專利名稱：一種雙酶分步水解制備甜高粱籽蛋白ace抑制肽的方法及其產(chǎn)品和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，可用于功能性食品添加劑的開發(fā)，具體涉及一種雙酶分步水解制備甜高粱籽蛋白ACE抑制肽的方法及其產(chǎn)品和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
甜高粱是高粱的一個(gè)變種，它起源于非洲，具有抗旱、耐澇、耐鹽堿、耐瘠薄等特性，因此在我國(guó)各地都有種植。中國(guó)甜高粱分布較廣泛，主要分布在西北、華北、東北、東南、華東和華中地區(qū)，從云南到黑龍江，從上海到新疆都有栽培。甜高粱秸桿含有大量糖類物質(zhì)，主要用于制備生物能源一酒精，該生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物甜高粱穗沒有得到有效利用(專利“用甜高粱秸桿制取乙醇的方法，公開號(hào)CN101024848A”和“一種用甜高粱秸桿制備乙醇的方法，公開號(hào)CN101343647A”)。甜高粱穗中的籽粒含有較高的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)含量約為13% (w/w)，必需氨基酸在總氨基酸含量中約占41% (w/w)，蛋白營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，另外，甜高粱籽蛋白中脯氨酸、芳香族氨基酸和疏水性氨基酸含量高，分別占到總氨基酸約4.4% (w/w),9.0% (w/w)和39.2% (w/w)左右，根據(jù)ACE抑制肽的構(gòu)效關(guān)系，這些氨基酸在ACE抑制肽活性方面起到重要作用。由此可知，甜高粱籽蛋白能被用于生產(chǎn)高活性ACE抑制肽。ACE是血管緊張素轉(zhuǎn)化酶，ACE抑制肽是一種生物活性肽，能夠調(diào)節(jié)高血壓病人的血壓，且無(wú)毒副作用，是近年來(lái)天然藥物研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一，現(xiàn)已有大量的食源ACE抑制肽被發(fā)現(xiàn)，如:草魚蛋白ACE抑制肽(Chen J, Wang Y，Zhong Q, et al.Purification andcharacterization of a novel angiotensin-1 converting enzyme (ACE) inhibitorypeptide derived from enzymatic hydrolysate of grass carp protein[J].Peptides,2012，33(1): 52-58.)、魷魚明膠 ACE 抑制肽(Alemdn A, Gimenez B, Perez-Santin E,et al.Contribution of Leu and Hyp residues to antioxidant and ACE-1nhibitoryactivities of peptide sequences isolated from squid gelatin hydrolysate[J].Food Chemistry, 2011, 125(2): 334-341.)和乳清蛋白 ACE 抑制肽(Pan D, Cao J, Guo
H,et al.Studies on purification and the molecular mechanism of a novel ACEinhibitory peptide from whey protein hydrolysate[J].Food Chemistry, 2012,130(1): 121-126.)等。而利用甜高粱籽蛋白制備ACE抑制肽的鮮見報(bào)道，特別是利用雙酶分步水解制備甜高粱籽蛋白ACE抑制肽的研究未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的:本發(fā)明的目的是提供一種雙酶分步水解制備甜高粱籽蛋白ACE抑制肽的方法，本發(fā)明能夠克服單酶水解位點(diǎn)不足，混合酶水解相互干擾以及ACE抑制肽不能有效釋放等缺點(diǎn)，而該方法國(guó)內(nèi)外尚無(wú)報(bào)道。

技術(shù)方案:為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的一種雙酶分步水解制備甜高粱籽蛋白ACE抑制肽的方法，其特征在于包括以下步驟:1)將甜高粱籽進(jìn)行粉碎，然后用蒸餾水配制成甜高粱籽粉的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為5% 10%的懸浮液；
