高純度替考拉寧的分離純化法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高純度替考拉寧的分離純化法，是將替考拉寧發(fā)酵液用微濾膜除去發(fā)酵液中固含，含替考拉寧的微濾液通過納濾膜濃縮，得到替考拉寧濃縮液；濃縮液再經(jīng)過兩次大孔吸附樹脂吸附洗脫后，得到高純度的替考拉寧洗脫液；最后將洗脫液納濾濃縮，往濃縮液中加入蛋白沉淀劑丙酮，使?jié)饪s液蛋白質(zhì)沉淀，過濾除去蛋白質(zhì)，得到濾液；往濾液中加入活性炭脫色，過濾得到脫色液；最后往脫色液中加入丙酮后低溫結(jié)晶，晶體經(jīng)真空干燥，獲得純度大于96%的高純度的替考拉寧成品。本發(fā)明成本低，替考拉寧分離純度高，適宜商業(yè)化大生產(chǎn)。
【專利說明】高純度替考拉寧的分離純化法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種高純度替考拉寧分離純化方法，屬于抗生素分離純化【技術(shù)領(lǐng)域】?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]替考拉寧(Teicoplanin)為替考游動(dòng)放線菌發(fā)酵產(chǎn)生的一組糖肽類抗生素，是繼國際公認(rèn)的抗耐藥菌抗生素萬古霉素后開發(fā)的另一種抗耐藥菌糖肽類抗生素，主要對革蘭氏陽性需氧和厭氧菌具有較強(qiáng)的抗菌活性，特別對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)引起的感染有很好的療效，是目前臨床上為數(shù)不多的仍具有對多重耐藥性金黃色葡萄球菌和腸球菌有抗菌活性的藥物之一。
[0003]替考拉寧是5個(gè)化學(xué)結(jié)構(gòu)十分相似化合物Teicoplanin A2(TA2-1、TA2_2、TA2_3、TA2-4、TA2-5)和去?；咸前稵eicoplanin A3 ( T-A3)組成的混合物，其中TA2-2為主要有效成分多種成分組成的混合物。結(jié)構(gòu)復(fù)雜，對熱、酸、堿穩(wěn)定性差，生產(chǎn)過程中容易引起失活和分解，且發(fā)酵液中替考拉寧的含量較低，目前采用的分離純化過程較復(fù)雜。替考拉寧主要的提取方法有:溶媒萃取法、吸附法、離子交換法和色譜法。溶媒萃取法由于溶劑使用量大，分離純化效果差，制備的最終產(chǎn)品純度低，所以目前該法已經(jīng)很少采用。離子交換法，由于使用酸性離子交換樹脂會(huì)增加T-A2糖基部分的降解，強(qiáng)堿性離子交換樹脂卻易增加T-A2的差向異構(gòu)化，且離子交換樹脂因選擇性較差也不能有效地用于純化T- A2，因此該法的應(yīng)用前景不被看好。色譜法，由于使用的色譜填料昂貴，生產(chǎn)成本高，不利于工業(yè)化運(yùn)用。吸附法采用的主要介質(zhì)為大孔吸附樹脂、活性炭等，其原料易得、價(jià)格低廉，替考拉寧純化效果好，已成為替考拉寧提取的主要方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供了一種高純度替考拉寧的分離純化法，采用吸附法結(jié)合膜分離、結(jié)晶等方法，成本低，替考拉寧分離純度高，適宜商業(yè)化大生產(chǎn)。
[0005]一種高純度替考拉寧的分離純化法，其特征在于步驟如下:
(1)將替考拉寧發(fā)酵液用微濾膜除去發(fā)酵液中固含，得到含替考拉寧的微濾液；微濾膜可除去發(fā)酵液中菌絲體、培養(yǎng)基等固含物質(zhì)；微濾膜孔徑為0.1 μ m ;微濾膜材質(zhì)為無機(jī)陶瓷膜；
