單體衣康酸的一種制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了單體衣康酸的一種制備方法，其具體步驟如下：以土曲霉(Aspergillus?terreus)ZS01為出發(fā)菌株，微波誘變獲得高產(chǎn)衣康酸菌株，采用氣升式發(fā)酵罐發(fā)酵，過(guò)濾發(fā)酵液，經(jīng)陰離子交換，真空濃縮，干燥，得到單體衣康酸，含量＝99.50％。本方法的衣康酸產(chǎn)酸達(dá)到100g/L以上，提高了衣康酸產(chǎn)率，減少了設(shè)備投資，節(jié)能效果明顯，降低了生產(chǎn)成本，適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說(shuō)明】單體衣康酸的一種制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，提供了一種單體衣康酸的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]衣康酸(Itaconic acid)又名亞甲基丁二酸、亞甲基琥拍酸或分解烏頭酸,是一種不飽和的二元有機(jī)酸。常溫下為白色晶體，無(wú)毒，在酸性、中性和弱堿性常溫條件下其性質(zhì)穩(wěn)定，但在強(qiáng)堿性條件下，其3種異構(gòu)體可以相互轉(zhuǎn)化，易溶于水、乙醇、丙酮，微溶于氯仿、苯和乙醚，有特殊的氣味，在真空下能升華。
[0003]衣康酸及其酯類是制造合成樹(shù)脂、合成纖維、塑料、橡膠、離子交換樹(shù)脂、表面活性劑和高分子螯合劑等的良好添加劑和單體原料。它作為交聯(lián)劑和乳化劑，含量在1%~5%時(shí)，生產(chǎn)的苯乙烯-丁二烯共聚物是質(zhì)輕、易塑、絕緣、防水、抗蝕性能均好的塑料和涂料。用玻璃纖維填充則是一種高強(qiáng)度玻璃鋼，可用于制造車(chē)，船和飛機(jī)的外殼及各種容器。含衣康酸的丙烯酸乳膠可以作為非織造纖維的粘合劑。含衣康酸單體的聚氯乙烯顯示對(duì)紙張，賽璐玢和聚對(duì)苯二酸乙二醇薄膜的粘著性增強(qiáng)。聚丙烯腈纖維中含少量的衣康酸，就能大大改善其染色性能，使著色加深。加入多價(jià)金屬氧化物(如鋅和鎂的硅鋁酸鹽或氧化物)交聯(lián)的衣康酸-丙烯酸制成的牙科粘合劑具有良好的抗壓性能和粘結(jié)強(qiáng)度，并有很好的生理適應(yīng)性。衣康酸聚合物有特殊光澤，透明，適合于制造人造寶石和特種透鏡，以及防水性能良好的抗化學(xué)劑和涂料等。衣康酸和丙烯酸的聚合物是一種高分子螯合物，用于作為水處理中的除垢劑，對(duì)防止堿性鈣，鎂垢的形成特別有效。加到海水蒸發(fā)脫鹽體系中，有效成分為0.5~10mg/kg時(shí)就能有效的抑制水垢在蒸發(fā)器表面形成與附著。由衣康酸與芳香二胺生產(chǎn)的吡咯烷酮衍生物是潤(rùn)滑油的增稠劑，與其他各種胺生成的吡咯烷酮衍生物可用于洗滌劑、醫(yī)藥、除草劑之中。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和各個(gè)行業(yè)之間的交叉滲透，衣康酸的應(yīng)用領(lǐng)域?qū)?huì)越來(lái)越多。
[0004]衣康酸自然界存在 較少，最早是由Baup等人于1836年在蒸餾分解檸檬酸時(shí)發(fā)現(xiàn)的。1929年，日本學(xué)者木下廣野首次發(fā)現(xiàn)了可分泌衣康酸的微生物，并命名為衣康酸曲霉(Asp.1taconicus)。Raistrick在研究霉菌代謝產(chǎn)物時(shí),發(fā)現(xiàn)土曲霉(Asp.terreus)也能分泌衣康酸，由此揭開(kāi)了微生物發(fā)酵法生產(chǎn)衣康酸的研究歷史。