2)將5000 10000U/g淀粉酶加入懸浮液中50°C 70°C酶解3h 4h，酶解結(jié)束后，將懸浮液的PH調(diào)至8.0 9.5，攪拌30min后離心，取上清液，調(diào)其pH至4.0 4.5，靜置30min后離心，收集沉淀，將沉淀溶于蒸餾水中，調(diào)pH至中性后經(jīng)真空濃縮裝置濃縮和噴霧干燥得到甜高粱籽蛋白粉；
3)將甜高粱籽蛋白粉配成質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為1% 4%的溶液，調(diào)pH至7.0 8.0，加入2000 4000U/ga -胰凝乳蛋白酶，在40°C 50°C下第一次酶解20 30min，第一次酶解結(jié)束后沸水浴滅酶得到混合液，將混合液的PH調(diào)至6.0 7.0，加入2000 4000U/g中性蛋白酶，在50°C 60°C下第二次酶解40 60min，第二次酶解結(jié)束后沸水浴滅酶，離心收集上清液，上清液經(jīng)真空濃縮裝置濃縮至固型物的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為5%-15%，用噴霧干燥后，得到粉末狀甜高粱籽蛋白ACE抑 制肽。所述步驟I)中甜高粱籽粉的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為8%。所述步驟2)中將7500U/g淀粉酶加入懸浮液中60°C酶解3.5h，酶解結(jié)束后，將懸浮液的PH調(diào)至9.0，攪拌30min后離心，取上清液，調(diào)其pH至4.2，靜置30min后離心，收集沉淀，將沉淀溶于蒸餾水中，調(diào)PH至中性后經(jīng)真空濃縮裝置濃縮和噴霧干燥得到甜高粱籽蛋白粉。所述步驟3)中取20g甜高粱籽蛋白粉，質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為2%的溶液，調(diào)pH至7.5，加入3000U/ga -胰凝乳蛋白酶在45°C下第一次酶解25min，第一次酶解結(jié)束后沸水浴滅酶得到混合液，將混合液的pH調(diào)至6.5，加入3000U/g中性蛋白酶，在55°C下第二次酶解50min，第二次酶解結(jié)束后沸水浴滅酶，離心收集上清液，上清液經(jīng)真空濃縮裝置濃縮至固型物質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為10%，用噴霧干燥，得到粉末狀甜高粱籽蛋白ACE抑制肽。所述甜高粱籽蛋白ACE抑制肽的IC5tl值為0.261 0.552mg/mL。所述的雙酶分步水解制備的甜高粱籽蛋白ACE抑制肽在抑制肽活性研究方面的應(yīng)用。采用乙酸乙酯萃取一比色法測(cè)定甜高粱籽蛋白ACE抑制肽的抑制活性(MuguerzaB, Ramos M, Sanchez E, et al.Antihypertensive activity of milk fermented byEnterococcus faecalis strains isolated from raw milk [J].1nternational DairyJournal, 2006，16(1): 61 _69.)，具體方法如下:
將10 μ L甜高粱籽蛋白ACE抑制肽溶液與10 μ L ACE溶液在37 °C下預(yù)熱5 min,加Λ 45 yL 5 mmol/L HHL (馬尿酰-組氨酰-亮氨酸)溶液，在37 °C反應(yīng)30 min，反應(yīng)結(jié)束后立即加入85 μ L lmol/L HCl溶液終止反應(yīng)；在反應(yīng)液中加入I mL乙酸乙酯，振蕩2min后,4 000 r/min離心10 min,取出800 μ L有機(jī)相溶液轉(zhuǎn)入玻璃管中，在100 °C下蒸發(fā)30 min,蒸發(fā)后的殘洛中加入800 μ L雙蒸水,混勻后在228 nm下測(cè)定吸光度,每個(gè)樣品重復(fù)3次。另以雙蒸水代替樣品作為空白。按下式計(jì)算ACE抑制活性:
I =(A — C)/ (A - B) X 100%
式中，I一甜高粱籽蛋白ACE抑制肽的抑制率;A—空白組的吸光度出一反應(yīng)體系中沒有加入甜高粱籽蛋白ACE抑制肽時(shí)的吸光度；(:一反應(yīng)體系中有甜高粱籽蛋白ACE抑制肽和樣品時(shí)的吸光度。
有益效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:
