專利名稱：黑青斑河鲀干擾素IFNγ1及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種黑青斑河飩II型干擾素IFNy 1的編碼基因、蛋白及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
細胞免疫因子Y干擾素(IFN Y)，作為干擾素系統(tǒng)中重要的II型IFN，是主要的巨噬細胞刺激因子和調(diào)控免疫反應(yīng)的關(guān)鍵信號分子，能激活效應(yīng)細胞，提高自然殺傷細胞 (NK)和巨噬細胞活性，促進免疫球蛋白的轉(zhuǎn)換，具有抗腫瘤、抗病毒、調(diào)節(jié)和增強機體免疫功能等作用。干擾素IFNyI和IFNY2基因是魚類IFNY基因的兩個亞型，其氨基酸序列的特征是含有兩個保守結(jié)構(gòu)，包括氨基酸序列中的6個α-螺旋和在靠近其氨基酸序列C 端的F螺旋中均存在[IV]-Q-X-[KQ]-A-X2-E-[LF]-X2-[IV]這個保守結(jié)構(gòu)，這與已研究過的其他區(qū)中的IFNy 二級結(jié)構(gòu)類似。IFNY具有廣泛的生物學(xué)活性。目前已知干擾素作為細胞因子的重要類型，是細胞和機體受到病毒感染或受核酸、細菌內(nèi)毒素等誘導(dǎo)時，由受體細胞分泌的一種具有廣譜抗病毒活性的糖蛋白，能誘導(dǎo)細胞進入抗病毒狀態(tài)。IFNy是由Thl細胞產(chǎn)生的細胞因子。 它主要通過與其受體結(jié)合，活化JAK-STAT信號通路，激活下游基因的轉(zhuǎn)錄，包括相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和免疫分子，如STATl、IRFl、ICSBP和MHC II等，從而誘導(dǎo)巨噬細胞產(chǎn)生毒性物質(zhì)消滅胞內(nèi)細菌，誘導(dǎo)宿主內(nèi)一些抗病毒蛋白的合成，調(diào)節(jié)T細胞的增殖和分化以及增強抗原提呈作用，達到保護宿主的目的。IFNy抗病毒機理主要是能提高細胞表面MHC類分子表達，有助于向細胞毒性T 細胞遞呈抗原，引起靶細胞的溶解，此外還可以通過下游基因的轉(zhuǎn)錄及抗病毒效應(yīng)基因表達而達到抗病毒作用。對于表達MHC I類抗原的細胞，IFN γ可以誘導(dǎo)I類抗原以更高的水平表達；對于無法檢測到的I類抗原基本表達水平的細胞，IFNy也可以誘導(dǎo)I類抗原的表達，且一般比I型干擾素IFNa/β具有更強的作用。在體注射IFNY可以導(dǎo)致許多組織中I類抗原表達水平的廣泛增高。IFNy對MHC II類分子表達的調(diào)節(jié)作用MHC II類分子僅存在于專職的抗原呈遞細胞(如樹突狀細胞及B細胞)，其他細胞中MHC II類分子均可由IFNy 誘導(dǎo)產(chǎn)生。II類抗原呈遞途徑的所有關(guān)鍵基因的正常表達都是必需的，它們受一個單一的受IFNy誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子II類反式激活蛋白(c II TA)的調(diào)節(jié)。IFNy能夠激活吞噬細胞的殺菌活性。活化的巨噬細胞表現(xiàn)最突出的是對許多細胞內(nèi)的和吞噬的生物體如分支桿菌、剛地弓形蟲、錐蟲和利什曼原蟲的殺菌活性大大增強。與哺乳動物相似，魚類IFN γ重組蛋白能夠影響刺激免疫細胞的增殖，增加IFN γ 自身的基因表達，以及誘導(dǎo)下游免疫基因，如MHC II和Mx基因的表達。Mx是IFN系統(tǒng)中熟為人知的抗病毒蛋白，作為一種GTP酶，它主要通過干擾病毒的聚合酶來抑制RNA的復(fù)制， 從而發(fā)揮抗病毒的作用。它主要受I型IFN誘導(dǎo)大量表達發(fā)揮其作用，II型IFN對其有一定的誘導(dǎo)作用。重組的IFNy可影響魚類的細胞免疫反應(yīng)。初步研究的結(jié)果表明，一定濃度的重組虹鱒IFNy在RTS-Il cells中會促進下游免疫基因IPlO和MHC II β的表達。
