專利名稱：一種聚乙二醇偶聯(lián)結(jié)合超濾離心分離富集糖肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及糖肽的富集方法，具體地說(shuō)是一種聚乙二醇偶聯(lián)結(jié)合超濾分離富集糖肽的方法，應(yīng)用于含N-連接糖基化位點(diǎn)的肽段的選擇性富集。
背景技術(shù)：
糖蛋白具有重要的生物功能，但其在生物體內(nèi)的豐度較低。因此，通常需要經(jīng)過(guò)富集才能對(duì)其進(jìn)行分析。現(xiàn)有的富集方法主要包括凝集素親和法、硼酸親和法、親水相互作用法和糖氧化/酰肼法等。其中凝集素親和法是一種基于生物親和的經(jīng)典方法，具有很高的特異性。但不同類(lèi)型的凝集素只能專一'I"生的親和富集一種類(lèi)型的糖蛋白/糖肽(Yahara,
I.and Edelman, G. Μ.，Proc. Nat. Acad. Sci.，1972,69,608-612)。如要富集不同類(lèi)型 的糖蛋白/糖肽，貝1J需要不同類(lèi)型的凝集素聯(lián)用(Jung K. ,Cho ff. ,Regnier F. , J. Proteome Res.,2009，8，643-650)。而其他幾種都是普適性的富集方法，對(duì)各種糖型具有效果。糖氧化/酰肼法是目前最廣范使用的普適性富集方法。作為一種化學(xué)衍生法，已有商品化的酰肼微球可提供用于實(shí)驗(yàn)研究。其富集過(guò)程為N-連接糖蛋白的糖鏈上的順式鄰二醇先經(jīng)高碘酸氧化成醛；醛基再與固定在基質(zhì)上的酰肼反應(yīng)形成共價(jià)的腙鍵，于是糖蛋白便可富集到酰肼微球上，非糖基化蛋白經(jīng)洗脫去除；糖蛋白再進(jìn)行固相的酶解，同樣通過(guò)洗脫去除掉非糖肽；富集的糖肽經(jīng)PNGase F酶酶解從固相基質(zhì)上切除下來(lái)。Zhang等進(jìn)一步完善了糖肽的酰肼化學(xué)富集，使之成為一套標(biāo)準(zhǔn)方法(Tian Y. ,Zhou Y. , et al. ,Nat.Protocol. ,2007,2 :334-339)。但基于微球的糖氧化/酰肼法操作步驟繁瑣，尤其對(duì)微球的非特性性吸附的洗脫需要多種試劑多次清洗。并且，由于商品化凝膠基質(zhì)微球是透明的，在離心后的分離過(guò)程中容易損失，影響回收率。因此，我們嘗試發(fā)展一種新型的基于衍生酰肼的聚乙二醇偶聯(lián)，結(jié)合超濾分離過(guò)濾的方法進(jìn)行糖肽的富集。該方法不僅對(duì)糖肽具有特異性，并且操作過(guò)程簡(jiǎn)單，非特性吸附的清洗容易，成本低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種糖肽選擇性富集方法，利用該方法富集N-連接糖肽，具備較好的特異性，并且操作步驟比較簡(jiǎn)單。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為糖肽經(jīng)過(guò)氧化后，糖鏈上的順式鄰二醇發(fā)應(yīng)生成醛基；再加入單甲氧基聚乙二醇酰肼，使其通過(guò)與醛基反應(yīng)形成共價(jià)腙鍵從而特異性的偶聯(lián)到糖鏈上；通過(guò)超濾離心分離將非糖肽濾出，與糖肽分離；再向?yàn)V膜內(nèi)樣品管中加入糖苷酶將糖鏈切下，產(chǎn)生的含糖基化位點(diǎn)的肽段經(jīng)超濾離心分離，即可實(shí)現(xiàn)含N-連接糖基化位點(diǎn)的肽段的選擇性富集。具體為一種聚乙二醇偶聯(lián)結(jié)合超濾分離富集糖肽的方法，1)N-連接糖蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)酶解產(chǎn)生的肽段混合物中加入高碘酸，糖鏈上的順式鄰二醇經(jīng)氧化生成醛基，通過(guò)反相色譜除鹽去除多余的氧化劑；2)向氧化后的肽段混合物中加入單甲氧基聚乙二醇酰肼，在乙酸-乙酸鈉緩沖液中糖肽與聚乙二醇偶聯(lián)；糖肽參與偶聯(lián)反應(yīng)的是糖鏈上經(jīng)氧化產(chǎn)生的醛基；醛基與聚乙二醇上衍生的酰肼基團(tuán)通過(guò)生成共價(jià)腙鍵發(fā)生偶聯(lián)，將單甲氧基聚乙二醇酰肼分子選擇性的修飾到糖肽的糖鏈上；步驟2)中聚乙二醇偶聯(lián)反應(yīng)的具體過(guò)程為將含有l(wèi)_5mg/mL單甲氧基聚乙二醇酰肼(分子量為10，000-20, OOODa)的pH = 4. 5-6. 5乙酸-乙酸鈉緩沖溶液加入肽段混合物中，在室溫下振蕩反應(yīng)6-24小時(shí)。3)將反應(yīng)產(chǎn)物加入超濾離心管樣品池中，經(jīng)過(guò)清洗和離心過(guò)濾將糖肽和非糖肽分開(kāi)；糖肽保留在濾膜內(nèi)，非糖肽離心到濾膜外；