(2)濾液通過截留分子量為700~800Da納濾膜濃縮，得到替考拉寧濃縮液；
通過納濾膜能減少微濾液中的水分，濃縮替考拉寧產(chǎn)物，減少后續(xù)樹脂吸附上樣的時(shí)
間；
(3)替考拉寧濃縮液再經(jīng)過兩次樹脂吸附洗脫后，得到高純度的替考拉寧洗脫液；
所述的樹脂均為大孔吸附樹脂，其中包括AMBERLITE XAD 1180N.AMBERLITE XAD 7HP、DIAION HP20、上海華震 HZ801 和 HZ816 等；
所述的洗脫劑可以是丙酮、異丙醇或乙腈水溶液；
洗脫方法是采用低濃度的洗脫溶劑清洗以去除樹脂上吸附的雜質(zhì)和色素，中等濃度的洗脫溶劑對樹脂吸附替考拉寧產(chǎn)物進(jìn)行洗脫；其中，低濃度清洗丙酮、異丙醇和乙腈水溶液濃度分別為15~20%、15%~22%和16%~23%;中等濃度的洗脫溶劑丙酮、異丙醇和乙腈濃度分別為28~30%、25%~34%和30%~35% ；
所述的洗脫劑pH為4.5或9.5，其中第一次樹脂吸附采用含pH4.5磷酸鹽緩沖液的溶劑清洗、洗脫，第二次樹脂吸附采用PH9.5溶劑清洗、洗脫獲得高純的的洗脫組分；
(4)最后將洗脫液納濾濃縮，采用蛋白質(zhì)沉淀方法，使?jié)饪s液的蛋白質(zhì)沉淀，過濾除去蛋白質(zhì)，得到濾液；
所述的蛋白質(zhì)沉淀劑方法是將丙酮添加到濃縮液直到丙酮量達(dá)到60% (v/v);在此條件下蛋白質(zhì)從溶液中析出沉淀而替考拉寧產(chǎn)物仍然保留在溶液中，從而可通過過濾方式除去蛋白質(zhì)；
(5)往濾液中加入活性炭脫色，過濾得到脫色液；
活性炭按照0.9~1.3% (w/v)的量加入,攪拌脫色30min ；
(6)脫色液中添加丙酮后低溫結(jié)晶，晶體經(jīng)真空干燥后，獲得純度大于96%的高純度的替考拉寧成品。
丙酮的體積是脫色液體積的3倍，結(jié)晶溫度為4°C，結(jié)晶時(shí)間12h ;真空的溫度是30°C，時(shí)間是12h。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0006]圖1是實(shí)施例1所分離的替考拉寧成品的液相色譜圖。 【具體實(shí)施方式】
[0007]以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0008]實(shí)施例1
將70L替考拉寧發(fā)酵液通過微濾膜(孔徑0.1 μ m，陶瓷微濾膜)去除發(fā)酵液中固含，當(dāng)發(fā)酵液進(jìn)料完成后，加入2倍體積水頂洗固含物，以回收替考拉寧產(chǎn)物。合并得到180L濾液，濾液通過納濾(截留分子量700~800Da)濃縮至70L，濃縮液效價(jià)6.02g/L,替考拉寧含量42L4g。
[0009]取17L納濾濃縮液(替考拉寧含量102.34g)，上裝有9L AMBERLITE XAD 7HP樹脂吸附，上樣流速9L/h。上柱結(jié)束后，用27L去離子水清洗樹脂以除去未吸附的雜質(zhì)，清洗流速18L/h ;繼續(xù)用50L 15%丙酮水溶液(含20g/LNaH2P04，磷酸調(diào)pH4.5)清洗樹脂去除吸附能力弱的雜質(zhì)，流速9L/h ;最后用28%丙酮水溶液(含20g/LNaH2P04，磷酸調(diào)pH4.5)洗脫，流速9L/min。共收集得到洗脫液10L，效價(jià)8.42g/L，回收替考拉寧84.20g，過程收率為82.3%，產(chǎn)物液相色譜純度78.6%。
