在粘合物質(zhì)和可鐵寧的粘合體上結(jié)合有抗-可鐵寧抗體的復(fù)合體及其用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及在粘合物質(zhì)和可鐵寧的粘合體上結(jié)合有抗-可鐵寧抗體的復(fù)合體及其用途，依據(jù)本發(fā)明的復(fù)合體在體外生物學(xué)分析方法（in?vitro?biological?assay）中可被用作分析工具，其可以保持粘合物質(zhì)的特異反活性、生物學(xué)功能；以及補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性（CDC）、抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性（ADCC）以及在體內(nèi)的長(zhǎng)半衰期等抗體的固有特性。
【專利說明】在粘合物質(zhì)和可鐵寧的粘合體上結(jié)合有抗-可鐵寧抗體的復(fù)合體及其用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及在粘合物質(zhì)和可鐵寧的粘合體上結(jié)合有抗-可鐵寧抗體的復(fù)合體及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002]眾多的肽以及適體生物藥品均具有有望成為候選藥物(drug candidate)的特性，但由于其在體內(nèi)容易被蛋白分解酶(proteinase)、肽酶(peptidase)以及核酸酶(nuclease)等分解，或者通過腎臟迅速排出體外，因此其半衰期通常特別短，一般僅為數(shù)分鐘至數(shù)小時(shí)(Sato A.K.et al., Curr Opin Biotechnol, 17，638-642，2006)。為了解決其不穩(wěn)定性及藥效持續(xù)時(shí)間短的問題，通常施行將聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEG)與其粘合的技術(shù)(Veronese, F.M.&Pasut G., Drug Discov Today, 10, 1451-1458，2005),阻礙由于體內(nèi)酶引起的分解，抑制腎臟和血管內(nèi)的吸收，從而延長(zhǎng)在血中的滯留時(shí)間。但該方法的缺點(diǎn)在于聚乙二醇化所需時(shí)間較長(zhǎng)，還需要根據(jù)不同粘合物質(zhì)需要特定的最優(yōu)化(specificoptimization),且由于PEG的粘合是異質(zhì)性(heterogenous)的，因此會(huì)產(chǎn)生多種分子粘合體。
[0003]為滿足作為新型遞送平臺(tái)(Novel delivery platform)使用的目的，半抗原(hapten)必須符合對(duì)于動(dòng)物和人無毒且無生理活性的條件?？设F寧(cotinine)是尼古丁的主要代謝產(chǎn)物，而人類已長(zhǎng)期暴露于尼古丁。因此，可鐵寧是作為新型遞送平臺(tái)的合適的半抗原。并且，其在小鼠體內(nèi)LD5tl值為2-4g/kg,相對(duì)來說非常安全的物質(zhì)(Riah 0.etal.，Toxicol.Lett.，109，21-29，1999)，以每天服用1.8g的量，服用四天時(shí)也未發(fā)現(xiàn)其它苜1J 作用(Bowman, E.R.&Mc, K.H.，Jr.，J.Pharmacol.Exp.Ther.，135，306-311，1962)。并且，已對(duì)可鐵寧在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的物質(zhì)代謝過程非常清楚，并對(duì)其血清半衰期大約為16小時(shí)的事實(shí)也非常清楚(Benowitz N.L.et al., 3rd Handb.Exp.Pharmacol.，29-60，2009)。另外，還有報(bào)告稱可鐵寧對(duì)于人沒有生理活性，3天內(nèi)吸收最高達(dá)160mg的可鐵寧，也未顯不任何生理上及行動(dòng)上的變化(Hatsukami, D.K.et al., Pharmacol.Biochem.Behav.，57，643-650，1997)。
[0004]另外，適體可以以特異的、三維的形態(tài)折疊，其類似于抗體，可與靶標(biāo)高親和性的、特異性的結(jié)合，從而被廣泛用于多種分析和實(shí)驗(yàn)。利用適體制備與抗體結(jié)合的復(fù)合體的現(xiàn)有方法主要是將適體與生物素(biotin)以及異羥基洋地黃毒苷(digoxigenin)粘合,使其與親和素(avidin)以及抗-異羥基洋地黃毒苷抗體結(jié)合形成復(fù)合體。
[0005]本發(fā)明人利用可鐵寧作為半抗原，制備了在粘合物質(zhì)和可鐵寧的粘合體結(jié)合有抗-可鐵寧抗體結(jié)合的復(fù)合體，并發(fā)現(xiàn)所述復(fù)合體可保持粘合物質(zhì)的特異反應(yīng)性、生物學(xué)功能；以及補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(complement-mediated cell cytoxicity, Q)C)、抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(antibody-dependent cell cytotoxicity, ADCC)以及在體內(nèi)的長(zhǎng)半衰期等抗體的固有特性，由此完成了本發(fā)明。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題
[0007]本發(fā)明的目的是提供在粘合物質(zhì)和可鐵寧的粘合體上結(jié)合有抗-可鐵寧抗體的復(fù)合體。
[0008]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供體外生物學(xué)分析方法(in vitro biologicalassay )，其特征在于，將可鐵寧和粘合物質(zhì)的粘合體作為分析工具使用。