步驟3)中超濾離心分離的過(guò)程為將步驟2中的反應(yīng)產(chǎn)物加入濾膜截留分子量為10，000的超濾離心管中，在室溫下14，000-16, OOOg離心15分鐘；被濾膜截留的部分再加入超純水或pH = 7-8碳酸氫銨緩沖液，振蕩后在室溫下14，000-16, OOOg離心15-30分鐘；如此反復(fù)清洗7-9次。4)向樣品池中再加入肽N糖苷酶F的碳酸氫銨緩沖液，酶解后將肽段從其糖基化位點(diǎn)處酶切下來(lái)，經(jīng)過(guò)離心即可獲得含糖基化位點(diǎn)的肽段。步驟4)中獲得含N-連接糖基化位點(diǎn)的肽段的過(guò)程為向?yàn)V膜內(nèi)含有偶聯(lián)了聚乙二醇的糖肽樣品中加入含肽N-糖苷酶F的pH 7. 5-8. 5的碳酸氫銨緩沖液，在37°C孵育4-12小時(shí)；在室溫下14，000-16，OOOg離心15-30分鐘；再向?yàn)V膜內(nèi)樣品管中加入pH
7.5-8. 5的碳酸氫銨緩沖液，振蕩后在室溫下14，000-16，OOOg離心15-30分鐘；將兩次收取的濾出液收集合并即得到含N-連接糖基化位點(diǎn)的肽段。本發(fā)明聚乙二醇偶聯(lián)結(jié)合超濾離心過(guò)濾分離方法對(duì)含有N-連接糖基化位點(diǎn)的肽段有特異性富集作用，應(yīng)用于混合肽段中N-連接糖肽的選擇性富集。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為本發(fā)明以單甲氧基聚乙二醇酰肼的酰肼基團(tuán)與糖肽糖鏈上氧化產(chǎn)生的醛基共價(jià)偶聯(lián)，結(jié)合超濾離心分離的方法即可用于N-連接糖肽的選擇性富集。其方法簡(jiǎn)便，成本低；對(duì)N-連接糖肽的選擇性好，非特異性吸附的洗脫過(guò)程簡(jiǎn)單。


圖I聚乙二醇偶聯(lián)結(jié)合超濾離心過(guò)濾分離富集糖肽方法的示意圖。圖2辣根過(guò)氧化物酶經(jīng)胰蛋白酶酶解后的產(chǎn)物，經(jīng)聚乙二醇偶聯(lián)結(jié)合超濾離心分離富集糖肽方法處理得到的產(chǎn)物(a)和經(jīng)商品化糖氧化/酰肼法處理得到的產(chǎn)物(b)MALDI-TOF MS分析得到的質(zhì)譜圖；0. 05mg的辣根過(guò)氧化物酶經(jīng)胰蛋白酶酶解后的產(chǎn)物經(jīng)過(guò)兩種富集方法的處理，得到相似的產(chǎn)物質(zhì)譜圖，用聚乙二醇偶聯(lián)結(jié)合超濾離心分離富集糖肽方法處理后檢測(cè)到的含N-連接糖基化位點(diǎn)的肽段數(shù)目增加。這說(shuō)明本發(fā)明所開(kāi)發(fā)的富集方法對(duì)N-連接糖肽的富集特異性好，可以有效的富集肽段混合物中的N-連接糖肽。圖3辣根過(guò)氧化物酶經(jīng)胰蛋白酶酶解后產(chǎn)物，經(jīng)濾膜截留分子量10，OOODa的超濾離心管清洗并離心過(guò)濾I次(a)和6次(b)MALDI-TOF MS分析得到的質(zhì)譜圖。經(jīng)過(guò)6次過(guò)濾分離，可以將酶解產(chǎn)物中絕大部分非糖肽去除，說(shuō)明本發(fā)明所開(kāi)發(fā)的超濾分離方法可以方便的去除非糖肽的干擾，簡(jiǎn)化富集的步驟。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明糖肽上糖鏈的氧化可參照文獻(xiàn)(Tian Y. , Zhou Y. , et al. , Nat.Protocol. ,2007,2 :334-339)進(jìn)行。具體操作過(guò)程為N-連接糖蛋白質(zhì)的蛋白酶酶解產(chǎn)物溶于100 μ L含有高碘酸鈉的pH 5-6的緩沖液(其中含有IOOmM乙酸鈉，150mM氯化鈉，IOmM高碘酸鈉)中，在4°C避光反應(yīng)I小時(shí)。產(chǎn)物酸化后上樣到用C18捕集柱上，捕集柱用O. I %三氟乙酸沖洗3-10倍柱體積，再用含O. I %三氟乙酸的 50%乙腈將保留在捕集柱上的氧化后的糖肽洗脫下來(lái)。洗脫液冷凍干燥，-20°C保存。實(shí)施例I按照如下步驟進(jìn)行N-連接糖肽的富集。I)聚乙二醇的偶聯(lián)反應(yīng)將含有l(wèi)mg/mL單甲氧基聚乙二醇酰肼的IOOmM乙酸鈉緩沖液(pH 5. 5，其中含有150mM氯化鈉)400μ L加入氧化后的肽段混合物中，在室溫下反應(yīng)12小時(shí)。即可制備得到聚乙二醇偶聯(lián)的糖肽。反應(yīng)實(shí)例具體參數(shù)如下表I所示。2)超濾離心分離含有偶聯(lián)了聚乙二醇的糖肽和其他非糖肽的水溶液，加入超濾離心管中，濾膜的截留分子量為10，OOODa0在室溫下1，400g離心15分鐘；再向?yàn)V膜內(nèi)樣品管中加入400yL水或pH 8. O的IOOmM碳酸氫銨緩沖液，振蕩后，再次在室溫下1，400g離心15分鐘；重復(fù)此清洗過(guò)程7-9次。(具體參數(shù)如下表I所示)。表I.聚乙二醇偶聯(lián)反應(yīng)和超濾離心分離參數(shù)。
