專利名稱：使用免疫球蛋白片段的因子viia復(fù)合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于因子VIIa(factor Vila，F(xiàn)acVIIa)長(zhǎng)效制劑的凝血復(fù)合物。更具體地，本發(fā)明涉及凝血復(fù)合物，其中FacVIIa、非肽基聚合物和免疫球蛋白Fe區(qū)通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合在一起，從而顯著延長(zhǎng)血清半衰期、維持凝血功能、并且顯著提高患者的角色行為(role behavior)的順應(yīng)性。本發(fā)明還涉及用于制備凝血因子復(fù)合物的方法。
背景技術(shù)：
據(jù)估算世界上有140，000人患有血友病，并且其發(fā)生率每年增長(zhǎng)20%。遺傳學(xué)上，血友病在每10，000個(gè)出生人口中發(fā)生一例，但只有血友病病例總數(shù)的約25%得到診斷或治療。用凝血因子治療后發(fā)生的最大問(wèn)題之一是產(chǎn)生針對(duì)常規(guī)藥物的抗體。血友病A是由凝血因子VIII缺乏引起的，且是這類疾病的最常見(jiàn)形式，占血友病病例的80%。血友病B 是與凝血因子X(jué)I缺乏相關(guān)的疾病，且占血友病病例的約20%。一些血友病患者產(chǎn)生針對(duì)給予他們之凝血因子的抗體，頻率為對(duì)于血友病A為10 15%，對(duì)于血友病B為I 3%。FacVIIa是FacVII的活化形式。肝臟所產(chǎn)生的FacVII是由406個(gè)氨基酸構(gòu)成的酶，其中10位為Y -羧基化谷氨酸，145位和322位為N-糖基化天冬酰胺，并且52位和60位為O糖基化絲氨酸。它具有兩個(gè)EGF樣結(jié)構(gòu)域和一個(gè)絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域，且通過(guò)152位精氨酸與153位異亮氨酸之間的鍵切割(bond cleavate)而活化,這導(dǎo)致重鏈中的活性部位暴露。在該過(guò)程中，與輕鏈和重鏈鍵合在一起的單鏈FacVII被轉(zhuǎn)化為FacVIIa，其具有分開(kāi)的輕鏈和重鏈的雙鏈結(jié)構(gòu)。與其他多種凝血因子不同，F(xiàn)acVIIa作用于凝血機(jī)制的輔助途徑，不產(chǎn)生抗體，因此可以高劑量施用。因此，F(xiàn)acVIIa適用于治療血友病A和B，并且已開(kāi)始用作血友病常規(guī)治療劑的替代物，這是因?yàn)樗诳贵w產(chǎn)生和高劑量施用方面可安全地使用。此外，產(chǎn)生響應(yīng)于給予血友病患者之因子的抗體使得難以應(yīng)用除FacVIIa以外的凝血因子。但是，盡管FacVIIa不引起產(chǎn)生針對(duì)它的抗體，但它具有各種凝血因子中最短的血清半衰期。因此，F(xiàn)acVIIa不僅需要頻繁地施用，給患者帶來(lái)痛苦，而且需要較大的劑量，給患者帶來(lái)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。為克服這些缺點(diǎn)，應(yīng)將FacVIIa配制成預(yù)期用于預(yù)防血友病的長(zhǎng)效形式，而不僅是作為出血后的補(bǔ)充因子。rVIIa-FP (CSL Behring)(其中白蛋白與FacVIIa的C端融合)處于臨床前期，并且發(fā)現(xiàn)它在大鼠中的血清半衰期與天然FacVIIa相比提高了 6. 7倍。然而，4. 38小時(shí)的半衰期太短，這使它仍不足以有效地用于血友病的預(yù)防和治療。此外，F(xiàn)acVIIa的聚乙二醇化脂質(zhì)體制劑PEGLip-FVIIa(Omri)也處于臨床前期，并且血清半衰期僅為天然FacVIIa的兩倍。MAXY-VII (Bayer/Maxygen)和 NN7128 (Novo/Neose)是因子 VII 產(chǎn)品，二者分別通過(guò)Gla結(jié)構(gòu)域突變和高糖基化以及通過(guò)40K聚乙二醇化而延長(zhǎng)血清半衰期，但在I期和II期研究的過(guò)程中，它們各自的血清半衰期比天然FacVII長(zhǎng)5倍，這仍不足以用于血友病的預(yù)防和治療。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問(wèn)題為了盡可能延長(zhǎng)血清半衰期并同時(shí)維持體內(nèi)活性而產(chǎn)生了本發(fā)明，使用了這樣的制備方法，其中通過(guò)共價(jià)鍵將免疫球蛋白Fe、非肽基聚合物和FacVIIa位點(diǎn)特異性地彼此相連接。結(jié)果，凝血因子復(fù)合物的血清半衰期被顯著地延長(zhǎng)至長(zhǎng)達(dá)60小時(shí)，這被證實(shí)比通過(guò)常規(guī)的聚乙二醇化或框內(nèi)融合(in-frame fusion)技術(shù)所獲得的血清半衰期長(zhǎng)得多。解決方案因此，本發(fā)明的目的是提供=FacVIIa復(fù)合物，其允許在保持相對(duì)高水平體內(nèi)活性的同時(shí)延長(zhǎng)FacVIIa的血清半衰期，從而發(fā)揮出極好的凝血功能；包含所述復(fù)合物的長(zhǎng)效制劑；以及所述復(fù)合物的制備方法。
發(fā)明優(yōu)點(diǎn)如上所述，本發(fā)明的FacVIIa復(fù)合物確保了 FacVIIa的體內(nèi)活性，并顯著延長(zhǎng)了FacVIIa的血清半衰期，因此所述復(fù)合物可用于開(kāi)發(fā)長(zhǎng)效FacVIIa制劑，其可提高血液不凝固患者的角色行為的順應(yīng)性。附圖簡(jiǎn)述

