jié)構(gòu)，在3’端具有poly (A)結(jié)構(gòu)，說明這就是全長cDNA序列，進一步分析獲得了開發(fā)閱讀框(0RF)。結(jié)果表明MpZFP基因由543個脫氧核糖核苷酸組成，具體序列如SEQ IDNO:1所示；其編碼的蛋白質(zhì)，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0051]RACE巢式所用引物如下:
【權(quán)利要求】
1.一種水黃皮耐逆相關(guān)基因MpZFP，其堿基序列如SEQ ID NO:1所示。
2.權(quán)利要求1所述的水黃皮耐逆相關(guān)基因MpZFP編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQID NO:2 所示。
3.含有權(quán)利要求1所述水黃皮耐逆相關(guān)基因MpZFP的重組載體。
4.權(quán)利要求3所述重組載體為重組植物表達載體。
5.含有權(quán)利要求3或4所述重組載體的重組細胞。
6.權(quán)利要求1所述水黃皮耐逆相關(guān)基因MpZFP在提高植物耐逆性中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求6所述植物為農(nóng)作物。
8.一種提高植物耐逆性的方法，將水黃皮耐逆相關(guān)基因MpZFP導(dǎo)入植物組織或細胞，得到耐逆性提高的植物，所述水黃皮耐逆相關(guān)基因MpZFP是下述核苷酸序列之一:
1)SEQ ID N O:1 所示 DNA 序列； 2)編碼SEQID NO:2所示氨基酸殘基序列的DNA序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于:所述水黃皮耐逆相關(guān)基因MpZFP通過含有所述水黃皮耐逆相關(guān)基因MpZFP的重組植物表達載體導(dǎo)入植物組織或細胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于:所述重組植物表達載體為PBII21-MpZFP。
【文檔編號】C07K14/415GK103468711SQ201310364191
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年8月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月20日
【發(fā)明者】鄭易之, 黃健子, 陳受宜, 黃榮峰, 張萬科, 陸翔 申請人:深圳大學(xué)