專利名稱：玉米干旱響應(yīng)基因ZmDIP1及其編碼蛋白的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，特別涉及一種玉米干旱響應(yīng)基因ZmDIPl及其編碼蛋白的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近年來，隨著全球氣候變暖，干旱已成為我國作物生產(chǎn)中頻繁發(fā)生的自然災(zāi)害。例如2010年3月我國西南地區(qū)發(fā)生的特大干旱，造成3000多萬畝秋冬播農(nóng)作物受災(zāi)，夏糧減產(chǎn)一半以上，農(nóng)業(yè)直接經(jīng)濟損失超過100億元，程度之重、范圍之大均為歷史罕見。玉米作為中國重要的糧食作物，在整個生育期對水分的要求很高。中國半數(shù)以上玉米種植在西北、西南、華北和東北地區(qū)的旱地上，常因土壤干旱而影響植株的生長發(fā)育，導(dǎo)致玉米的產(chǎn)量和品質(zhì)降低，干旱已成為制約我國玉米產(chǎn)量與品質(zhì)提高的主要限制因子之一。因此，加強玉米 抗旱基因資源的挖掘和利用，對于培育玉米抗旱新品種，保障國家糧食安全，實現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重大意義。干旱對作物生長、發(fā)育、代謝的影響主要表現(xiàn)在(I)干旱脅迫影響了葉綠素的合成，促進了葉綠素的分解，從而影響了葉片的光合效率(Plant Molecular Biology, 1979,20: 37-44) ; (2)干旱脅迫導(dǎo)致植株氮素代謝關(guān)鍵酶一硝酸還原酶(NR)的活性降低，而脯氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺和纈氨酸等大量積累；(3)干旱脅迫導(dǎo)致葉片膜脂過氧化作用增強，膜透性增加，丙二醛(MDA)含量升高，出現(xiàn)電解質(zhì)外滲?？寡趸Ｗo酶SOD、POD、CAT等酶活性顯著下降。(4)干旱脅迫降低了種子的萌發(fā)和幼苗的成活；(5)抑制了根系的生長，從而影響了礦質(zhì)營養(yǎng)的吸收；(6)干旱脅迫導(dǎo)致植株矮小，節(jié)間短，葉片小，易早衰。這些研究較好地闡明了干旱對作物生長、發(fā)育及代謝影響的生理生化基礎(chǔ)，但缺乏對作物抗旱分子遺傳機理的研究。近年來，隨著分子生物學(xué)和基因組學(xué)研究的深入，作物抗旱基因的發(fā)掘成為作物遺傳資源與品種改良研究的熱點，越來越多的抗旱相關(guān)基因相繼被克隆和鑒定。按照抗旱基因的功能，可以把植物抗旱相關(guān)基因分為兩大類第一類為功能基因，主要在植物抗性中起保護作用。這一類基因主要包括滲透調(diào)節(jié)基因如海藻糖合成酶基因TPS1、脯氨酸合成酶基因P5CS、甘露醇合成基因MtlD、甜菜堿合成酶基因BADH及多胺合成酶基因Odc等；保護生物大分子的活性基因如脫水蛋白基因BDN1、水通道蛋白基因AQP和晚期胚胎發(fā)生豐富蛋白LEA等。第二類基因為調(diào)節(jié)基因，主要在信號傳導(dǎo)和逆境基因表達過程中起調(diào)節(jié)作用，主要包括一些轉(zhuǎn)錄因子如DREB、MYB、bZIP、WRKY、NAC等。這些基因已在植物基因工程中得到應(yīng)用。泛素化是生物體內(nèi)蛋白質(zhì)翻譯后的重要修飾之一，是蛋白質(zhì)降解的信號。泛素連接酶E3是泛素化過程中的關(guān)鍵酶類，決定了泛素化修飾的特異性，在植物激素調(diào)控、逆境脅迫和病原菌防衛(wèi)反應(yīng)中起著重要的作用(Plant Cell, 2004, 16: 2795 - 2808; PlantCell, 2007, 19:1912 - 1929)。目前尚未見玉米中E3連接酶編碼基因的克隆與功能鑒定的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種受干旱脅迫誘導(dǎo)表達的玉米基因ZmDIPl (drought-inducedprotein I)及其編碼蛋白的應(yīng)用；該基因能提高植物對干旱脅迫的抗性，尤其是能夠提高植物的抗旱能力和改造該基因后的玉米可以報告干旱程度的基因。本發(fā)明所提供的玉米干旱響應(yīng)的基因，名稱為ZmDIPl，來源于玉米(Zea maysL.):是下述核苷酸序列之一(I)序列表中的SEQ ID No: I的核苷酸序列；(2)編碼序列表中的SEQ ID No:2蛋白質(zhì)序列的DNA ；(3)與序列表中的SEQ ID No: I限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且編碼相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列；