圖1是示出SD大鼠中FacVIIa和免疫球蛋白Fc-PEG-FacVIIa的血液水平隨時(shí)間變化的圖。圖2是不出Novoseven、FacVIIa和免疫球蛋白Fc-PEG-FacVIIa的比較性體外效能測(cè)試結(jié)果的圖。圖3是不出Novoseven、FacVIIa和免疫球蛋白Fc-PE G-FacVIIa的比較性體外效能測(cè)試結(jié)果的圖。最優(yōu)實(shí)施方式根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明論述了一種FacVIIa復(fù)合物，其中FacVIIa通過(guò)非肽基聚合物與免疫球蛋白Fe區(qū)相連接。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“FacVIIa”是指凝血因子VII的活性形式。優(yōu)選地，本發(fā)明的FacVIIa復(fù)合物通過(guò)FacVII復(fù)合物的活化來(lái)制備。在這種情況中，長(zhǎng)效復(fù)合物由FacVI1、非肽基聚合物和免疫球蛋白Fe區(qū)來(lái)制備，然后使其經(jīng)過(guò)活化過(guò)程以形成包含F(xiàn)acVIIa、非肽基聚合物和免疫球蛋白Fe區(qū)的FacVIIa復(fù)合物，其間所述復(fù)合物的體內(nèi)活性增強(qiáng)且結(jié)構(gòu)上變得更均一。將FacVII復(fù)合物轉(zhuǎn)化為FacVIIa復(fù)合物的活化方法可包括但不限于柱上活化(on-column activation)法和溶液內(nèi)活化(in-solution activation)法。優(yōu)選地，柱上活化用于本發(fā)明的FacVII復(fù)合物。在柱上活化法中(還稱為固相活化法)，將FacVIIa復(fù)合物固定在陰離子交換柱上，然后進(jìn)行“自活化”，無(wú)需特殊的添加物。與柱上活化法不同，溶液內(nèi)活化法需要多種因素(例如，鈣離子濃度、pH、溫度和FacVII濃度)來(lái)活化FacVII。本發(fā)明的FacVIIa是FacVII的活化肽，其參與凝血機(jī)制的輔助途徑。所述肽中有天然FacVII的活化形式，F(xiàn)acVIIa的激動(dòng)劑、前體、衍生物、片段和變體。
本文中使用的術(shù)語(yǔ)“FacVIIa激動(dòng)劑”是指表現(xiàn)出與FacVIIa相同生物活性的物質(zhì),與FacVIIa的結(jié)構(gòu)無(wú)關(guān)。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“FacVIIa衍生物”是指具有體內(nèi)調(diào)節(jié)凝血之功能的肽，其具有與天然FacVIIa至少80%的氨基酸序列同源性，并且可在一些氨基酸殘基處通過(guò)化學(xué)取代(例如，α -甲基化、α -羥基化)、缺失(例如，脫氨基)或者裝飾(decoration)(例如，N-甲基化)進(jìn)行修飾。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“FacVIIa衍生物”是指在FacVIIa氨基酸序列中添加或缺失一個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基并且具有體內(nèi)凝血活性的肽。所添加的氨基酸殘基可是非天然氨基酸(例如，D-氨基酸)。 本文中使用的術(shù)語(yǔ)“FacVIIa變體”是指一個(gè)或更多個(gè)氨基酸與FacVIIa的氨基酸序列不同并且具有體內(nèi)凝血活性的肽。除了單個(gè)的FacVIIa激動(dòng)劑、衍生物、片段和變體之外，還可使用具有其性質(zhì)組合的肽(例如，氨基酸序列中一個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基不同且在其N端氨基酸處脫氨基的肽)，只要其具有凝血功能即可。優(yōu)選地，本發(fā)明的FacVIIa復(fù)合物由非肽基聚合物、免疫球蛋白Fe區(qū)和FacVIIa組成，所述非肽基聚合物的一端與免疫球蛋白Fe區(qū)相連接，而所述非肽基聚合物的另一端與FacVIIa的N端相連接。更優(yōu)選地，在本發(fā)明的FacVIIa復(fù)合物中，非肽基一端與免疫球蛋白Fe區(qū)相連接，而另一端與FacVIIa輕鏈的N端相連接。在FacVIIa的情況中使用的術(shù)語(yǔ)“N端”旨在涵蓋包含F(xiàn)acVIIa之N端的區(qū)域。因此，在本發(fā)明的FacVIIa復(fù)合物中，非肽基聚合物可與FacVIIa最N端的氨基酸殘基相連接，或者與距離N端稍遠(yuǎn)的氨基酸殘基相連接，只要FacVIIa復(fù)合物保持期望的功能。因?yàn)镕acVII在活化前是輕鏈與重鏈彼此相連接的單鏈結(jié)構(gòu)，所以僅輕鏈的N端暴露在外。將FacVII轉(zhuǎn)化為FacVIIa(152位精氨酸與153位異亮氨酸之間切割)，暴露了重鏈的活性部位，153位的異亮氨酸為重鏈的N端。因?yàn)橹劓淣端在FacVIIa的活性中發(fā)揮重要作用，聚合物必須與輕鏈的N端(而非重鏈)相連接，從而提高效價(jià)。在一個(gè)實(shí)施方案中，PEG與免疫球蛋白Fe區(qū)的N端相連接，并選擇性地與FacVII輕鏈的N端偶聯(lián)以產(chǎn)生FacVI1-PEG-免疫球蛋白Fe復(fù)合物。然后實(shí)施另外的活化方法以完成FacVI1-PEG-免疫球蛋白Fe復(fù)合物。根據(jù)本發(fā)明制備的FacVI1-PEG-免疫球蛋白Fe復(fù)合物的血清半衰期為60小時(shí)，遠(yuǎn)長(zhǎng)于常規(guī)治療劑的血清半衰期，并在動(dòng)物模型中顯示出極好的凝血作用，因此可制備成保留極好體內(nèi)活性的長(zhǎng)效FacVIIa制劑。免疫球蛋白Fe區(qū)是可在體內(nèi)代謝的可生物降解的多肽，因此可安全地用作藥物載體。此外，免疫球蛋白Fe區(qū)在生產(chǎn)、純化和產(chǎn)率方面更有優(yōu)勢(shì)，這是因?yàn)槠渑c整個(gè)免疫球蛋白分子相比相對(duì)較小。