電子標(biāo)簽親和配體庫及用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種電子標(biāo)簽親和配體庫、構(gòu)建方法和用途；提供了基于配體結(jié)構(gòu)信息的電子標(biāo)簽化技術(shù)、配體在標(biāo)簽封裝材料上的合成技術(shù)、靶生物分子標(biāo)記、無標(biāo)記篩選技術(shù)，用于快速、特異、高通量篩選靶生物分子的親和配體；本發(fā)明的電子標(biāo)簽配體庫針對(duì)靶生物分子篩選的親和配體可以用于研發(fā)蛋白純化的親和材料、疾病靶點(diǎn)抑制劑和藥物的非共價(jià)結(jié)合長(zhǎng)效制劑輔料。
【專利說明】電子標(biāo)簽親和配體庫及用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域的親和配體，具體涉及一種電子標(biāo)簽親和配體庫、構(gòu)建 方法和在生物醫(yī)藥中用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 藥物分子與生物大分子（如蛋白質(zhì)）的結(jié)合是具有良好生物利用度、代謝穩(wěn)定 性和低毒性的前提。尋找到能夠和生物靶分子高度親和性和選擇性結(jié)合的配體分子（通 常稱為親和配體、先導(dǎo)化合物、lead compound)是新藥研發(fā)的重要起步，也是制備生物革巴 分子親和純化分離材料的基礎(chǔ)。為了能快速地研發(fā)靶分子親和配體，近20多年來已經(jīng)發(fā) 展了許多方法，包括以結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的分子設(shè)計(jì)和用生物靶分子篩選化合物庫，如美國(guó)專 利申請(qǐng) US20090240033A1 "Affinity Matrix Library and Its Use" 公布了在瓊脂糖、 娃膠、纖維素、玻璃、Toyopearl、Hydroxyethymethacrylate、Polyacrylamide、Hyper D、 Stryrenedivinylbenzene或者Perfluorocarbons介質(zhì)上合成的親和配基庫。在篩選親和 配體分子是，需要將每種介質(zhì)分別裝層析柱，用樣品逐個(gè)柱子進(jìn)行親和層析操作，評(píng)估純化 效果；篩選親和配體需要的樣品量多，操作過程繁瑣、時(shí)間長(zhǎng)、人力物力需求大。因此，需要 建立操作簡(jiǎn)單、時(shí)間短、速度快、高通量高的針對(duì)生物靶分子的親和配體庫以及篩選系統(tǒng)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明利用電子芯片作為親和配體結(jié)構(gòu)信息存儲(chǔ)和讀取的電子標(biāo)簽，在包裹封裝 材料上合成親和配體庫、利用靶生物分子（標(biāo)記和無標(biāo)記）進(jìn)行篩庫，挑選能夠和靶分子結(jié) 合的親和配體，讀出芯片中親和配體分子結(jié)構(gòu)信息，組成一種快速、高通量親和配體篩選系 統(tǒng)。電子標(biāo)簽通過封裝，如玻璃管封裝，對(duì)封裝材料表面基團(tuán)進(jìn)行功能化衍生、活化，直接用 化學(xué)反應(yīng)共價(jià)偶聯(lián)配基分子，和/或通過多活性位點(diǎn)的骨架分子分步偶聯(lián)多種分子合成親 和配體庫。在篩選階段，利用天然或基因工程表達(dá)蛋白的標(biāo)記和/或無標(biāo)記篩選，快速篩選 到能夠結(jié)合靶生物分子的親和配體。篩選過程操作簡(jiǎn)單、快速。
