專利名稱：一種乳及乳制品中低分子肽的提取方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種基于分子篩提取、固相萃取凈化乳及乳制品中小肽、寡肽和多肽(50個氨基酸以下)的方法，可應用于人乳、牛乳、羊乳及其乳制品中低分子肽的提取、凈化、和檢測領域，在含肽類產(chǎn)品肽的檢測、活性肽功能性產(chǎn)品的研發(fā)等方面也具有良好的應用價值。
背景技術：
源于蛋白質的低分子肽是一種多功能因子，組成結構包括幾個氨基酸殘基的短肽鏈的小肽以及寡肽(5 10個氨基酸)和多肽(11 50個氨基酸)；這類肽能直接被機體吸收利用，具有吸收效率高、免疫原性低等特點。此外，它們還在細胞生理及代謝功能的調節(jié)上具有重要的作用，這些調節(jié)作用幾乎涉及到人體所有的生理活動，如神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、內分泌系統(tǒng)等。不僅如此，其中許多肽還具有原蛋白質或其組成氨基酸所沒有的新功能。特別是以數(shù)個氨基酸結合生成的低肽不僅有比蛋白質更好化吸收性能，還具有促進免疫、調節(jié)激素、抗菌、抗病毒、降血壓和降血脂等生理機能‘迄今短肽的發(fā)現(xiàn)已經(jīng)成為多肽類藥物和功能性食品添加劑的開發(fā)熱點，而且也是當前食品科技界最熱門的研究課題和極具發(fā)展前景的功能因子。在乳及乳制品中肽的研究主要集中在兩個方面，一是人乳中活性肽的研究，人乳經(jīng)過自然進化與適應，成為嬰幼兒最佳的食品，除了蛋白、脂肪和乳糖外，人乳中還含有豐富的肽，這些肽對消化、吸收、神經(jīng)、免疫等各個系統(tǒng)均不完善的嬰幼兒至關重要。隨著嬰幼兒配方食品帶來如過敏、上火、 結石、腹瀉等諸多問題，以牛乳為原料的配方奶粉母乳化程度需進一步提高，對人乳中生物功能肽的深入研究更是顯得迫切。二是乳源活性肽功能性食品的開發(fā)，研究者對乳及乳制品中的生物活性肽研究的日益深入，越來越多的乳源性生物活性肽被發(fā)現(xiàn)，鑒于生物活性肽在心血管系統(tǒng)，免疫系統(tǒng)，消化系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)等均有諸多作用，人們逐漸利用這些乳源性的生物活性多肽所具有的生物活性作用來制造健康食品或功能性食品，以期提升人類健康水平。提取、凈化技術是低分子肽的定性、定量、結構和功能研究的基礎；傳統(tǒng)的肽的提取方法是采用緩沖鹽浸取、超聲提取，或蛋白經(jīng)過酶切后，將未消化的蛋白采用鹽、有機溶劑或其他試劑沉淀，離心后直接取上清濃縮。這些提取方法所得到的是粗提物，提取效果差，雜質多；并且對仿母乳嬰幼兒配方奶粉的研制和乳品中生物活性肽的研究不利。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是克服上述背景技術的不足，提供一種乳及乳制品中天然低分子肽的提取方法，該方法應具有提取效果好、凈化性能佳的優(yōu)點。本發(fā)明提供的技術方案是:—種乳及乳制品中低分子肽的提取方法，按以下步驟進行:I)初提
用緩沖液將生鮮乳稀釋I 5倍，或用緩沖液將乳粉稀釋5 15倍，用正己烷或乙醚一石油醚混合溶液去除脂類；接著采用超濾膜以及離心或抽濾的方式去除乳與乳制品中的高分子蛋白和其他顆粒物，得到低分子肽初提取液；乙醚一石油醚混合溶液中，乙醚的體積比例為30% 70%，其余是石油醚；2)初凈化將上述初提取液經(jīng)過C18反相固相萃取柱的萃?。唤又扔?