[0009]本發(fā)明的另一個(gè)目的是通過在可鐵寧和粘合物質(zhì)的粘合體上結(jié)合抗-可鐵寧抗體，提供延長(zhǎng)所述粘合物質(zhì)的體內(nèi)半衰期的方法。
[0010]本發(fā)明的另一個(gè)目的是通過在可鐵寧和粘合物質(zhì)的粘合體上結(jié)合抗-可鐵寧抗體，提供誘導(dǎo)所述粘合物質(zhì)結(jié)合的細(xì)胞發(fā)生補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性的方法。
[0011]本發(fā)明的另一個(gè)目的是通過在可鐵寧和粘合物質(zhì)的粘合體上結(jié)合抗-可鐵寧抗體，提供誘導(dǎo)所述粘合物質(zhì)結(jié)合的細(xì)胞發(fā)生抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的方法。
[0012]本發(fā)明的另一個(gè)目的是通過在可鐵寧和粘合物質(zhì)的粘合體上結(jié)合抗-可鐵寧抗體，提供將所述粘合物質(zhì)在體內(nèi)的分布變化為一般抗體在體內(nèi)的分布狀況的方法。
[0013]技術(shù)方案
[0014]為了實(shí)現(xiàn)所述目的，本發(fā)明提供在粘合物質(zhì)和可鐵寧的粘合體上結(jié)合有抗-可鐵寧抗體的復(fù)合體。
[0015]為了實(shí)現(xiàn)所述另一個(gè)目的，本發(fā)明提供體外生物學(xué)分析方法，其特征在于，將可鐵寧和粘合物質(zhì)的粘合體作為分析工具使用。
[0016]為了實(shí)現(xiàn)所述另一個(gè)目的，本發(fā)明通過在可鐵寧和粘合物質(zhì)的粘合體上結(jié)合抗-可鐵寧抗體，提供延長(zhǎng)所述粘合物質(zhì)的體內(nèi)半衰期的方法。
[0017]為了實(shí)現(xiàn)所述另一個(gè)目的，本發(fā)明通過在可鐵寧和粘合物質(zhì)的粘合體上結(jié)合抗-可鐵寧抗體，提供誘導(dǎo)所述粘合物質(zhì)結(jié)合的細(xì)胞發(fā)生補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性的方法。
[0018]為了實(shí)現(xiàn)所述另一個(gè)目的，本發(fā)明通過在可鐵寧和粘合物質(zhì)的粘合體上結(jié)合抗-可鐵寧抗體，提供誘導(dǎo)所述粘合物質(zhì)結(jié)合的細(xì)胞發(fā)生抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的方法。
[0019]為了實(shí)現(xiàn)所述另一個(gè)目的，本發(fā)明通過在可鐵寧和粘合物質(zhì)的粘合體上結(jié)合抗-可鐵寧抗體，提供將所述粘合物質(zhì)在體內(nèi)的分布變化為一般抗體在體內(nèi)的分布狀況的方法。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]本發(fā)明所述以及其它的目的和特征，將通過所附的附圖和下述對(duì)于本發(fā)明的說明更加明確。
[0021]圖1是對(duì)于實(shí)施例2中純化的抗-可鐵寧抗體進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色的凝膠圖片。
[0022]圖2以及圖3是實(shí)施例(3-1)中合成的可鐵寧-WKYMVm-NH2粘合體，以及實(shí)施例(3-2)中合成的可鐵寧-AS1411以及可鐵寧-派加他尼粘合體的結(jié)構(gòu)式。
[0023]圖4是表示在試驗(yàn)例I中施行的，分析抗-可鐵寧IgG抗體對(duì)于可鐵寧的親和性的曲線圖。[0024]圖5是表示可鐵寧-WKYMVm-NH2/抗-可鐵寧IgG復(fù)合體對(duì)于FPR2細(xì)胞受體的特異性結(jié)合能力的曲線圖。
[0025]圖6至圖8分別是分析可鐵寧-WKYMVm-NH2/抗-可鐵寧IgG復(fù)合體的細(xì)胞內(nèi)鈣濃度變化、超氧化物產(chǎn)生程度以及趨化性的結(jié)果。
[0026]圖9是比較可鐵寧-WKYMVm-NH2粘合體以及可鐵寧-WKYMVm-NH2/抗-可鐵寧IgG復(fù)合體在小鼠體內(nèi)半衰期的曲線圖以及直方圖。
[0027]圖10是表示抗-可鐵寧IgG在血清中的體內(nèi)半衰期的曲線圖。
[0028]圖11是表示可鐵寧-WKYMVm-NH2/抗-可鐵寧IgG復(fù)合體在敗血癥模型中的改善的治療效果的曲線圖。
[0029]圖12是比較可鐵寧-派加他尼粘合體以及可鐵寧-派加他尼/抗-可鐵寧IgG復(fù)合體在小鼠體內(nèi)半衰期的曲線圖。
[0030]圖13以及圖14表示可鐵寧-AS1411/抗-可鐵寧IgG復(fù)合體對(duì)于核仁素細(xì)胞受體的特異性結(jié)合能力的試驗(yàn)結(jié)果。
[0031]圖15是對(duì)可鐵寧-AS1411/抗-可鐵寧IgG復(fù)合體進(jìn)行蛋白免疫印跡的結(jié)果。
[0032]圖16是表示利用可鐵寧-AS1411/抗-可鐵寧IgG復(fù)合體的核仁素的免疫沉淀試
驗(yàn)結(jié)果。
[0033]圖17是表示可鐵寧-派加他尼/抗-可鐵寧IgG復(fù)合體對(duì)于血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的結(jié)合性的曲線圖。
[0034]圖18是表示阿昔單抗、阿昔單抗-可鐵寧粘合體以及可鐵寧-阿昔單抗/抗-可鐵寧IgG復(fù)合體對(duì)于整合素a 2b β 3的反應(yīng)性的曲線圖。
[0035]圖19是可鐵寧-阿昔單抗/抗-可鐵寧IgG復(fù)合體對(duì)于血小板結(jié)合能力的試驗(yàn)結(jié)果。
[0036]圖20是可鐵寧-胰島素/抗-可鐵寧抗體復(fù)合體對(duì)于MCF-7以及SK_Br_3細(xì)胞的結(jié)合能力的試驗(yàn)結(jié)果。
[0037]圖21是分析可鐵寧-胰島素/抗-可鐵寧抗體復(fù)合體的補(bǔ)體依賴性毒性的分析結(jié)果。
[0038]圖22表示粘合物質(zhì)和可鐵寧的粘合體上結(jié)合有抗-可鐵寧抗體的復(fù)合體的示意圖。