[0005]衣康酸的生產(chǎn)方法主要有發(fā)酵法和化學(xué)合成法兩種。化學(xué)合成法以原料的來(lái)源可以分為農(nóng)產(chǎn)品和石油化工產(chǎn)品兩種方法，農(nóng)產(chǎn)品原料主要有檸檬酸、異檸檬酸、烏頭酸及其酸酐等，石油化工產(chǎn)品原料主要有丁二酸酐、丁二酸二甲酯或丁二酸酯等。發(fā)酵法是目前工業(yè)上生產(chǎn)衣康酸的主要方法，國(guó)內(nèi)外大多數(shù)生產(chǎn)廠家都采用這種方法來(lái)生產(chǎn)衣康酸。衣康酸的工業(yè)生產(chǎn)菌種主要是衣康酸曲霉(Asp.1taconicus)和土曲霉(Asp.terreus)。所用的原料主要有葡萄糖、蔗糖以及淀粉水解糖、糖蜜等。發(fā)酵工藝主要有表面發(fā)酵工藝、深層發(fā)酵工藝以及固定化細(xì)胞生產(chǎn)工藝等。衣康酸表面發(fā)酵工藝具有設(shè)備簡(jiǎn)單，投資少，上馬快，操作技術(shù)簡(jiǎn)單，能耗低以及原料粗放等優(yōu)點(diǎn)，不足之處是設(shè)備占地面積大，勞動(dòng)強(qiáng)度高，增大產(chǎn)量有困難，目前此方法在衣康酸的生產(chǎn)中已經(jīng)很少使用。深層發(fā)酵工藝是現(xiàn)行工業(yè)上最流行、最經(jīng)濟(jì)的衣康酸生產(chǎn)方法，整個(gè)工藝過(guò)程的連續(xù)性強(qiáng)，自動(dòng)化程度高，產(chǎn)品成本低。近幾年，固定化全細(xì)胞生產(chǎn)衣康酸的研究比較活躍，使用的載體多為聚丙烯酰胺凝膠，利用包埋法固定衣康酸生產(chǎn)菌的全細(xì)胞，目前存在的問(wèn)題是固定化細(xì)胞制備技術(shù)不過(guò)關(guān)，產(chǎn)率太低以及生產(chǎn)速度慢等，還有待于進(jìn)一步的研究開(kāi)發(fā)。因此，發(fā)酵技術(shù)仍然是衣康酸生產(chǎn)的研究點(diǎn)。
[0006]采用發(fā)酵法生產(chǎn)單體衣康酸，菌種保存過(guò)程中由于經(jīng)過(guò)多次傳代，衣康酸的產(chǎn)量都有不同程度降低，同時(shí)許多學(xué)者試圖通過(guò)提高衣康酸的產(chǎn)酸率來(lái)降低衣康酸生產(chǎn)成本，例如采用固定化技術(shù)，但由于衣康酸的發(fā)酵與供氧關(guān)系甚密，采用固定化技術(shù)后，無(wú)論是發(fā)酵產(chǎn)酸，還是轉(zhuǎn)化率均難以與以游離細(xì)胞的方式進(jìn)行的工業(yè)化生產(chǎn)水平相比。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是要尋找一種誘變方法使菌株具有較高產(chǎn)量，同時(shí)，采用新的生化反應(yīng)器代替機(jī)械攪拌罐，以提高衣康酸產(chǎn)酸率。
[0008]本發(fā)明的整體技術(shù)構(gòu)思是:以土曲霉為出發(fā)菌株，微波誘變獲得高產(chǎn)衣康酸菌株，采用氣升式發(fā)酵罐發(fā)酵，分離純化單體衣康酸，其特征在于具體包括以下步驟:
[0009]I)微波誘變
[0010]土曲霉ZSOl出發(fā)菌株，斜面活化，將孢子用0.85%無(wú)菌氯化鈉洗下，倒入裝有玻璃珠的滅菌三角瓶中，35°C，搖床振蕩活化lh，制備單孢子懸液。微波照射15s，將處理過(guò)的孢子懸液進(jìn)行梯度稀釋，涂布于平板。挑平板上透明圈大的單圈落，35°C，上搖瓶發(fā)酵72h，獲得衣康酸高產(chǎn)菌株，產(chǎn)酸91.3g/L ；
[0011]2)種子培養(yǎng)
[0012]取一環(huán)經(jīng)活化的高產(chǎn)菌種，接種于500ml三角瓶中，于35°C 200r/min往復(fù)搖床上培養(yǎng)2天；
[0013]3)氣升式發(fā)酵罐發(fā)酵
