專利名稱：用于pet成像的親脂陽離子探針的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及為了體內(nèi)線粒體供能(mitochondrial energisation)的可視化，在諸如正電子發(fā)射斷層成像術(shù)(PET)和單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層成像術(shù)(SPECT)的技術(shù)中使用的成像探針。
背景技術(shù)：
線粒體功能異常會導(dǎo)致種種病態(tài)(pathologies),包括癌癥、糖尿病、心臟衰竭、心血管和肝臟疾病、AIDS、自身免疫紊亂、退行性疾病和衰老的病理生理學(xué)。線粒體功能障礙引起的疾病常常與線粒體膜電位(Λ Ψπι)的明顯變化有關(guān)。線粒體膜電位的改變是與凋亡受抑(如癌癥)有關(guān)；或與凋亡增強(qiáng)(如AIDS和退行性疾病)有關(guān)的那些病態(tài)的一個重要特性。它還與多種由線粒體功能障礙直接導(dǎo)致的疾病有關(guān)，比如DNA突變和氧化應(yīng)激。因此有必要對患者體內(nèi)的線粒體功能進(jìn)行監(jiān)測。正電子發(fā)射斷層成像術(shù)(PET)是一項(xiàng)廣泛用于給生物組織和患者的體內(nèi)代謝造影的技術(shù)。將半衰期很短的正電子發(fā)射核子(比如18F)引入探針分子并注射到患者體內(nèi)。然后探針在某些組織中累積。利用PET掃描儀可以由Y射線的放射顯示出探針的位置，并由斷層成像中推導(dǎo)出探針的局部濃度。由于跨越內(nèi)膜的負(fù)膜電位，諸如四苯基磷鎦陽離子或三苯基磷彳t陽離子的親脂性陽離子能夠穿過細(xì)胞質(zhì)和線粒體膜，有選擇性地在線粒體中累積?；诤唵蜹PP陽離子的示蹤劑已被建議用于線粒體功能障礙成像(Cheng etal (2005)J. Label . Compd. Radiopharm. 48:131-137)、腫瘤成像(Madar et al(1999)J. Nucl. Med. 40:1180-1185; Wang et al (2007) 50:5057-5069)和冠狀動脈疾病的診斷成像(Madar et al(2006)J. Nucl. Med. 47:1359-1366)。本發(fā)明涉及對已知靶向線粒體的PET探針的改進(jìn)。附圖簡述

圖1-實(shí)施例中使用的TPP陽離子的結(jié)構(gòu)。圖2-1v(靜脈)注射后，[3H]MitoQ攝入小鼠組織的時程圖。小鼠經(jīng)iv尾靜脈注射被給予IOOnmol [3H]MitoQ大丸藥。在所示的時間點(diǎn)，處死小鼠并確定組織中的[3H]MitoQ含量。數(shù)據(jù)是nmol MitoQ/g濕重組織，是每個時間點(diǎn)兩只獨(dú)立小鼠的平均值土范圍。A，肝和腎；B，心臟、肌肉、腦和白色脂肪組織(脂肪)；(和0，分別是注射MitoQ后頭I小時的肝和腎的視圖(C)以及心臟、肌肉、腦和白色脂肪組織(脂肪)的視圖(D)。圖3-1v注射后[3H]TPP化合物從循環(huán)系統(tǒng)清除的時程圖。小鼠經(jīng)iv尾靜脈注射被給予IOOnmol [3H]TPP大丸藥。在所示的時間點(diǎn)，處死小鼠并確定血液中的[3H]TPP含量。數(shù)據(jù)是nmol TPP化合物/ml血，是每個時間點(diǎn)兩只獨(dú)立小鼠的平均值土范圍。A，[3H]MitoQ ；B, [3H]癸基 TPP 和[3H]氟代^^一烷基 TPP ；C, [3H] TPMP。圖4-[3H]癸基TPP和[3H]氟代十一烷基TPP攝入組織的時程圖。小鼠經(jīng)iv尾靜脈注射被給予IOOnmol [3H]癸基TPP或[3H]氟代i^一烷基TPP大丸藥。在所示的時間點(diǎn)，處死小鼠并確定組織中的[3H]癸基TPP或[3H]氟代十一烷基TPP含量。數(shù)據(jù)是每個時間點(diǎn)兩只獨(dú)立小鼠的平均值土范圍。A，肝和腎的[3H]癸基TPP含量；B，心臟、肌肉、腦和白色脂肪組織(脂肪)的[3H]癸基TPP含量；C，所有組織的[3H]氟代十一烷基TPP含量。圖5-[3H]TPMP攝入組織的時程圖。小鼠經(jīng)尾靜脈注射IOOnmol [3HlTPMP大丸藥。在所示的時間點(diǎn)，處死小鼠并確定組織中的[3H]TPMP含量。數(shù)據(jù)是每個時間點(diǎn)兩只獨(dú)立小鼠的平均值土范圍。A，肝和腎含量；B，心臟、肌肉、腦和白色脂肪組織(脂肪)含量。圖6-TPP化合物在不同時間點(diǎn)攝入組織的比較。小鼠經(jīng)iv注射100nmol[3H]MitoQ, [3H]癸基 TPP、[3H]氟代i^一烷基 TPP 或[3H] TPMP 大丸藥，在 15 分鐘(A, B)、Ih (C，D)或5h(E，F(xiàn))的時間點(diǎn)，處死小鼠并確定[3H] TPP化合物的組織含量。數(shù)據(jù)是每個時間點(diǎn)兩只獨(dú)立小鼠的平均值土范圍，A、C和E中是nmol TPP化合物/g濕重組織，B，D和F是nmolTPP化合物/ml血。圖7-TPP化合物的體內(nèi)線粒體攝入。A，經(jīng)尾靜脈給小鼠注射IOOnmol [3H]氟代i^一烷基TPP大丸藥。15分鐘后，小鼠經(jīng)ip注射DNP (200或300 μ g/kg)或載體鹽水，再過15分鐘后，處死小鼠并確定組織中的[3H]氟代十一烷基TPP含量。數(shù)據(jù)是每個條件下兩只獨(dú)立小鼠的平均值土范圍。B，顯示IAM-TPP被攝入細(xì)胞內(nèi)的線粒體中，并在那里與巰基蛋白反應(yīng)形成能夠通過免疫印跡檢測的硫醚加合物。C，IAM-TPP與細(xì)胞內(nèi)線粒體結(jié)合的共聚焦圖像。C2C12細(xì)胞與IyM IAM-TPP溫育3h± 10 μ M FCCP。然后將細(xì)胞固定，通過用抗TPP部分的抗血清標(biāo)記來確定TPP部分在細(xì)胞內(nèi)的位置，經(jīng)免疫熒光共聚焦顯微鏡可視化。對照試驗(yàn)證實(shí)，IAM-TPP結(jié)合部位與線粒體特異性染料Mitotracker Orange有共同定位(數(shù)據(jù)未顯示)。D，經(jīng)尾靜脈給小鼠注射500nmol IAM-TPP大丸藥。I小時后，處死小鼠，制備肝和心臟線粒體。經(jīng)SDS-PAGE分離線粒體(40 μ g蛋白質(zhì))，用抗TPP部分的抗血清經(jīng)免疫印跡檢測標(biāo)記有IAM-TPP的蛋白。用未接觸過IAM-TPP的小鼠的線粒體作為對照。在三只獨(dú)立小鼠上重復(fù)試驗(yàn),結(jié)果相似。