紅豆杉中抗癌成分的綠色分離及結(jié)構(gòu)方法
【專(zhuān)利摘要】紅豆杉中抗癌成分的綠色分離及結(jié)構(gòu)方法，本發(fā)明紅豆杉枝葉為原料，對(duì)紫杉醇及其它三種紫杉烷的提取、分離及結(jié)構(gòu)修飾進(jìn)行了研究。利用樹(shù)脂層析法對(duì)四種物質(zhì)進(jìn)行了高效快速的分離。并將其他三種紫杉烷轉(zhuǎn)化成為抗癌藥物紫杉醇或多西紫杉醇。所得結(jié)論如下：確立了四種物質(zhì)的檢測(cè)、提取、樹(shù)脂層析以及純化條件，并將純化后的其他三種紫杉烷進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，使之轉(zhuǎn)化成紫杉醇或多西紫杉醇。
【專(zhuān)利說(shuō)明】紅豆杉中抗癌成分的綠色分離及結(jié)構(gòu)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明以紅豆杉枝葉為原料，對(duì)紫杉醇及其它三種紫杉烷的提取、分離及結(jié)構(gòu)修飾進(jìn)行了研究。

【背景技術(shù)】
[0002]目前，在紫杉醇及其它紫杉烷類(lèi)化合物的提取分離、半合成研究中，研究最多的是從紅豆杉植物中提取和分離紫杉醇。而對(duì)其它紫杉烷類(lèi)化合物只進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定，并未進(jìn)行深入研究。其中，提取方法報(bào)道的最多，幾乎所有的提取方法均被用于紫杉烷的提取研究中，包括溶劑冷浸法，熱回流法、索氏提取法等傳統(tǒng)方法，以及后出現(xiàn)的超優(yōu)勢(shì)，但僅限于實(shí)驗(yàn)室研究，難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。
[0003]此外，對(duì)紫杉烷類(lèi)化合物的分離方法主要集中在萃取、硅膠柱層析、固相萃取和樹(shù)脂吸附分離等幾個(gè)方面，但是這些方法分別具有分離選擇性差、使用有毒試劑、成本昂貴和分離效率低等制約性因素。在紫杉醇的研究領(lǐng)域中，美國(guó)最早發(fā)現(xiàn)并分離得到紫杉醇，對(duì)紫杉烷類(lèi)化合物的研究起步最早，工藝和理論水平較為領(lǐng)先。對(duì)該類(lèi)產(chǎn)品的推廣使用普及率較高。無(wú)論是在提取分離方面、化學(xué)合成方面還是在抗癌活性方面，美國(guó)無(wú)疑是研究最早、最深入的國(guó)家。在1994年，美國(guó)科學(xué)家R.A.Holton和K.C.Nicolaou幾乎同時(shí)宣布成功地合成了紫杉醇。然而，由于全合成步驟多、收率低、成本高等諸多限制因素，難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，沒(méi)有從根本上解決紫杉醇臨床藥源的問(wèn)題。
[0004]我國(guó)擁有接近世界50%以上的紅豆杉資源儲(chǔ)量，從全球范圍看，雖然紅豆杉在美國(guó)、加拿大、法國(guó)、印度及中國(guó)都有分布，但亞洲的紅豆杉儲(chǔ)量最多。其中，在全球的11個(gè)品種中中國(guó)就有5種。雖然我國(guó)的紅豆杉資源豐富，但對(duì)紫杉醇的規(guī)摸性提取發(fā)展較晚，直到90年代才開(kāi)始。而且主要是為發(fā)達(dá)國(guó)家的臨床用紫杉醇提供原料藥，工藝水平薄弱，理論尚不完善。在實(shí)際應(yīng)用中，生產(chǎn)規(guī)模小，市場(chǎng)普及率低。對(duì)資源利用造成了很?chē)?yán)重的浪費(fèi)、難以實(shí)現(xiàn)最大附加值。因此，從大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)和市場(chǎng)推廣應(yīng)用的現(xiàn)實(shí)角度長(zhǎng)遠(yuǎn)考慮，生產(chǎn)工藝的環(huán)?；⒌统杀净c資源的合理利用顯得尤為重要。總之，目前世界范圍內(nèi)對(duì)紫杉醇的需求仍是供不應(yīng)求的，而臨床用紫杉醇主要是通過(guò)植物提取和化學(xué)半合成而來(lái)。因此，對(duì)紫杉醇的提取分離、以及將其它在紅豆杉中含量較大的紫杉醇類(lèi)似物轉(zhuǎn)化成為紫杉醇或者多西紫杉醇進(jìn)行深入研究，不僅可以提高我國(guó)紫杉醇的發(fā)展步伐，增加農(nóng)民收入，而且可以從很大程度上，為臨床提供紫杉醇用藥，為更多癌癥患者解決藥源缺少的問(wèn)題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對(duì)上述存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的是實(shí)現(xiàn)一種紅豆杉中抗癌成分的綠色分離及結(jié)構(gòu)方法，利用樹(shù)脂柱層析技術(shù)對(duì)紅豆杉中紫杉醇等四種紫杉烷進(jìn)行綠色高效分離，并采用結(jié)構(gòu)修飾將傳統(tǒng)工藝中被廢棄的其他三種紫杉烷轉(zhuǎn)化為抗癌藥物紫杉醇或多西紫杉醇，增加了資源利用率。內(nèi)容包括:利用樹(shù)脂層析法對(duì)紅豆杉粗提物中包括紫杉醇在內(nèi)的四種紫杉烷類(lèi)化合物進(jìn)行快速高效的分離；采用正相-反相硅膠柱層析技術(shù)對(duì)四種紫杉烷進(jìn)行進(jìn)一步的純化；將其它三種紫杉烷類(lèi)物質(zhì)通過(guò)系列結(jié)構(gòu)修飾合成多西紫杉醇或紫杉醇。
