專利名稱：從野菊花中分離制備刺槐素單體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及野菊花的加工方法，尤其是涉及一種采用高速逆流色譜法從野菊花中分離制備刺槐素單體的方法。
背景技術(shù)：
野菊花為菊科植物野菊(Chrysanthemum indicum L.)的干燥頭狀花序。在我國盛產(chǎn)于吉林、遼寧、河北、山西等地。我國對(duì)野菊花的研究歷史悠久，《中國藥典》(2010版)中記載野菊花具有清熱解毒、瀉火平肝的功效?，F(xiàn)代藥理證明:野菊花具有廣譜抗菌、降壓、增加冠脈血流量、抗病毒、清除氧自由基等作用(張捷，譚生建，姜韌，等，野菊花的研究進(jìn)展，中國新醫(yī)藥，2004，3 (1):8-10)。野菊花中主要含有揮發(fā)油、刺槐苷(acaciin)、蒙花苷、槲皮素、木犀草素、芹菜素和刺槐素(acacetin)等成分(畢躍峰，潘成學(xué)，王普菊，等.野菊花化學(xué)成分的研究，中國藥學(xué)雜志，2009，44 (12):8794-897)，刺槐素具有抗炎、抗過氧化、抑菌、促進(jìn)白血球吞噬等作用(吳釘紅，楊立偉，蘇薇薇，野菊花化學(xué)成分及藥理研究進(jìn)展，中藥材，2004，27 (2):142-144)，刺槐素可以抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長，具有良好的抗腫瘤應(yīng)用前景(陳妙汝，楊佩玉，許志宏等，刺槐素抑制人類腫瘤細(xì)胞生長的體外試驗(yàn)，J Int ChinWest Med,2007,9 (2):15_20)。刺槐素在自然界中存在量極低，且多與糖結(jié)合，以苷的形式存在，因此大量研究人員一直在探索刺槐素的理想分離純化方法。除野菊花中含有刺槐素外，飛機(jī)草及大薊中也都含有刺槐素。目前有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道中，刺槐素的提取方法主要為柱層析法，如娃膠柱層析法、凝膠柱層析法、聚酰胺柱層析法等。柱層析法的不足之處是:分離周期長，回收率低，成本較高，分離效果很不理想。經(jīng)文獻(xiàn)檢索，刺槐素的提取方法已`有一些文獻(xiàn)報(bào)道(丁智慧，張學(xué)镅，劉吉開，等，飛機(jī)草中的化學(xué)成分，天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2001，13(5):22-24 ;鄭晗，萬春鵬，張的鳳，等，大薊炭化學(xué)成分的研究，江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009,21 (2):83-85;朱性海，王秀敏，連惠龍，等，水解法提取純化刺槐素的工藝研究，中國生化藥物雜志，2012，3 (33):275-277),同時(shí)有3篇與刺槐素提取方法有關(guān)的中國專利:一種柳穿魚黃酮及其總黃酮的制備方法和用途，申請(qǐng)?zhí)?200910010324.2 ;野菊花類黃酮類色素的提取和制備方法，申請(qǐng)?zhí)?201010515860.0 ;一種從菊花中提取刺槐素的方法，申請(qǐng)?zhí)?201110409452.1 ;但上述專利所用提取的方法主要以柱層析為主。高速逆流色譜(High-speedCounter-current Chromatography,HSCCC)是一種新型的、連續(xù)高效的液-液分配色譜技術(shù)，不需任何固態(tài)載體，避免固相載體表面與樣品發(fā)生反應(yīng)而導(dǎo)致樣品的污染、失活、變性和不可逆吸附等不良影響。同時(shí)它也具有適用范圍廣、快速、進(jìn)樣量大、費(fèi)用低、回收率高等優(yōu)點(diǎn)。