[0004] 因此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于構(gòu)建一個(gè)電子標(biāo)簽親和配體庫，親和配體信息存儲(chǔ) 在配體所在的電子標(biāo)簽中；
[0005] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于建立用生物分子快速篩選電子標(biāo)簽親和配體的方法，靶 生物分子（標(biāo)記和/或無標(biāo)記）樣品與親和配體庫孵育，讀取每個(gè)親和配體標(biāo)簽上的靶生 物分子信號(hào)、挑出信號(hào)最高的親和配體標(biāo)簽，用讀寫器直接閱讀配體結(jié)構(gòu)信息，從而實(shí)現(xiàn)快 速、高通量靶生物分子特異的親和配體篩選。
[0006] 本發(fā)明的再一個(gè)目的是篩選天然蛋白或基因工程表達(dá)蛋白的親和配體，發(fā)展親和 純化分離材料和純化工藝。
[0007] 本發(fā)明中，所述的親和配體庫是在內(nèi)置電子標(biāo)簽的玻璃封裝管表面化學(xué)偶聯(lián)小分 子配體化合物、配體化合物含有多種功能基團(tuán)、構(gòu)成多種特異空間構(gòu)象、可特異性結(jié)合多種 蛋白，包括：以具有讀、寫功能的電子標(biāo)簽用玻璃管為封裝基質(zhì)，并對(duì)玻璃管表面進(jìn)行功能 化處理，及偶聯(lián)和原位合成多種結(jié)構(gòu)的小分子配基化合物，構(gòu)成親和配體庫，可以用于高通 量、規(guī)?；牡鞍缀Y選。
[0008] 本發(fā)明中所述的靶蛋白親和配體的高通量、快速篩選，和親和材料的制備、分離與 純化方法的建立，包括標(biāo)記和/或無標(biāo)記靶蛋白與親和配體庫的孵育、洗滌、陽性標(biāo)簽的挑 選，配體結(jié)構(gòu)信息的讀取，以及標(biāo)簽的洗脫再生；
[0009] 本發(fā)明中所述的篩選方法在標(biāo)記或無標(biāo)記的天然蛋白或基因工程表達(dá)蛋白篩選、 分離與純化中的應(yīng)用，是用少量靶蛋白純品與親和配體庫中的電子標(biāo)簽玻璃管孵育，用熒 光信號(hào)或其它非標(biāo)記信號(hào)挑選吸附靶蛋白陽性信號(hào)電子標(biāo)簽玻璃管，讀取親和配體的結(jié)構(gòu) 信息；
[0010] 本發(fā)明中所述的靶蛋白的親和層析方法是根據(jù)篩選得到的親和配體信息在層析 介質(zhì)上偶聯(lián)和/或合成相應(yīng)的親和配體，用于蛋白的快速篩選及分離與純化。
[0011] 這種小分子仿生親和配基比天然生物分子性質(zhì)更穩(wěn)定，特異性及重復(fù)性更好，尤 為突出的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是：可一次性合成大量的小分子化合物的配體庫，用于蛋白質(zhì)的篩選、分 離與純化。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 圖1是實(shí)施例三仿生親和材料純化抗體的SDS-PAGE電泳圖
[0013] 圖2是實(shí)施例三仿生親和材料純化蛋白A的SDS-PAGE電泳圖 [0014] 表1，100 X 100電子（標(biāo)簽）玻璃管小分子配體編號(hào)及屬性列（表）
[0015] 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，具體包括如下步驟：
