專利名稱：一種兒茶素單體egcg工廠化生產(chǎn)分離純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種兒茶素單體提取分離技術(shù)工藝的改進(jìn)，特別是一種兒茶素單體 EGCG工廠化生產(chǎn)分離純化方法。
背景技術(shù)：
兒茶素是茶葉中重要的一類天然活性物質(zhì)，屬于黃烷醇類化合物，1929年由日 本人首次提取分離出來。它由八種左右的單體組成，即D、L-兒茶素(D、L-C)， L-表兒茶 素(L-EC) ， L-表沒食子兒茶素(L-EGC) ， D、 L_沒食子兒茶素(D、 L-GC) ， L_表兒茶素沒食 子酸酯(L-ECG) ， L-兒茶素酸酯(L-CG) 、 L_表沒食子兒茶素沒食子酸酯(L-EGCG) 、 L_沒 食子兒茶素沒食子酸酯(L-GCG)。由于CG、ECG、GCG、和EGCG中發(fā)生了兒茶素與沒食子 酸的酯化作用，故稱其為酯型兒茶素；而沒有發(fā)生酯化作用的C、 EC、 GC、 EGC稱為非酯型 兒茶素，各兒茶素的結(jié)構(gòu)較為相似，有些為同分異構(gòu)體，結(jié)構(gòu)的主要區(qū)別在于羥取代的數(shù) 量和位置不同。各種單位的含量也因茶葉品質(zhì)不同各異，一般來說其中的兩類酯型兒茶 素-印igallocatechi卿llate(EGCG)禾口-印icatechin gallate(ECG)含量較大，藥理活性 最強(qiáng)。研究表明茶多酚的主體化合物兒茶素既是理想的天然抗氧化劑、抗衰老以及抑菌、抗 艾滋病病毒等多種獨(dú)特功效。近年來，世界發(fā)達(dá)國家積極推進(jìn)兒茶素應(yīng)用產(chǎn)品的開發(fā)，以其 作為天然抗氧化劑和自由基清除劑，已廣泛應(yīng)用于食品加工、醫(yī)藥保健和日用化工等領(lǐng)域。
目前分離兒茶素的方法一般分為二步首先從茶末中提取含有兒茶素的茶多酚粗 制品(TP);其次從粗提物中純化分離兒茶素組分。若要得到兒茶素中的各種單體組分，則 需進(jìn)一步經(jīng)過柱色譜法、半制備高效液相色譜法(HPLC)純化或者其它儀器方法純化。由于 兒茶素各組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)十分相近，采用一般的方法很難分離，根據(jù)資料分析，目前 分離制備兒茶素單體的方法主要有以下幾種
(1)柱層析分離法 該方法是將茶多酚粗品經(jīng)一定的溶劑溶解后，上柱分離，用洗脫劑洗脫，收集兒茶 素。柱層析的關(guān)鍵是柱填料與洗脫劑的選擇。國內(nèi)外報道的柱填料有三大類型吸附型柱、 離子交換柱、凝膠柱。這種分離方法繁瑣、費(fèi)時、產(chǎn)品純度不高、還有溶劑殘留。 [OOOS] (2)高效液相(HPLC)制備色譜法 制備型HPLC主要用于分離純化出兒茶素的單體組分。工藝流程是TP粗品經(jīng)葡聚 糖凝膠S印hadex LH-20柱分離純化出兒茶素混合物，一般以不同梯度的丙酮水溶液作洗脫 劑，分離得到酯型兒茶素和非酯型兒茶素兩組流分，再經(jīng)HPLC制備柱分離純化，采用甲醇/ 水為洗脫劑，進(jìn)一步純化得到兒茶素單體組分，所得兒茶素產(chǎn)品純度較高，但存在成本高， 周期長后期溶劑難以完全除盡等缺點。
(3)高速逆流色譜法(HSCCC) 高速逆流色譜法是80年代發(fā)展起來的新技術(shù)，其特點是高速運(yùn)轉(zhuǎn)產(chǎn)生的重力場 使固定相能在分離柱中實現(xiàn)高的保留，從而大大提高了分離能力，該法屬儀器分離法，溶劑 系統(tǒng)中各溶劑在分液漏斗中混合后，上層為固定相，灌入色譜分離柱；下層為流動相，將TP粗品溶解成5%_10%的溶液。當(dāng)流動相流經(jīng)色譜柱時，兒茶素各組分得到分離。這種分 離方法是在兩相之間進(jìn)行的，克服了使用固體吸附材料造成的樣品不可逆吸附或降解的缺 點，樣品可最大限度的得以回收。但該方法成本高，制備量小，目前難以普及。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是通過對現(xiàn)有兒茶素單體提取分離技術(shù)工藝的改進(jìn)，提供一種分離 純化操作步驟簡單、分離效率高、制備量大的兒茶素單體EGCG工廠化生產(chǎn)分離純化方法。