圖8-靶向線粒體的PET探 針18F-氟代i^一烷基TPP的合成。發(fā)明各方面的概述本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，如果通過例如引入疏水部分來提高成像探針的疏水性，會極大提高探針在線粒體中累積的程度，并加強(qiáng)探針從循環(huán)系統(tǒng)的清除，產(chǎn)生更大的組織循環(huán)比。這些因素一起表明本發(fā)明的靶向線粒體的疏水性成像探針比目前使用的體內(nèi)線粒體供能可視成像探針靈敏20-100倍，并且有更好的組織加載和對比性能。因此，本發(fā)明第一方面中提供了包含親脂陽離子、疏水部分和PET核的成像探針。所述成像探針可以用于例如正電子發(fā)射斷層成像術(shù)(PET)和/或單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層成像術(shù)(SPECT)中。親脂陽離子可以是或者包含三苯基磷镕(triphenylphosphonium, TPP)。疏水部分可以是或者包含脂肪鏈，例如含至少5個碳原子的脂肪鏈。疏水部分可以包含線性烷基鏈，例如線性癸基或十一烷基鏈。PET核可以是例如18F。所述疏水部分可以作為親脂陽離子和PET核的連接分子。本發(fā)明第二方面提供了分析受試對象中線粒體膜電位的方法，所述方法包括以下步驟(i)將發(fā)明第一方面所述的成像探針給予受試對象；(ii)探針的可視化；和(iii)推導(dǎo)線粒體膜電位的絕對值或相對值。通過分析線粒體膜電位，可以例如將腫瘤可視化、研究線粒體損傷、診斷/監(jiān)測涉及受試對象中線粒體供能改變的病態(tài)，或者用于考察測試化合物對線粒體電位的影響。本發(fā)明第三方面提供了發(fā)明第一方面的成像探針，其用于(i)分析線粒體膜電位的方法；(ii)受試對象體內(nèi)腫瘤可視化的方法；(iii)考察受試對象中線粒體損傷的方法；(iv)診斷和/或監(jiān)測受試對象體內(nèi)病理學(xué)的方法；或(V)考察測試化合物對線粒體電位的影響的方法。發(fā)明第四方面提供了包含親脂陽離子和疏水部分的前體分子，所述前體分子可以與陰離子形式的PET核反應(yīng)，產(chǎn)生發(fā)明第一方面所述的成像探針。所述前體分子可以包含能夠與PET核的陰離子形式反應(yīng)的甲磺酸根基團(tuán)。例如，前體分子可以是甲磺酸烷基三苯基 磷翁化合物，能夠與18Γ反應(yīng)形成18Γ氟代烷基TPP。本發(fā)明第五方面提供了制備發(fā)明第一方面所述成像探針的方法，所述方法包括將陰離子形式的PET核與發(fā)明第四方面所述前體分子反應(yīng)的步驟。本發(fā)明還提供了制備發(fā)明第一方面所述成像探針并將其給予受試對象的方法，所述方法包括以下步驟⑴合成PET核的陰離子形式，比如18F_(ii)將所述PET核的陰離子形式引入發(fā)明第四方面所述前體分子產(chǎn)生成像探針；(iii)將成像探針給予受試對象。本發(fā)明還提供了 (i)提高包含三苯基磷tf! (TPP)陽離子的成像探針攝入的方法，所述方法包括增加成像探針的疏水性的步驟；和(ii)提高包含三苯基磷爾(TPP)陽離子的成像探針的組織循環(huán)比的方法，所述方法包括增加成像探針的疏水性的步驟。成像探針的疏水性可以通過例如引入含有至少5個碳原子的烷基鏈來提高。發(fā)明詳述IH電子發(fā)射斷層成像術(shù)(PET)正電子發(fā)射斷層成像術(shù)(PET)是一種核醫(yī)學(xué)成像技術(shù)，其產(chǎn)生體內(nèi)功能過程的三維圖像或照片。系統(tǒng)檢測由能夠發(fā)射正電子的放射性核素(示蹤物)間接發(fā)射的Y射線對，其中所述放射性核素由生物活性分子引入身體。然后通過計(jì)算機(jī)分析可以重構(gòu)出體內(nèi)的示蹤物三維空間濃度圖像。在現(xiàn)代掃描儀中，這一重構(gòu)過程常常借助在同一機(jī)器內(nèi)同一操作過程中對患者進(jìn)行的CTX射線掃描來實(shí)現(xiàn)。 葡萄糖類似物氟-18 (F-18)氟去氧葡萄糖(FDG)是臨床腫瘤學(xué)上給PET廣泛使用的生物活性分子。這種示蹤劑被利用葡萄糖的細(xì)胞攝取，并被己糖激酶磷酸化，然后成像的示蹤劑濃度可以給出就局部葡萄糖攝入來說的組織代謝活性。為了給線粒體和/或線粒體膜電位變化成像，有可能使用親脂性陽離子，這些親脂性陽離子由于負(fù)的內(nèi)膜電位(-120到-170mV)會在線粒體中累積。這類親脂性陽離子包括羅丹明-123(Rhl23)和四苯基磷锫鹽。文中使用的術(shù)語“正電子發(fā)射斷層成像術(shù)(PET)探針”或“成像探針”意味著適合在正電子發(fā)射斷層成像術(shù)、SPECT或任何其他成像技術(shù)中使用的分子，這些分子可以通過例如注射給予患者，并在目標(biāo)組織中累積。然后利用PET掃描和成像術(shù)、SPECT或另一種類型的成像技術(shù)可以推導(dǎo)探針的位置和局部濃度。靶向線粒體的成像探針選擇性地在線粒體中累積，可能是由于線粒體膜的高電位。探針的攝入可能是八屯^衣賴性的，因此探針可以提供關(guān)于線粒體供能狀態(tài)的信息。本發(fā)明的探針?biāo)哂械捏w內(nèi)分布特性可能一定程度上取決于線粒體的完整性。本發(fā)明的探針可以用于給線粒體表面電位(Λ Ψπ)變動成像、給含有功能障礙的線粒體的細(xì)胞或組織成像，以及在與功能障礙線粒體有關(guān)的疾病或狀況的成像或監(jiān)測中使用。本發(fā)明的成像探針包含親脂陽離子、疏水部分和PET核。單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層成像術(shù)(SPECT)單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層成像術(shù)(SPECT)是一種利用Y射線的核醫(yī)學(xué)斷層成像技術(shù)。它與利用Y照相機(jī)的傳統(tǒng)核醫(yī)學(xué)平面顯像非常類似，但能夠提供真正的3D信息。該信息通常是呈現(xiàn)為沿患者的橫斷面，但根據(jù)需要可以自由地重新格式化或操作。