I)提高了甜高粱秸桿轉(zhuǎn)化乙醇產(chǎn)業(yè)中副產(chǎn)物甜高粱穗的利用價(jià)值。2)克服了單酶水解位點(diǎn)不足，單酶水解得到的甜高粱籽蛋白ACE抑制肽抑制的IC5tl值為1.030 1.475mg/mL，混合酶水解相互干擾的缺點(diǎn)，混合酶水解得到的甜高粱籽蛋白ACE抑制肽抑制的IC5tl值為0.770 0.993mg/mL,而本方法大大提高了酶解產(chǎn)物甜高粱籽蛋白ACE抑制肽抑制活性，其IC5tl值為0.261 0.552mg/mL。3)該方法操作簡(jiǎn)單，產(chǎn)品性質(zhì)穩(wěn)定，適宜規(guī)模化生產(chǎn)。


圖1利用雙酶分步水解技術(shù)制備甜高粱籽蛋白ACE抑制肽的工藝流程。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述。本實(shí)驗(yàn)所用的試劑均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。實(shí)施例1
將粉碎后的甜高粱籽粉配成5% (w/v)懸浮液，用淀粉酶在50°C酶解3h，加酶量為5000U/g,酶解結(jié)束后，將懸浮液的pH調(diào)至8.0,攪拌30min后離心，取上清液，調(diào)其pH至4.0，靜置30min后離心，收集沉淀，將沉淀溶于蒸餾水中，調(diào)pH至中性后噴霧干燥，即得到甜高粱籽蛋白粉。取20g甜高粱籽蛋白粉配制成質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為I % (w/v)的溶液，調(diào)pH至7.0，用a -胰凝乳蛋白酶在40°C酶解20min，加酶量為2000U/g，酶解結(jié)束后，沸水浴滅酶，將反應(yīng)混合液的PH調(diào)至6.0，用中性蛋白酶在50°C酶解40min，加酶量為2000U/g，酶解結(jié)束后沸水浴滅酶，離心收集上清液，上清液用真空濃縮裝置濃縮至固型物含量10% (w/v)左右，用噴霧干燥設(shè)備進(jìn)行干燥，得到粉狀甜高粱籽蛋白ACE抑制肽，其IC5tl值為0.552mg/mL。實(shí)施例2
將粉碎后的甜高粱籽粉配成8% (w/v)懸浮液，用淀粉酶在60°C酶解3.5h，加酶量為7500U/g,酶解結(jié)束后，將懸浮液的pH調(diào)至9.0,攪拌30min后離心，取上清液，調(diào)其pH至4.2，靜置30min后離心，收集沉淀，將沉淀溶于蒸餾水中，調(diào)pH至中性后噴霧干燥。取20g甜高粱籽蛋白粉配制成質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為2% (w/v)的溶液，調(diào)pH至7.5，用a -胰凝乳蛋白酶在45°C酶解25min，加酶量為3000U/g，酶解結(jié)束后，沸水浴滅酶，將反應(yīng)混合液的PH調(diào)至6.5，用中性蛋白酶在55°C酶解50min，加酶量為3000U/g，酶解結(jié)束后沸水浴滅酶，離心收集上清液，上清液用真空濃縮裝置濃縮至固型物含量10% (w/v)左右，用噴霧干燥設(shè)備進(jìn)行干燥，得到粉狀甜高粱籽蛋白ACE抑制肽，其IC5tl值為0.261mg/mL。實(shí)施例3
將粉碎后的甜高粱籽粉配成10% (w/v)懸浮液，用淀粉酶在70°C酶解4h，加酶量為10000U/g,酶解結(jié)束后，將懸浮液的pH調(diào)至9.5，攪拌30min后離心，取上清液，調(diào)其pH至
4.5，靜置30min后離心，收集沉淀，將沉淀溶于蒸餾水中，調(diào)pH至中性后噴霧干燥。取20g甜高粱籽蛋白粉配制成高粱籽蛋白粉質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為4%(W/v)的溶液，調(diào)pH至8.0，用a -胰凝乳蛋白酶在50°C酶解30min，加酶量為4000U/g，酶解結(jié)束后，沸水浴滅酶，將反應(yīng)混合液的PH調(diào)至7.0，用中性蛋白酶在60°C酶解60min，加酶量為4000U/g，酶解結(jié)束后沸水浴滅酶，離心收集上清液，上清液用真空濃縮裝置濃縮至固型物含量10%(W/v)左右，用噴霧干燥設(shè)備進(jìn)行干燥，得到粉狀甜高粱籽蛋白ACE抑制肽，其IC5tl值為0.359mg/mL 。
權(quán)利要求