此外，由于抗體彼此之間的氨基酸序列不同，可以預(yù)計(jì)的是，移除高度異質(zhì)性的Fab極大地提高物質(zhì)的同質(zhì)性，并且降低誘導(dǎo)血液抗原性的可能性。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“免疫球蛋白Fe區(qū)”是指缺乏輕鏈和重鏈可變區(qū)、重鏈恒定區(qū)I (CHl)和輕鏈恒定區(qū)I (CLl)的免疫球蛋白片段，即包含重鏈恒定區(qū)2和3 (CH2和CH3)的片段。任選地，重鏈恒定區(qū)還可包含鉸鏈區(qū)。此外，只要顯示出優(yōu)于典型Fe區(qū)或與其基本相同的作用，本發(fā)明的免疫球蛋白Fe區(qū)也可以是延長(zhǎng)的Fe區(qū)，其除了重鏈恒定區(qū)2和3(CH2和CH3)之外，還包含整個(gè)重鏈恒定區(qū)1 (CHl)和/或輕鏈恒定區(qū)I (CLl)或其一部分，僅排除免疫球蛋白輕鏈和重鏈的可變區(qū)。此外，它可以是這樣的區(qū)域其中缺失對(duì)應(yīng)于CH2和/或CH3區(qū)的相當(dāng)長(zhǎng)部分的氨基酸序列。因此，本發(fā)明的免疫球蛋白Fe區(qū)可由以下部分構(gòu)成DCHl結(jié)構(gòu)域、CH2結(jié)構(gòu)域、CH3結(jié)構(gòu)域和CH4結(jié)構(gòu)域，2) CHl結(jié)構(gòu)域和CH2結(jié)構(gòu)域，3) CHl結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域，4)CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域，5) —個(gè)或更多個(gè)結(jié)構(gòu)域與免疫球蛋白鉸鏈區(qū)(或鉸鏈區(qū)的一部分)的組合，或者6)每個(gè)重鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域和輕鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的二聚體。此外，本發(fā)明的免疫球蛋白Fe區(qū)不僅可包括野生型Fe，并且包括其氨基酸序列突變體。本文中使用的的術(shù)語(yǔ)“氨基酸序列突變體”是指由于一個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基的缺失、插入、保守或非保守替換或其組合而不同于野生型的氨基酸序列。例如，在IgG Fe中，已知對(duì)于連接重要的214至238、297至299、318至322或327至331位的氨基酸殘基可用作合適的修飾部位。可使用多種衍生物，例如通過(guò)移除二硫鍵部位、移除天然Fe的數(shù)個(gè)N端氨基酸或者向天然Fe的N端添加甲硫氨酸而制備的那些。此外，補(bǔ)體結(jié)合部位，例如Clq結(jié)合部位或ADCC部位可被去除以移除天然Fe區(qū)的效應(yīng)子功能。制備免疫球蛋白Fe區(qū)的氨基酸序列突變體的技術(shù)在國(guó)際專利公布的No. WO 97/34631和WO 96/32478等中公開(kāi)。不改變分子活性的蛋白質(zhì)或肽分子中的氨基酸替換是本領(lǐng)域公知的。(H. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979)。最常見(jiàn)替換發(fā)生在以下氨基酸殘基之間Ala/Ser、Val/Ike、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和 Asp/Gly。任選地，氨基酸可通過(guò)磷酸化、硫酸化、丙烯酸化(acrylation)、糖基化、甲基化、法尼基化、乙?；约磅０坊瘉?lái)修飾。上述Fe衍生物顯示出與野生型相同的生物活性，但當(dāng)遇熱和pH時(shí)具有提高的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。這些Fe區(qū)可作為來(lái)自人或動(dòng)物(例如，牛、山羊、豬、小鼠、兔、倉(cāng)鼠、大鼠、豚鼠等)的天然Fe區(qū)而獲得，或者作為來(lái)自經(jīng)轉(zhuǎn)化動(dòng)物細(xì)胞或微生物的重組或衍生化Fe區(qū)。天然Fe區(qū)可通過(guò)對(duì)從人或動(dòng)物樣品中分離的整個(gè)免疫球蛋白進(jìn)行蛋白酶消化而獲得。免疫球蛋白被木瓜蛋白酶切割成Fab和Fe，被胃蛋白酶切割成pF' c和F(ab' )2，隨后用大小排阻色譜從其中分離Fe或pF' Co優(yōu)選地，優(yōu)選從微生物中獲得的重組人Fe區(qū)。可用于本發(fā)明的免疫球蛋白Fe區(qū)可被糖基化至與天然形式相同的程度或更高和更低的程度，或者可被去糖基化。免疫球蛋白提高或降低的糖基化或去糖基化可通過(guò)典型方法實(shí)現(xiàn)，例如通過(guò)使用化學(xué)方法、酶法或使用微生物的基因工程方法。在本文中，當(dāng)去糖基化時(shí)，所述免疫球蛋白Fe區(qū)的補(bǔ)體(Clq)結(jié)合變得顯著降低，并且其抗體依賴細(xì)胞毒性或補(bǔ)體依賴細(xì)胞毒性降低或喪失，所以它不誘導(dǎo)不必要的體內(nèi)免疫應(yīng)答。在這種情況下，免疫球蛋白Fe區(qū)的去糖基化或無(wú)糖基化更符合作為藥物載體的目的。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“去糖基化”旨在表示從Fe區(qū)酶促移除糖。當(dāng)與Fe區(qū)結(jié)合使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“無(wú)糖基化”意為由原核生物(優(yōu)選由大腸桿菌(E. coli))表達(dá)的不含糖的Fe區(qū)。