[0039]圖23表示為了從細(xì)胞培養(yǎng)液中純化對(duì)于人補(bǔ)體C5的ScFv抗體，利用蛋白A瓊脂糖(protein A agarose)進(jìn)行親和層析(affinity chromatography)的結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0040]以下，將對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更為詳細(xì)的說明。
[0041]本文中“抗體”是指免疫系統(tǒng)中通過抗原的刺激而產(chǎn)生的物質(zhì)，對(duì)其種類沒有特殊的限制。本說明書中所述抗體可包括動(dòng)物抗體、嵌合(chimeric)抗體,人源化抗體或者全人源抗體。并且，本說明書所述抗體還包括保留抗原結(jié)合能力的抗體片段，例如Fab。
[0042]本文中“嵌合抗體”是指抗體的可變區(qū)(variable region)或者其補(bǔ)償決定區(qū)(complementarity-determining region, (DR)與抗體其它部分源于不同動(dòng)物的抗體。例如，這類抗體的抗體可變區(qū)可以是源于人類以外的動(dòng)物(例如，小鼠、兔子、家禽類等)，而抗體恒定區(qū)(constant region)可以是源于人類。此類嵌合抗體由本領(lǐng)域公知的基因重組等方法制備。
[0043]本文中“重鏈”是指包含可變區(qū)結(jié)構(gòu)域Vh及3個(gè)恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域CH1、CH2以及CH3的全長(zhǎng)重鏈及其片段。其中，所述可變區(qū)結(jié)構(gòu)域Vh包含充分的可變區(qū)氨基酸序列以使抗體具有對(duì)于抗原的特異性。
[0044]本文中“輕鏈”是指包含可變區(qū)結(jié)構(gòu)域\及恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域Q的全長(zhǎng)輕鏈及其片段。其中，所述可變區(qū)結(jié)構(gòu)域'包含充分的可變區(qū)氨基酸序列以使抗體具有對(duì)于抗原的特異性。
[0045]本文中“補(bǔ)償決定區(qū)”是指在抗體可變區(qū)中，使抗體具有與抗原結(jié)合的特異性的部位。
[0046]本文中的“粘合體”屬于異型分子，可在一個(gè)以上的非-多肽部分(特別是聚合物部分)以共價(jià)形式附著一種以上的多肽而成(典型為一個(gè)多肽)。所述非-多肽部分包括聚合物分子、親脂性化合物、碳水化合物部分或者有機(jī)衍生劑((^1'；^31^2；[1^)等。另外,粘合體還可在一個(gè)以上碳水化合物部分利用N-或者O-糖基化進(jìn)行附著。以共價(jià)形式吸附是指多肽及非-多肽部分直接以共價(jià)鍵結(jié)合，或者通過橋接、空間(space)、連接部分、或者與部分相同的中介部分或者部分等，間接的以共價(jià)形式附著。例如，本文中公開的由粘合物質(zhì)與可鐵寧接合的粘合體就屬于本定義的范圍內(nèi)。
[0047]本發(fā)明提供在粘合物質(zhì)和可鐵寧的粘合體上結(jié)合有抗-可鐵寧抗體的復(fù)合體(圖22)。
[0048]并且，本發(fā)明提供的體外生物學(xué)分析方法，其特征在于，將可鐵寧和粘合物質(zhì)的粘合體作為分析工具。所述體外生物學(xué)分析方法的特征在于，其可選自由流式細(xì)胞分析法、蛋白免疫印跡分析法、免疫沉淀分析法以及酶聯(lián)免疫化學(xué)分析法組成的組中。
[0049]本發(fā)明中的在粘合物質(zhì)和可鐵寧的粘合體上結(jié)合抗-可鐵寧抗體的復(fù)合體，使用可鐵寧作為半抗原，因此可保留粘合物質(zhì)和抗體所有的固有特性。具體的，所述復(fù)合體可保留分子的特異反應(yīng)性和功能；以及補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)、抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)以及體內(nèi)的長(zhǎng)半衰期等抗體的特性。
[0050]因此，本發(fā)明通過在可鐵寧和粘合物質(zhì)的粘合體上結(jié)合抗-可鐵寧抗體，提供延長(zhǎng)所述粘合物質(zhì)的體內(nèi)半衰期的方法。
[0051]并且，本發(fā)明通過在可鐵寧和粘合物質(zhì)的粘合體上結(jié)合抗-可鐵寧抗體，提供誘導(dǎo)所述粘合物質(zhì)結(jié)合的細(xì)胞發(fā)生補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性的方法。
[0052]并且，本發(fā)明通過在可鐵寧和粘合物質(zhì)的粘合體上結(jié)合抗-可鐵寧抗體，提供誘導(dǎo)所述粘合物質(zhì)結(jié)合的細(xì)胞發(fā)生抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的方法。
[0053]并且，本發(fā)明通過在可鐵寧和粘合物質(zhì)的粘合體上結(jié)合抗-可鐵寧抗體，提供將所述粘合物質(zhì)在體內(nèi)的分布變化為一般抗體在體內(nèi)的分布狀況的方法。
[0054]本發(fā)明的復(fù)合體是由一種抗體和可鐵寧構(gòu)成的，其可通過將短序列的粘合物質(zhì)與可鐵寧進(jìn)行簡(jiǎn)單得粘合即可制備，因此可用作具有高集約、易開發(fā)、簡(jiǎn)單等特點(diǎn)的遞送平臺(tái)。
[0055]從而，本發(fā)明的復(fù)合體是其抗原反應(yīng)性(antigenic reactivity)由與可鐵寧粘合的粘合物質(zhì)所決定的一種新型抗體，因此其可用作擁有分子固有的生物學(xué)或者化學(xué)功能的治療用抗體。