% — 5%的甲醇溶液或乙腈溶液洗去前述萃取柱上的強極性的雜質，然后用40% — 70%的甲醇洗脫溶液或乙腈洗脫溶液將前述萃取柱上的低分子肽洗脫下來，收集洗脫溶液；最后旋轉蒸發(fā)掉洗脫溶液中的甲醇或乙腈，剩下的溶液即為低分子肽初凈化液；3)再凈化用鹽酸或硫酸或甲酸或乙酸溶液將獲得的初凈化液pH值調到2 4以內，以使低分子肽上的氨基“一N H2 ”帶上H+變?yōu)椤耙籒H3+” ;接著將前述溶液通過帶有負電荷基團的陽離子交換固相萃取小柱，以將低分子肽吸附并富集在該固相樹脂上；隨后，依次用酸性、中性洗滌液將不帶電荷的有機小分子物質和雜質洗滌掉，再用氨水甲醇溶液洗脫固相樹脂，使低分子肽上的“一NH3+”重新成為不帶電荷的“一NH2”狀態(tài)，并隨氨水甲醇溶液洗脫下來，收集洗脫液；4)蒸發(fā)洗脫液經(jīng)過低溫氮吹至凈干，得到高純度的低分子肽混合物。所述步驟I)中的緩沖液是磷酸鹽緩沖液(PBS)，或者是檸檬酸緩沖液，或者是NaCl溶液。所述超濾膜是截留分子量為5K的超濾膜。所述步驟2)中的甲醇洗脫溶液的成分為甲醇和水，其中甲醇的體積含量為40% 70%。所述步驟2)中的乙腈洗脫溶液的成分為乙腈和水，其中乙腈的體積含量為40% 70%。所述步驟3)中的氨水甲醇溶液的成分為甲醇和氨水，其中氨水的體積含量為
2% 5% ο所述步驟3)中的酸性洗滌液為磷酸鹽緩沖液(PBS)，或者是檸檬酸鹽緩沖液，或者是NaCl溶液，用鹽酸或硫酸或甲酸或乙酸溶液將其pH值調至2 4以內；所述步驟3)中的中性洗滌液為磷酸鹽緩沖液(PBS)，或者是檸檬酸鹽緩沖液，或者是NaCl溶液，pH在6.5 7.5以內。所述1% — 5%的甲醇溶液的成分為甲醇和水,其中甲醇的體積含量為1% 5%。所述1% — 5%的乙腈溶液的成分為乙腈和水，其中乙腈的體積含量為1% 5%。本發(fā)明的有益效果是:所采用的方法提取和凈化效果好，雜質少，獲得的低分子肽純度高(可達90%以上)，前處理簡便易操作；可應用于人乳、牛乳、羊乳及其乳制品中低分子肽的提取、凈化、和檢測。在含肽類產(chǎn)品肽的檢測、活性肽功能性產(chǎn)品的研發(fā)等方面也具有良好的應用價值。


圖1是本發(fā)明實施例之一獲得的低分子肽總離子流圖(TIC);圖中顯示不同的肽在色譜柱上得到分離，每一個峰包含一個到多個低分子肽。圖2是本發(fā)明實施例之一的低分子肽質譜圖(5min — 9min)。圖3是本發(fā)明實施例之一的低分子肽質譜圖(Ilmin — 15min)。圖4是本發(fā)明實施例之一的低分子肽質譜圖(17min — 24min)。圖5是本發(fā)明實施例之一的低分子肽質譜圖(17min — 24min)。
具體實施例方式為了有效提取和凈化乳及乳制品中小肽、寡肽和低分子多肽，本發(fā)明人進行了廣泛深入的研究；采用截留分子量為5K的超濾膜將低分子肽與高分子蛋白和其他顆粒物分開，然后根據(jù)不同物質具有的非極性強弱不同的原理，采用反相固相萃取柱對低分子肽進行初步凈化，接著根據(jù)正負離子電荷作用力的原理，選擇陽離子交換固相萃取柱對低分子肽進一步凈化，最后采用氮吹方式進行了濃縮，得到高純度的低分子肽混合物。通過以上處理，完成了本發(fā)明。本發(fā)明的有關細節(jié)描述如下:
1、試劑與材料水為GB/T 6682規(guī)定的三級水。甲醇，色譜純。乙腈，色譜純。正己烷，分析純。甲酸，分析純。鹽酸，分析純。磷酸鹽緩沖液(PBS):在800ml 蒸餾水中溶解 8g NaCU0.2g KCl、L 44g Na2HPOjP