[0014]以10%接種量轉(zhuǎn)接至裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的氣升式發(fā)酵罐中，通風(fēng)量1.5vvm,35°C,發(fā)酵3天，產(chǎn)酸103.8g/L ；
[0015]4)紗布過(guò)濾
[0016]用潔凈紗布過(guò)濾除去衣康酸發(fā)酵液中的菌絲體；
[0017]5)活性炭脫色
[0018]添加I~2 %的活性炭，吸附脫色I(xiàn)h ；
[0019]6)過(guò)濾
[0020]將經(jīng)脫色處理的發(fā)酵液泵入過(guò)濾器中，去除活性炭及其它不溶物；
[0021]7)離子交換樹(shù)脂
[0022]用濕法將處理好的D311陰離子交換樹(shù)脂裝入玻璃交換柱，通入1.5mol/LNa0H溶液，流速為2Bv/h (Bv表示樹(shù)脂床體積)，時(shí)間為2h左右，再用去離子水洗至pH8~9。通入衣康酸發(fā)酵液，上柱流速為4.0mL/min,最佳洗脫條件為以2mol/L的NaOH溶液為洗脫劑，洗脫流速為6.0mL/min，其回收率達(dá)86%以上；
[0023]8)濃縮
[0024]洗脫液于真空度為0.05Mpa的濃縮罐中濃縮；[0025]9)真空干燥
[0026]真空度低至0.08Mpa，升溫至50°C干燥時(shí)間lh，得到單體衣康酸，含量=99.50%。
[0027]本發(fā)明提供的上述一種單體衣康酸的制備方法，其特點(diǎn)在于:
[0028]I)采用微波誘變獲得高產(chǎn)菌株
[0029]微波在生物學(xué)上主要用于殺菌、刺激植物種子發(fā)芽生長(zhǎng)。隨著人們對(duì)微波的生物學(xué)效應(yīng)及微生物特點(diǎn)認(rèn)識(shí)的深入，微波在工業(yè)微生物誘變育種中也應(yīng)用得越來(lái)越廣泛，與紫外線、離子注入、抗癌藥物、染料等方法處理菌種相比較，微波處理法具有操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用低、安全性高、對(duì)環(huán)境污染小、正變率較高等特點(diǎn)。本項(xiàng)目采用微波育種方法得到高產(chǎn)菌株，可有效提高衣康酸的產(chǎn)量。
[0030]2)采用氣升式發(fā)酵罐發(fā)酵衣康酸
[0031]發(fā)酵采用氣升式發(fā)酵罐，該設(shè)備最主要的特征是以靜態(tài)攪拌裝置代替了傳統(tǒng)的動(dòng)態(tài)攪拌裝置，并結(jié)合了氣升原理，因而對(duì)發(fā)酵工藝的改善具有下列特點(diǎn):
[0032]a、與機(jī)械攪拌式發(fā)酵罐相比節(jié)電70% _80%，能耗成本降低。
[0033]b、本設(shè)備具有工作噪音小，裝料系數(shù)高，基本不用維修等特點(diǎn)，設(shè)備投資比攪拌罐降低20%左右。
[0034]C、傳熱和傳氧效率高，可滿足好氧性微生物的發(fā)酵生產(chǎn)。研究適合衣康酸發(fā)酵的通風(fēng)比,可提高衣康酸產(chǎn)酸18%。
[0035]3)采用陰離子交換樹(shù)脂法提取衣康酸
[0036]對(duì)于含雜質(zhì)較多的發(fā)酵液，采用濃縮結(jié)晶法易出現(xiàn)不合格產(chǎn)品，且造成衣康酸回收率無(wú)法提高，而用離子交換來(lái)完成的分離較單純的結(jié)晶蒸發(fā)有更理想的效果。采用離子交換樹(shù)脂進(jìn)行衣康酸的分離提取，衣康酸的粗品回收率達(dá)到86%以上。