[0016] 步驟一：電子標(biāo)簽親和配體庫的構(gòu)建：包括將一定數(shù)量的電子標(biāo)簽玻璃管與活化 試劑置于低溫環(huán)境下攪拌1-12小時(shí)，反應(yīng)過程中用酸或堿性試劑調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH5-10,用有 機(jī)溶劑或水清洗電子標(biāo)簽玻璃管2-20次，剔除未結(jié)合活化試劑，最后將電子標(biāo)簽玻璃管浸 泡于10% -30%的乙醇或丙酮的水溶液，低溫保存待用。
[0017] 將功能化反應(yīng)的可讀寫二維數(shù)碼的電子標(biāo)簽按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的規(guī)則進(jìn)行寫與讀的操 作，使每個(gè)電子標(biāo)簽玻璃管具有相應(yīng)的獨(dú)立的編號(hào)；根據(jù)擬構(gòu)建配體庫的大小，將一定數(shù)量 的電子標(biāo)簽玻璃管分裝在特定濃度的配（體）反應(yīng)液的容器中。固定在立式旋轉(zhuǎn)烘箱中， 調(diào)節(jié)溫度為20-55°C，轉(zhuǎn)速為5-100rpm，反應(yīng)5-48小時(shí)，并用酸或堿性溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)液的Ph 值至PH5-9。待反應(yīng)結(jié)束后用乙醇，丙酮，DMF(N'N-二甲基甲酰胺）或水等溶劑洗滌電子 標(biāo)簽玻璃管5-20次，除去未結(jié)合的游尚的小分子配基。
[0018] 已寫、讀和偶聯(lián)了第一個(gè)小分子配基的電子標(biāo)簽玻璃管，只需對(duì)其第二個(gè)可讀、寫 編碼區(qū)的數(shù)字進(jìn)行讀與寫操作。
[0019] 將一定數(shù)量的已偶聯(lián)第一個(gè)小分子配基且完成第二個(gè)小分子配基編號(hào)的電子標(biāo) 簽玻璃分組后分裝在內(nèi)含一定濃度的特定配基溶液的容器中，固定在立式旋轉(zhuǎn)烘箱中，調(diào) 節(jié)烘箱溫度至45-98 (85-95) °C，轉(zhuǎn)速為10-200rpm，反應(yīng)24-72小時(shí)，反應(yīng)過程中每4-8小 時(shí)測(cè)定反應(yīng)液的pH值，并用酸或堿性溶液調(diào)節(jié)至pH5-10 ;待反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫。用乙 醇、丙酮，DMF(Ν' N-二甲基甲酰胺）或其他有機(jī)溶劑或水洗滌電子標(biāo)簽玻璃管5-20次，除 去未結(jié)合的游離的小分子配基。最后將電子標(biāo)簽玻璃管浸泡于5-20%的乙醇、Ν' Ν二甲基 甲酰胺或丙酮的水溶液中，低溫保存待用。
[0020] 步驟二：本發(fā)明中，所述的蛋白質(zhì)的高通量、快速篩選，分離與純化方法的建立； 它包括靶蛋白的范圍為標(biāo)記、非標(biāo)記的天然蛋白或基因工程表達(dá)蛋白與偶聯(lián)有不同配體電 子標(biāo)簽玻璃管在4-70°C下孵育0. l_6h，用pH3-12的離子濃度為0. 005-2M的緩沖液漂洗未 結(jié)合的蛋白，挑出蛋白信號(hào)最強(qiáng)的10個(gè)標(biāo)簽、讀取配體結(jié)構(gòu)信息。測(cè)定標(biāo)簽上

【具體實(shí)施方式】
[0021] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，以下實(shí)施方式只以舉例的方式描述本發(fā) 明。很明顯，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可在本發(fā)明的范圍和實(shí)質(zhì)內(nèi)，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種變通和修 改。需要了解的是，本發(fā)明意欲涵蓋在所附權(quán)利要求書中包括的變通和修改。