(4)在高嚴謹條件下可與序列表中的SEQ ID No: I限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。所述高嚴謹條件用0. 5XSSPE(0. 5XSSC), 0. 1%SDS的溶液，在60°C下雜交并洗膜。序列表中的SEQ ID No: I由843個堿基組成，其編碼框為自5’端第1-840位堿基，編碼具有序列表中的SEQ ID No:2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的ZmDIPl基因所編碼的蛋白ZmDIPl，是下述氨基酸序列之一(I)序列表中的 SEQ ID No:2;(2)將序列表中的SEQ ID No:2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十二個氨基酸殘基的取代或缺失或添加且對植物的生長發(fā)育具有調(diào)控作用的蛋白質(zhì)。序列表中的的SEQ ID No:2由280個氨基酸殘基組成。在一個實施方案中，該玉米干旱響應(yīng)基因的重組表達載體、轉(zhuǎn)基因細胞系和工程菌以及擴增該基因中任一片段的引物對。在另一個實施方案中，該玉米干旱響應(yīng)基因的應(yīng)用，包括利用該基因檢測植物遭受干旱脅迫程度的方法。在另一個實施方案中，可將ZmDIPl的啟動子與報告基因(gus)融合,將該構(gòu)建ZmDIPl- gus轉(zhuǎn)化玉米，得到可以比較準確地估量植物受到干旱脅迫程度的植株。上述重組表達載體均可按照常規(guī)方法構(gòu)建。本發(fā)明的ZmDIPl是一個抗旱基因，可以在玉米受到干旱脅迫時大量表達，以抵御干旱逆境。而ZmDIPl — gus的轉(zhuǎn)基因植株可以報告玉米干旱程度。本發(fā)明中，干旱處理的玉米幼苗葉片中，所述的泛素E3連接酶編碼基因ZmDIPl被誘導(dǎo)表達。本發(fā)明所述的蛋白ZmDIPl是植物泛素化蛋白降解途徑中的關(guān)鍵酶類，所以調(diào)控ZmDIPl的表達能夠調(diào)節(jié)植物對干旱的抗性。因此所述的編碼干旱誘導(dǎo)的基因ZmDIPl在植物抗旱領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，其經(jīng)濟效益潛力巨大。


圖I =ZmDIPlPCR產(chǎn)物的電泳圖；圖2 :玉米幼苗葉片中ZmDIPl基因響應(yīng)干旱脅迫的表達模式柱狀圖；圖3 =ZmDIPl基因植物表達載體構(gòu)建示意圖4 :轉(zhuǎn)ZmDIPl基因的煙草株系表達水平柱狀圖；圖5 :轉(zhuǎn)ZmDIPl基因的煙草幼苗對干旱脅迫處理的生長表型照片；圖6 :轉(zhuǎn)ZmDIPl基因的煙草幼苗對干旱脅迫處理的生長表現(xiàn)柱狀圖。
具體實施例方式下面，本發(fā)明將用實施例進行進一步的說明，但是它并不限于這些實施例的任一個或類似實例。實施例I :材料處理玉米(Zea mays L.)自交系鄭58，購自河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物所。 玉米材料處理A.種子消毒挑選飽滿的玉米種子，經(jīng)0. 1%的升汞消毒后，置于28 °C，黑暗條件下發(fā)芽。B.干旱脅迫處理將發(fā)芽的種子移至含蒸餾水的培養(yǎng)皿中，在溫度為24_26°C、濕度為60%、光暗交替周期為12h/12h的光照培養(yǎng)室中培養(yǎng)。待幼苗長至二葉一心(約10天)時，倒掉蒸餾水，進行20% PEG 6000溶液脅迫處理實驗。處理的時間分別為1、3、6、12、24、48小時；脅迫處理后的玉米作為實驗者，未做脅迫處理的玉米幼苗作為對照組。實施例2 :ZmDIPl (drought-induced protein I)基因的克隆A.玉米葉片總RNA的分離和純化I.總RNA的提取總RNA的提取按照TRIZOL (Invitrogen, USA)試劑說明書進行操作。2. RNA的純化(以總RNA為50 為例)(I)純化體系
RNASOpl
DNase (RNase Free, I u/|.i])6.25 (.il
RNase Inhibitor0.5 pi
10 XDNaseBuITer7.5