[0010]將替考拉寧洗脫液用去離子水稀釋至丙酮濃度小于20%，后用3M NaOH調(diào)pH9.5，上裝有4L HZ816樹脂柱吸附，上樣流速4L/h。上柱結(jié)束后，用20L去離子水清洗樹脂以除去未吸附的雜質(zhì)和丙酮，清洗流速8L/h ;繼續(xù)用20L 15%異丙醇水溶液(3MNa0H調(diào)pH9.5)清洗樹脂去除吸附能力弱的雜質(zhì)，流速4L/h ;最后用25%異丙醇水溶液(3MNa0H調(diào)pH9.5)洗脫，流速4L/h。共收集得到洗脫液8.17L，效價(jià)8.69g/L，回收替考拉寧70.98g，過程收率為84.3%，產(chǎn)物液相色譜純度87.82%。[0011]將8.17L洗脫液通過納濾(截留分子量700~800Da)濃縮至0.61L (替考拉寧效價(jià)約105g/L);納濾過程中，加入去離子水清洗濃縮液以去除異丙醇溶劑和無機(jī)鹽。
[0012]往濃縮液中加入0.92L丙酮至濃度達(dá)到60%，靜置沉淀蛋白質(zhì)，后布式漏斗抽濾獲得1.46L濾液。稱取13.14g (添加量按0.9% (w/v))藥用活性炭，加入到濾液，室溫?cái)嚢杳撋?0min,后過濾獲得1.43L脫色液。
[0013]往脫色液中迅速加入4.29L丙酮，后放置冰箱4°C結(jié)晶12h，后過濾得到晶體。將晶體放置真空干燥箱中，30°C真空干燥12h。最終的得到58.2g替考拉寧成品，經(jīng)液相色譜檢測純度為96.25% (液相色譜圖見圖1)。
[0014]實(shí)例2
取實(shí)例I中30L納濾濃縮液(替考拉寧含量180.6g)，上裝有IOL HZ801樹脂吸附，上樣流速10L/h。上柱結(jié)束后，用30L去離子水清洗樹脂以除去未吸附的雜質(zhì)，清洗流速20L/h ；繼續(xù)用50L 16%乙腈水溶液(含20g/LNaH2P04，磷酸調(diào)pH4.5)清洗樹脂去除吸附能力弱的雜質(zhì)，流速10L/h ;最后用30%乙腈水溶液(含20g/L NaH2PO4,磷酸調(diào)pH4.5)洗脫，流速IOL/h。共收集得到洗脫液14.6L,效價(jià)11.4g/L，回收替考拉寧166.44g，過程收率為92.1%，產(chǎn)物液相色譜純度81.5%。
[0015]將替考拉寧洗脫液用去離子水稀釋至乙腈濃度小于20%，后用3MNa0H調(diào)pH9.5，上裝有9L DIAION HP20樹脂柱吸附，上樣流速9L/h。上柱結(jié)束后，用36L去離子水清洗樹脂以除去未吸附的雜質(zhì)和乙腈，清洗流速18L/h ;繼續(xù)用45L 20%異丙醇水溶液(3M NaOH調(diào)PH9.5)清洗樹脂去除吸附能力弱的雜質(zhì)和色素，流速9L/h ;最后用30%異丙醇水溶液(3MNaOH調(diào)pH9.5)洗脫，流速9L/h。共收集得到洗脫液15.88L，效價(jià)8.92g/L，共回收替考拉寧141.65g，過程收率為85.1%，產(chǎn)物液相色譜純度88.75%。
[0016]將15.88L洗脫液通過納濾濃縮至1.35L(替考拉寧效價(jià)105g/L);納濾過程中，加入去離子水清洗濃縮液以去除異丙醇溶劑和無機(jī)鹽。
[0017]往1.35L濃縮液中加入2.1L丙酮至濃度達(dá)到60%，靜置沉淀蛋白質(zhì)，后布式漏斗抽濾獲得3.4L濾液。稱取44.2g(添加量按1.3% (w/v))藥用活性炭，加入到濾液，室溫?cái)嚢杳撋?0min，后過濾獲得3.23L脫色液。