因此，高速逆流色譜法已越來越多地被應(yīng)用于生物、醫(yī)藥、環(huán)保等領(lǐng)域各種物質(zhì)的制備分離和純化。但現(xiàn)有方法中，尚未見采用高速逆流色譜法用于野菊花中刺槐素單體分離的有關(guān)技術(shù)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種分離效率高、回收率高的采用高速逆流色譜法從野菊花中分離制備刺槐素單體的方法。本發(fā)明所述從野菊花中分離制備刺槐素單體的方法，采用野菊花總黃酮水解產(chǎn)物為原料，采用高速逆流色譜儀為分離設(shè)備，包括以下步驟:I)制備構(gòu)成固定相、流動(dòng)相的溶劑體系，所述溶劑體系由正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水組成；2)先使高速逆流色譜儀填充固定相，然后調(diào)節(jié)流動(dòng)相流速及主機(jī)轉(zhuǎn)速，再泵入流動(dòng)相并平衡；3)由進(jìn)樣閥進(jìn)樣；4)收集目標(biāo)組分，經(jīng)減壓蒸干后重結(jié)晶，即得刺槐素單體。在步驟I)中，所述溶劑體系按體積比，正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水可為(1.0 1.4): (0.6 1.0):1:1 ;以溶劑體系的上相為固定相，溶劑體系的下相為流動(dòng)相。在步驟2)中，所述高速逆流色譜儀可選用分析型、半制備型或制備型等不同類型的高速逆流色譜儀；所述主機(jī)轉(zhuǎn)速最好為900rpm ;所述流動(dòng)相的流速最好為2.99ml/min。在步驟4)中，所述收集目標(biāo)組分可根據(jù)檢測(cè)器圖譜或薄層色譜檢測(cè)方法或高效液相色譜收集目標(biāo)組分；經(jīng)測(cè)定所得刺槐素單體純度在99%以上。與現(xiàn)有技術(shù)比較， 本發(fā)明的有益效果如下:分離出的刺槐素通過高效液相色譜儀測(cè)定其純度，通過紫外(Ultraviolet，UV)全波普掃描圖譜、核磁共振圖譜(Nuclear Magnetic Resonance,NMR)、質(zhì)譜(Mass Spectrum,MS)等方法驗(yàn)證其結(jié)構(gòu)，結(jié)果體現(xiàn)所得產(chǎn)物為純度99%以上的刺槐素單體。本發(fā)明具有下述突出優(yōu)點(diǎn):I)高效、便捷，操作簡單，分離周期短。傳統(tǒng)分離制備方法操作繁瑣，分離一般要I個(gè)月甚至更長時(shí)間，周期長；高速逆流色譜法只需2天即可從野菊花總黃酮水解產(chǎn)物中分離刺槐素單體，大大縮短了分離周期。2)反應(yīng)條件容易控制，重復(fù)可控性好。傳統(tǒng)的柱層析法常采用梯度洗脫，洗脫液濃度、洗脫速度不易精確控制，重復(fù)性差；而本發(fā)明的參數(shù)可控，重復(fù)性好。3)制備量大。根據(jù)所需的目標(biāo)樣品量，可選擇不同類型的高速逆流色譜儀進(jìn)行分離。4)低成本，樣品損耗少，得率高，分離效果好。傳統(tǒng)的柱層析法所用固定相是固體，易出現(xiàn)樣品的吸附、分離純度不高等現(xiàn)象；而高速逆流色譜法所用的固定相是液體，不存在吸附現(xiàn)象，因而分離得率高，分離效果好，經(jīng)重結(jié)晶后純度可達(dá)99%以上。5)目標(biāo)化合物穩(wěn)定性好。由于分離過程不加入酸堿，而且在常溫下進(jìn)行，目標(biāo)化合物不發(fā)生變化，最大程度地保持了化合物的穩(wěn)定性。6)分離得到的刺槐素單體，具有多種藥理活性，如抗炎、抗過氧化、抑菌、促進(jìn)白血球吞噬、抗腫瘤等作用，具有開發(fā)為新藥的潛在應(yīng)用。