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基本的技術(shù)需要向患者血流中注射能夠發(fā)射Y射線的放射性同位素(又稱為放射性核素)。這可能涉及將放射性同位素標(biāo)記物附著到配體上，后者具有所希望的與某些類型的組織的化學(xué)結(jié)合特性。這種聯(lián)姻使得配體和放射性同位素的組合(放射性藥物)能夠被攜帶到體內(nèi)的目標(biāo)部位并與之結(jié)合，然后(由于同位素發(fā)射的Y射線)可以通過Y照相機(jī)看到配體濃度。親脂性陽離子本發(fā)明所述探針的親脂性陽離子部分可以是由于線粒體膜的高電位而在線粒體中累積的任何陽離子。所述陽離子可能帶有的離域正電荷促使它-依賴性地在線粒體中累積和穿過磷脂雙層。這類陽離子的例子包括羅丹明-123和磷If陽離子、三苯基和四苯基磷鑛■衍生物、砷衍生物、帶有疏水基團(tuán)的季銨(例如四芐基銨)，和帶有離域正電荷與羅丹明相似的疏水性芳香族系統(tǒng)。幾種標(biāo)記的磷翁陽離子，比如[11C]甲基三苯基磷鐙、223_[18F]氟丙基和4-[18F]氟節(jié)三芳基磷狂i (fluorobenzyltriarylphosphonium)曾被用做線粒體革巴向劑。親脂性陽離子可以是三苯基磷鋃，當(dāng)它與疏水部分(見下文)連接時產(chǎn)生親脂性烷基三苯基磷-翁陽離子。疏水部分疏水部分與陽離子通過例如共價鍵相連時，會提高陽離子的整體疏水性。包含疏水部分的成像探針的辛醇/PBS分配系數(shù)是至少50、100、250、500、750或1000。甲基TPP和癸基TPP的分配系數(shù)分別是O. 35和5000，其中數(shù)字越大反映出疏水性越高。氟代i^一烷基的數(shù)值是740。疏水部分可以是例如脂肪鏈。所述脂肪鏈可能包含至少2個碳原子，例如5-20、8-15或10-12個碳原子。脂肪鏈可能含有10或11個碳原子。
疏水部分可以包含烷基鏈，可以基本或者完全是線性烷基鏈，或者包含某些支鏈。鏈可以包含位于內(nèi)部和/或末端的一或多個雜原子(例如O、S、N、P)。此外疏水部分可以含有不飽和的(烯基、炔基、芳香基、雜芳基)成分和/或可能含有插入的一或多個芳香環(huán)。疏水部分可以與親脂陽離子共價連接。當(dāng)親脂性陽離子是三苯基磷锫(TPP)時，疏水部分可能象圖1中顯示的與中間的磷離子連接。不希望被理論限制，本申請人相信與包含疏水部分的成像探針相關(guān)的增加的攝入是由于探針能更迅速地穿透細(xì)胞質(zhì)膜，以及疏水部分對線粒體內(nèi)膜中面向基質(zhì)的表面的吸附增加。PET 核可以在本發(fā)明的探針中使用的非放射性元素和它們的相對物包括F-19(F_18)、C-12 (C-1l)、1-127 (1-125、1 — 124、1 — 131 和 1 — 123)、CI_36(CI_32、CI—33、CI—34)、Br-80 (Br-74、Br_75、Br_76、Br_77、Br_78)、Re-185/187 (Re-186, Re-188), Υ_89(Υ_90、Y-86)、Lu-177 和 Sm-153。替代地，本發(fā)明的探針可以標(biāo)記有一或多個放射性同位素，比如nC、18F、76Br、1231、1241、1311、13N 或 150。PET掃描中使用的放射性核素一般是半衰期較短的同位素，比如碳-11Γ20分鐘)、氮-13 Γ10分鐘)、氧-15 Γ2分鐘)和氟-18 CllO分鐘)。PET核可以包含18F。術(shù)語“PET核”是指可以在PET、SPECT或其他成像過程中使用的非放射性元素或放射性核素。

PET核可以附著到，例如共價連接到親脂性陽離子和/或疏水部分上。例如疏水部分可以作為親脂性陽離子和PET核之間的連接物。探針可以是18F-氟代i^一烷基TPP。使用方法本發(fā)明還提供了分析受試對象體內(nèi)線粒體膜電位的方法，所述方法包括以下步驟(i)將本發(fā)明所述的成像探針給予受試對象；(ii)探針的可視化；和(iii)推導(dǎo)線粒體膜電位。用于檢測和監(jiān)控成像劑的成像裝置包括諸如Y照相機(jī)、PET裝置和SPECT裝置的成像技術(shù)。線粒體膜電位的分析可以用于例如診斷和/或監(jiān)測與受試對象體內(nèi)線粒體供能改變有關(guān)的病態(tài)。線粒體膜電位的分析可以用于例如腫瘤可視化的方法或者考察受試對象體內(nèi)線粒體損傷的方法。探針可以通過本領(lǐng)域已知的任何合適的技術(shù)給予，比如直接注射。注射可以是靜脈注射(IV)。給藥可以是全身的或者在目標(biāo)部位局部，比如腫瘤。探針可以與例如能夠顯現(xiàn)特定組織或腫瘤的另一種探針聯(lián)用。兩種(或更多種)探針可以一起給予，獨(dú)立給予或者順序給予。
本發(fā)明的成像探針可以用于診斷、評估或監(jiān)測疾病或狀況的進(jìn)展或治療情況。本發(fā)明的成像探針可以用于研究測試化合物對線粒體供能的影響。例如，可以將成像探針與測試化合物一起給藥，并利用本發(fā)明的方法體內(nèi)實(shí)時分析測試化合物對線粒體供能的效果。疾病所述疾病或狀況可以以線粒體供能的改變?yōu)樘卣?。例如，線粒體供能的改變(更高或更低的線粒體膜電位)可以是疾病的一個癥狀，或者是疾病的誘因或者誘因之一。致病性線粒體供能狀態(tài)在治療后的完全或部分逆轉(zhuǎn)可指示治療效果。線粒體的氧化損傷促成多種病態(tài)，因?yàn)榫€粒體是活性氧的來源而且容易受到氧化損傷。多種疾病和狀況與線粒體功能障礙有關(guān)，包括各種癌癥、糖尿病、心臟衰竭、心血管和肝臟疾病、AIDS、退行性疾病、自身免疫紊亂、衰老和其他肌病。本發(fā)明提供了能夠被線粒體攝取的探針，并且所述攝取與八屯 1成比例。這使得能夠?qū)δ墚惓５木€粒體(例如活性受到抑制或者加強(qiáng)的線粒體)進(jìn)行檢測和成像。腫瘤往往有更高的線粒體膜電位，而組織損傷區(qū)域可能有較低的△ Ψπ。狀況和/或其治療可能通過增加或減少的細(xì)胞凋亡來表征，而細(xì)胞凋亡即可利用本發(fā)明的成像探針進(jìn)行監(jiān)測。線粒體膜電位的喪失是由促凋亡劑引起的細(xì)胞死亡中的一個早期事件。線粒體控制的細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是心臟衰竭中細(xì)胞損傷的內(nèi)在原因。發(fā)明的成像方法還可以用于對延緩或破壞癌癥和其他惡性腫瘤中使用的化療或放療方案的效果進(jìn)行評估。 本發(fā)明的成像方法可以用于癌癥的診斷或評估，例如肺癌、乳腺癌或前列腺癌。已有證據(jù)顯示癌細(xì)胞中的線粒體跨膜電位比正常上皮細(xì)胞中的明顯高。例如，CX-1結(jié)腸癌細(xì)胞系和對照綠猴上皮細(xì)胞系CV-1之間的Λ Ψπι差別約為60mV (在腫瘤細(xì)胞中的163mV vs.正常細(xì)胞中的104mV)。等試對象受試對象可以是人或動物受試對象。受試對象可以是健康受試對象，或者是患有某疾病或者有染上某疾病風(fēng)險(xiǎn)的受試對象。