0.24gKH2P04,用HCl調節(jié)溶液的pH值至7.4加水定容至1L。檸檬酸鹽緩沖液:5.88g 二水檸檬酸鈉溶于800ml蒸餾水中，用檸檬酸調pH值至7.0，加水定容至1L。NaCl緩沖液:9g NaCl溶于800ml蒸餾水中，加水定容至1L。甲醇洗脫溶液:成分為甲醇和水，其中甲醇的體積含量為40% 70%。乙腈洗脫溶液:成分為乙腈和水，其中乙腈的體積含量為40% 70%。氨水甲醇溶液的體積比例是:甲醇:氨水=95:5:取5mL氨水，用甲醇定容至IOOmL01%—5%的甲醇溶液的成分為甲醇和水,其中甲醇的體積含量為1% 5%。超濾膜，截留分子量大小為5K，如美國的Milipore超濾管等產(chǎn)品。C18反相固相萃取柱，如Waters公司的HLP柱等。強陽離子交換SPE柱，其中鍵合相為苯磺酸型，如Varian公司的PCX小柱、Waters公司的MCX柱等。2、儀器與設備冷凍高速離心機，真空泵，
旋轉蒸發(fā)儀，氮吹儀。以上試劑、材料、儀器及設備全都外購獲得。3、操作步驟3.1試樣制備生鮮乳(人乳)和液體乳(人乳)樣品:準確稱取IOg樣品，置于IOOmL玻璃器皿中，加20mL磷酸鹽緩沖液，充分震蕩混勻。乳粉和粉狀乳制品:準確稱取3g樣品，置于50mL玻璃具塞試管中。加入30mL檸檬酸緩沖液，溶解并充分震蕩混勻。3.2 提取實施例1在生鮮乳和液體乳樣品溶液中加入20mL正己烷，充分震蕩混勻，6000rpm/min離心15分鐘，上層為正己烷-脂類溶液，中間層為磷酸鹽緩沖溶液，最低層為蛋白沉淀-顆粒雜物層，取中間層溶液，過截留分子量為5K的超濾膜，濾液即為初提取液?；罨?常規(guī)處理工序):取反相固相萃取柱(HLP柱)，依次用IOmL甲醇，IOmL水進行活化。上樣及洗滌:將初 提取液加入到已活化的HLP柱中，依次用IOmL PBS和20mL5%的甲醇溶液洗滌。洗脫:用10mL60%的甲醇洗脫溶液洗脫，收集洗脫溶液。旋轉蒸發(fā):洗脫溶液用旋轉蒸發(fā)儀濃縮至大約4mL，即為初凈化液?；罨?常規(guī)處理工序):取MCX柱依次用IOmL甲醇，10mLpH=3的稀鹽酸或甲酸溶液活化。上樣及洗滌:初凈化液加入等體積pH=3的稀鹽酸或甲酸溶液，加入已活化完成的MCX柱中，依次加入IOmL稀鹽酸或甲酸溶液和IOmL水洗滌，并用真空泵將MCX柱抽干。洗脫:用IOmL的氨水甲醇溶液淋洗小柱，收集洗脫液。洗脫液用氮吹儀濃縮至凈干，即獲得高純度的低分子肽混合物。實施例2在乳粉和粉狀乳制品溶液中加入20mL正己烷，充分震蕩混勻，6000rpm/min離心15分鐘，上層為正己烷-脂類溶液，中間層為檸檬酸緩沖溶液萃取層，最低層為蛋白沉淀一顆粒雜物層，取中間層溶液，過截留分子量為5K的超濾膜，濾液即為初提取液。活化(常規(guī)處理工序):取反相固相萃取柱(HLP柱)，依次用IOmL甲醇，IOmL水進行活化。上樣及洗滌:將初提取液加入到已活化的HLP柱中，依次用IOmL PBS和20mL 5%的甲醇溶液洗滌。洗脫:用IOmL 60%的甲醇洗脫溶液洗脫，收集洗脫溶液。旋轉蒸發(fā):洗脫溶液用旋轉蒸發(fā)儀濃縮至大約4mL，即為初凈化液?；罨?常規(guī)處理工序):取MCX柱依次用IOmL甲醇，10mLpH=3的稀鹽酸或甲酸溶液活化。上樣及洗滌:初凈化液加入等體積pH=3的稀硫酸或乙酸溶液，加入已活化完成的MCX柱中，依次加入IOmL稀鹽酸或甲酸溶液和IOmL水洗滌，并用真空泵將MCX柱抽干。洗脫:用IOmL的氨水甲醇溶液淋洗小柱，收集洗脫液。洗脫液用氮吹儀濃縮至凈干，即獲得高純度的低分子肽混合物。4、提取物測定提取、凈化后的低分子肽測試-飛行時間質譜(HPLC-Q-TOF)4.1分析參數(shù)設置4.1.1液相色譜參數(shù)設置(waters公司UPLC)色譜柱:BEH300C18 (2.1mmX IOOmmX 1.7 μ m)進樣量:5.0uL柱溫:30度流速:0.4mL/min流動相A:0.1%甲酸水溶液流動相B:乙腈 流動相梯度按表1.表I低分子肽色譜分離流動相梯度
權利要求