免疫球蛋白Fe區(qū)可源自人或動(dòng)物(例如，牛、山羊、豬、小鼠、兔、倉(cāng)鼠、大鼠、豚鼠等)，優(yōu)選源自人。此外，免疫球蛋白Fe區(qū)可來(lái)源于IgG、IgA、IgD、IgE、IgM或其組合或雜合體。優(yōu)選地，F(xiàn)e區(qū)來(lái)源于人血液中最豐富的IgG或IgM,且最優(yōu)選來(lái)源于IgG (已知其可延長(zhǎng)配體結(jié)合蛋白質(zhì)的血清半衰期)。本文中使用的“組合”意為編碼相同來(lái)源的單鏈免疫球蛋白Fe區(qū)的多肽與不同來(lái)源的單鏈多肽相連接以形成二聚體或多聚體。即，二聚體或多聚體可由兩種或更多種選自IgGlFc, IgG2Fc、IgG3Fc 和 IgG4Fc 的片段形成。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“雜合體”意為編碼兩種或更多種不同來(lái)源免疫球蛋白Fe區(qū)的序列存在于單鏈免疫球蛋白Fe片段中。在本發(fā)明中，多種類型的雜合體是可能的。即，結(jié)構(gòu)域雜合體可由選自 IgG Fe、IgM Fe、IgAFc、IgE Fe 和 IgD Fe 的 CHl、CH2、CH3 和 CH4 中的一至四個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，并且可包含鉸鏈區(qū)。IgG分為IgGl、IgG2、IgG3和IgG4亞類，且本發(fā)明可包括其組合或雜合體。優(yōu)選 的是IgG2和IgG4亞類，且最優(yōu)選的是幾乎不具有效應(yīng)子功能(例如，CDC(補(bǔ)體依賴細(xì)胞毒性))的IgG4Fc區(qū)。即，最適宜作為本發(fā)明藥物載體的免疫球蛋白Fe區(qū)是源自人IgG4的無(wú)糖基化Fe區(qū)。源自人的Fe區(qū)比非人來(lái)源的Fe區(qū)更優(yōu)選，后者可在人體內(nèi)充當(dāng)抗原并引起不期望的免疫應(yīng)答，例如產(chǎn)生針對(duì)所述抗原的新抗體。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“非肽基聚合物”是指包含通過(guò)除肽鍵之外的任何共價(jià)鍵結(jié)合在一起的至少兩個(gè)重復(fù)單元的生物相容性聚合物。所述非肽基聚合物可具有兩個(gè)或三個(gè)末端官能團(tuán)。對(duì)本發(fā)明來(lái)說(shuō)，可用的非肽基聚合物可選自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇與丙二醇的共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯乙醚、可生物降解的聚合物如PLA (聚乳酸)和PLGA (聚乳酸乙醇酸)、脂質(zhì)聚合物、幾丁質(zhì)、透明質(zhì)酸及其組合。最優(yōu)選的是聚乙二醇。它們的衍生物是本領(lǐng)域中公知的，且可很容易地用本領(lǐng)域公知的方法制備的衍生物也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。通過(guò)框內(nèi)融合技術(shù)構(gòu)建的在融合蛋白中使用的常規(guī)肽聚合物的缺點(diǎn)在于它們?cè)隗w內(nèi)易被蛋白酶切割，因此不能確保通過(guò)載體延長(zhǎng)血清半衰期。相反，對(duì)蛋白酶有抗性的本發(fā)明聚合物保持肽的血清半衰期，如同載體那樣。因此，只要對(duì)體內(nèi)蛋白酶有抗性，任何非肽基聚合物均可無(wú)限制地在本發(fā)明中使用。非肽基聚合物分子量范圍為I至IOOkDa,優(yōu)地I至20kDa。另外，與免疫球蛋白Fe區(qū)相連接的非肽基聚合物不僅可以是單獨(dú)的聚合物，還可以是不同聚合物的組合?？捎糜诒景l(fā)明的非肽基聚合物具有與免疫球蛋白Fe區(qū)和蛋白質(zhì)藥物偶聯(lián)的官能團(tuán)。上文中討論的非肽基聚合物具有兩個(gè)或三個(gè)末端。且官能團(tuán)優(yōu)選選自醛、丙醛、丁醛、馬來(lái)酰亞胺和琥珀酰亞胺衍生物。對(duì)于琥珀酰亞胺，還可使用其衍生物包括琥珀酰亞胺丙酸酯(succinimidyl propionate)、輕基玻拍酸亞胺(hydroxy succinimidyl)、琥拍酰亞胺乙酸酯(succinimidylcarboxymethyl)或琥拍酰亞胺碳酸酯(succinimidylcarbonate)。尤其是當(dāng)所述非肽基聚合物在其兩端具有醛官能團(tuán)時(shí)，所述聚合物可通過(guò)其間最小的非特異性反應(yīng)有效地在其兩端分別與生理活性多肽和免疫球蛋白相連接。通過(guò)經(jīng)由醛鍵的還原烷基化產(chǎn)生的終產(chǎn)物比通過(guò)酰胺鍵連接的那些更穩(wěn)定。醛官能團(tuán)在低PH下與氨基端特異性地反應(yīng)，而在高pH(例如，pH 9.0)時(shí)，可與賴氨酸殘基形成共價(jià)鍵。非肽基聚合物的兩個(gè)或三個(gè)末端官能團(tuán)可以相同或不同。例如，非肽基聚合物可在一端具有馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)，并且其他端或另一端可具有醛基、丙醛基或丁醛基。當(dāng)在兩端具有羥基的聚乙二醇用作非肽基聚合物時(shí)，羥基可在用于本發(fā)明之前被活化成上述官能團(tuán)?；蛘?，市售的具有經(jīng)修飾官能團(tuán)的聚乙二醇可用于制備本發(fā)明的蛋白質(zhì)復(fù)合物。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于凝血的藥物組合物，其包含F(xiàn)acVIIa復(fù)合物。優(yōu)選地，本發(fā)明提供用于治療凝血相關(guān)疾病(包括血友病、出血、急性腦內(nèi)出血、創(chuàng)傷和FacVII缺乏癥)的藥物組合物。