[0022] 實(shí)施例一：
[0023] 高通量仿生親和配體庫的構(gòu)建
[0024] 電子標(biāo)簽芯片上的可讀、寫碼區(qū)由一個(gè)10位數(shù)的條碼讀寫區(qū)，和一個(gè)4位數(shù)的的 條碼讀寫區(qū)組成。本配體庫用第一個(gè)10位數(shù)的條碼讀寫區(qū)記錄，用射頻讀寫器寫與讀的操 作。編碼和信息寫入規(guī)則：第一個(gè)10位數(shù)讀、寫碼區(qū)的第0位數(shù)字表示配體庫的構(gòu)建批次 第1次小分子配體庫的構(gòu)建信息用寫入1。對(duì)氨基化合物依次按照從001號(hào)起始至100號(hào) 編號(hào)，作為第一個(gè)功能基團(tuán)偶聯(lián)至電子標(biāo)簽時(shí)，化合物編碼寫入第一條碼讀寫區(qū)最后的第 6-9位；當(dāng)作為第二個(gè)功能基團(tuán)偶聯(lián)至電子標(biāo)簽時(shí)，化合物編碼寫入第二條碼讀寫區(qū)的第 1 _3位，第0位寫入1。
[0025] 將20000只電子標(biāo)簽玻璃管（1. 5mmX 7mm)，第1位寫入1，代表第1批次合成雙基 團(tuán)配體。裝入2L的錐型塑料瓶中，加入500ml無水甲苯和7. 5mmol3_氨基丙基三甲氧基娃 烷和92. 5mmol的正硅酸四乙酯試劑，50°C攪拌反應(yīng)24h，冷卻傾去反應(yīng)液，用無數(shù)乙醇洗滌 10次，用20 %乙醇保存?zhèn)溆谩?br> [0026] 配制濃度為0. 5mg/ml的三氯三氮嗪（C3N3C13)-丙酮溶液1000ml，置于-20冰箱預(yù) 冷1小時(shí)后，將10000個(gè)待活化電子標(biāo)簽玻璃管裝入含冷丙酮溶液的塑料瓶中，置于4°C攪 拌器上反應(yīng)5分鐘后，將配制好的0. 5mg/ml的三氯三氮嗪（C3N3C13)-丙酮溶液加入塑料瓶 中，使三氯三氮嗪（C 3N3C13)終濃度為0. lmg/ml，攪拌20分鐘后測(cè)定溶液pH值，并不斷用飽 和Na2C03溶液調(diào)節(jié)三氯三氮嗪（C 3N3C13)-丙酮溶液pH值為pH7-8,繼續(xù)在攪拌器上攪拌反 應(yīng)4. 5小時(shí)后，用蒸餾水洗滌電子標(biāo)簽玻璃管10次，得活化的電子標(biāo)簽（玻璃管）4°C冰箱 中保存待用。
[0027] 對(duì)氨基化合物依次按照從001號(hào)起始至100號(hào)編號(hào)；取100個(gè)電子標(biāo)簽，把1001 寫入電子標(biāo)簽第一條碼讀寫區(qū)的第2-4位，然后裝入100ml的耐高溫塑料瓶，加入配制好的 1號(hào)小分子氨基化合物溶液，密封固定在攪拌反應(yīng)箱中，在50°C攪拌反應(yīng)24小時(shí)，實(shí)驗(yàn)反應(yīng) 過程中，前8小時(shí)左右，每2小時(shí)測(cè)量一次反應(yīng)液的pH值，用飽和Na 2C03溶液（水為溶劑的 反應(yīng)液）維持PH7-10。待反應(yīng)結(jié)束后用丙酮、DMF(溶于有機(jī)溶劑的含氨基的小分子配基） 或水依次洗滌電子標(biāo)簽玻璃管5-15次。洗滌過程中每瓶電子標(biāo)簽玻璃管單獨(dú)洗滌，避免混 合；4°C保存待用；依次對(duì)其余氨基化合物編號(hào)，寫入各批次電子標(biāo)簽，合成相應(yīng)結(jié)構(gòu)寫入 電子標(biāo)簽的配體，合成上相應(yīng)化合物，得所有化合物偶聯(lián)的電子標(biāo)簽子庫。