1.一種乳及乳制品中低分子肽的提取方法，按以下步驟進行: 1)初提 用緩沖液將生鮮乳稀釋1 5倍，或用緩沖液將乳粉稀釋5 15倍，用正己烷或乙醚一石油醚混合溶液去除脂類；接著采用超濾膜以及離心或抽濾的方式去除乳與乳制品中的高分子蛋白和其他顆粒物，得到低分子肽初提取液；乙醚一石油醚混合溶液中，乙醚的體積比例為30% 70%，其余是石油醚； 2)初凈化 將上述初提取液經(jīng)過C18反相固相萃取柱的萃??；接著先用1% — 5%的甲醇溶液或乙腈溶液洗去前述萃取柱上的強極性的雜質，然后用40% — 70%的甲醇洗脫溶液或乙腈洗脫溶液將前述萃取柱上的低分子肽洗脫下來，收集洗脫溶液；最后蒸發(fā)掉洗脫溶液中的甲醇或乙腈，剩下的溶液即為低分子肽初凈化液； 3)再凈化 用鹽酸或硫酸或甲酸或乙酸溶液將獲得的初凈化液PH值調到2 4以內，以使低分子肽上的氨基“一 NH2”帶上H+變?yōu)椤耙?Ml/”;接著將前述溶液通過帶有負電荷基團的陽離子交換固相萃取小柱，以將低分子肽吸附并富集在該固相樹脂上；隨后，依次用酸性、中性洗滌液將不帶電荷的有機小分子物質和雜質洗滌掉，再用氨水甲醇溶液洗脫固相樹脂，使低分子肽上的“-NH3+”重新成為不帶電荷的“-nh2”狀態(tài)，并隨氨水甲醇溶液洗脫下來，收集洗脫液； 4)蒸發(fā) 洗脫液經(jīng)過低溫氮吹至凈干，得到高純度的低分子肽混合物。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種乳及乳制品中低分子肽的提取方法，其特征在于:所述步驟I)中的緩沖液是磷酸鹽緩沖液(PBS)，或者是檸檬酸緩沖液，或者是NaCl溶液。
3.根據(jù)權利要求2所述的一種乳及乳制品中低分子肽的提取方法，其特征在于:所述超濾膜是截留分子量為5K的超濾膜。
4.根據(jù)權利要求3所述的一種乳及乳制品中低分子肽的提取方法，其特征在于:所述步驟2)中的甲醇洗脫溶液的成分為甲醇和水，其中甲醇的體積含量為40% 70%。
5.根據(jù)權利要求4所述的一種乳及乳制品中低分子肽的提取方法，其特征在于:所述步驟2)中的乙腈洗脫溶液的成分為乙腈和水，其中乙腈的體積含量為40% 70%。
6.根據(jù)權利要求5所述的一種乳及乳制品中低分子肽的提取方法，其特征在于:所述步驟3)中的酸性洗滌液為磷酸鹽緩沖液(PBS)，或者是檸檬酸鹽緩沖液，或者是NaCl溶液，用鹽酸或硫酸或甲酸或乙酸溶液將其PH值調至2 4以內； 所述步驟3)中的中性洗滌液為磷酸鹽緩沖液(PBS)，或者是檸檬酸鹽緩沖液，或者是NaCl溶液，pH在6.5 7.5以內。
7.根據(jù)權利要求6所述的一種乳及乳制品中低分子肽的提取方法，其特征在于:所述步驟3)中的氨水甲醇溶液的成分為甲醇和氨水,其中氨水的體積含量為2% 5%。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種乳及乳制品中低分子肽的提取方法。目的是提供的方法具有提取效果好、凈化性能佳的優(yōu)點。技術方案是1)初提用緩沖液將生鮮乳或乳粉稀釋稀釋1～5倍，去除脂類和乳與乳制品中的高分子蛋白和其他顆粒物，得到低分子肽初提取液；2)初凈化將初提取液經(jīng)過萃取和去雜質；然后將萃取柱上的低分子肽洗脫下來，收集洗脫溶液，最后旋轉蒸發(fā)掉洗脫溶液中的甲醇或乙腈，得到低分子肽初凈化液；3)再凈化將獲得的初凈化液pH值調到2～4以內，接著將低分子肽吸附并富集在該固相樹脂上，隨后將不帶電荷的有機小分子物質和雜質洗滌掉，再用氨水甲醇溶液洗脫固相樹脂，收集洗脫液。4)蒸發(fā)得到高純度的低分子肽混合物。
文檔編號C07K1/14GK103183720SQ20121029277
公開日2013年7月3日 申請日期2012年8月16日 優(yōu)先權日2012年8月16日
發(fā)明者肖海龍, 屠海云, 林賽君, 王紅青 申請人:杭州市質量技術監(jiān)督檢測院