[0056]可鐵寧是煙草煙霧的主要成分尼古丁的重要代謝產(chǎn)物，雖然人類暴露于煙草煙霧的時(shí)間很長(zhǎng)，但僅有關(guān)于可鐵寧即刻毒性少量報(bào)導(dǎo)，因此可鐵寧被認(rèn)為是非常穩(wěn)定的分子。由于可鐵寧的這種相對(duì)低毒性特性，使其成為了可用于體內(nèi)的理想的分子用粘合體。本發(fā)明中通過將可鐵寧與粘合物質(zhì)進(jìn)行粘合，使所述粘合物質(zhì)的半衰期顯著延長(zhǎng)。
[0057]本發(fā)明中所稱的粘合物質(zhì)可以是具有特定治療活性或者結(jié)合反應(yīng)性等的多種生物學(xué)以及化學(xué)物質(zhì)。
[0058]所述粘合物質(zhì)例如可選自由肽、適體、激素、蛋白質(zhì)以及化學(xué)物質(zhì)組成的組中，可優(yōu)選選自由 WKYMVm-NH2 妝(WKYMVm-NH2)、Wkymvm-NH2 妝(Wkymvm-NH2 )、AS 1411 適體、派加他尼(pegaptanib)、阿昔單抗以及胰島素組成的組中。
[0059]可使用為本發(fā)明粘合物質(zhì)的阿昔單抗是對(duì)在血小板表面廣泛表達(dá)的整合素a 2b β 3具有反應(yīng)性的小鼠/人嵌合Fab。
[0060]依據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，可將所述阿昔單抗與可鐵寧進(jìn)行粘合制備可鐵寧-阿昔單抗粘合體以及包含抗-可鐵寧抗體的復(fù)合體(以下稱為可鐵寧-阿昔單抗/抗-可鐵寧抗體復(fù)合體)。通過參考本文試驗(yàn)例9、圖18以及圖19可知，所述復(fù)合體對(duì)于整合素α 2b β 3和血小板維持與阿西單抗相同水平的反應(yīng)性。
[0061]可使用為本發(fā)明粘合物質(zhì)的胰島素是在體內(nèi)調(diào)節(jié)碳水化合物以及脂肪物質(zhì)代謝的重要激素。胰島素由2種多肽鏈構(gòu)成，其中由21個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的A鏈內(nèi)有一個(gè)分子間二硫鍵(intra molecular disulfide bond),而由30個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的B鏈內(nèi)有2個(gè)將其與 A 鏈相連接的分子內(nèi)二硫鍵(inter-molecular disulfide bond) (Nicol DS, Smith, LF.，Nature.1960Aug6, 187:483-5，PubMed PMID:14426955)。
[0062]依據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，可將所述胰島素與可鐵寧進(jìn)行粘合制備可鐵寧-胰島素粘合體以及包含抗-可鐵寧抗體的復(fù)合體(以下稱為可鐵寧-胰島素/抗-可鐵寧抗體復(fù)合體)。通過參考本文試驗(yàn)例10、圖20以及圖21可知，所述復(fù)合體對(duì)于表達(dá)胰島素受體的細(xì)胞維持與胰島素受體的結(jié)合能力。
[0063]可使用為本發(fā)明粘合物質(zhì)的WKYMVm-NH2肽是抗-敗血癥的治療性肽，并且是對(duì)于甲酰肽受體(Formyl peptide receptors,FPRs)的拮抗劑。其還可在卩遼菌細(xì)胞(phagocyte)中誘導(dǎo)超化性移行(chemotactic migration),增加單核細(xì)胞(monocyte)和嗜中性粒細(xì)胞(neutrophil)的超氧化物(superoxide)的產(chǎn)生，因此具有抗生作用。
[0064]依據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，可將所述WKYMVm-NH2肽與可鐵寧進(jìn)行粘合制備可鐵寧-WKYMVm-NHJi粘合體(圖2)以及包含抗-可鐵寧抗體的復(fù)合體(以下稱為可鐵寧-WKYMVm-NH2/抗-可鐵寧抗體復(fù)合體)。具體的，所述WKYMVm-NH2肽(參考文獻(xiàn)[BaekSH, et al., J Biol Chem., 1996Apr5;271 (14):8170-5.PubMed PMID:8626507]以及[Kim SD,et al., J Immunol.2009Novl, 183(9):5511-7.PubMed PMID:19843937])利用迷你PEG (min1-PEG)作為連接體與可鐵寧進(jìn)行結(jié)合。之后，可與抗-可鐵寧抗體(ParkS，et al., Clin Chim Acta.2010Sep6, 411 (17-18):1238-42.Epub2010Mayl1.PubMedPMID:20438723)形成復(fù)合體。
[0065] 由此制備的本發(fā)明的復(fù)合體在流式細(xì)胞分析法中對(duì)于表達(dá)甲酰肽受體的細(xì)胞顯示反應(yīng)性，由此可知其仍保留了 WKYMVm-NH2的結(jié)合能力(參考圖5)。并且，可鐵寧-WKYMVm-NH2粘合體能使鈣從細(xì)胞成功地釋放出去，因此，能夠推斷與可鐵寧粘合后WKYMVm-NH2仍能維持其的生物學(xué)功能(參考圖6至圖8)。并且，在敗血癥小鼠模型中，給予所述可鐵寧-WKYMVm-NH2/抗-可鐵寧抗體復(fù)合體的組，以劑量依賴的方式(dose-dependent manner)使敗血癥小鼠恢復(fù)；而單獨(dú)給予可鐵寧-WKYMVm-NH2粘合體的組，未顯示任何效果。這些結(jié)果顯示所述復(fù)合體中的WKYMVm-NH2肽不僅維持了其生物學(xué)治療效果，還因所述抗-可鐵寧抗體的體內(nèi)長(zhǎng)半衰期，導(dǎo)致可鐵寧-WKYMVm-NH2粘合體的半衰期也得到了延長(zhǎng)(參考圖9)。
[0066]可使用為本發(fā)明粘合物質(zhì)的派加他尼是聚乙二醇化的抗-血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子適體，它與在血管新生成的過程中起到重要作用的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子165 (VEGF165)結(jié)合。