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“施用”意為通過(guò)某種適合的方法將預(yù)定量的物質(zhì)引入患者中。只要能引導(dǎo)復(fù)合物到達(dá)靶組織，可使用任何施用途徑?？紤]多種施用方式，包括腹膜內(nèi)、靜 脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、經(jīng)口、局部、鼻內(nèi)、肺內(nèi)和直腸內(nèi)，但本發(fā)明不限于這些施用方式。然而，由于肽在經(jīng)口施用后被消化，應(yīng)當(dāng)對(duì)用于經(jīng)口施用之組合物的活性成分進(jìn)行包衣或?qū)⑵渑渲瞥勺柚乖谖钢薪到?。?yōu)選地，可以注射劑形式施用本發(fā)明的組合物。此外，可使用某種能夠?qū)⒒钚猿煞诌\(yùn)送到靶細(xì)胞中的裝置來(lái)施用本發(fā)明的藥物組合物。 包含根據(jù)本發(fā)明復(fù)合物的藥物組合物可包含可藥用載體。對(duì)于經(jīng)口施用，所述可藥用載體可包括黏合劑、潤(rùn)滑劑、崩解劑、賦形劑、增溶劑、分散劑、穩(wěn)定劑、助懸劑、著色劑和芳香物質(zhì)(odoriferous substance)。對(duì)于可注射制劑,所述可藥用載體可包括緩沖劑、防腐劑、鎮(zhèn)痛劑、增溶劑、等滲劑和穩(wěn)定劑。對(duì)于用于局部施用的制劑，所述可藥用載體包括基質(zhì)、賦形劑、潤(rùn)滑劑和防腐劑。可將本發(fā)明的藥物組合物配制成與上述可藥用載體組合的多種劑型。例如，對(duì)于經(jīng)口施用，可將所述藥物組合物可配制成片劑、錠劑、膠囊劑、酏劑、混懸劑、糖漿劑或薄片劑(wafer)。對(duì)于可注射制劑，可將所述藥物組合物可配制成單位劑型，例如單劑量劑型的安瓿或多劑量容器。還可將藥物組合物配制成溶液劑、混懸劑、片劑、丸齊U、膠囊劑和長(zhǎng)效制劑。適用于藥物制劑的載體、賦形劑和稀釋劑包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤蘚糖醇(erythritol)、麥芽糖醇、淀粉、阿拉伯橡膠(acacia rubber)、藻酸鹽、明膠、磷酸鈣、硅酸鈣、纖維素、甲基纖維素、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸鎂和礦物油。此外，藥物制劑還可包括填充劑、抗凝劑、潤(rùn)滑劑、濕潤(rùn)劑、芳香物質(zhì)和防腐劑?？赏ㄟ^(guò)活性組分的藥物類型以及通過(guò)數(shù)種相關(guān)因素(包括待治療疾病的類型，施用途徑，患者的年齡、性別、體重和疾病嚴(yán)重程度)來(lái)確定本發(fā)明藥物組合物的劑量。由于本發(fā)明的藥物組合物具有非常長(zhǎng)的體內(nèi)作用時(shí)間和高效價(jià)，所以它具有顯著降低藥物施用頻率的優(yōu)點(diǎn)。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供用于治療凝血相關(guān)疾病的方法，其包括向?qū)ζ溆行枰膶?duì)象施用本發(fā)明的FacVIIa復(fù)合物或藥物組合物。優(yōu)選地，所述疾病是由凝血不充分引起的，并且可包括但不限于血友病、出血、急性腦內(nèi)出血、創(chuàng)傷和FacVII缺乏癥。所述對(duì)象可以是哺乳動(dòng)物，包括但不限于人、小鼠、豬、牛、狗、綿羊等，優(yōu)選人。FacVIIa復(fù)合物、組合物和施用如上所述。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供用于制備FacVIIa復(fù)合物的方法，其包括(I)將末端具有醛、馬來(lái)酰亞胺或琥珀酰亞胺衍生物作為官能團(tuán)的非肽基聚合物通過(guò)共價(jià)鍵與免疫球蛋白Fe區(qū)的胺基相連接以產(chǎn)生綴合物；(2)從步驟(I)的反應(yīng)混合物中分離所述非肽基聚合物-免疫球蛋白Fe區(qū)綴合物；(3)將FacVII與所分離綴合物中所述非肽基聚合物的另一端共價(jià)相連接以得到FacVII復(fù)合物，其中所述非肽基聚合物一端與所述免疫球蛋白Fe區(qū)相連接，而另一端與FacVII相連接；和 (4)將步驟(3)的FacVII復(fù)合物活化成FacVIIa復(fù)合物，其中FacVIIa通過(guò)所述非肽基聚合物與所述免疫球蛋白Fe區(qū)相連接。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供用于制備FacVIIa復(fù)合物的方法，其包括(I)將每一末端具有醛基的非肽基聚合物于pH 5. O至7. O下通過(guò)共價(jià)鍵與免疫球蛋白Fe的N端相連接以產(chǎn)生免疫球蛋白-非肽基聚合物綴合物；(2)從步驟(I)的反應(yīng)混合物中分離所述綴合物；(3)將FacVII與所述綴合物中所述非肽基聚合物的另一端共價(jià)相連接以形成FacVII復(fù)合物，其中所述非肽基聚合物一端與所述免疫球蛋白Fe區(qū)相連接，而另一端與FacVII相連接；和(4)將步驟(3)的FacVII復(fù)合物活化成FacVIIa復(fù)合物，其中FacVIIa通過(guò)所述非肽基聚合物與所述免疫球蛋白Fe區(qū)相連接。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供用于制備FacVIIa復(fù)合物的方法，其包括(I)將每一末端具有醛基的非肽基聚合物通過(guò)共價(jià)鍵與FacVII相連接以產(chǎn)生綴合物；(2)從步驟(I)的反應(yīng)混合物中分離所述FacVI1-非肽基聚合物綴合物；(3)將免疫球蛋白Fe區(qū)與所分離綴合物中非肽基聚合物的另一端共價(jià)相連接以產(chǎn)生FacVII復(fù)合物，其中非肽基聚合物一端與免疫球蛋白Fe區(qū)相連接，另一端與FacVII相連接；和(4)將步驟(3)中FacVII復(fù)合物活化成FacVIIa復(fù)合物，其中FacVIIa通過(guò)非肽基聚合物與免疫球蛋白Fe區(qū)相連接。