權(quán)利要求
1.一種聚乙二醇偶聯(lián)結(jié)合超濾離心分離富集糖肽的方法，其特征在于 DN-連接糖蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)酶解產(chǎn)生的肽段混合物中加入高碘酸，糖鏈上的順式鄰二醇經(jīng)氧化生成醛基，通過(guò)反相色譜除鹽去除多余高碘酸； 2)向氧化后的肽段混合物中加入單甲氧基聚乙二醇酰肼(mPEG-Hz)，在乙酸-乙酸鈉緩沖液中糖肽與聚乙二醇偶聯(lián)； 3)將反應(yīng)產(chǎn)物加入超濾離心管樣品池中，經(jīng)過(guò)清洗和離心過(guò)濾將糖肽和非糖肽分開(kāi)；糖肽保留在濾膜內(nèi)，非糖肽離心到濾膜外； 4)向樣品池中再加入肽N-糖苷酶F(PNGase F)的碳酸氫銨緩沖液，酶解后將肽段從其糖基化位點(diǎn)處酶切下來(lái)，經(jīng)過(guò)離心即可獲得含糖基化位點(diǎn)的肽段。
2.按照權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于 步驟2)中聚乙二醇偶聯(lián)反應(yīng)的具體過(guò)程為肽段混合物中加入含有l(wèi)_5mg/mL單甲氧基聚乙二醇酰肼(分子量為10，000—20, 000 Da)的pH=4. 5—6. 5乙酸一乙酸鈉緩沖溶液中，在室溫下振蕩反應(yīng)6-24小時(shí)。
3.按照權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于 步驟3)中超濾離心分離的過(guò)程為將步驟2)中的反應(yīng)產(chǎn)物加入濾膜截留分子量為10，000 — 5，000的超濾離心管中，在室溫下14，000-16，000 g離心15 — 30分鐘；被濾膜截留的部分再加入超純水或PH = 7-8碳酸氫銨緩沖液，振蕩后在室溫下14，000-16, 000 g離心15 - 30分鐘；如此反復(fù)清洗7-9次。
4.按照權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于 步驟4)中碳酸氫銨緩沖液為50 - 100 mM的碳酸氫銨水溶液，pH為7. 5 — 8. 5。
全文摘要
本發(fā)明涉及糖肽的富集方法，具體地說(shuō)是一種聚乙二醇偶聯(lián)結(jié)合超濾分離富集糖肽的方法；N-連接糖蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)酶解產(chǎn)生的肽段混合物中加入高碘酸，糖鏈上的順式鄰二醇經(jīng)氧化生成醛基，通過(guò)反相色譜除鹽去除多余的高碘酸；向氧化后的肽段混合物中加入單甲氧基聚乙二醇酰肼(mPEG-Hz)，在乙酸－乙酸鈉緩沖液中糖肽與聚乙二醇偶聯(lián)；將反應(yīng)產(chǎn)物加入超濾離心管樣品池中，經(jīng)過(guò)清洗和離心過(guò)濾將糖肽和非糖肽分開(kāi)；糖肽保留在濾膜內(nèi)，非糖肽離心到濾膜外；向樣品池中再加入肽N-糖苷酶F(PNGaseF)的碳酸氫銨緩沖液，酶解后將肽段從其糖基化位點(diǎn)處酶切下來(lái)，經(jīng)過(guò)離心即可獲得含糖基化位點(diǎn)的肽段。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為是一種普適性的糖肽富集方法，具有較好的選擇性，操作步驟簡(jiǎn)單，非特性吸附的清洗比較容易，成本較低。
文檔編號(hào)C07K14/00GK102757992SQ20111010446
公開(kāi)日2012年10月31日 申請(qǐng)日期2011年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月25日
發(fā)明者侯春彥, 張麗華, 張玉奎, 楊開(kāi)廣, 梁振 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所