[0018]往3.23L脫色液中迅速加入9.69L丙酮，后放置冰箱4°C結(jié)晶12h，后過濾得到晶體。將晶體放置真空干燥箱中，30°C真空干燥12h。最終的得到104.4g替考拉寧成品，經(jīng)液相色譜檢測純度為96.78%。
[0019]實(shí)施例3
取實(shí)例I中20L納濾濃縮液(替考拉寧含量120.4g)，上裝有6L AMBERLITE XAD 1180N樹脂吸附，上樣流速6L/h。上柱結(jié)束后，用24L去離子水清洗樹脂以除去未吸附的雜質(zhì)，清洗流速12L/h ;繼續(xù)用24L 22%異丙醇水溶液(含20g/LNaH2P04，磷酸調(diào)pH4.5)清洗樹脂去除吸附能力弱的雜質(zhì)，流速10L/h ;最后用34%異丙醇水溶液(含20g/L NaH2PO4，磷酸調(diào)PH4.5)洗脫，流速6L/h。共收集得到洗脫液13.8L,效價(jià)7.59g/L，回收替考拉寧104.86g，過程收率為87.1%，產(chǎn)物液相色譜純度85.5%。
[0020]將替考拉寧洗脫液用去離子水稀釋至異丙醇濃度小于15%，后用3MNa0H調(diào)pH9.5，上裝有6.5L HP20樹脂柱吸附，上樣流速6.5L/h。上柱結(jié)束后，用26L去離子水清洗樹脂以除去未吸附的雜質(zhì)和異丙醇，清洗流速13L/h;繼續(xù)用32.5L 23%乙腈水溶液(3M NaOH調(diào)pH9.5)清洗樹脂去除吸附能力弱的雜質(zhì)和色素，流速13L/h ;最后用35%乙腈水溶液(3MNaOH調(diào)ρΗ9.5)洗脫，流速6.5L/h。共收集得到洗脫液13.65L，效價(jià)6.73g/L，共回收替考拉寧91.76g，過程收率為87.5%，產(chǎn)物液相色譜純度89.92%。
[0021]將13.65L洗脫液通過納濾濃縮至0.87L(替考拉寧效價(jià)105g/L);納濾過程中，加入去離子水清洗濃縮液以去除乙腈溶劑和無機(jī)鹽。
[0022]往0.87L濃縮液中加入1.30L丙酮至濃度達(dá)到60%，靜置沉淀蛋白質(zhì)，后布式漏斗抽濾獲得2.06L濾液。稱取20.60g (添加量按1.0% (w/v))藥用活性炭，加入到濾液，室溫?cái)嚢杳撋?0min，后過濾獲得2.0lL脫色液。
[0023]往2.0lL脫色液中迅速加入6.03L丙酮，后放置冰箱4°C結(jié)晶12h，后過濾得到晶體。將晶體放置真空干燥箱中，30°C真空干燥12h。最終的得到82.58g替考拉寧成品，經(jīng)液相色譜檢測純度為96.85%。
[0024]實(shí)施例4
與實(shí)施例1的不同內(nèi)容在于:取17L納濾濃縮液(替考拉寧含量102.34g)，上裝有9LAMBERLITE XAD 7HP樹脂吸附，上樣流速9L/h。上柱結(jié)束后，用27L去離子水清洗樹脂以除去未吸附的雜質(zhì)，清洗流速18L/h ;繼續(xù)用50L 20%丙酮水溶液(含20g/LNaH2P04，磷酸調(diào)pH4.5)清洗樹脂去除吸附能力弱的雜質(zhì)，流速9L/h ;最后用30%丙酮水溶液(含20g/LNaH2PO4,磷酸調(diào)pH4.5)洗脫，流速9L/min。共收集得到洗脫液10L，效價(jià)8.42g/L，回收替考拉寧84.20g，過程收率為82.3%，產(chǎn)物液相色譜純度78.6%。