[0067]依據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，可將所述派加他尼的核酸部分與可鐵寧進(jìn)行粘合制備可鐵寧-派加他尼粘合體(參考圖3)以及包含抗-可鐵寧抗體的復(fù)合體(以下稱為可鐵寧-派加他尼/抗-可鐵寧抗體復(fù)合體)，并且可知所述復(fù)合體在體內(nèi)的半衰期得到了極大的改善(參考試驗(yàn)例7)。
[0068]可使用為本發(fā)明粘合物質(zhì)的AS1411適體具有以G-rich寡核苷酸的形式與在癌細(xì)胞表面表達(dá)的核仁素結(jié)合后被吸收至癌細(xì)胞內(nèi)，從而破壞核仁素的DNA復(fù)制和細(xì)胞增殖等正常功能的特征。
[0069]本發(fā)明中可在所述適體的5’粘合可鐵寧，從而與抗體形成穩(wěn)定的復(fù)合體。依據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，可將所述AS1411與可鐵寧進(jìn)行粘合制備可鐵寧-AS1411粘合體(參考圖3)以及包含抗-可鐵寧抗體的復(fù)合體(以下稱為可鐵寧-AS1411/抗-可鐵寧抗體復(fù)合體)，并且可知所述復(fù)合體與AS1411適體類似，仍保留了對(duì)于血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的結(jié)合能力(參考試驗(yàn)例8)。
[0070]本發(fā)明中所述粘合物 質(zhì)通過聚乙二醇連接體(迷你聚乙二醇-12)或者氨基C6連接體與可鐵寧進(jìn)行連接。
[0071]所述可鐵寧和粘合物質(zhì)的粘合體結(jié)合于抗-可鐵寧抗體形成本發(fā)明的復(fù)合體，此時(shí)的粘合體可與抗體的重鏈或者輕鏈結(jié)合，尤其是優(yōu)選結(jié)合于抗-可鐵寧抗體的抗原結(jié)合部位。
[0072]并且，本發(fā)明中的抗-可鐵寧抗體可以使用將高親和度的抗-可鐵寧Fab抗體(參考美國專利US8，008, 448B2)以IgG形式制備以及表達(dá)的抗體。
[0073]例如，所述抗-可鐵寧抗體可以通過如下的方法制備。將對(duì)所述美國專利第8，008，448號(hào)記載的方式進(jìn)行變形而制備的輕鏈基因以及重鏈基因分別插入到表達(dá)載體(例如，pcDNA3.1)。接著，將其轉(zhuǎn)化至哺乳動(dòng)物細(xì)胞后表達(dá)抗體蛋白質(zhì)，然后采用通常使用的方法對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行純化，制備本發(fā)明中的抗-可鐵寧IgG抗體。
[0074]此時(shí)，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以使用CHO DG44細(xì)胞(英杰公司，美國)，而純化的方法優(yōu)選對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行濃縮后，用蛋白A柱(protein A column ;吉諾泰,美國)進(jìn)行純化。
[0075]本發(fā)明中所述抗-可鐵寧抗體的特征在于，選自由所述抗體；選自Fab、ScFv以及結(jié)構(gòu)域抗體的抗體片段；以及包含所述抗體和抗體片段作為構(gòu)成成分的融合蛋白質(zhì)(fusion protein)組成的組中。
[0076]制備在粘合物質(zhì)和可鐵寧的粘合體上結(jié)合抗-可鐵寧抗體的復(fù)合體的方法，可包含以下步驟:1)制備粘合物質(zhì)和可鐵寧的粘合體的步驟；2)制備抗-可鐵寧抗體的步驟；以及3)使所述制備的粘合物質(zhì)和可鐵寧粘合而成的粘合體以及抗-可鐵寧抗體結(jié)合的步驟。
[0077]具體的，所述方法可包含以下步驟:a)將編碼在粘合物質(zhì)和可鐵寧的粘合體上結(jié)合抗-可鐵寧抗體的復(fù)合體的核酸分子插入到載體的步驟；b)將所述載體導(dǎo)入至宿主細(xì)胞的步驟；以及c)培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞的步驟。
[0078]制備在粘合物質(zhì)和可鐵寧的粘合體上結(jié)合有抗-可鐵寧抗體的復(fù)合體，可在臨床階段設(shè)定抗-可鐵寧抗體生產(chǎn)系統(tǒng)時(shí)，成為制備治療用抗體的有效的方法。重新開發(fā)新型治療用抗體需要消耗很長(zhǎng)的時(shí)間，但利用本發(fā)明中復(fù)合體制備方法，可在臨床階段以高通量方式制備可迅速、輕易合成的小分子形態(tài)的治療用抗體。
[0079]本發(fā)明中，使可鐵寧和粘合物質(zhì)粘合后，在制備出的粘合體上結(jié)合抗-可鐵寧抗體而形成復(fù)合體。所述抗體的抗原反應(yīng)性是由粘合于可鐵寧的粘合物質(zhì)產(chǎn)生。由此制備的本發(fā)明的復(fù)合體可保留包含補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性、抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性以及在體內(nèi)的長(zhǎng)半衰期的所述抗體的所有特征。
[0080]相比于將粘合分子直接與抗體結(jié)合的現(xiàn)有的分子-抗體粘合體，本發(fā)明中的復(fù)合體還在免疫學(xué)方面具有其它的優(yōu)點(diǎn)。
[0081]具體地，現(xiàn)有的治療用的分子和抗體的粘合體可用作半抗原-載體(hapten-carrier),對(duì)于直接結(jié)合于抗體的分子即刻發(fā)生免疫學(xué)反應(yīng)。所述分子-抗體粘合體被抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cell)包圍后,所述抗體會(huì)被分解成短肽。此時(shí)，無數(shù)的治療用分子仍然與所述短肽以化學(xué)方式發(fā)生交聯(lián)。如與所述治療用分子連接的肽中的一個(gè)，與特定MHC分子具有高親和性時(shí)，將會(huì)明顯的出現(xiàn)在抗原提呈細(xì)胞的細(xì)胞表面。而這將能有效地誘導(dǎo)對(duì)于治 療用分子的免疫性。