優(yōu)選地，將所述FacVII復(fù)合物附著于陰離子交換柱，并通過(guò)柱上活化(自活化)而活化成FacVIIa復(fù)合物。在此方法中，F(xiàn)acVII優(yōu)選地在其N端與非肽基聚合物相連接。更優(yōu)地，上述N端來(lái)自FacVII的輕鏈。在此方法的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，F(xiàn)acVII是天然FacVII，或FacVII激動(dòng)劑、前體、衍生物、片段或變體。最優(yōu)選的是天然FacVII。此方法的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，F(xiàn)acVIIa是天然FacVIIa，或FacVIIa激動(dòng)劑、前體、衍生物、片段或變體。最優(yōu)選的是天然FacVIIa?？捎糜诒景l(fā)明方法的非肽基聚合物的實(shí)例包括聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇與丙二醇的共聚物、聚氧乙基化的多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯乙醚、可生物降解的聚合物如PLA (聚乳酸)和PLGA (聚乳酸乙醇酸)、脂質(zhì)聚合物、幾丁質(zhì)和透明質(zhì)酸。最優(yōu)選的是聚乙二醇。本發(fā)明的方法中，優(yōu)選地，非肽基聚合物具有醛基衍生物作為末端官能團(tuán)，并且更優(yōu)選地在三個(gè)末端具有醛基官能團(tuán)。
具體實(shí)施例方式通過(guò)以下列出的用以舉例說(shuō)明的實(shí)施例可更好地理解本發(fā)明，但所述實(shí)施例不應(yīng)解釋為限制本發(fā)明。實(shí)施例1 :免疫球蛋白Fc-PEG-FacVIIa復(fù)合物的制備將免疫球蛋白Fe在N端用5K丙醛(3) PEG (具有三個(gè)末端丙醛基團(tuán)的PEG，N0F，日本)聚乙二醇化。就這一點(diǎn)而言，6mg/mL的免疫球蛋白Fe與PEG在4°C下反應(yīng)4. 5小時(shí)，免疫球蛋白Fe與PEG的摩爾比設(shè)定為1: 2。該反應(yīng)在pH 6. O的IOOmM磷酸鉀緩沖液中，在20mM的SCB(NaCNBH3)作為還原劑存在下進(jìn)行。將反應(yīng)混合物加載到S0URCEQ(LRC2585ml， Pall公司)上以純化單聚乙二醇化的免疫球蛋白Fe。然后，將FVII與免疫球蛋白Fc_5KPEG以1: 10(FVI1:免疫球蛋白Fc-5K PEG)的摩爾比在4°C下偶聯(lián)18小時(shí)，總蛋白質(zhì)濃設(shè)定為20mg/mL。偶聯(lián)反應(yīng)在pH 6. O的IOOmM磷酸鉀中，在20mM SCB作為還原劑存在下進(jìn)行。偶聯(lián)反應(yīng)混合物通過(guò)流過(guò)兩個(gè)柱進(jìn)行純化。為去除仍未偶聯(lián)的免疫球蛋白Fc-5K PEG綴合物，采用了 SOURCE Q(LRC2585ml，Pall Corporation) 給以 20mM Tris (pH 7.5)中 IMNaCl的鹽梯度，該柱首先洗脫相對(duì)弱結(jié)合的免疫球蛋白Fc-5K，然后是免疫球蛋白Fc_3臂PEG-FVII。然后，使用SOURCE ISO (GE Healthcare)柱進(jìn)行第二純化以將免疫球蛋白Fc_3臂PEG-FVII與FVII和FVII多聚物雜質(zhì)分離。在這種情況中，F(xiàn)VI1、免疫球蛋白Fc_3臂PEG-FVII和FVII多聚物雜質(zhì)以該順序洗脫。為了活化，將免疫球蛋白Fc-3臂PEG-FVII再加載到SOURCE Q上，隨后倒入含有1. 75mM鈣離子的流動(dòng)相6小時(shí)。用35mM鈣離子進(jìn)行洗脫以獲得免疫球蛋白Fc_3臂PEG-FVIIa0柱SourceQ(LRC2585ml, Pall 公司)流速4ml/分鐘梯度AO —7% I 分鐘B，7% —40%80分鐘B(A :20mM Tris pH7. 5,B A+1M NaCl)柱S0URCEISO (23ml, 16/10HR 柱，GE Healthcare)流速2ml/分鐘梯度B100 — 40% 60 分鐘 A (A 20mM Tris pH7. 5，B A+1. 6M(NH4)2SO4)柱SourceQ(15ml, 16/10HR 柱，GE Healthcare)流速1ml/分鐘流動(dòng)相20mMTris pH 7. 5+1. 75mM CaCl2+l. 25mM NaCl實(shí)施例2 20k PEG-FacVIIa(N)綴合物的制備將FVII (FacVII)在 N 端用 20K mPEG 丁醛(Nektar，USA)聚乙二醇化。就這一點(diǎn)而言，5mg/mL的FVII與PEG在4°C下反應(yīng)10小時(shí)，F(xiàn)VII與20K PEG的摩爾比設(shè)定1: 5。該反應(yīng)在pH 5. O的IOOmM乙酸鈉緩沖液中，在20mM SCB (NaCNBH3)作為還原劑存在下進(jìn)行。單聚乙二醇化的FVII通過(guò)RESOURCE Q(lml，預(yù)包裝，GE Healthcare)來(lái)純化。給以20mMTris (pH 7.5)中IM NaCl的鹽梯度，該柱依次洗脫多聚乙二醇化的FVI1、單聚乙二醇化的FVII 和 FVII。然后，使用 Superdex_200 (Hiroad 16/60，GE Healthcare)柱進(jìn)行第二純化以將單聚乙二醇化的FVII與FVII和FVII多聚物雜質(zhì)分離。為了活化，將單聚乙二醇化的FVII再加載到SOURCE Q上，隨后倒入含有1. 75mM鈣離子的流動(dòng)相洗脫I小時(shí)。用35mM鈣離子進(jìn)行洗脫以獲得單聚乙二醇化的FVIIa。柱RESOURCEQ(lml，預(yù)包裝，GE Healthcare)流速0.5ml/ 分鐘梯度AO — 50% 50 分鐘 B (A 20mM Tris pH 7· 5，B A+lMNaCl)柱Superdex_200(Hiroad 16/60HR 柱，GE Healthcare)流速1ml/分鐘