[0025]上述【具體實(shí)施方式】不以任何形式限制本發(fā)明的技術(shù)方案，凡是采用等同替換或等效變換的方式所獲得的技術(shù)方 案均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.高純度替考拉寧的分離純化法，其特征在于，其包括如下步驟: 1)將替考拉寧發(fā)酵液用微濾膜除去發(fā)酵液中固含，收集濾液； 2)含替考拉寧的濾液通過納濾膜濃縮，得到替考拉寧濃縮液； 3)替考拉寧濃縮液再經(jīng)過兩次大孔樹脂吸附、洗脫后，得到高純度的替考拉寧洗脫液； 4)最后將洗脫液納濾濃縮，往濃縮液中加入蛋白質(zhì)沉淀劑，使?jié)饪s液蛋白質(zhì)沉淀，過濾除去蛋白質(zhì)，得到濾液； 5)往濾液中加入活性炭脫色，過濾得到脫色液； 6)最后往脫色液中加入丙酮后，低溫結(jié)晶，晶體經(jīng)真空干燥后，獲得高純度的替考拉寧成品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高純度替考拉寧分離純化方法，其特征在于步驟(I)所述微濾膜孔徑為0.1 μ m。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高純度替考拉寧分離純化方法，其特征在于步驟(2)所述納濾膜截留分子量為700~800Da。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高純度替考拉寧分離純化方法，其特征在于步驟(4)所述蛋白質(zhì)沉淀劑為丙酮,且直至丙酮體積為濃縮液體積的60%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高純度替考拉寧分離純化方法，其特征在于步驟(5)所述濾液活性炭脫色，活性炭添加量為0.9~1.3% (w/v)的量加入，攪拌脫色30min。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高純度替考拉寧分離純化方法，其特征在于步驟(6)所述的結(jié)晶溶劑為丙酮，其體積是脫色液體積的3倍；所述的低溫是4°C，結(jié)晶時(shí)間12h，所述真空干燥的溫度是30°C，時(shí)間是12h。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高純度替考拉寧分離純化方法，其特征在于步驟(3)大孔樹脂洗脫所采用的洗脫劑是丙酮、異丙醇或乙腈水溶液； 第一、二次洗脫采用的洗脫劑的PH值分別為4.5，9.5，其中第一次樹脂吸附采用含PH4.5磷酸鹽緩沖液的溶劑清洗、洗脫，第二次樹脂吸附采用pH9.5溶劑清洗、洗脫獲得高純的的洗脫組分； 洗脫方法是采用低濃度的洗脫溶劑清洗以去除樹脂上吸附的雜質(zhì)和色素，中等濃度的洗脫溶劑對樹脂吸附替考拉寧產(chǎn)物進(jìn)行洗脫；所述的低濃度對于丙酮、異丙醇和乙腈水溶液濃度分別為15~20%、15%~25%和16%~23%;所述的中等濃度的洗脫溶劑對于丙酮、異丙醇和乙腈濃度分別為28~30%、22%~30%和30%~35%。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的高純度替考拉寧分離純化方法，其特征在于第一、二次洗脫采用的洗脫劑的，分別是含PH4.5磷酸鹽緩沖液、pH9.5溶劑。
【文檔編號(hào)】C07K1/34GK103467576SQ201310177467
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年5月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月15日
【發(fā)明者】吳學(xué)華, 賈坤, 呂祖平, 苗玉武 申請人:江蘇海闊生物醫(yī)藥有限公司