[0037]本發(fā)明接種高產(chǎn)衣康酸菌株于氣升式發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，產(chǎn)酸達(dá)到100g/L以上，衣康酸含量= 99.50%，提高了衣康酸產(chǎn)率，減少了設(shè)備投資，節(jié)能效果明顯，降低了生產(chǎn)成本，更能適應(yīng)市場(chǎng)需求(注:土曲霉(Aspergillus terreus)保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址在北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，保藏日期2012年10 月 15 日，保藏編號(hào):CGMCCN0.6413)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0038]附圖1是以土曲霉為原料，微波誘變獲得高產(chǎn)衣康酸菌株，種子培養(yǎng)，采用氣升式發(fā)酵罐發(fā)酵，過(guò)濾發(fā)酵液，經(jīng)陰離子交換，真空濃縮，干燥，得到單體衣康酸的工藝流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0039]提出以下實(shí)例來(lái)具體說(shuō)明，以更好地理解本發(fā)明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。
[0040]實(shí)施例1
[0041]土曲霉出發(fā)菌株，斜面活化，將孢子用0.85%無(wú)菌生理鹽水洗下，倒入裝有玻璃珠的滅菌三角瓶中，35°C，搖床振蕩活化lh，制備單孢子懸液。微波照射15s，將處理過(guò)的孢子懸液進(jìn)行梯度稀釋，涂布于平板。挑平板上透明圈大的單圈落，350C，上搖瓶發(fā)酵72h，獲得衣康酸高產(chǎn)菌株，產(chǎn)酸91.6g/L。
[0042]取一環(huán)經(jīng)活化的高產(chǎn)菌種,接種于500ml三角瓶中，于35°C 200r/min往復(fù)搖床上、培養(yǎng)2天；以10%接種量轉(zhuǎn)接至裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的氣升式發(fā)酵罐中，通風(fēng)量1.5VVm，35°C，發(fā)酵3天，產(chǎn)酸104.5g/L。
[0043]用潔凈紗布過(guò)濾除去衣康酸發(fā)酵液中的菌絲體；添加I %的活性炭，吸附脫色I(xiàn)h ；將經(jīng)脫色處理的發(fā)酵液泵入過(guò)濾器中，去除活性炭及其它不溶物；用濕法將處理好的D311陰離子交換樹(shù)脂裝入玻璃交換柱，通入1.5mol/LNa0H溶液，流速為2Bv/h，時(shí)間為2h左右，再用去離子水洗至pH8~9。通入衣康酸發(fā)酵液,上柱流速為4.0mL/min,最佳洗脫條件為以2mol/L的NaOH溶液為洗脫劑，洗脫流速為6.0mL/min，其回收率為86.6% ;洗脫液于真空度為0.05Mpa的濃縮罐中濃縮；真空度低至0.08Mpa，升溫至50°C干燥時(shí)間lh，得到單體衣康酸，含量99.68%。
[0044]實(shí)施例2
[0045]土曲霉出發(fā)菌株，斜面活化，將孢子用0.85%無(wú)菌生理鹽水洗下，倒入裝有玻璃珠的滅菌三角瓶中，35°C，搖床振蕩活化lh，制備單孢子懸液。微波照射10s，將處理過(guò)的孢子懸液進(jìn)行梯度稀釋，涂布于平板。挑平板上透明圈大的單圈落，350C，上搖瓶發(fā)酵72h，獲得衣康酸高產(chǎn)菌株，產(chǎn)酸92.2g/L。
[0046]取一環(huán)經(jīng)活化的高產(chǎn)菌種,接種于500ml三角瓶中，于35? 250r/min往復(fù)搖床上培養(yǎng)2天；以10%接種量轉(zhuǎn)接至裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的氣升式發(fā)酵罐中，通風(fēng)量1.0VVm，35°C，發(fā)酵3天，產(chǎn)酸105.lg/L。