[0028] 從已經(jīng)偶聯(lián)第一個(gè)化合物的電子標(biāo)簽字庫中各取一個(gè)，共100個(gè)電子標(biāo)簽，把001 寫入電子標(biāo)簽第一條碼讀寫區(qū)的第5-7位，然后裝入100ml的耐高溫塑料瓶，加入配制好的 1號(hào)小分子氨基化合物溶液，密封固定在攪拌反應(yīng)箱中，在95°c攪拌反應(yīng)24小時(shí)，實(shí)驗(yàn)反應(yīng) 過程中，前8小時(shí)左右，每2小時(shí)測(cè)量一次反應(yīng)液的pH值，用飽和Na2C03溶液（水為溶劑的 反應(yīng)液）維持PH7-10。待反應(yīng)結(jié)束后用N'N-二甲基甲酰胺和水依次洗滌電子標(biāo)簽玻璃管 5-15次。洗滌過程中每瓶電子標(biāo)簽玻璃管單獨(dú)洗滌，避免混合；4°C保存待用；繼續(xù)從已經(jīng) 偶聯(lián)第一個(gè)化合物的電子標(biāo)簽字庫中各取一個(gè)，共100個(gè)電子標(biāo)簽，依次將其余氨基化合 物編號(hào)寫入各批次電子標(biāo)簽，合成相應(yīng)化合物，電子標(biāo)簽配體庫1。
[0029] 實(shí)施例二：
[0030] 高通量仿生親和配體庫的構(gòu)建
[0031] 將300只電子標(biāo)簽玻璃管（1.5mmX7mm)，第1位寫入2,代表第2批次合成單基團(tuán) 配體。裝入500mL的錐型塑料瓶中，加入200ml無水甲苯和7. 5mmol2,3-環(huán)氧基丙基三甲 氧基硅烷和92. 5mmol的正硅酸四乙酯試劑，50°C攪拌反應(yīng)24h，冷卻傾去反應(yīng)液，用無數(shù)乙 醇洗滌10次，用20 %乙醇保存?zhèn)溆谩?br> [0032] 每次取3個(gè)電子標(biāo)簽，第一條碼讀寫區(qū)的第2-4位寫入001，然后裝入50ml的耐 高溫塑料瓶，加入配制好的1號(hào)小分子氨基化合物溶液，密封固定在攪拌反應(yīng)箱中，在60°C 攪拌反應(yīng)24小時(shí)，實(shí)驗(yàn)反應(yīng)過程中，前8小時(shí)左右，每2小時(shí)測(cè)量一次反應(yīng)液的pH值，用飽 和Na2C0 3溶液（水為溶劑的反應(yīng)液）維持pH7-10。待反應(yīng)結(jié)束后用DMF和水依次洗滌電 子標(biāo)簽玻璃管5-15次。洗滌過程中每瓶電子標(biāo)簽玻璃管單獨(dú)洗滌，避免混合；4°C保存待 用；依次將其余氨基化合物編號(hào)寫入各批次電子標(biāo)簽，合成相應(yīng)結(jié)構(gòu)的化合物，得所有化合 物偶聯(lián)的電子標(biāo)配體庫2。
[0033] 實(shí)施例三：
[0034] 電子標(biāo)簽親和配體庫在蛋白純化中的應(yīng)用
[0035] 將人血清免疫球蛋白 IgG 共 11. 8mg(5ml，2. 36mg/ml)用 PBS(0. 01M ΡΒ+0· 15M NaCl，pH7. 4)緩沖液稀釋至濃度為1. 2mg/ml，4°C冷柜內(nèi)的磁力攪拌器上攪拌5?10分鐘， 取FITC (異硫氰酸熒光素）0. 12mg與待標(biāo)記抗體進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)：將秤取的FITC熒光素緩慢 加入稀釋后的抗體中，在10分鐘內(nèi)全部加入，攪拌15h，12000g離心lOmin，除去少量沉淀 物，將標(biāo)記的抗體溶液裝入透析袋中，用0. 01M PBS(0. 01M PB+0. 15M NaCl，pH7. 4)，在4°C 透析過夜，最后用SepHadex G-25脫鹽柱過濾除掉游離突光素，收集標(biāo)記的突光抗體。