1.一種雙酶分步水解制備甜高粱籽蛋白ACE抑制肽的方法，其特征在于包括以下步驟: 1)將甜高粱籽進(jìn)行粉碎，然后用蒸餾水配制成甜高粱籽粉的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為5% 10%的懸浮液； 2)將5000 10000U/g淀粉酶加入懸浮液中50°C 70°C酶解3h 4h，酶解結(jié)束后，將懸浮液的PH調(diào)至8.0 9.5，攪拌30min后離心，取上清液，調(diào)其pH至4.0 4.5，靜置30min后離心，收集沉淀，將沉淀溶于蒸餾水中，調(diào)pH至中性后經(jīng)真空濃縮裝置濃縮和噴霧干燥得到甜高粱籽蛋白粉； 3 )將甜高粱籽蛋白粉配成質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為I % 4 %的溶液，調(diào)pH至7.0 8.0，加入2000 4000U/g的α -胰凝乳蛋白酶，在40°C 50°C下第一次酶解20 30min，第一次酶解結(jié)束后沸水浴滅酶得到混合液，將混合液的pH調(diào)至6.0 7.0，加入2000 4000U/g中性蛋白酶，在50°C 60°C下第二次酶解40 60min，第二次酶解結(jié)束后沸水浴滅酶，離心收集上清液，上清液經(jīng)真空濃縮裝 置濃縮至固型物的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為5%-15%，用噴霧干燥后，得到粉末狀甜高粱籽蛋白ACE抑制肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雙酶分步水解制備甜高粱籽蛋白ACE抑制肽的方法，其特征在于:所述步驟I)中甜高粱籽粉的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為8%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙酶分步水解制備甜高粱籽蛋白ACE抑制肽的方法，其特征在于:所述步驟2)中將7500U/g淀粉酶加入懸浮液中60°C酶解3.5h，酶解結(jié)束后，將懸浮液的PH調(diào)至9.0，攪拌30min后離心，取上清液，調(diào)其pH至4.2，靜置30min后離心，收集沉淀，將沉淀溶于蒸餾水中，調(diào)PH至中性后經(jīng)真空濃縮裝置濃縮和噴霧干燥得到甜高粱籽蛋白粉。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙酶分步水解制備甜高粱籽蛋白ACE抑制肽的方法，其特征在于:所述步驟3)中取20g甜高粱籽蛋白粉，質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為2%的溶液，調(diào)pH至7.5，加入3000U/ga -胰凝乳蛋白酶在45°C下第一次酶解25min，第一次酶解結(jié)束后沸水浴滅酶得到混合液，將混合液的pH調(diào)至6.5，加入3000U/g中性蛋白酶，在55°C下第二次酶解50min，第二次酶解結(jié)束后沸水浴滅酶，離心收集上清液，上清液經(jīng)真空濃縮裝置濃縮至固型物質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為10%，用噴霧干燥，得到粉末狀甜高粱籽蛋白ACE抑制肽。
5.權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)所述的雙酶分步水解制備的甜高粱籽蛋白ACE抑制肽，其特征在于:所述甜高粱籽蛋白ACE抑制肽的IC5tl值為0.261 0.552mg/mL。
6.權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)所述的雙酶分步水解制備的甜高粱籽蛋白ACE抑制肽在抑制肽活性研究方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種雙酶分步水解制備甜高粱籽蛋白ACE抑制肽，其制備方法為將甜高粱籽粉碎后配制成懸浮液，利用淀粉酶輔助提取甜高粱籽蛋白，然后將甜高粱籽蛋白配成溶液，調(diào)其pH后依次分別用α-胰凝乳蛋白酶和中性蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解產(chǎn)物經(jīng)濃縮和噴霧干燥后，即得到粉末狀甜高粱籽蛋白ACE抑制肽產(chǎn)品。本發(fā)明具有生產(chǎn)時(shí)間短、操作方便、原料來(lái)源廣泛及價(jià)格低廉、甜高粱籽蛋白ACE抑制肽抑制活性高等優(yōu)點(diǎn)，產(chǎn)品符合功能食品要求。
文檔編號(hào)C07K2/00GK103194514SQ20131011236
公開日2013年7月10日 申請(qǐng)日期2013年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月2日
發(fā)明者吳瓊英, 賈俊強(qiáng), 顏輝 申請(qǐng)人:江蘇科技大學(xué)