[0047]用潔凈紗布過(guò)濾除去衣康酸發(fā)酵液中的菌絲體；添加I %的活性炭，吸附脫色I(xiàn)h ；將經(jīng)脫色處理的發(fā)酵液泵入過(guò)濾器中，去除活性炭及其它不溶物；用濕法將處理好的D311陰離子交換樹(shù)脂裝入玻璃交換柱，通入1.5mol/LNaOH溶液，流速為2Bv/h，時(shí)間為2h左右，再用去離子水洗至pH8~9。通入衣康酸發(fā)酵液,上柱流速為4.5mL/min,最佳洗脫條件為以1.5mol/L的NaOH溶液為 洗脫劑，洗脫流速為6.0mL/min，其回收率為86.3% ;洗脫液于真空度為0.05Mpa的濃縮罐中濃縮；真空度低至0.08Mpa，升溫至50°C干燥時(shí)間lh，得到單體衣康酸，含量99.75%。
[0048]實(shí)施例3
[0049]土曲霉出發(fā)菌株，斜面活化，將孢子用0.85%無(wú)菌生理鹽水洗下，倒入裝有玻璃珠的滅菌三角瓶中，35°C，搖床振蕩活化lh，制備單孢子懸液。微波照射20s，將處理過(guò)的孢子懸液進(jìn)行梯度稀釋，涂布于平板。挑平板上透明圈大的單圈落，350C，上搖瓶發(fā)酵72h，獲得衣康酸高產(chǎn)菌株，產(chǎn)酸91.5g/L。
[0050]取一環(huán)經(jīng)活化的高產(chǎn)菌種,接種于500ml三角瓶中，于35? 200r/min往復(fù)搖床上培養(yǎng)2天；以12%接種量轉(zhuǎn)接至裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的氣升式發(fā)酵罐中，通風(fēng)量1.5VVm，35°C，發(fā)酵3天，產(chǎn)酸105.8g/L。
[0051]用潔凈紗布過(guò)濾除去衣康酸發(fā)酵液中的菌絲體；添加2%的活性炭，吸附脫色I(xiàn)h ；將經(jīng)脫色處理的發(fā)酵液泵入過(guò)濾器中，去除活性炭及其它不溶物；用濕法將處理好的D311陰離子交換樹(shù)脂裝入玻璃交換柱，通入1.5mol/LNaOH溶液，流速為2Bv/h，時(shí)間為2h左右，再用去離子水洗至pH8~9。通入衣康酸發(fā)酵液,上柱流速為4.5mL/min,最佳洗脫條件為以2mol/L的NaOH溶液為洗脫劑，洗脫流速為5.0mL/min，其回收率為86.9% ;洗脫液于真空度為0.05Mpa的濃縮罐中濃縮；真空度低至0.08Mpa,升溫至50°C干燥時(shí)間lh，得到單體衣康酸，含量99.73%。
【權(quán)利要求】
1.一種以土曲霉(Aspergillus terreus)ZSOl為出發(fā)菌株,發(fā)酵制備單體衣康酸的方法，其特征在于: 1)微波誘變:土曲霉ZSOl為出發(fā)菌株，斜面活化，將孢子用無(wú)菌生理鹽水洗下，倒入裝有玻璃珠的滅菌三角瓶中，350C，搖床振蕩活化，制備單孢子懸液。微波照射，將處理過(guò)的孢子懸液進(jìn)行梯度稀釋，涂布于平板。挑平板上透明圈大的單圈落，上搖瓶發(fā)酵，獲得衣康酸高產(chǎn)菌株； 2)種子培養(yǎng):取一環(huán)經(jīng)活化的高產(chǎn)菌種，接種于500ml三角瓶中，于搖床上培養(yǎng)2天； 3)氣升式發(fā)酵罐發(fā)酵:接種至裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的氣升式發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)； 4)紗布過(guò)濾:用潔凈紗布過(guò)濾除去衣康酸發(fā)酵液中的菌絲體； 5)活性炭脫色:添加I~2%的活性炭，吸附脫色I(xiàn)h； 6)過(guò)濾:將經(jīng)脫色處理的發(fā)酵液泵入過(guò)濾器中，去除活性炭及其它不溶物； 7)離子交換樹(shù)脂:用濕法將處理好的陰離子交換樹(shù)脂裝入玻璃交換柱，通入1.5mol/LNaOH溶液，流速為2Bv/h (Bv表示樹(shù)脂床體積)，時(shí)間為I~2h，再用去離子水洗至pH8~9，通入衣康酸發(fā)酵液， NaOH溶液洗脫； 8)濃縮:洗脫液于真空度為0.05Mpa的濃縮罐中濃縮； 9)真空干燥:真空度低至0.08Mpa,升溫干燥,得到單體衣康酸,含量=99.60%。