[0006]本發(fā)明的目的是通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0007]本發(fā)明以東北紅豆杉枝葉為原料，對(duì)抗癌藥物紫杉醇及其它三種重要的紫杉烷類(lèi)化合物——10-脫乙?；涂ㄍI1、7-木糖基-10-去乙?；仙即己腿馍紝帀A的提取、分離、純化工藝進(jìn)行了研究。在分離過(guò)程中，采用了新型樹(shù)脂層析法對(duì)四種物質(zhì)進(jìn)行了高效快速的分離。并將10-脫乙?；涂ㄍI1、7_木糖基-10-去乙酰基紫杉醇和三尖杉寧堿通過(guò)化學(xué)手段進(jìn)行了結(jié)構(gòu)改造，合成了抗癌藥物紫杉醇和多紫杉醇，并得出以下結(jié)論:
[0008]一、確立了用于四種紫杉烷類(lèi)物質(zhì)定性和定量檢測(cè)的HPLC條件:色譜柱Curosil-PFP 5 μ (4.6_X 250mm),檢測(cè)波長(zhǎng) 234nm,流速 lmL/min,進(jìn)樣量 10 μ L,流動(dòng)相為l-17min乙腈-水(25/75)，18_58min乙腈-水(37/63)體系，柱溫保持為35。。。結(jié)果表明，在此色譜條件下對(duì)四種紫杉烷類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，精密度高，重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確度高，適用于紅豆杉及其他制劑中四種紫杉烷類(lèi)化合物的質(zhì)量分析檢驗(yàn)。
[0009]二、確立了東北紅豆杉枝葉中四種紫杉烷類(lèi)化合物的最佳提取工藝參數(shù):提取方法為超聲提??；提取溶劑為80%乙醇溶液；提取固液比為1: 30 ;提取時(shí)間為30min ;提取次數(shù)為3次。
[0010]三、確立了一種簡(jiǎn)單、成本低廉的循環(huán)分離與富集四種紫杉烷類(lèi)化合物的樹(shù)脂層析法:分別用30^^45%及60%的乙醇溶液進(jìn)行梯度洗脫，所用體積分別為:20BV、30BV、1BV ;流速為 6BV/h ；
[0011 ] 四、確立了利用正相硅膠柱層析純化10-去乙酰基巴卡亭III和7-木糖基-10-去乙?；仙即嫉姆椒?；以及先經(jīng)正相硅膠柱層析，后經(jīng)反相硅膠柱層析純化紫杉醇及三尖衫寧堿的方法。正相層析填料為300~400目硅膠；洗脫劑為乙酸乙酯:石油醚=3: 2(V/V);反相層析填料為0DS(C18)，洗脫劑為35%乙睛-水溶液。
[0012]五、以純化后三種紫杉烷類(lèi)物質(zhì)為底物，利用對(duì)活潑羥基的保護(hù)、與側(cè)鏈的酯化縮合、肼解、氧化以及脫保護(hù)和乙?；仁侄?，將抗癌活性較差的紫杉烷類(lèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)化成了紫杉醇或多西紫杉醇。并對(duì)合成得到的物質(zhì)利用1H-NMR，13C-NMR等手段進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定。
[0013]綜上，本發(fā)明充分利用了植物資源，提高了工藝附加值。為紫杉烷的產(chǎn)業(yè)化提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持和保障。發(fā)明采用的樹(shù)脂層析-結(jié)構(gòu)修飾技術(shù)可推廣至植物活性成份研究的諸多領(lǐng)域，為其提供理論基礎(chǔ)和積極的示范作用。

【具體實(shí)施方式】
[0014]首先，利用超聲提取的方法，從紅豆杉枝葉中提取四種紫杉烷類(lèi)化合物，主要指標(biāo)為:提取溶劑為80%乙醇溶液；提取固液比為1: 30 ;提取時(shí)間為30min ;提取次數(shù)為3次。
[0015] 將上述提取物經(jīng)過(guò)循環(huán)分離與富集四種紫杉烷類(lèi)化合物的樹(shù)脂層析法分離得到的10-去乙?；涂ㄍI1、7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇、三尖杉寧堿和紫杉醇的含量分別為5.12%,6.23%,15.97%和3.85%，分別是傳統(tǒng)樹(shù)脂分離方法所得各物質(zhì)含量的
13.54倍、12.19倍、10.41倍和20.48倍。四種化合物的回收率分別為94.96%、77.32%,88.09%和 95.25%。
[0016]分離后的四種化合物利用正相硅膠柱層析純化10-去乙?；涂ㄍII和7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇的方法；以及先經(jīng)正相硅膠柱層析，后經(jīng)反相硅膠柱層析純化紫杉醇及三尖衫寧堿的方法純化后，10-去乙酰基巴卡亭II1、7_木糖基-10-去乙?；仙即肌⑷馍紝帀A和紫杉醇的純度分別為90%，94%，93%和91%，收率分別為86.74%,85.12%,72.72%和 43.02%。