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的一種兒茶素單體EGCG工廠化生產(chǎn)分離純化方法，包 括以下步驟 a、單柱萃取分離將粗制茶多酚溶液和洗脫劑上柱，柱高15m，直徑55cm，用75% 乙醇作洗脫劑，控制茶多酚溶液流速700-900L/min，乙醇流速1500-1700L/min，萃取時間 1. 5-2小時，用減壓真空回收含L-表兒茶素沒食子酸酯兒茶素單體EGCG的洗脫液，再將其 貯存待層析； b、低壓柱層析純化以KR100-5C18為柱填料，柱高2. 8m，以25%乙醇水溶液為洗 脫劑，洗脫流速450L/min，對回收濃縮后待純化的含L-表兒茶素沒食子酸酯兒茶素單體 EGCG的洗脫液進(jìn)行柱層析，按時間或體積收集兒茶素單體EGCG目標(biāo)液，對兒茶素單體EGCG 目標(biāo)液進(jìn)行回收濃縮、結(jié)晶、冷凍干燥得兒茶素單體EGCG成品。 本發(fā)明采用KR100-5C18柱層析，分別以25% 、75%乙醇作為洗脫劑，進(jìn)行預(yù)分離 及純化實驗，可將粗制茶多酚中的主要六個兒茶素(EGCG/GCG/ECG/DL-C/EG/GCG/EGC)實 現(xiàn)連續(xù)高效的分離。該方法操作簡便，產(chǎn)量大、成本低廉、溶劑無毒，單體提取率及產(chǎn)品純度 均較高，并可實現(xiàn)EGCG —次性公斤級以上的制備，經(jīng)濟(jì)效益十分可觀。
本發(fā)明具有三方面的有益技術(shù)效果 (1)第一次分離采用25%乙醇做洗脫劑替代了目前常用的丙酮等其他水溶液洗 脫劑，具有以下優(yōu)點 a、一次性分離主要酯型兒茶素EGCG(含有GCG)與ECG，分離效果及分離效率均較 高，且非酯型兒茶素、咖啡因以茶色素可同時分離出去，解決了已報道得到茶多酚經(jīng)匍聚糖 凝膠S印hadex LH-20層析后，一般只能將原料茶多酚中的兒茶素分為酯型和非酯型兒茶素 兩類，而EGCG與ECG、 EGC無法分離的問題，可大大降低后續(xù)純化手續(xù)；
b、分離效果好，色帶均勻，不易拖尾和產(chǎn)生氣泡； c、溶劑回收方便，由于收集液均為兒茶素單體的水乙醇液，采用真空減壓濃縮回 收，回收十分快速方便，縮短了與后續(xù)純化的連接過程，而其他溶劑水溶液洗脫液體由于含 有水成分，收集液不易充分濃縮。 (2)EGCG柱層析純化方法采用柱層析技術(shù)，大大簡化了目前報道的半制備HPLC純 化等工藝，只需經(jīng)過常規(guī)的柱層析系統(tǒng)即可完成單體EGCG的分離提純，色譜純度99X，且 EGCG —次性純化制備降低了生產(chǎn)成本；整個分離、純化過程采用乙醇及25%乙醇水溶液， 兼容性及連續(xù)性強(qiáng)，且極易回收，廉價無毒，避免了半制備HPLC純化溶劑帶來的安全問題。
具體實施例方式
—種兒茶素單體EGCG工廠化生產(chǎn)分離純化方法，包括以下步驟
a、單柱萃取分離將粗制茶多酚溶液和洗脫劑上柱，柱高15m，直徑55cm，用75% 乙醇作洗脫劑，控制茶多酚溶液流速700-900L/min，乙醇流速1500-1700L/min，洗脫劑用 量4000L，萃取時間1.5-2小時，用減壓真空回收含L-表兒茶素沒食子酸酯兒茶素單體 EGCG的洗脫液，再將其貯存待層析； b、低壓柱層析純化以KR100-5C18為柱填料，柱高2. 8m，以25%乙醇水溶液為洗 脫劑，洗脫流速450L/min，洗脫用量800L，對回收濃縮后待純化的含L-表兒茶素沒食子酸 酯兒茶素單體EGCG的洗脫液進(jìn)行柱層析，按時間或體積收集兒茶素單體EGCG目標(biāo)液，對兒 茶素單體EGCG目標(biāo)液進(jìn)行回收濃縮、結(jié)晶、冷凍干燥得兒茶素單體EGCG成品。
實施實例1 : (1)首先投入1200kg茶葉，用去離子水加溫浸泡茶葉，浸泡三次 (2)抽濾茶水 (3)分別將兩次抽濾混合液濃縮 (4)上層析柱 ①填料的預(yù)處理稱取KR100-5C18 300kg，用洗脫劑25 %乙醇400kg充分溶脹 (也可以用8(TC溫水浸泡1. 5小時)。 ②將溶脹好的填料慢慢倒入層析柱，使其均勻沉降，待沉降到2. 75m時，關(guān)閉上料 口，用輸送泵將5-8倍柱床體積的25%乙醇輸入柱內(nèi)淋洗，以平衡柱子。