流動(dòng)相PBS柱RESOURCEQ(lml，預(yù)包裝，GE Healthcare)流速0.5ml/ 分鐘流動(dòng)相20mMTris pH7. 5+1. 75mM CaCl2+l. 25mM NaCl實(shí)施例3 20K PEG-FacVIIa(Lys)綴合物的制備將FVII在賴氨酸殘基處用20k mPEG SPA(Nektar，USA)聚乙二醇化。就這一點(diǎn)而言，3mg/mL的FVII與20k PEG在室溫下反應(yīng)3小時(shí)，F(xiàn)VII與20k PEG的摩爾比設(shè)定為1: 5。該反應(yīng)在pH 8.0的IOOmM磷酸鈉緩沖液中進(jìn)行。單聚乙二醇化的FVII通過(guò)RESOURCE Q(lml，預(yù)包裝，GE Healthcare)來(lái)純化。給以 20mM Tris (pH 7.5)中 IM NaCl的鹽梯度，該柱依次洗脫出多聚乙二醇化的FVI1、單聚乙二醇化的FVII和FVII。然后，用Superdex_200 (Hiroad 16/60, GE Healthcare)柱進(jìn)行第二純化以將單聚乙二醇化的FVII與FVII和FVII多聚物雜質(zhì)分離。為了活化，將純化的單聚乙二醇化的FVII再加載到SOURCE Q上，隨后在柱上倒入含有1. 75mM鈣離子的流動(dòng)相I小時(shí)。用35mM鈣離子進(jìn)行洗脫以獲得單聚乙二醇化的FVIIa。柱SOURCEQ (23ml, HR 柱，GE Healthcare)流速2ml/分鐘梯度AO — 50% 50 分鐘 B (A 20mM Tris pH 7· 5，B A+lMNaCl)柱Superdex_200(Hiroad 16/60HR 柱，GE Healthcare)流速1ml/分鐘流動(dòng)相PBS柱RESOURCEQ(lml，預(yù)包裝，GE Healthcare)流速0.5ml/分鐘流動(dòng)相20mMTris pH 7. 5+1. 75mM CaCl2+l. 25mM NaCl實(shí)施例4 =FVIIa和免疫球蛋白Fc-PEG-FVIIa血清半衰期的測(cè)量為評(píng)價(jià)其藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，將FVIIa和免疫球蛋白Fc-PEG-FVIIa各自以100 μ g/kg的劑量靜脈內(nèi)注射到正常SD大鼠中，隨后進(jìn)行ELISA分析以獲得血清水平。靜脈內(nèi)注射后，在0. 25,0. 5、1、2、5、10、24和48小時(shí)從施用FVIIa的大鼠以及在0. 25,0. 5、1、2、5、10、24、48、72、96和120小時(shí)從施用免疫球蛋白Fc-PEG-FVIIa的大鼠取0. 5ml血樣。將血樣收集在裝有朽1檬酸鈉的試管中以防止凝固，用Eppendorf高速微型離心機(jī)離心5分鐘以分離血清。通過(guò)使用FVIIa特異性抗體的ELISA(MUBIND，因子VIIaELISA試劑盒，American diagnostic inc.)測(cè)量血清蛋白質(zhì)水平。圖1和表I中給出了 FVIIa和免疫球蛋白Fc-PEG-FVIIa的血清濃度-時(shí)間曲線和藥代動(dòng)力學(xué)分析結(jié)果。在如下的表格中，Tmax指藥物達(dá)到最大血清濃度所需時(shí)間，T1/2指藥物血清半衰期，并且MRT (平均滯留時(shí)間)指藥物分子滯留在體內(nèi)的平均時(shí)間。如表I和圖1所示，觀察到免疫球蛋白Fc-PEG-FVIIa具有長(zhǎng)達(dá)約60小時(shí)的極好血清半衰期。表ISD大鼠中FVIIa和免疫球蛋白Fc-PEG-FVIIa的藥代動(dòng)力學(xué)

權(quán)利要求
1.FacVIIa復(fù)合物，其包含通過(guò)非肽基聚合物與免疫球蛋白Fe區(qū)相連接的FacVIIa，所述非肽基聚合物選自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇與丙二醇的共聚物、聚氧乙基化多元醇、 聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯乙醚、可生物降解的聚合物、脂質(zhì)聚合物、幾丁質(zhì)、透明質(zhì)酸及其組合。
2.權(quán)利要求1所述的FacVIIa復(fù)合物，其中所述非肽基聚合物在末端分別與所述免疫球蛋白Fe區(qū)和FacVIIa的N端相連接。
3.權(quán)利要求1所述的FacVIIa復(fù)合物，其中所述非肽基聚合物在末端分別與所述免疫球蛋白Fe區(qū)和FacVIIa輕鏈的N端相連接。
4.權(quán)利要求1所述的FacVIIa復(fù)合物，其中所述免疫球蛋白Fe區(qū)是無(wú)糖基化的。
5.權(quán)利要求1所述的FacVIIa復(fù)合物，其中所述免疫球蛋白Fe區(qū)包含一至四個(gè)選自 CH1、CH2、CH3和CH4的結(jié)構(gòu)域。
6.權(quán)利要求5所述的FacVIIa復(fù)合物，其中所述免疫球蛋白Fe區(qū)還包含鉸鏈區(qū)。
7.權(quán)利要求1所述的FacVIIa復(fù)合物，其中所述免疫球蛋白Fe區(qū)來(lái)源于IgG、IgA、IgD、 IgE 或 IgM0