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟I)所述的斜面培養(yǎng)基(g/L):玉米淀粉 7 ~10、(NH4) 2S043 ~6、MgSO4.7Η200.4、FeSO4.7Η200.4、ρΗ4.0 ~4.5、瓊月旨 10 ~16 ;平板培養(yǎng)基(g/L):玉米淀粉 7 ~10、(NH4) 2S044 ~8、MgSO4.7Η200.4、LiCl0.05 ~0.2、溴甲酚綠0.2、ρΗ4.0~4.5、瓊脂10~16 ;發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):玉米淀粉8~15、NH4N034~8、MgSO4.7Η200.4、FeSO4.7Η200.4、ρΗ4.0 ~4.5。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟I)所述的無(wú)菌生理鹽水為0.85%氯化鈉；搖床振蕩活化溫度為30~40°C，時(shí)間為0.5~1.5h ;微波照射處理時(shí)間為10~25s ；經(jīng)篩選菌落搖瓶發(fā)酵的溫度為30~40°C，時(shí)間為48~72h。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)所述的種子培養(yǎng)基(g/L):玉米淀粉 50 ~60、NH4N035 ~8、MgSO4.7H202、FeSO4.7Η200.4、ρΗ4.0 ~4.5 ;種子培養(yǎng)溫度為30~40°C，搖床轉(zhuǎn)速為150~250r/min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)所述的發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):玉米淀粉 120 ~150、NH4N036 ~10、MgS04.7H202、FeSO4.7Η200.4、ρΗ4.0 ~4.5。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)所述的接種量為8%~10%，通風(fēng)量I~1.5vvm,發(fā)酵溫度30~40°C。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟7)所述的陰離子交換樹(shù)脂為D311。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟7)所述的發(fā)酵液上柱流速為3~6mL/min,以I~2mol/L的NaOH溶液為洗脫劑,洗脫流速為5~8mL/min。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟9)所述的真空干燥溫度為50°C以上，干燥時(shí)間I~2h。
【文檔編號(hào)】C07C51/47GK103468752SQ201310143806
【公開(kāi)日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2013年4月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月24日
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