[0036] 將人血漿蛋白用0. 01M PBS(0. 15M NaCl，pH7. 4)稀釋至濃度為3mg/ml，與相應(yīng)濃 度的FITC標(biāo)記的蛋白按照已標(biāo)記IgG :人血漿=1 : 9的比例配制的混合物；
[0037] 從電子標(biāo)配體庫1中取出200個(gè)電子標(biāo)簽玻璃管，置于100ml塑料瓶中，加入30ml 的已配制含F(xiàn)ITC標(biāo)記IgG的人血漿蛋白，在4°C條件下，輕微震蕩孵育30min，然后取出 IgG樣品，加30ml 0.01M PBS(0.01M ΡΒ+0· 15M NaCl，ρΗ7·4)平衡緩沖液在室溫下輕微震 蕩lOmin，取出平衡緩沖液，重復(fù)此操作10次。最后將電子標(biāo)簽玻璃管置于熒光酶標(biāo)板內(nèi)， 經(jīng)保鮮膜包裹后，置于FLA-5100多功能掃描儀進(jìn)行熒光成像掃描（激發(fā)光473nm，吸收光 532nm，分辨率為lOOum)，電子標(biāo)簽玻璃管的突光值掃描與數(shù)據(jù)處理和分析。
[0038] 將熒光值高的電子標(biāo)簽玻璃管挑選出，分別選用pHIO和pH3的鹽離子濃度為 1-1. 5M的洗滌緩（沖液）震蕩洗滌20min，重復(fù)此操作兩次，分別收集兩次洗滌后的電子標(biāo) 簽玻璃管進(jìn)行二次熒光掃描，剔除熒光值高的電子標(biāo)簽玻璃管，保留熒光值較低電子標(biāo)簽 玻璃管，并讀取電子標(biāo)簽玻璃管的配基信息，為（1000000079,1039,），（1000000079,1074)， (1000000027,1049)，相應(yīng)結(jié)構(gòu)分別為i^一胺和4- (2氨乙基）-苯磺酰胺，L-絲氨酸和4- (2 氨乙基）-苯磺酰胺，2,4,6-三氨基嘧啶和乙二胺組成的雙基團(tuán)配體。在后續(xù)合成驗(yàn)證時(shí)分 別標(biāo)記為仿生親和配基7,仿生親和配基11和仿生親和配基14。
[0039] Sepharose 6B用三氯三氮嗪活化（操作參照《親和色譜導(dǎo)論》（洛（C. R. Lowe)著； 劉毓秀譯.科學(xué)出版社，1983年5月第1版），量取3份各50ml，估算三氮嗪摩爾數(shù)，分別 稱取5倍摩爾過量的氨基化合物（R1) 4-(2氨乙基）-苯磺酰胺，4-(2氨乙基）-苯磺酰胺， 乙二胺，溶解于l〇〇ml量的蒸餾水、DMF中，分別加入三氮嗪活化介質(zhì)中，混勻在50°C攪拌 反應(yīng)24h，反應(yīng)過程中飽和NaHC0 3溶液維持pH在7-8,反應(yīng)完成后取出，依次用10倍體積 DMF(N' N二甲基甲酰胺）和水洗滌介質(zhì)。
[0040] 再分別稱取5倍摩爾過量的氨基化合物（R2) i^一胺，L-絲氨酸，2,4,6-三氨基嘧 啶，溶解于l〇〇ml量的蒸餾水、DMF中，分別加入，已經(jīng)偶聯(lián)4-(2氨乙基）-苯磺酰胺，4-(2 氨乙基）-苯磺酰胺，乙二胺的三氮嗪活化介質(zhì)，混勻，95°C攪拌反應(yīng)24小時(shí)，反應(yīng)過程用飽 和NaHC0 3維持pH在7. 0-8. 0之間，反應(yīng)完成后取出依次用10倍體積DMF (Ν'N二甲基甲酰 胺）和水洗滌介質(zhì)，得仿生親和介質(zhì)7,仿生親和介質(zhì)11和仿生親和介質(zhì)14。用體積分?jǐn)?shù) 為20 %的乙醇保存待用。