具體來說，受試對象可能患有或者有染上前面章節(jié)提及的疾病或狀況之一的風(fēng)險(xiǎn)。受試對象可能正接受針對所述疾病的治療。本發(fā)明的成像探針可以用于考察與疾病或狀況的進(jìn)展或緩解有關(guān)的線粒體供能的改變。受試對象可以是實(shí)驗(yàn)動物，特別是以上章節(jié)提及的疾病或狀況之一的動物模型。探針合成PET核，例如18F,可以被引入成像探針的前體形式，所述前體形式能夠接受或者經(jīng)調(diào)適接受PET核。例如，可以通過本領(lǐng)域已知方法在回旋加速器中合成18F。合成后，18F通常處于F-形式，考慮到它110分鐘的半衰期，需要迅速并入成像探針、純化和給予受試對象。本發(fā)明還提供了經(jīng)調(diào)適能夠接受PET核的前體分子。例如本發(fā)明提供了包含親脂陽離子和疏水部分的前體分子，能夠與PET核的陰離子形式反應(yīng)產(chǎn)生本發(fā)明所述的成像探針。前體分子可以例如包含容易發(fā)生親核取代的離去基團(tuán)。例如，前體分子可能包含能夠與PET核陰離子形式反應(yīng)的甲磺酸、甲苯磺酸、間硝基苯磺酸、三氟甲磺酸或碘基團(tuán)。前體可以是能夠與18f_反應(yīng)形成18f_氟代烷基TPP的甲磺酸烷基三苯基磷4參化合物。圖8顯示了甲磺酸i^一烷基TPP前體與18F_p反應(yīng)形成18F-1^一烷基TPP的反應(yīng)。本發(fā)明還提供了制備成像探針的方法，所述方法包括將PET核的陰離子形式與這類前體分子反應(yīng)的步驟。這提供了生產(chǎn)成像探針的方便的一步完成法。本發(fā)明還提供了生成發(fā)明所述成像探針并給予受試對象的方法，所述方法包括以下步驟⑴在例如回旋加速器中合成18F_ ；(ii)將18Γ并入前體分子產(chǎn)生成像探針；(ill)任選地純化成像探針；和(iv)將任選純化過的成像探針給予受試對象。探針應(yīng)當(dāng)在合成后盡可能早地給予受試對象。提筒攝入和從循環(huán)系統(tǒng)的清除本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在靶向線粒體的成像探針中包含一個疏水部分可以提高它被攝入組織中以及從循環(huán)系統(tǒng)清除的程 度。攝入量相對背景循環(huán)更高導(dǎo)致更高的組織/循環(huán)比。這極大地增加了這些探針在檢測和顯現(xiàn)體內(nèi)線粒體供能改變中的靈敏度。本發(fā)明因此提供了提高包含三苯基磷锫(TPP)陽離子的成像探針攝入量的方法，所述方法包括增加成像探針的疏水性的步驟。與缺少疏水部分的相應(yīng)化合物的攝入情況相比，攝入的速率和/或含量可以提高5-50、10-40 或者 20-30 倍。特別是某些組織，比如腎、肌肉、心臟和脂肪中的攝入會提高。攝入的差別可以在例如給藥后I小時到5小時后測量。本發(fā)明還提供了提高包含三苯基磷(TPP)陽離子的成像探針的組織循環(huán)比的方法，所述方法包括增加成像探針的疏水性的步驟。組織循環(huán)比可以通過將組織(例如腎、肝、肌肉或心臟)中的化合物濃度和循環(huán)系統(tǒng)(例如血液)中的化合物濃度進(jìn)行比較來獲得。成像探針從循環(huán)系統(tǒng)的清除與缺少疏水部分的相應(yīng)成像探針比較提高了 5-50、
10-40或20-30倍。與缺少疏水部分的相應(yīng)化合物相比，組織/循環(huán)比要高至少50-、80_或100-倍。含有疏水部分的成像探針的例子是18F-氟代i^一烷基TPP，相應(yīng)的缺少疏水部分的成像探針是18F-TPP或18F-TPMP。由于PET核不可能影響探針的攝入或清除，PET可以與缺少疏水部分和PET核(例如TPP或TPMP)的相應(yīng)分子比較。因此，通過引入三苯基磷f貧親脂陽離子或者增加其烷基側(cè)鏈的長度(比如具有至少5個,例如8-15個碳原子)可以提高疏水性。疏水性還可以通過給三苯基磷彳泣部分上的烷基基團(tuán)添加側(cè)鏈、在鏈中加入芳香基團(tuán)以及給苯環(huán)添加側(cè)基來提高。以下通過實(shí)施例對發(fā)明做進(jìn)一步描述，所述實(shí)施例是為了協(xié)助本領(lǐng)域普通技術(shù)人員實(shí)施發(fā)明，并非限制發(fā)明的范圍。實(shí)施例實(shí)施例1 -考察iv(靜脈內(nèi))注射后，靶向線粒體的烷基TPP化合物的器官分布動力學(xué)為了確定烷基TPP化合物在體內(nèi)分布的速度有多快，iv注射后首先評估靶向線粒體的抗氧化劑MitoQ的攝入(圖2)。為此，將IOOnmol [3HjMitoQ大丸藥經(jīng)尾靜脈注射給予小鼠，并測量接下來的48小時內(nèi)各個器官中的[3H]MitoQ的量(圖2)。注射I小時后測量到肝和腎有大量MitoQ攝入(圖2A)。此時，心臟的攝入沒有如此大量，肌肉和脂肪組織攝入更低，腦只有非常少的攝入(圖2B)。MitoQ的這種迅速被器官攝取的情況通過它很快從血液中消失可以反映出來(圖3A)。然后組織中累積的[3H]MitoQ逐漸消失，對于肝臟半衰期為 2小時，腎I小時，心臟 15小時。48小時內(nèi)被給予的放射性就幾乎完全從這些組織中清除，這與其他研究中發(fā)現(xiàn)的iv注射后24小時 80%MitoQ被清除的情況一致。為了評估[3H]MitoQ到組織的最初攝入情況，重點(diǎn)研究了注射后第一個小時內(nèi)它的組織分布(圖2C和D)。這顯示了 MitoQ非常迅速地被攝入組織，在注射后能夠測量到的最早時間(5分鐘)達(dá)到最大值。這些數(shù)據(jù)共同顯示MitoQ被迅速從血液中攝入多數(shù)器官，但不同器官攝取的程度有顯著差異。為了了解MitoQ從循環(huán)系統(tǒng)迅速攝入器官是否是所有烷基TPP陽離子的一般特性，還是MitoQ所特有的，接下來評估了三種烷基TPP陽離子，即[3H]癸基TPP、[3H]氟代i^一烷基TPP和[3扣了 1^，在“注射后的器官分布。這些化合物的疏水性涵蓋從比較親水的[3H]TPMP (辛醇/PBS分配系數(shù)O. 35)到疏水的[3H]癸基TPP和[3H]氟代i^一烷基TPP (辛醇/PBS分配系數(shù)分別為5000和740±100)。48小時內(nèi)[3H]癸基TPP的組織分布如圖4A和B所示，[3H] 氟代i^一烷基TPP在5小時內(nèi)的如圖4C所示。它們的攝入特性與MitoQ類似，兩種化合物都是迅速被攝入肝、腎和心臟，然后從肝和腎中消失，半衰期小時。與MitoQ —樣，從心臟的消失稍慢，對[3H]癸基TPP和[3H]氟代i^一烷基TPP的半衰期分別為 15小時和 21小時。