[0082]然而，本文中發(fā)明的復(fù)合體被抗原提呈細(xì)胞包圍時(shí)，由于抗體被分解為短肽，可鐵寧和粘合物質(zhì)組成的粘合體與抗-可鐵寧抗體即刻發(fā)生分離。此種方法的優(yōu)點(diǎn)在于，這種方法可以使對(duì)于與可鐵寧粘合的治療用分子的免疫原性反應(yīng)的激活變得較困難。
[0083]以下，將根據(jù)下述實(shí)施例更加詳細(xì)的說明本發(fā)明。下述實(shí)施例僅是為了例示本發(fā)明，本發(fā)明的范圍并不僅僅局限于此。
[0084]實(shí)施例1:抗-可鐵寧兔子/人嵌合IgG基因的制備
[0085](1-1)利用杭-可鐵寧兔子scFv對(duì)杭體可奪區(qū)講行擴(kuò)增
[0086]為了擴(kuò)增兔子的抗體可變區(qū)(' 以及VH)，將兔子抗-可鐵寧scFv基因(參考美國專利第8，008，448號(hào))為模板，并分別使用60pmole的八用上游及下游引物(SEQ NO:11以及12)以及Vh用上游及下游引物(SEQ NO: 13以及14)施行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。
[0087]具體地，為進(jìn)行PCR反應(yīng)，將美國專利第8，008, 448號(hào)中合成的cDNA (約0.5 μ g)I μ l、60pmole的上游引物及下游引物、10 μ的10 XPCR緩沖液、8 μ I的2.5mM的dNTP混合物以及0.5 μ I的Taq聚合酶(polymerase)混合后,添加100 μ I的蒸懼水。將所述混合物在94?下進(jìn)行10分鐘的變性(denaturation)后，再反復(fù)以下循環(huán)反應(yīng),共30回:941^條件下15秒；56°C條件下30秒；72°C條件下90秒。然后在72°C下靜置10分鐘。
[0088]將經(jīng)所述過程擴(kuò)增的DNA在1%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳后，利用QIA快速凝膠回收試劑盒(QIAquick gel extraction kit,凱杰,美國)進(jìn)行純化。
[0089]( 1-2)對(duì)人杭體恒定區(qū)的擴(kuò)增
[0090]為擴(kuò)增人輕鏈恒定區(qū)(Ck )以及人重鏈恒定區(qū)(CH1-CH3)的抗體恒定區(qū)(Constant region),以 20ng 的 pComb3XTT 載體(Barbas et al., Proc.Natl.Acad.Sc1., USA, (1991)，15:88(18)，7978-7982)為模板，分別使用60pmole的Ck用上游引物及下游引物(SEQ NO:15以及16)以及CH1-CH3用上游引物及下游引物(SEQ NO:17以及18)進(jìn)行PCR。除所述部分外，其余部分都采用與所述實(shí)施例(1-1)相同的方法進(jìn)行。然后，對(duì)擴(kuò)增的DNA進(jìn)行凝膠電泳及純化。
[0091](1-3)輕鏈的擴(kuò)增
[0092]為了進(jìn)行輕鏈的PCR擴(kuò)增，利用重疊延伸PCR，對(duì)所述實(shí)施例(1-1)以及(1_2)中制備并純化的兔子抗體輕鏈可變區(qū)(')以及人抗體輕鏈恒定區(qū)(Ck )進(jìn)行結(jié)合，從而制備出了輕鏈基因。
[0093]具體地，為進(jìn)行PCR反應(yīng)分別加入IOOng的' 以及C κ PCR產(chǎn)物，分別加入60pmole的抗-可鐵寧兔子/人嵌合抗體輕鏈的上游引物以及下游引物(SEQ NO:7以及8)進(jìn)行PCR。除所述部分外，其余部分都采用與所述實(shí)施例(1-1)相同的方法進(jìn)行。并且，采用與實(shí)施例(1-1)相同的方法對(duì)擴(kuò)增的DNA進(jìn)行凝膠電泳及純化。
[0094]( 1-4)重鏈的擴(kuò)增
[0095]為了進(jìn)行重鏈的PCR擴(kuò)增，利用重疊延伸PCR，對(duì)所述實(shí)施例(1-1)以及(1_3)中制備并純化的兔子抗體重鏈可變區(qū)(Vh)以及人抗體重鏈恒定區(qū)(CH1-CH3)進(jìn)行結(jié)合，從而制備出了重鏈基因。
[0096]具體地說，為進(jìn)行PCR反應(yīng)分別加入IOOng的Vh以及CH1-CH3PCR產(chǎn)物、分別加A60pmole的抗-可鐵寧兔子/人嵌合抗體重鏈的上游引物以及下游引物(SEQ NO:9以及10)，并再加入10 μ I的10XPCR緩沖液、8 μ I的2.5mM的dNTP混合物以及0.5 μ I的Taq聚合酶混合后，添加100 μ I 的蒸餾水。將所述混合物在94°C下進(jìn)行10分鐘的變性后，再反復(fù)以下循環(huán)反應(yīng)，共20回:94°C條件下15秒；56°C條件下30秒；72°C條件下180秒。然后在72 °C下靜置10分鐘。
[0097]之后，采用與實(shí)施例(1-1)相同的方法對(duì)擴(kuò)增的DNA進(jìn)行凝膠電泳及純化。
[0098](1-5)制備包含抗-可鐵寧兔子/人嵌合抗體IgG基因的表達(dá)載體
[0099]將所述實(shí)施例(1-3)中制備以及純化的輕鏈PCR產(chǎn)物，以及所述實(shí)施例(2-4)中制備以及純化的重鏈PCR產(chǎn)物，分別利用限制酶Hind ΙΙΙ/Xba I(NEB，美國)以及限制酶BamHI/Nhe 1(肥8，美國)進(jìn)行酶切，提純后插入到表達(dá)載體(？00嫩3.1)的多克隆位點(diǎn)(Multipleclonining site, MCS)的部位。
[0100]實(shí)施例2:為抗-可鐵寧兔子/人嵌合IgG表達(dá)以及試管內(nèi)分析進(jìn)行的純化