本發(fā)明提供了實(shí)現(xiàn)刺槐素單體藥用的產(chǎn)業(yè)化制備基礎(chǔ)。由此可見，本發(fā)明可通過調(diào)整溶劑體系，采用高速逆流色譜法一步分離野菊花中刺槐素單體，較傳統(tǒng)分離方法操作簡便，分離周期短，可控性好，制備量大，樣品損耗少，擁有用于自動(dòng)化制備野菊花中刺槐素單體應(yīng)用的前景，分離得到的刺槐素單體，具有多種藥理活性，有潛力開發(fā)為一種新藥，而本發(fā)明則成為制備野菊花中刺槐素單體藥用的產(chǎn)業(yè)化制備基礎(chǔ)。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例1所得產(chǎn)物的逆流色譜圖。在圖1中，橫坐標(biāo)為出峰時(shí)間(min),縱坐標(biāo)為響應(yīng)值(mV);箭頭所指為刺槐素單體。圖2為本發(fā)明實(shí)施例2所得產(chǎn)物的逆流色譜圖。在圖2中，橫坐標(biāo)為出峰時(shí)間(min),縱坐標(biāo)為響應(yīng)值(mV);箭頭所指為刺槐素單體。圖3為本發(fā)明實(shí)施例3所得產(chǎn)物的逆流色譜圖。在圖3中，橫坐標(biāo)為出峰時(shí)間(min),縱坐標(biāo)為響應(yīng)值(mV);箭頭所指為刺槐素單體。
具體實(shí)施例方式以下各實(shí)施例均通過現(xiàn)有技術(shù)，先從野菊花中制備出野菊花總黃酮水解產(chǎn)物，然后均以野菊花總黃酮水解產(chǎn)物為分離制備刺槐素的原料，均采用高速逆流色譜儀為分離設(shè)備。實(shí)施例1本實(shí)施例的溶劑體系，按體積比，正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水為6: 4: 5: 5。從野菊花中分離制備刺槐素的方法包括以下步驟:a、樣品:取粉碎至粗粉的野菊花lKg，加入3倍量80%的乙醇室溫浸泡3次，每次I周，浸提液經(jīng)抽濾得清液，清液減壓回收乙醇后，過大孔樹脂(AB-8)，乙醇梯度洗脫，合并含有刺槐素的洗脫液，減壓回收乙醇得水溶液；向水溶液中加入2.5倍量、3mol/L的鹽酸，在100°C溫度條件下，進(jìn)一步進(jìn)行酸水解，得到壁上黑色固體水解產(chǎn)物，用氯仿對(duì)水解產(chǎn)物進(jìn)行超聲提取，提取液減壓回收氯仿即得野菊花總黃酮水解產(chǎn)物。b、儀器:TBE_300A高速逆流色譜儀，上海同田生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。采用柱容積為300ml的高速逆流色譜儀(TBE-300A)進(jìn)行分離。選取正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水作為溶劑體系，按6: 4: 5: 5體積比將上述溶劑組分配置于分液漏斗中，充分搖勻后，靜置過夜，分層。分離兩相溶劑系統(tǒng)，選定上相為固定相，下相為流動(dòng)相。將固定相、流動(dòng)相在超聲清洗器中脫氣30min。C、稱取120mg野菊花總黃酮水解產(chǎn)物，以IOml流動(dòng)相超聲溶解，過濾取濾液作為
進(jìn)樣樣品備用。進(jìn)樣前，將固定相以9.99ml/min的流速泵入高速逆流色譜的色譜柱。待泵滿整個(gè)柱子后，開啟高速逆流色譜儀主機(jī)，設(shè)定儀器旋轉(zhuǎn)方向?yàn)檎D(zhuǎn)，緩慢將轉(zhuǎn)速升至900rpm，將流動(dòng)相按設(shè)定的流速2.99ml/min泵入色譜儀中，直至建立動(dòng)態(tài)平衡。由進(jìn)樣閥進(jìn)樣；通過與儀器信號(hào)采集系統(tǒng)相連的計(jì)算機(jī)色譜工作站采集數(shù)據(jù)，然后根據(jù)檢測(cè)圖譜，接收目標(biāo)成分，分離得到刺槐素8mg，經(jīng)過HPLC檢測(cè)，純度在99%以上。實(shí)施例2本實(shí)施例的溶劑體系，按體積比，正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水為7: 3: 5: 5。