DEPC-H2O加至總體系100 pi(2 ) 37 °C溫浴 30 min，去除 RNA 中的 DNA。(3)加 DEPC-H2O 至 300 U I0(4)加入300 Ul的酚/氯仿(I: I)抽提。(5)加入等體積的異丙醇，_20°C沉淀1-2 h。(6)加入 30 40 DEPC-H2O 溶解。B. RT-PCR 擴增玉米 ZmDIPl 基因I.玉米葉片第一鏈cDNA合成將所述的玉米葉片總RNA吸取1-2 V- g于I. 5 ml離心管中，按照Fermentas公司的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit產(chǎn)品說明進行反轉(zhuǎn)錄,得到玉米葉片第一鏈cDNA。
2. ZmDIPl 基因的 PCR 擴增以所述的第一鏈cDNA為模板，進行ZmDIPl基因的PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物。根據(jù)網(wǎng)站http: //www. ncbi. nlm. nih. gov/ 中玉米表達序列標簽(ExpressedSequence Tag, EST)信息設(shè)計玉米的ZmDIPl基因的全長cDNA引物上游引物(SEQ4) : 5 ’ -ATGAGCTTCGTGTTCCGAG-3 ’ ；下游引物(SEQ5) : 5 ’ -TTACACCATGTATGAAGCATC-3 ’。PCR反應(yīng)體系組成為cDNA 模板(約 50 ng) 1 W，上游引物2 W，下游引物2 W，10XPCR Buffer 5 Ex-Taq 酶1 W，10 X dNTPs 2 W，滅超水37 W。PCR擴增程序
權(quán)利要求
1.一種玉米干旱響應(yīng)基因，其特征在于為下述核苷酸序列之一的基因(1)SEQ ID No: I ; (2)與SEQID No: I限定的核苷酸序列具有90%以上同源性的核苷酸序列； (3)在高嚴謹條件下可與SEQID No: I限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
2.權(quán)利要求I所述玉米干旱響應(yīng)基因表達的蛋白質(zhì)，其特征在于為下述氨基酸殘基序列之一(1)SEQ ID No: 2 ; (2)SEQ ID No:2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十二個氨基酸殘基的取代或缺失或添加且對植物的生長發(fā)育具有調(diào)控作用的蛋白質(zhì)。
3.含有權(quán)利要求I所述的玉米干旱響應(yīng)基因及其調(diào)控元件的表達載體。
4.含有權(quán)利要求I所述的玉米干旱響應(yīng)基因及其調(diào)控元件的轉(zhuǎn)基因細胞系。
5.含有權(quán)利要求I所述的玉米干旱響應(yīng)基因及其調(diào)控元件的工程菌。
6.擴增權(quán)利要求I所述的玉米干旱響應(yīng)基因及其調(diào)控元件中任一片段的引物對。
7.權(quán)利要求I所述的玉米干旱響應(yīng)基因及其調(diào)控元件中在植物生長發(fā)育中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，所述的植物包括單子葉植物和雙子葉植物。
9.根據(jù)權(quán)利要7所述的應(yīng)用，其特征在于將所述玉米干旱響應(yīng)基因的調(diào)控元件啟動子區(qū)域與報告基因gus融合后轉(zhuǎn)化玉米，在受過干旱處理的轉(zhuǎn)基因玉米植株里，其報告基因呈現(xiàn)誘導(dǎo)表達。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種玉米干旱脅迫應(yīng)答基因ZmDIP1及其編碼蛋白與應(yīng)用。主要提供了一個玉米抗旱基因及建立于此基因調(diào)控元件基礎(chǔ)上的有效檢測植物所受干旱脅迫程度的方法。經(jīng)檢測，該方法具有快速、準確估量玉米植株所受干旱影響程度的特點。本發(fā)明為植物缺水檢測提供了一種快速、便捷、有效的方法，并為植物抗旱研究及干旱育種提供了一個優(yōu)質(zhì)基因，具有較高的實際應(yīng)用價值。
文檔編號C07K14/415GK102796747SQ20121029259
公開日2012年11月28日 申請日期2012年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月16日
發(fā)明者萬向元, 王美平, 王超 申請人:北京金冠豐生物技術(shù)有限公司