[3H]癸基TPP和[3H]氟代i^一烷基TPP從血液的清除(圖3B)與[3H]MitoQ(圖3A)在性質(zhì)上類似，但它們的血液濃度更低。測量了 iv注射后5小時內(nèi)[3H] TPMP的器官分布(圖5A、B)。[3H] TPMP的分布與MitoQ、癸基TPP和氟代i^一烷基TPP的在性質(zhì)上類似，迅速被攝入肝、心臟、腎和脂肪。但TPMP攝入的程度比MitoQ、癸基TPP和氟代i^一烷基TPP普遍要低，除了腦。[3H] TPMP從肝和腎清除的半衰期分別是 3小時和 2小時，與其他TPP化合物類似。但是，TPMP從心臟清除的半衰期是 2h，比其他烷基TPP化合物的顯著更短。[3H] TPMP從血液的清除與更疏水的烷基TPP化合物性質(zhì)類似，但血液中剩余的[3H]TPMP濃度更高一些(圖3C)。比較[3H]TPMP和其他烷基TPP化合物從其余組織的清除半衰期從技術(shù)上很困難，因?yàn)楸粩z取的化合物的量低，但對于脂肪和肌肉，TPMP的清除半衰期估計(jì)在 1-2小時，而癸基TPP和氟代i^一烷基TPP的是顯著更長的 7-12小時。這些試驗(yàn)一起展示了所有烷基TPP化合物被廣泛迅速地從血液中攝入器官。實(shí)施例2-烷基TPP化合物隨時間攝入器官程度的比較圖2、4和5中的數(shù)據(jù)顯示，接受評估的四種TPP化合物的器官分布性質(zhì)類似。但是，化合物攝入不同器官的程度存在顯著的量的差別。為了評估這些差別，我們制作了 iv注射后15分鐘、I小時和5小時四種TPP化合物的組織含量(圖6A、C、E)。因?yàn)楸粩z入肌肉、脂肪和腦的量比其他器官的低，這些數(shù)據(jù)在每個小圖中呈現(xiàn)為放大的插入項(xiàng)。這項(xiàng)分析顯示對于腎、心臟和肌肉，攝入程度的順序是癸基TPP、氟代i^一烷基TPP>MitoQ>TPMP，并且差別在注射后1-5小時最明顯。這些差別的幅度很大，例如注射后I小時癸基TPP、MitoQ和TPMP攝入心臟的比率是17:6:1，到5小時，該比率是32:10:1。MitoQ、癸基TPP和氟代十一烷基TPP的器官分布與攝入有類似順序腎〉肝〉心臟 > 肌肉，脂肪〉腦。TPMP的器官分布與其他三種更疏水的化合物的器官分布大體類似，不同的是，該化合物的肝攝入比腎攝入更高，而且更多地被攝入腦。烷基TPP化合物由于細(xì)胞質(zhì)和線粒體膜電位而累積到組織中，如Nernst等式所述。因此，化合物在組織的線粒體中的濃度由線粒體和細(xì)胞質(zhì)膜電位以及循環(huán)系統(tǒng)中化合物的濃度決定。因?yàn)閷τ诒疚膱?bào)道的所有試驗(yàn)這些膜電位都是類似的，化合物攝入組織的程度的主要決定因素是它在血液中的濃度。為了修正這個因素造成的器官攝入的偏差，我們還測定了化合物在器官中的濃度與它在循環(huán)系統(tǒng)中的濃度的比率，這些數(shù)據(jù)顯示的是在iv注射后15分鐘、I小時和5小時當(dāng)時的情況(圖6B、D和F)。這些數(shù)據(jù)驗(yàn)證了圖6A、C和E的發(fā)現(xiàn)，證實(shí)攝入程度的順序是癸基TPP、氟代i^一烷基TPP>MitoQ>TPMP。例如，對于癸基TPP、MitoQ和TPMP，注射后I小時的心/血比率是109:11:1，到5小時該比率是248:26:1。一個例外是雖然MitoQ和TPMP的肝/血比率類似，但癸基TPP和氟代i^一烷基TPP的明顯更高。此外，所有四種化合物的腦/血比率差別很小，說明圖6A、C和E中看到的TPMP的明顯更高的攝入可能是由于它存在于被截留的血液中，而不是在腦本身中。圖6中的數(shù)據(jù)共同表明所有四種化合物的器官分布性質(zhì)上類似。癸基TPP和氟代十一烷基TPP的攝取程度顯著高于MitoQ，而MitoQ的攝入又比TPMP保持大得多的程度。實(shí)施例3-烷基TPP化合物的體內(nèi)線粒體攝入實(shí)施例1和2的結(jié)果顯示烷基TPP化合物在體內(nèi)被迅速攝入器官。TPP化合物被攝取到線粒體和細(xì)胞中經(jīng)證實(shí)是由于線粒體和細(xì)胞質(zhì)膜電位所致，其中累積的化合物多數(shù)位于線粒體內(nèi)。因此有可能烷基TPP化合物一旦在組織中累積，受膜電位驅(qū)使，它們會主要定位在線粒體內(nèi)。為了驗(yàn)證試驗(yàn)中確實(shí)是這種情況，接下來確定通過降低線粒體膜電位是否能減少烷基TPP化合物的 體內(nèi)攝取。為了這個目的，將[3H]氟代i^一烷基TPP經(jīng)iv注射給小鼠，15分鐘后再給小鼠注射不同劑量的線粒體解偶聯(lián)劑2，4-二硝基苯酚(DNP)或者載體鹽水(saline carrier)，再過15分鐘測量器官累積[3H]氟代i^一烷基TPP的程度(圖7A)。所用的DNP的量被證實(shí)能夠?qū)е麦w內(nèi)線粒體的部分解偶聯(lián)而沒有毒性。我們的試驗(yàn)顯示，DNP以劑量依賴的方式將器官對[3H]氟代十一烷基TPP的攝入降低最多達(dá)40%(圖7A)。這些發(fā)現(xiàn)與體內(nèi)器官中烷基TPP化合物的攝取程度由線粒體膜電位決定是一致的。要直接展示烷基TPP化合物在體內(nèi)線粒體中的定位在技術(shù)上有困難，因?yàn)榫€粒體分離所需的組織勻漿會使它們迅速地重新分布。以前為了克服這個問題，曾使用修飾過的烷基TPP化合物4-碘丁基TPP (IBTP)和10-碘癸基TPP (IDTP)。這些化合物和其他烷基TPP化合物以相同的方式累積在線粒體中，但一旦進(jìn)入線粒體基質(zhì)，碘部分即被線粒體巰基蛋白代替形成穩(wěn)定的硫醚加合物，后者可以利用抗TPP部分的抗體來顯現(xiàn)。因?yàn)镮BTP和IDTP與蛋白巰基的反應(yīng)速率較低，將該法延伸到制備與更具巰基活性的碘代乙酰胺(IAM)部分附著的TPP化合物(IAM-TPP;圖7B)。其意圖是，該分子應(yīng)當(dāng)被線粒體累積，并在這里標(biāo)記線粒體巰基蛋白，有了 IAM部分的增強(qiáng)的巰基活性，有利于IAM-TPP在被從器官清除前，在體內(nèi)與線粒體蛋白巰基進(jìn)行反應(yīng)(圖7B)。在與分離的線粒體溫育時，IAM-TPP迅速與蛋白巰基反應(yīng)，可以利用抗TPP抗體檢測，如先前針對IBTP所示(數(shù)據(jù)未顯示)。IAM-TPP與細(xì)胞的溫育及隨后通過免疫細(xì)胞化學(xué)進(jìn)行的分析顯示解偶聯(lián)劑敏感型IAM-TPP定位在線粒體內(nèi)(圖7C)，證實(shí)IAM-TPP使線粒體蛋白被標(biāo)記。然后經(jīng)iv注射給予小鼠大劑量IAM-TPP，并在I小時后從心臟和肝分離線粒體。