[0041] 分別取仿生親和介質(zhì)7,仿生親和介質(zhì)11和仿生親和介質(zhì)14各2ml分別填裝10ml 塑料層析柱中，并在重力柱外壁標(biāo)記，用l〇ml PB (10mM，pH7. 4)緩沖液平衡各仿生親和層析 柱。將0.01M PBS緩沖液10倍稀釋人血漿蛋白樣品，取2ml上樣到各親和柱，用20ml0.01M 的PB溶液平衡，最后用10ml的50mMGly-HCl(pH3)和0. IN NaOH溶液洗脫吸附蛋白，用12% SDS-PAG(E)膠電泳檢測(cè)與分析仿生親和分離材料對(duì)人血漿中IgG抗體的吸附效果。仿生 親和材料7,11和14從人血清樣品中特異性分離純化IgG抗體的純度分別為95%，91 %和 86%。
[0042] 實(shí)施例四：
[0043] 取蛋白 A20mg用 20ml PBS(0. 01M ΡΒ+0. 15M NaCl，pH7. 4)緩沖液溶解，加 FITC(異 硫氰酸熒光素）〇. 15mg溶解后混合，4°C攪拌15h ;取出裝入透析袋中，用0. 01M PBS(0. 01M ΡΒ+0. 15M NaCl，pH7. 4)，在4°C透析過夜，收集熒光標(biāo)記蛋白A。
[0044] 從電子標(biāo)配體庫1中取出500個(gè)電子標(biāo)簽玻璃管，置于200ml塑料瓶中，加入50ml 熒光標(biāo)記蛋白A(0. lmg/ml)，在4°C條件下，輕微震蕩孵育30min，然后取出電子標(biāo)簽玻璃管 用0. 01M PBS(0. 01M ΡΒ+0. 15M NaCl，pH7. 4)緩沖液洗滌10次。最后將電子標(biāo)簽玻璃管置 于熒光酶標(biāo)板內(nèi)，經(jīng)保鮮膜包裹后，置于FLA-5100多功能掃描儀進(jìn)行熒光成像掃描（激發(fā) 光473nm，吸收光532nm，分辨率為100um)，電子標(biāo)簽玻璃管的熒光值掃描與數(shù)據(jù)處理和分 析。
[0045] 將熒光值高的電子標(biāo)簽玻璃管挑選出，分別選用pH10和pH3的鹽離子濃度為 1-1. 5M的洗滌緩震蕩洗滌20min，重復(fù)此操作兩次，分別收集兩次收集洗滌后的電子標(biāo)簽 玻璃管進(jìn)行二次熒光掃描，剔除熒光值高的電子標(biāo)簽玻璃管，保留熒光值較低電子標(biāo)簽玻 璃管，并讀取電子標(biāo)簽玻璃管的配基信息，為（1000000002,0000)，（1000000031,0000)， (1000000065,0000)，相應(yīng)結(jié)構(gòu)分別為正辛胺和組胺單基團(tuán)配體。在后續(xù)合成驗(yàn)證時(shí)分別標(biāo) 記為仿生親和配基CL3和仿生親和配基CL31。
[0046] Sepharose 6B用三氯三氮嗪活化（操作參照《親和色譜導(dǎo)論》（洛（C. R. Lowe)著； 劉毓秀譯.科學(xué)出版社，1983年5月第1版），量取3份各50ml，估算三氮嗪摩爾數(shù)，分別稱 取5倍摩爾過量的氨基化合物（R1)正辛胺，組胺和苯氨基甲酰肼，溶解于lOOmlDMF中，分 別加入三氮嗪活化介質(zhì)中，混勻在50°C攪拌反應(yīng)24h，反應(yīng)過程中飽和NaHC0 3溶液維持pH 在7-8,反應(yīng)完成后取出依次用10倍體積DMF(N'N二甲基甲酰胺）和水洗滌介質(zhì)。得仿生 親和介質(zhì)CL3和仿生親和介質(zhì)CL31，用體積分?jǐn)?shù)為20%的乙醇保存待用。
[0047] 分別取仿生親和介質(zhì)CL3和仿生親和介質(zhì)CL31各2ml分別填裝10ml塑料層析柱 中，并在重力柱外壁標(biāo)記，用l〇ml PB(10mM，pH7.4)緩沖液平衡各仿生親和層析柱。取2ml 大腸桿菌發(fā)酵重組表達(dá)的蛋白A樣品（按照中國(guó)專利申請(qǐng)：201110087262. 2制備）上樣到 各親和柱，用20ml 0. 01M的PB溶液平衡，最后用10ml的50mMGly-HCl (pH3)和0. IN NaOH 溶液洗脫吸附蛋白，用12 % SDS-PAG (E)膠電泳檢測(cè)與分析仿生親和分離材料純化蛋白A的 效果。仿生親和介質(zhì)CL3和仿生親和介質(zhì)CL31純化蛋白A的純度分別為96^,97?^