[0101]用包含抗-可鐵寧兔子/人嵌合IgG基因的表達(dá)載體DNA對(duì)哺乳動(dòng)物CHO DG44(英杰，美國)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在含有100U/ml青霉素以及100g/ml鏈霉素(GIBC0，美國)的⑶OptiCHO?表達(dá)培養(yǎng)基(GIBCO)中加入500μ g/ml的G418，將所述轉(zhuǎn)化的細(xì)胞用此培養(yǎng)基，在37°C、135rpm的條件下培養(yǎng)。將培養(yǎng)液的上層液用小型切向流超濾系統(tǒng)(LabScaleTFF system)(默克密理博,美國)進(jìn)行濃縮,后利用蛋白A柱(Repligen C0.,美國)進(jìn)行純化。用考馬斯亮藍(lán)對(duì)純化的150KDa的IgG進(jìn)行染色，對(duì)其確認(rèn)(參考圖1)后用于之后的實(shí)驗(yàn)(試驗(yàn)例)。
[0102]如圖1所示，泳道I為大小標(biāo)志物；泳道2為未還原的抗-可鐵寧IgG (150KDa)；泳道3為還原的抗-可鐵寧IgG，可知為輕鏈(25KDa)以及重鏈(50KDa)。[0103]實(shí)施例3:可鐵寧以及粘合物質(zhì)組成的粘合體的制備_4] (3-1)可鐵寧及肽的粘合體
[0105]其中作為肽使用的是WKYMVm-NH2 肽(WKYMVm-NH2，SEQ NO:1)以及 Wkymvm-NH2 肽(Wkymvm-NH2, SEQ NO:2)。WKYMVm-NH2 以及 Wkymvm-NH2 是通過固相多妝合成(solid phasepeptide synthesis)的方法,利用ASP48S多肽自動(dòng)合成儀進(jìn)行合成的。之后利用VydacEverest C18 柱(250mmX22mm, 10 μ m),通過反相高效液相色譜法(reverse phase HPLC)進(jìn)行純化(> 95%純度)，利用液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(Agilent HPllOOseries)確認(rèn)了肽的大小(> 95%純度)。
[0106]并且，作為可鐵寧和肽的粘合體，可鐵寧-WKYMVm-NH2以及可鐵寧-wkymvm_NH2，除了在肽合成的最后過程中導(dǎo)入聚乙二醇連接體和可鐵寧之外，其合成采用均與上述方法相同的方法進(jìn)行。
[0107]可鐵寧和肽的粘合體的制備方法首先利用ASP48S多肽自動(dòng)合成儀合成最基本的肽后，為了 C-末端酰胺化(C-terminal amidation)將第一個(gè)序列Fmoc-m-OH (8當(dāng)量)和偶聯(lián)劑HBTU (8當(dāng)量)/HOBt (8當(dāng)量)/NMM (16當(dāng)量)溶解于二甲基甲酰胺(DMF)后加入至甲苯氫胺鏈酰胺樹脂(MBHA link amide resin)，在常溫反應(yīng)2小時(shí)。之后，在二甲基甲酰胺中加入20%的哌啶，并在常溫下5分鐘內(nèi)反應(yīng)2回，從而分解Fmoc。重復(fù)所述過程，制備肽的基本骨架，即NH2-W(Boc)-K(BOC) -Y (tBu)-M-V-m-MBHA鏈酰胺樹脂。并取一些吸附上肽的樹脂加入裂解混合物(cleavage cocktail, THA/TIS/H20=95/2.5/2.5)，將肽與樹脂分離后，加入過量的二乙醚使肽發(fā)生沉淀。將獲得的少量精煉的肽溶解于DW/CAN (1/1)后，利用液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)確認(rèn)能否獲得所需肽(WKYMVm-NH2)的分子量。之后采用與所述過程相同的方法偶聯(lián)Fomc-迷你PEG12-0H，并再取一些樹脂利用液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)確認(rèn)分子量。重新用反式-4-可鐵寧羧酸，采用與所述過程相同的方法進(jìn)行偶聯(lián)，加入裂解混合物(TFA/TIS/H20=95/2.5/2.5)將肽與樹脂分離后，加入過量的二乙醚使肽發(fā)生沉淀。用高效液相色譜法進(jìn)行純化，再用液相色譜/質(zhì)譜連用技術(shù)確認(rèn)分子量后，進(jìn)行了冷凍干燥。
[0108]所述合成的WKYMVm-NH2以及Wkymvm-NH2肽和可鐵寧-肽粘合體溶解于DMSO后在_20°C條件下保存。以這種方法制備的可鐵寧-WKYMVm-NH2粘合體的結(jié)構(gòu)如圖2所示。
[0109](3-2)可鐵寧-適體的粘合體
[0110]其中作為適體使用的是AS1411DNA 適體(5，-dTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3’，SEQ NO:3), CR026DNA 適體(5，-dCCTCCTCCTCCTTCTCCTCCTCCTCC-3’，SEQ NO:4)以及派加他尼 RNA 適體(5，-pCfpGmpGmpArpArpUfpCfpAmpGmpUfpGmpAmpAmpUfpGmp CfpUfpUfpAmpUfpAmpCfpAmpUfpCfpCfpGm3J -p-dT-3，SEQ NO:5)。
[0111]并且，作為可鐵寧和適體的粘合體，可鐵寧-AS1411、可鐵寧-CR026以及可鐵寧派加他尼，可通過固相寡肽合成(solid phase oligonucleotide synthesis)的方法,利用寡肽合成儀(oligonucleotide synthesizer)從3’至5’的方向合成后,在合成最后過程就加上了氨基 C6 連接體(ST Pharm,韓國)。之后利用 Xbridge Prep C18 柱(5 μ m, IOX 150_，沃特世，美國)，通過反相高效液相色譜法(reverse phase HPLC)進(jìn)行純化(> 95%純度)，利用質(zhì)譜分析技術(shù)(mass spectrometry, MS)確認(rèn)了適體的大小。
[0112]將所述合成的可鐵寧-AS1411以及可鐵寧-CR026溶解于蒸餾水，而可鐵寧派加他尼由于是RNA,因此溶解于用焦炭酸二乙酯(diethryl pyrocarbonate)處理的蒸懼水中，在95°C條件下，靜置5分鐘后，在常溫下緩慢使其降溫，之后再_20°C條件下保存。以這種方法制備的可鐵寧-AS1411以及可鐵寧-派加他尼的結(jié)構(gòu)如圖3所示。
[0113](3-3)可鐵寧及阿昔單抗的粘合體
[0114]利用阿昔單抗(Reopro)制備了可鐵寧和阿昔單抗的粘合體(可鐵定-阿昔單抗)。