利用針對TPP部分的選擇性抗血清對這些線粒體組分進(jìn)行的Western印跡顯示了 IAM-TPP對心臟和肝線粒體蛋白的標(biāo)記(圖7D)。這些數(shù)據(jù)綜合表明，iv注射后，烷基TPP化合物受到線粒體膜電位的驅(qū)使迅速被組織內(nèi)的線粒體攝取。因此，烷基TPP化合物已被證實(shí)在iv給藥后5分鐘內(nèi)被體內(nèi)多種器官積累，從而給組織提供治療有效量的化合物。這種組織攝取是由于化合物以膜電位依賴性方式累積到線粒體中。該項(xiàng)研究中的有趣發(fā)現(xiàn)是，癸基TPP和氟代i^一烷基TPP化合物相比于TPMP而言被攝入組織的量大得多。這是由于線粒體內(nèi)膜的面向基質(zhì)表面對更長鏈的烷基TPP陽離子有更大的吸收。重要的是，通過改變側(cè)鏈可以大大地(10-30倍)加強(qiáng)TPP陽離子的攝入程度。除了提高烷基TPP化合物在器官內(nèi)的絕對水平，將烷基側(cè)鏈修飾為氟代i^一烷基或癸基部分能大大提高烷基TPP化合物的器官/血液濃度比率，比TPMP提高100倍以上。這一特性對于為了評估與癌癥和細(xì)胞死亡相關(guān)的線粒體極性變化而設(shè)計(jì)更有效的用于評估線粒體體內(nèi)功能的PET探針是有用的。這里給出的數(shù)據(jù)表明，與TPMP類似，基于長鏈、疏水性烷基TPP陽離子的PET探針比目前開發(fā)作為PET探針的烷基TPP陽離子有明顯更好的
組織加載和反差特性(contrast properties)。這方面來說，由氟代^--燒基TPP獲得的數(shù)
據(jù)特別有趣，因?yàn)?9F原子可以容 易地被PET-活性18F替代，且氟代十一烷基TPP的攝入對體內(nèi)線粒體極化的不同程度產(chǎn)生應(yīng)答。實(shí)施例4 -用18F-十一烷基TPP在動物模型中顯現(xiàn)腫瘤和線粒體損傷使用了其中移植有各種大小腫瘤的免疫缺陷型小鼠模型。然后將18F-十一烷基TPP給予小鼠，利用PET顯現(xiàn)腫瘤。還使用了心臟或腎缺血再灌注模型來顯示，18F-十一烷基TPP可以用于顯現(xiàn)組織內(nèi)有可視的損傷的線粒體。最后，利用血腦屏障損傷模型研究了本發(fā)明的探針在所述損傷后是否被腦攝取，從而指示血腦屏障是否受到損害。材料與方法化學(xué)合成鵬化[3H]TPMP(60Ci/mmol)來自American Radiolabeled Chemicals。合成[3H]MitoQ和[3H]癸基TPP制品并HPLC純化至>97%放射性純度。為了合成甲磺酸11_氟i 燒基三苯基磷鎦I (氟代i 燒基TPP),將11-溴^ 醇(752. lmg, 2. 99mmol)、氟化四丁基按(2. 34g 7. 21mmol)和！120(162 4 1^)的混合物置于 Kimax 管(15mm x 150mm)中。氬氣吹洗下用螺旋蓋密封，80° C攪拌I小時。允許反應(yīng)稍微冷卻，萃取至戊烷(25mL)中。有機(jī)層用H20(30mL)洗三次，用MgSO4干燥，過濾并在真空中濃縮，產(chǎn)生淺棕色油狀的含有 Tl 由-CH2F (4. 5) Vs=CH2 (4. 9-5)共振態(tài)的 1H NMR 積分(integration)的 11_ 氣十一 _1_ 稀(f luoroundec-1-ene)的 11-氣 _1-十一醇(416mg,2. 1 QmmoI ,73%)。1HMMR 4. 46 (2H, d, t J=47. 3，6. 2Hz, -CH2F)，3. 66 (2H, t, J=6. 2Hz, -CH2OH)，1. 2-
1.8(18H，m)ppm。19F NMR-218. 5(t, t J=47. 5，24. 6Hz)ppm。將粗制 11-氟-1- -j--醇
(333mg,1. 75mmol)、三乙胺(351mg, 3. 47mmo1, 484 μ L, 2equiv.)溶于無水 CH2Cl2(IOmL)的溶液于 10° C攪拌10分鐘。然后在保持溫度〈10° C情況下，加入溶于無水CH2Cl2 (ImL)中的甲基磺酰氯(230mg，2.02mmol，156μυ溶液。加畢后，允許反應(yīng)物暖至RT并攪拌2小時。通過用CH2Cl2 (25mL)稀釋來逐漸完成反應(yīng)，用H2O (12. 5mL)、l%NaHC03水溶液(12. 5mL)、飽和NaCl水溶液(12. 5mL)洗滌有機(jī)層，用MgSO4干燥，過濾并真空中濃縮產(chǎn)生淺棕色油狀物(444mg)。粗產(chǎn)物經(jīng)柱層析純化，柱子是用5%醚/石油醚在硅膠60A 40-63 μ m (20g)上制備。用20%醚/石油醚洗脫純產(chǎn)品，真空濃縮得到透明油狀
11-氟十一烷基甲磺酸酯(279. 5mg 59%)。1HNMR 4. 43 (2H, d, t J=47. 4，6. 2Hz, -CH2F)、
4.22 (2H, t, J=6. 6Hz, -CH2O)、3· 00 (3H, s, CH3SO2)、1. 6_1· 8 (4H, m)、1. 2_1· 4 (14Η, m) ppm。19FNMR-218. 4 (t, tj=47. 4，24. 9Hz)ppm。質(zhì)譜發(fā)現(xiàn):291. 1406。C12H25FO3S2Na 需要:291. 1401。將純化的11-氟4 燒基甲磺酸酯(279. 5mg,1. 041mmol)和三苯基膦(582mg, 2. 21mmol)合并到帶有磁力攪拌條的IOmm X 100mm Kimax管中，気氣吹洗并用螺旋蓋密封。給反應(yīng)加熱，并于90° C攪拌4天。然后將反應(yīng)產(chǎn)物溶解在最小量的CH2Cl2中，真空中濃縮產(chǎn)生粗油(0.842g)。粗產(chǎn)品再次溶于最小量的CH2Cl2ClmL)中，用醚r50mL)沉淀之。冰浴中靜置沉淀物，棄去透明液體。重復(fù)該溶解/沉淀過程，產(chǎn)生微濁粘性油狀的11-氟十一烷基三苯基磷潘甲磺酸(407.1mg 74%)。1H NMR: 7. 69-7. 81 (15H, m)，4. 41 (2H, d, t J=47. 4，6. 2Hz, -CH2F)，3. 6 (2H, m, -CH2P)，2. 73 (3H, s, CH3SO2)，1. 5-1. 8 (6H, m)，1. 2-1. 4 (12H, m) ppm。31PNMR:24. 78ppm。19F NMR:-218. 4 (t, t J=47. 4，24. 9Hz)ppm。MS 發(fā)現(xiàn):435. 2627，C29H37FP+ 需要:435.261。

為了合成甲磺酸[3H]氟代1--烷基 TPP ([3H] FluoroUndecylTPP