8.權(quán)利要求7所述的FacVIIa復(fù)合物，其中所述免疫球蛋白Fe區(qū)為選自IgG、IgA、IgD、 IgE和IgM之兩個(gè)或更多個(gè)結(jié)構(gòu)域的雜合體，所述結(jié)構(gòu)域具有來(lái)源于免疫球蛋白的不同來(lái)源。
9.權(quán)利要求7所述的FacVIIa復(fù)合物，其中所述免疫球蛋白Fe區(qū)是由相同來(lái)源之結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的單鏈免疫球蛋白的二聚體或多聚體。
10.權(quán)利要求7所述的FacVIIa復(fù)合物，其中所述免疫球蛋白Fe區(qū)是IgG4Fc區(qū)。
11.權(quán)利要求10所述的FacVIIa復(fù)合物，其中所述免疫球蛋白Fe區(qū)是無(wú)糖基化的人 IgG4Fc 區(qū)。
12.權(quán)利要求1所述的FacVIIa復(fù)合物，其中所述非肽基聚合物具有選自醛、丙醛、丁醛、馬來(lái)酰亞胺和琥珀酰亞胺衍生物的官能團(tuán)。
13.權(quán)利要求12所述的FacVIIa復(fù)合物，其中所述琥珀酰亞胺衍生物是琥珀酰亞胺丙酸酯、琥珀酰亞胺乙酸酯、羥基琥珀酰亞胺或琥珀酰亞胺碳酸酯。
14.權(quán)利要求12所述的FacVIIa復(fù)合物，其中所述非肽基聚合物在兩個(gè)或三個(gè)末端具有反應(yīng)性醛基作為官能團(tuán)。
15.權(quán)利要求12所述的FacVIIa復(fù)合物，其中所述非肽基聚合物在各個(gè)末端具有反應(yīng)性醛基作為官能團(tuán)。
16.權(quán)利要求15所述的FacVIIa復(fù)合物，其中所述非肽基聚合物是聚乙二醇。
17.用于凝血的藥物組合物，其包含權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)所述的FacVIIa復(fù)合物。
18.用于制備FacVIIa復(fù)合物的方法，其包括(1)將末端具有醛、馬來(lái)酰亞胺或琥珀酰亞胺衍生物作為官能團(tuán)的非肽基聚合物通過(guò)共價(jià)鍵與免疫球蛋白Fe區(qū)的胺基或巰基相連接以產(chǎn)生綴合物；(2)從步驟(I)的反應(yīng)混合物中分離所述非肽基聚合物-免疫球蛋白Fe區(qū)綴合物；(3)將FacVII與所分離綴合物中所述非肽基聚合物的另一端共價(jià)相連接以得到 FacVII復(fù)合物，其中所述非肽基聚合物一端與所述免疫球蛋白Fe區(qū)相連接，而另一端與 FacVII相連接；和(4)將步驟(3)的FacVII復(fù)合物活化成FacVIIa復(fù)合物，其中FacVIIa通過(guò)所述非肽基聚合物與所述免疫球蛋白Fe區(qū)相連接。
19.用于制備FacVIIa復(fù)合物的方法，其包括(1)將每一末端具有醛基的非肽基聚合物于PH5. O至7. O下通過(guò)共價(jià)鍵與免疫球蛋白 Fe的N端相連接以產(chǎn)生免疫球蛋白-非肽基聚合物綴合物；(2)從步驟(I)的反應(yīng)混合物中分離所述綴合物；(3)將FacVII與所述綴合物中所述非肽基聚合物的另一端共價(jià)相連接以形成FacVII 復(fù)合物，其中所述非肽基聚合物一端與所述免疫球蛋白Fe區(qū)相連接，而另一端與FacVII相連接；和(4)將步驟(3)的FacVII復(fù)合物活化成FacVIIa復(fù)合物，其中FacVIIa通過(guò)所述非肽基聚合物與所述免疫球蛋白Fe區(qū)相連接。
20.權(quán)利要求18所述的方法，其中所述非肽基聚合物在各個(gè)末端處具有醛基，并且與 FacVII輕鏈的N端共價(jià)相連接。
21.權(quán)利要求18至20中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述FacVII在N端與所述非肽基聚合物共價(jià)鍵合。
22.權(quán)利要求18至20中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述FacVII復(fù)合物通過(guò)柱上活化或溶液內(nèi)活化而活化。
23.權(quán)利要求18至20中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述FacVII和所述FacVIIa分別是天然FacVII和天然FacVIIa。
24.權(quán)利要求18至20中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述非肽基聚合物是聚乙二醇。
25.治療凝血相關(guān)疾病的方法，其包括向?qū)ζ溆行枰膶?duì)象施用權(quán)利要求1所述的 FacVIIa復(fù)合物。
26.治療凝血相關(guān)疾病的方法，其包括向?qū)ζ溆行枰膶?duì)象施用權(quán)利要求17所述的藥物組合物。
27.權(quán)利要求25或26所述的方法，其中所述凝血相關(guān)疾病是血友病、出血、急性腦內(nèi)出血、創(chuàng)傷或FacVII缺乏癥。
全文摘要
公開(kāi)了凝血因子復(fù)合物及其用途，其中FacVIIa、非肽基聚合物和免疫球蛋白Fc區(qū)通過(guò)共價(jià)鍵鍵合。FacVIIa復(fù)合物確保了FacVIIa的體內(nèi)活性并顯著地延長(zhǎng)了FacVIIa的血清半衰期，因此所述復(fù)合物可用于開(kāi)發(fā)長(zhǎng)效FacVIIa制劑，其可提高血液不凝固患者的角色行為的順應(yīng)性。
文檔編號(hào)C07K16/18GK103025358SQ201180032580
公開(kāi)日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2011年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月30日
發(fā)明者宋大海, 林圣仁, 金昌煥, 洪性甲, 任大成, 權(quán)世昌 申請(qǐng)人:韓美科學(xué)株式會(huì)社