從野菊花中分離制備刺槐素的方法包括以下步驟:a、樣品:取粉碎至粗粉的野菊花lKg，加入3倍量80%的乙醇室溫浸泡3次，每次I周，浸提液經(jīng)抽濾得清液，清液減壓回收乙醇后，過大孔樹脂(AB-8)，乙醇梯度洗脫，合并含有刺槐素的洗脫液，減壓回收乙醇得水溶液；向水溶液中加入2.5倍量、3mol/L的鹽酸，在100°C溫度條件下，進(jìn)一步進(jìn)行酸水解，得到壁上黑色固體水解產(chǎn)物，用氯仿對(duì)水解產(chǎn)物進(jìn)行超聲提取，提取液減壓回收氯仿即得野菊花總黃酮水解產(chǎn)物。b、儀器:TBE_300A高速逆流色譜儀，上海同田生物技術(shù)有限公司采用柱容積為300ml的高速逆流色譜儀(TBE-300A)進(jìn)行分離。選取正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水作為溶劑體系，按7: 3: 5: 5體積比將上述溶劑組分配置于分液漏斗中，充分搖勻后，靜置過夜，分層。分離兩相溶劑系統(tǒng)，選定上相為固定相，下相為流動(dòng)相。將固定相、流動(dòng)相在超聲清洗器中脫氣30min。C、稱取220mg野菊花總黃酮水解產(chǎn)物，以IOml流動(dòng)相超聲溶解，過濾取濾液作為
進(jìn)樣樣品備用。 進(jìn)樣前，將固定相以9.99ml/min的流速泵入高速逆流色譜的色譜柱。待泵滿整個(gè)柱子后，開啟高速逆流色譜儀主機(jī)，設(shè)定儀器旋轉(zhuǎn)方向?yàn)檎D(zhuǎn)，緩慢將轉(zhuǎn)速升至900rpm，將流動(dòng)相按設(shè)定的流速2.99ml/min泵入色譜儀中，直至建立動(dòng)態(tài)平衡。由進(jìn)樣閥進(jìn)樣；通過與儀器信號(hào)采集系統(tǒng)相連的計(jì)算機(jī)色譜工作站采集數(shù)據(jù)，然后根據(jù)檢測(cè)圖譜，接收目標(biāo)成分，分離得到刺槐素13mg，經(jīng)過HPLC檢測(cè)，純度在99%以上。實(shí)施例3本實(shí)施例的溶劑體系，按體積比，正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水為1:1:1:1。從野菊花中分離制備刺槐素的方法包括以下步驟:a、樣品:取粉碎至粗粉的野菊花lKg，加入3倍量80%的乙醇室溫浸泡3次，每次I周，浸提液經(jīng)抽濾得清液，清液減壓回收乙醇后，過大孔樹脂(AB-8)，乙醇梯度洗脫，合并含有刺槐素的洗脫液，減壓回收乙醇得水溶液；向水溶液中加入2.5倍量、3mol/L的鹽酸，在100°C溫度條件下，進(jìn)一步進(jìn)行酸水解，得到壁上黑色固體水解產(chǎn)物，用氯仿對(duì)水解產(chǎn)物進(jìn)行超聲提取，提取液減壓回收氯仿即得野菊花總黃酮水解產(chǎn)物。b、儀器:TBE_300A高速逆流色譜儀，上海同田生物技術(shù)有限公司采用柱容積為300ml的高速逆流色譜儀(TBE-300A)進(jìn)行分離。選取正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水作為溶劑體系，按1:1:1:1體積比將上述溶劑組分配置于分液漏斗中，充分搖勻后，靜置過夜，分層。分離兩相溶劑系統(tǒng)，選定上相為固定相，下相為流動(dòng)相。將固定相、流動(dòng)相在超聲清洗器中脫氣30min。