[0017]純化后三種紫杉烷類(lèi)物質(zhì)為底物，利用對(duì)活潑羥基的保護(hù)、與側(cè)鏈的酯化縮合、肼解、氧化以及脫保護(hù)和乙酰化等手段，將抗癌活性較差的紫杉烷類(lèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)化成了紫杉醇或多西紫杉醇。
[0018]最后用四種紫杉烷類(lèi)物質(zhì)定性和定量檢測(cè)的HPLC條件對(duì)四種紫杉烷類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè),生產(chǎn)合格的成品。
[0019]綜上，本發(fā)明充分利用了植物資源，提高了工藝附加值。為紫杉烷的產(chǎn)業(yè)化提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持和保障。發(fā)明采用的樹(shù)脂層析-結(jié)構(gòu)修飾技術(shù)可推廣至植物活性成份研究的諸多領(lǐng)域，為其提供理論基礎(chǔ)和積極的示范作用。
[0020]以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實(shí)施例，其只是作為范例。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對(duì)該進(jìn)行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作出的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種紅豆杉中抗癌成分的綠色分離及結(jié)構(gòu)方法，其特征在于，以東北紅豆杉枝葉為原料，對(duì)抗癌藥物紫杉醇及其它三種重要的紫杉烷類(lèi)化合物:10-脫乙?；涂ㄍI1、7-木糖基-10-去乙?；仙即己腿馍紝帀A的提取、分離、純化并將10-脫乙?；涂ㄍI1、7-木糖基-10-去乙?；仙即己腿馍紝帀A通過(guò)化學(xué)手段進(jìn)行了結(jié)構(gòu)改造。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種紅豆杉中抗癌成分的綠色分離及結(jié)構(gòu)方法，其特征在于，所述提取技術(shù)最佳提取工藝參數(shù):提取方法為超聲提?。惶崛∪軇?0%乙醇溶液；提取固液比為1: 30 ;提取時(shí)間為30min ;提取次數(shù)為3次。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種紅豆杉中抗癌成分的綠色分離及結(jié)構(gòu)方法，其特征在于，所述分離采用樹(shù)脂層析法:分別用30%、45%及60%的乙醇溶液進(jìn)行梯度洗脫，所用體積分別為:20BV、30BV、10BV ;流速為 6BV/h。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種紅豆杉中抗癌成分的綠色分離及結(jié)構(gòu)方法，其特征在于，所述純化方法利用正相硅膠柱層析純化10-去乙?；涂ㄍII和7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇的方法；以及先經(jīng)正相硅膠柱層析，后經(jīng)反相硅膠柱層析純化紫杉醇及三尖衫寧堿的方法。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的一種紅豆杉中抗癌成分的綠色分離及結(jié)構(gòu)方法，其特征在于，所述正相層析填料為300~400目硅膠；洗脫劑為乙酸乙酯:石油醚=3: 2(V/V)；反相層析填料為ODS (C18)，洗脫劑為35%乙睛-水溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種紅豆杉中抗癌成分的綠色分離及結(jié)構(gòu)方法，其特征在于，利用對(duì)活潑羥基的保護(hù)、與側(cè)鏈的酯化縮合、肼解、氧化以及脫保護(hù)和乙?；仁侄危瑢⒖拱┗钚暂^差的紫杉烷類(lèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)化成了紫杉醇或多西紫杉醇。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的一種紅豆杉中抗癌成分的綠色分離及結(jié)構(gòu)方法，其特征在于，所述合成得到的物質(zhì)利用1H-NMR，13C-NMR等手段進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定。
【文檔編號(hào)】C07H1/08GK104130219SQ201310161158
【公開(kāi)日】2014年11月5日 申請(qǐng)日期:2013年5月3日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月3日
【發(fā)明者】徐燕鋒 申請(qǐng)人:徐燕鋒