mesylate),將11-氟^ 燒基甲磺酸鹽(6. 8mg, 25. 3 μ mol)和[3H]三苯基膦(3. 2mg, 12. 2 μ mol, 372 μ Ci)合并到帶有磁力攪拌條的500 μ L微量反應(yīng)管中，氬氣吹洗并用螺旋蓋密封。將反應(yīng)加熱并于90° C攪拌4天。然后將反應(yīng)產(chǎn)物溶解在CH2Cl2GOyL)中，并加至帶蓋離心管內(nèi)的二乙醚(2mL)中。懸浮物以 160Xg離心10分鐘，棄去溶劑。將殘留物溶于加至乙醚(2mL)的CH2Cl2(40yL)中，進(jìn)行如上所述離心。棄去溶劑得到油狀產(chǎn)物(196 μ Ci) ο在1:9甲醇/CH2Cl2中的硅膠上進(jìn)行的TLC顯示99%的放射活性位于Rf
O.2-0. 5 之間。為了合成甲磺酸[5-(2-碘-乙酰氨基-戊基]-三苯基磷鉞(IAM-TPP)，將0° C的溴化 5-氨基戍基三苯基憐措(5-aminopenty I tripheny lphosphonium bromide hydrogenbromide) (0. 050g, 0. 098mmol)的 CH2Cl2(IOmL)溶液加入三乙胺(15mL, 0. 108mmo1)，溶液攪拌5分鐘。將溶液冷卻至-78° C(丙酮/干冰)，一次加入固體碘乙酸P-硝基苯酯(0. 030g，0. 098mmol)。將溶液攪拌20分鐘，在-78° C真空除去溶劑。將殘余物溶于丙酮(3mL)，然后加入碘化鈉(IOOmg)，室溫下攪拌溶液2小時。然后真空下除去溶劑，所得固體物重新溶解在CH2Cl2 (5mL)中，用蒸餾水和10%甲磺酸鈉水溶液順序洗滌。真空下將有機(jī)組分的體積減小(ImL)并加到二乙醚(20mL)中使之沉淀。將該溶解/沉淀過程重復(fù)兩次，以除去所有殘余的P-硝基苯酚。將最終的固體物溶解在水中，凍干產(chǎn)生黃色大體積固體O.0465g (78%) o 質(zhì)譜(高分辨率+ve)-發(fā)現(xiàn) 516. 0938，C25H28INOP+需要 516. 0948。1H NMR(CD3OD)1. 5-1. 8 (m, 6H)，2. 69 (s, 3H)，3. 16 (m, 2H)，3. 39-3. 50 (m, 2H)，3. 67 (s, 2H)，7. 70-7.95 (m, 15H) ppm。13C NMR (CD3OD)-1. 8，22. 7 (d, J=49Hz)，23.1 (d, J=2Hz)，28. 5 (d, J=17Hz)，29 2，39. 5，40.1, 119. 9 (d, J=87Hz), 131. 5 (d, J=13Hz)，134. 8 (d, J=IOHz)，136. 3 (d, J=3Hz)，I71.4ppm。31P NMR(CD3OD) - 24. 8ppm。已發(fā)表的辛-1-醇的分配系數(shù)是TPMP，O. 35 ；MitoQ, 2760 ;癸基TPP, 5000。本項(xiàng)研究中確認(rèn)氟代i^一烷基TPP(740±100)和IAM-TPP(19±1)的辛_1_醇分配系數(shù)與前述相同。將化合物給予小鼠雌性C57/BL6小鼠(20_25g)培養(yǎng)在12小時的光/暗周期下，可隨意攝取標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室食物和水。至8-10周齡時，將小鼠置于約束管中，經(jīng)尾靜脈iv注射溶于補(bǔ)充有10%DMS0的100 μ L無菌磷酸緩沖液(PBS)中的IOOnmol [3H]化合物r400_500nCi)。保留一份注射用的[3H]化合物溶液樣品以便計(jì)算比活，然后用于確定化合物的組織含量。在注射后的指定時間點(diǎn)，通過頸椎脫位處死小鼠，經(jīng)心臟穿刺獲得 100-200μ L血樣。然后取出器官，除凈血液，轉(zhuǎn)移到冰上預(yù)冷過的Eppendorf管中，稱量并保存在-80° C待處理。采集的組織是心臟、腎、肝、腦、骨骼肌(腓腸肌)和白色脂肪組織(皮下的)。注射這種用量的MitoQ和其他TPP陽離子在以前顯示是無毒的，在這里也是。注射后對小鼠進(jìn)行監(jiān)測以保證無發(fā)病或痛苦，所有程序按照University of Otago動物倫理學(xué)委員會的批準(zhǔn)進(jìn)行。從組織提取「aHl化合物將組織在室溫下解凍，轉(zhuǎn)移到50mL Falcon管中。向組織中加入冰冷甲醇( 4° C; ImL/1OOmg組織濕重),用Ultraturrax勻衆(zhòng)儀將組織勻衆(zhòng)(冰上2x30秒)。將組織勻衆(zhòng)按每批Iml的量轉(zhuǎn)移到1. 5mL Eppendorf管中，離心(4。C, 10, OOOx g，8分鐘)。將甲醇提取物倒入20ml玻璃閃爍管(Wheaton)，使甲醇在N2流環(huán)境中揮發(fā)。向組織勻漿沉淀物中再加入冰冷的甲醇(lmL/100mg)，渦旋I分鐘，如上所述離心，甲醇提取物倒入新鮮20mL玻璃閃爍管并揮發(fā)。將該過程再重復(fù)3次得到每個組織樣品的5份提取物。第五份提取物中的放射性往往可以忽略不計(jì)。每個管中加入閃爍體(OptiPhase HiSafe II; IOmL),在閃爍計(jì)數(shù)儀(LKB Wallac 1217Rackbeta)中使用合適的淬滅校正測量3H DPM含量，并計(jì)算每個樣品的放射性總量。然后利用注射的[3H]化合物的比活將組織攝取含量計(jì)算為mol化合物/g濕重組織。由[3H]化合物從器官消失的一級速率常數(shù)(測量為iv注射后前5小時，In[TPP化合物]對時間的斜率)確定化合物在器官中的半衰期。對于肝、腎和心臟，因?yàn)槔鄯e了大量放射性，該過程很穩(wěn)定。但其他器官累積的較少量放射性使得評估變化性更大，因此對于那些器官只能提供一個估計(jì)。IAM-TPP線粒體攝取的分析為了評估體內(nèi)線粒體對IAM-TPP的攝取，小鼠如上所述經(jīng)尾靜脈iv注射溶于100 μ L無菌PBS的500nmol IAM-TPP。I小時后，經(jīng)頸椎脫位處死小鼠，通過勻漿和隨后的分級離心制備肝和心臟線粒體，用牛血清清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)二辛可寧酸法確定蛋白含量。通過在12. 5%丙烯酰胺膠上進(jìn) 行還原性SDS-聚丙烯酰胺電泳，將線粒體蛋白(40yg)分開，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜，用抗TPP部分的兔抗血清來檢測TPP結(jié)合蛋白，隨后用偶聯(lián)了馬辣根過氧化物酶的抗兔IgG的第二抗體通過增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光進(jìn)行監(jiān)測。