C、稱取140mg野菊花總黃酮水解產(chǎn)物，以IOml流動(dòng)相超聲溶解，過濾取濾液作為進(jìn)樣樣品備用。進(jìn)樣前，將固定相以9.99ml/min的流速泵入高速逆流色譜的色譜柱。待泵滿整個(gè)柱子后，開啟高速逆流色譜儀主機(jī)，設(shè)定儀器旋轉(zhuǎn)方向?yàn)檎D(zhuǎn)，緩慢將轉(zhuǎn)速升至900rpm，將流動(dòng)相按設(shè)定的流速2.99ml/min泵入色譜儀中，直至建立動(dòng)態(tài)平衡。由進(jìn)樣閥進(jìn)樣；通過與儀器信號(hào)采集系統(tǒng)相連的計(jì)算機(jī)色譜工作站采集數(shù)據(jù)，然后根據(jù)檢測(cè)圖譜，接收目標(biāo)成分，分離得到刺槐素10mg，經(jīng)過HPLC檢測(cè)，純度在99%以上。
權(quán)利要求
1.從野菊花中分離制備刺槐素的方法，其特征在于，采用野菊花總黃酮水解產(chǎn)物為原料，采用高速逆流色譜儀為分離設(shè)備，包括以下步驟: 1)制備構(gòu)成固定相、流動(dòng)相的溶劑體系，所述溶劑體系由正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水組成； 2)先使高速逆流色譜儀填充固定相，然后調(diào)節(jié)流動(dòng)相流速及主機(jī)轉(zhuǎn)速，再泵入流動(dòng)相并平衡； 3)由進(jìn)樣閥進(jìn)樣； 4)收集目標(biāo)組分，經(jīng)減壓蒸干后重結(jié)晶，即得刺槐素單體。
2.如權(quán)利要求1所述的從野菊花中分離制備刺槐素的方法，其特征在于，在步驟I)中，所述溶劑體系按體積比，正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水為(1.0 1.4): (0.6 1.0):1:1。
3.如權(quán)利要求1所述的從野菊花中分離制備刺槐素的方法，其特征在于，在步驟I)中，以溶劑體系的上相為固定相，溶劑體系的下相為流動(dòng)相。
4.如權(quán)利要求1所述的從野菊花中分離制備刺槐素的方法，其特征在于，在步驟2)中，所述主機(jī)轉(zhuǎn)速為900rpm 。
5.如權(quán)利要求1所述的從野菊花中分離制備刺槐素的方法，其特征在于，在步驟2)中，所述流動(dòng)相的流速為2.99ml/min。
6.如權(quán)利要求1所述的從野菊花中分離制備刺槐素的方法，其特征在于，在步驟4)中，所述收集目標(biāo)組分根據(jù)檢測(cè)器圖譜或薄層色譜檢測(cè)方法或高效液相色譜收集目標(biāo)組分。
全文摘要
從野菊花中分離制備刺槐素單體的方法，涉及野菊花的加工方法。提供一種分離效率高、回收率高的采用高速逆流色譜法從野菊花中分離制備刺槐素單體的方法。1)制備構(gòu)成固定相、流動(dòng)相的溶劑體系，所述溶劑體系由正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水組成；2)先使高速逆流色譜儀填充固定相，然后調(diào)節(jié)流動(dòng)相流速及主機(jī)轉(zhuǎn)速，再泵入流動(dòng)相并平衡；3)由進(jìn)樣閥進(jìn)樣；4)收集目標(biāo)組分，經(jīng)減壓蒸干后重結(jié)晶，即得刺槐素單體。
文檔編號(hào)C07D311/40GK103193748SQ201310106920
公開日2013年7月10日 申請(qǐng)日期2013年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月29日
發(fā)明者王秀敏, 連惠龍, 楊欽磊, 陳慶, 劉澤華, 邱彥 申請(qǐng)人:廈門大學(xué)