[0115]可鐵寧及阿昔單抗的粘合體通過活潑酯法(active ester method)制備。在Iml的二甲基甲酰胺中加入0.1mmol的可鐵寧，常溫下溶解后再加入極少量二甲基氨基吡啶(DMAP)、0.118mmol的二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和0.12mmol的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，常溫下旋轉(zhuǎn)(rotation) 4小時(shí)左右。10000X g條件下離心30分鐘，分離上層液。將20mg的阿昔單抗加入到2ml碳酸鹽緩沖液(carbonate buffer)溶解,再加入Iml的二甲基甲酰胺，緩慢倒入所述上層液，常溫下旋轉(zhuǎn)3小時(shí)左右。之后，在4°C條件下進(jìn)行6小時(shí)以上的透析(dialysis)，再進(jìn)行離心分離獲得上層液，從而制備出粘合體。
[0116]( 3-4 )可鐵寧及胰島素的粘合體
[0117]利用胰島素(SEQ NO:6)制備可鐵寧和胰島素的粘合體(可鐵寧-胰島素)。
[0118]可鐵寧及胰島素的粘合體，采用與所述實(shí)施例3-3的制備可鐵寧-阿昔單抗粘合體相同的方法進(jìn)行制備。
[0119]實(shí)施例4:包含在可鐵寧和粘合物質(zhì)的粘合體上結(jié)合有抗-可鐵寧抗體的復(fù)合體的制備
[0120]為了制備包含所述實(shí)施例1制備的可鐵寧和粘合物質(zhì)的粘合體以及實(shí)施例2中制備的抗-可鐵寧抗體的復(fù)合體，即可鐵寧-WKYMVm-NH2/抗-可鐵寧IgG復(fù)合體，實(shí)施了如下的步驟。
[0121]試驗(yàn)例1:對(duì)于可鐵寧的抗-可鐵寧兔子/人嵌合IgG的親和性分析
[0122]對(duì)于可鐵寧的抗-可鐵寧兔子/人嵌合IgG的親和性是使用BIAcore3000(BIACore AB,烏普薩拉,瑞士),通過表面等離子共振技術(shù)(Surface plasmon Resonance,SPR)進(jìn)行分析。
[0123]具體地，使IOmM的醋酸鈉緩沖溶液(pH4.0)以5μ I/分鐘的速度流過，在此條件下使用胺類偶聯(lián)試劑盒(Biocore ΑΒ)，并根據(jù)試劑盒所附的說明書，將可鐵寧-卵清蛋白(ovalbumin, OVA)固定于 CM5 (羧甲基葡聚糖改性，carboxymethyldextran-modified)傳感芯片(Biacore AB)。將溶解于包含0.005%吐溫20(西格瑪，美國)的磷酸鹽緩沖液(pH7.4)的抗-可鐵寧兔子/人嵌合IgG抗體，在25°C條件下，以30 μ I/分鐘的速度注入到芯片中?？?可鐵寧兔子/人嵌合IgG抗體被稀釋成0.15625-ΙΟηΜ的濃度。
[0124]用IM NaCl/50mM N aOH對(duì)表面進(jìn)行再生，利用分析軟件(BIAevaluationsoftware)獲得運(yùn)動(dòng)速率常速(kon以及koff)和平衡解離常數(shù)(Kd)。其結(jié)果如表1所示，圖4示出了其曲線圖。
[0125]如圖4所示，隨著抗-可鐵寧兔子/人嵌合IgG抗體的注入量的增加，固定于CM5芯片的與可鐵寧結(jié)合的抗-可鐵寧IgG抗體的量逐漸增加。
[0126]表1
[0127]
【權(quán)利要求】
1.一種在可鐵寧和粘合物質(zhì)的粘合體上結(jié)合有抗-可鐵寧抗體的復(fù)合體。
2.如權(quán)利要求1所述的復(fù)合體，其特征在于，所述粘合物質(zhì)選自肽、適體、激素、蛋白質(zhì)以及化學(xué)物質(zhì)組成的組中。
3.如權(quán)利要求1所述的復(fù)合體，其特征在于，所述粘合物質(zhì)選自WKYMVm-NH2肽、AS1411適體、派加他尼、阿昔單抗以及胰島素組成的組中。
4.如權(quán)利要求1所述的復(fù)合體，其特征在于，所述粘合物質(zhì)通過聚乙二醇連接體或者氨基C6連接體與可鐵寧連接。
5.如權(quán)利要求1所述的復(fù)合體，其特征在于，所述粘合體結(jié)合于抗-可鐵寧抗體的抗原結(jié)合部位。
6.如權(quán)利要求1所述的復(fù)合體，其特征在于，所述抗-可鐵寧抗體選自由所述抗體；選自Fab、ScFv以及結(jié)構(gòu)域抗體的抗體片段；以及包含所述抗體和抗體片段作為構(gòu)成成分的融合蛋白質(zhì)組成的組中。
7.—種體外生物學(xué)分析方法，其特征在于，其將可鐵寧和粘合物質(zhì)的粘合體作為分析工具使用。
8.如權(quán)利要求7所述的體外生物學(xué)分析方法，其特征在于，所述方法選自由流式細(xì)胞分析法、蛋白免疫印跡分析法、免疫沉淀分析法以及酶聯(lián)免疫化學(xué)分析法組成的組中。
9.通過在可鐵寧粘合了粘合物質(zhì)的粘合體上結(jié)合抗-可鐵寧抗體，從而延長(zhǎng)所述粘合物質(zhì)的體內(nèi)半衰期的方法 。
10.通過在可鐵寧粘合了粘合物質(zhì)的粘合體上結(jié)合抗-可鐵寧抗體，從而誘導(dǎo)所述粘合物質(zhì)結(jié)合的細(xì)胞發(fā)生補(bǔ)體依賴 性細(xì)胞毒性的方法。
11.通過在可鐵寧粘合了粘合物質(zhì)的粘合體上結(jié)合抗-可鐵寧抗體，從而誘導(dǎo)所述粘合物質(zhì)結(jié)合的細(xì)胞發(fā)生抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的方法。
12.通過在可鐵寧粘合了粘合物質(zhì)的粘合體上結(jié)合抗-可鐵寧抗體，從而將所述粘合物質(zhì)在體內(nèi)的分布變化為一般抗體在體內(nèi)的分布狀況的方法。
【文檔編號(hào)】C07K16/44GK103476798SQ201280018671
【公開日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2012年4月16日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月15日
【發(fā)明者】鄭埈昊, 樸仙榮, 黃度彬, 李花京 申請(qǐng)人:首爾大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力團(tuán)