為了評估細(xì)胞內(nèi)的線粒體對IAM-TPP的攝取情況，在補(bǔ)充了 10%(v/v)胎牛血清、青霉素(100U/ml)和鏈霉素(100 μ g/ml)的 DMEM 中，將 C2C12 小鼠成肌細(xì)胞系(European Collection of AnimalCell Cultures)在6孔培養(yǎng)板中的22mm玻璃蓋玻片上生長至半鋪滿。然后將這些細(xì)胞與不含F(xiàn)CS/X%FCS的DMEM，以及I μ M IAM_TPP± 10 μ M FCCP 一起溫育3小時。在一些溫育中，于溫育的最后30分鐘加入IOOnM MitoTracker Orange (Molecular Probes)。溫育結(jié)束時，用甲醛固定細(xì)胞，處理后，進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)和共聚焦顯微鏡研究。用抗TPP部分的兔抗血清聯(lián)合偶聯(lián)了 Oregon Green的二抗抗兔IgG(Molecular Probes)使細(xì)胞內(nèi)的TPP顯現(xiàn)。用共聚焦顯微鏡獲取圖像。以上說明書提及的所有出版物均通過引用并入本文。發(fā)明中描述過的方法和系統(tǒng)的各種改動和變化對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的，不需脫離發(fā)明的范圍和精神。雖然是結(jié)合具體優(yōu)選實(shí)施方案對發(fā)明進(jìn)行的描述，可以理解不應(yīng)將要求保護(hù)的發(fā)明局限于這些具體實(shí)施方案。的確，對線粒體生物學(xué)、放射學(xué)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員來說顯而易見的發(fā)明實(shí)施模式的各種改動也包含在 以下權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.成像探針，其包含親脂陽離子、疏水部分和PET核。
2.權(quán)利要求1的成像探針，其中所述親脂陽離子是或者包含三苯基磷^(TPP)。
3.權(quán)利要求1或2的成像探針，其中所述疏水部分包含含有至少5個碳原子的脂肪鏈。
4.權(quán)利要求3的成像探針，其中所述疏水部分包含含有8-15個碳原子的脂肪鏈。
5.權(quán)利要求4的成像探針，其中所述疏水部分包含線性烷基鏈。
6.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的成像探針，其中所述疏水部分作為親脂陽離子和PET核之間的連接物。
7.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的成像探針，其中所述PET核選自下組nC、18F、76Br、1231、1241、1311、13N 或 150。
8.分析受試對象中的線粒體膜電位的方法，包括以下步驟 (i)將前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的成像探針給予受試對象； ( )探針的可視化；和 (iii)推導(dǎo)線粒體膜電位。
9.使受試對象體內(nèi)腫瘤可視化的方法，包括用權(quán)利要求8的方法分析線粒體膜電位的步 驟。
10.考察受試對象中線粒體損傷的方法，包括用權(quán)利要求8的方法分析線粒體膜電位的步驟。
11.診斷和/或監(jiān)測與線粒體供能改變有關(guān)的病態(tài)的方法，包括用權(quán)利要求8的方法分析線粒體膜電位的步驟。
12.研究測試化合物對線粒體電位的影響的方法，包括將測試化合物給予受試對象和用權(quán)利要求8的方法分析線粒體膜電位的變化的步驟。
13.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的成像探針，其用于 (i)權(quán)利要求8所述的分析線粒體膜電位的方法； ( )權(quán)利要求9所述的使腫瘤可視化的方法； (iii)權(quán)利要求10所述的考察受試對象中線粒體損傷的方法； (iv)權(quán)利要求11所述的診斷和/或檢測與線粒體供能改變有關(guān)的病態(tài)的方法；或者 (V)權(quán)利要求12所述的研究測試化合物對線粒體電位的影響的方法。
14.前體分子，其包含親脂陽離子和疏水部分，該前體分子能夠與PET核的陰離子形式反應(yīng)生成權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的成像探針。
15.權(quán)利要求14的前體分子，其包含與PET核的陰離子形式反應(yīng)的甲磺酸根。
16.權(quán)利要求14的前體分子，其是甲磺酸烷基三苯基磷锫化合物，能夠與18F_形成18F-氟代烷基TPP。
17.制備權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的成像探針的方法，包括將PET核的陰離子形式與權(quán)利要求14-16中任一項(xiàng)的前體分子反應(yīng)的步驟。
18.制備和給予權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的成像探針的方法，包括以下步驟 ⑴合成18F_ ( )將18F_引入權(quán)利要求14-16任一項(xiàng)的前體分子以產(chǎn)生成像探針； ( )將所述成像探針給予受試對象。
19.提高包含三苯基磷(TPP)陽離子的成像探針的攝入的方法，包括增加成像探針的疏水性的步驟。
20.提高包含三苯基磷鎦(TPP)陽離子的成像探針的組織循環(huán)比的方法，包括增加成像探針的疏水性的步驟。
21.權(quán)利要求13或14的方法，其中通過引入具有至少5個碳原子的烷基鏈來增加成像探針的疏水性。
全文摘要
本發(fā)明提供了包含親脂陽離子、疏水部分和PET核的成像探針。本發(fā)明還提供了產(chǎn)生這類成像探針的前體分子以及利用探針分析受試對象的線粒體膜電位的方法。
文檔編號C07B59/00GK103068407SQ201180027477
公開日2013年4月24日 申請日期2011年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月1日
發(fā)明者D.K.梅農(nóng), M.P.默菲, F.I.艾格波西奧, R.A.J.史密斯 申請人:醫(yī)療研究局, 劍橋企業(yè)有限公司, 奧塔戈大學(xué)