[0048] 表 1
[0049]

【權(quán)利要求】
1. 一種電子標(biāo)簽親和配體庫，其特征在于每個(gè)配體的結(jié)構(gòu)信息儲(chǔ)存于電子標(biāo)簽中，方 便能夠快速直接讀取。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的電子標(biāo)簽親和配體庫，其特征在于電子標(biāo)簽具備信息讀取、 寫入和擦除功能，工作方式含通過射頻讀、寫碼器進(jìn)行。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的電子標(biāo)簽親和配體庫，其特征在于電子標(biāo)簽由耐有機(jī)溶劑的 材料封裝，包括但不限于無機(jī)材料如玻璃、高分子材料如聚丙烯。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的電子標(biāo)簽親和配體庫，其特征是所述的親和配體包括但不限 于本發(fā)明中所列舉的有機(jī)化合物在電子標(biāo)簽封裝材料表面單個(gè)化合物直接化學(xué)固定和通 過多活性基團(tuán)骨架分步組合固定多種化合物合成復(fù)雜結(jié)構(gòu)配體。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的親和配體庫合成方法，其特征是多活性基團(tuán)骨架包括不限于 三氯三氮嗪、多肽固相合成。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的電子標(biāo)簽配體庫，其特征在于構(gòu)建步驟包括但不限于電子標(biāo) 簽玻璃管的表面功能化處理、活化反應(yīng)、電子標(biāo)簽玻璃管的讀、寫編碼和小分子配基的偶聯(lián) 反應(yīng)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的電子標(biāo)簽親和配體庫，其特征在于篩選目標(biāo)分子的親和配 體，篩選時(shí)目標(biāo)分子可以用熒光素，酶，放射性同位素標(biāo)記，也可以是非標(biāo)記的天然蛋白質(zhì) 或基因工程表達(dá)的融合蛋白。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的電子標(biāo)簽親和配體庫，其特征在于所篩選的親和配體用于發(fā) 展目標(biāo)分子的分離純化材料。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的電子標(biāo)簽親和配體庫，其特征在于所篩選的親和配體用于研 發(fā)目標(biāo)分子的抑制劑。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的電子標(biāo)簽親和配體庫，其特征在于所篩選的親和配體用于 研發(fā)目標(biāo)分子的長(zhǎng)效制劑輔料。
【文檔編號(hào)】C07K1/22GK104156739SQ201310178037
【公開日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2013年5月14日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月14日
【發(fā)明者】馬貴軍, 李榮秀, 馬國(guó)榮, 葉龍 申請(qǐng)人:馬貴軍