③上柱約200L萃取多酚浸膏溶液，用輸送泵輸入柱內(nèi)，待樣品完全滲入柱內(nèi)后， 再接上收集器，用低壓輸送泵輸入25 %乙醇開始收集，第一段為EGC，依次為DL-C、 CAF、 EGCG、 EC、 GCG、 ECG，洗脫流速為450L/min，共收集800L。 ④采用高效液相色譜儀，分別對收集液的成分和含量進(jìn)行定性分析。 (5)合并EGCG(含ECG)兒茶素單體的洗脫液，在100L真空濃縮機(jī)組濃縮40分鐘
(含固量在45左右)。 ①裝柱將溶脹好的填料緩慢倒入柱內(nèi)，使其均勻沉降，待沉降到2. 75m時，關(guān)閉 填柱口閥門，用輸送泵輸送5-8倍的50%乙醇淋洗，以平衡柱子。 ②上柱將濃縮后EGCG(ECG)固含量在50左右的兒茶素單體收集液，用輸送泵輸 入柱內(nèi)，待樣品完全滲入柱內(nèi)后，采用高級液相色譜法，對收集液的成分、含量進(jìn)行定性分 析，合并含EGCG兒茶素單體的洗脫液，在50L減壓濃縮機(jī)組，濃縮至含45%的固含量后，進(jìn) 一步純化結(jié)晶，冷凍干燥得成品10. 065kg，純度為99. 9%。
實施實例2 : 兒茶素單體L-表兒茶素沒食子酸酯EGCG和L-表兒茶素沒食子酸酯ECG的預(yù)分 離方法KR100-5C18為柱填料，以25%乙醇為洗脫劑，工藝條件為柱高2. 8m，洗脫流速 450L/min，一次性上樣量(TP)可達(dá)400L，洗脫劑用量800L，可實現(xiàn)粗制茶多酚原料中兒茶 素(EGCG與ECG/GCG)的有效分離。技術(shù)效果EGCG(含EGC)單體洗脫率為98. 45%，純度 可達(dá)98. 66 % ， ECG單體洗脫率為98. 64 % ，純度達(dá)98. 62 % ，提取率88. 57 % 。
兒茶素單體L-表兒茶素沒食子酸酯EGCG純化方法分離得到的EGCG (ECG)，真空 減壓濃縮至40L，再經(jīng)KR100-5C18柱層析分離純化，具體工藝條件為洗脫劑為50%乙醇， 柱高2. 8m，洗脫流速450L/min，洗脫劑用量800L，洗脫率可達(dá)98 %以上，純度達(dá)99. 9 %以 上，提取率88. 57% ，且無色素殘留。
權(quán)利要求
一種兒茶素單體EGCG工廠化生產(chǎn)分離純化方法，其特征在于包括以下步驟a、單柱萃取分離將粗制茶多酚溶液和洗脫劑上柱，柱高15m，直徑55cm，用75％乙醇作洗脫劑，控制茶多酚溶液流速700-900L/min，乙醇流速1500-1700L/min，萃取時間1.5-2小時，用減壓真空回收含L-表兒茶素沒食子酸酯兒茶素單體EGCG的洗脫液，再將其貯存待層析；b、低壓柱層析純化以KR100-5C18為柱填料，柱高2.8m，以25％乙醇水溶液為洗脫劑，洗脫流速450L/min，對回收濃縮后待純化的含L-表兒茶素沒食子酸酯兒茶素單體EGCG的洗脫液進(jìn)行柱層析，按時間或體積收集兒茶素單體EGCG目標(biāo)液，對兒茶素單體EGCG目標(biāo)液進(jìn)行回收濃縮、結(jié)晶、冷凍干燥得兒茶素單體EGCG成品。
全文摘要
一種兒茶素單體EGCG工廠化生產(chǎn)分離純化方法，采用KR100-5C18為柱填料，分別以25％、75％乙醇水溶液為洗脫劑，進(jìn)行柱層析，按時間或體積收集兒茶素單體EGCG目標(biāo)液，對兒茶素單體EGCG目標(biāo)液進(jìn)行回收濃縮、結(jié)晶、冷凍干燥得兒茶素單體EGCG成品。本發(fā)明解決了實驗室成果向工廠化生產(chǎn)的轉(zhuǎn)化難題，產(chǎn)量大、方法簡便、成本低廉、純度高、大大縮短的操作時間，整個生產(chǎn)過程綠色無污染，單體提取率及產(chǎn)品純度均達(dá)99.9％。
文檔編號C07D311/62GK101723927SQ200910273058
公開日2010年6月9日 申請日期2009年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月2日
發(fā)明者王軍偉 申請人:宜昌綠源生物技術(shù)有限公司