近年來魚類病害發(fā)生頻繁，其中某些疾病給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成災(zāi)難性的危害，這就使得免疫防治技術(shù)在魚病防治中呈現(xiàn)出日趨廣闊的應(yīng)用前景。IFNy由于其抗腫瘤、抗病毒、調(diào)節(jié)和增強機體免疫功能等作用在哺乳動物中的應(yīng)用已非常廣泛，對人的臨床應(yīng)用治療疾病方面也已很普遍。而其在魚類的研究與應(yīng)用才開始起步，可以預(yù)測其具有廣闊的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)魚類免疫防治中沒有干擾素蛋白IFNY的缺陷， 提供一種黑青斑河飩干擾素IFNy 1。本發(fā)明的另一目的是提供黑青斑河飩干擾素ifny 1的編碼基因。本發(fā)明的又一目的是提供黑青斑河飩干擾素IFNY 1的制備方法。本發(fā)明的再一目的是提供黑青斑河飩干擾素IFN y 1的應(yīng)用。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)上述目的
一種黑青斑河飩干擾素IFN γ 1，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示，共179個氨基酸； 等電點為7. 882，分子量為20. 18千道爾頓。黑青斑河飩干擾素IFN γ 1氨基酸編碼序列含有一段N段信號肽序列，使用Jpred方法預(yù)測其蛋白的二級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)它含有6個α-螺旋結(jié)構(gòu)，且在靠近其氨基酸序列C端的F螺旋中存在[IV]-Q-X-[KQ]-A-X2-E-[LF]-X2-[ IV] 這個保守結(jié)構(gòu)，這與其他已鑒定的IFNy —樣。此外，對干擾素IFNYI進行糖基化位點的預(yù)測發(fā)現(xiàn)其含有一個糖基化位點。同時，通過對氨基酸序列的C末端進行分析，發(fā)現(xiàn)在黑青斑河飩干擾素IFNyI氨基酸序列的C末端沒有類似核定位序列(NLS)的RRRR 序列。上述黑青斑河飩干擾素ifn y 1的編碼基因，其核苷酸序列如seq id no: 2所示。上述黑青斑河飩干擾素IFNy 1的編碼基因的制備方法，其特征在于以黑青斑河飩總mRNA為模板，以RNA Oligo dT，其序列如SEQ ID NO: 3為引物，進行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA ； 再以cDNA為模板，設(shè)計上游引物SEQ ID N0:4，下游引物SEQ ID NO: 5，進行PCR，得到黑青斑河飩干擾素IFNy 1的編碼基因。黑青斑河飩干擾素ifny 1可以通過表達載體在大腸桿菌中以胞內(nèi)不溶的形式表達，具體制備方法是將黑青斑河飩干擾素IFNy 1的編碼基因克隆至表達載體，得到重組表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，經(jīng)誘導(dǎo)后收集菌體，純化、酶切，得到黑青斑河飩干擾素IFNy 1。所述表達載體為大腸桿菌表達載體pET32a，重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建包括以下步驟以含黑青斑河飩干擾素IFNyI編碼基因的質(zhì)粒為模板，設(shè)計含有
I酶切位點的上游引物SEQ ID N0:6，含歷idIII酶切位點的下游引物SEQ ID N0:7進行PCR，
PCR產(chǎn)物克隆到原核融合表達載體pET32a上，得到重組表達質(zhì)粒，該質(zhì)粒含有6 XHis親和標(biāo)記位點。該表達載體是以T7為啟動子，獲得的蛋白的C端有6XHis結(jié)構(gòu)，便于利用固定化金屬配體親和層析進行純化。所述培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的培養(yǎng)條件為接單菌落至含氨芐青霉素lb液體培養(yǎng)基中，37°C，250 rpm，振蕩培養(yǎng)過夜，按1: 50體積比接種到200 ml 37°C預(yù)熱的含氨芐青霉素TB液體培養(yǎng)基中，37 °C，250 rpm，培養(yǎng)至0D600達到0. 6。大腸桿菌優(yōu)選BL21 (DE3)。 所述誘導(dǎo)為加入IPTG至終濃度為0. 3mmol/L，經(jīng)誘導(dǎo)后收集菌體。誘導(dǎo)時間優(yōu)選為7小時，可以獲得最大的可溶性重組蛋白表達量。所述純化是將總菌體用Bug Buster Master Mix混勻重懸，收菌后可以免除細胞破碎，室溫下將重懸的細胞液孵育10-20min ；(孵育后獲得的抽提物不是粘稠的)4°C下 16，OOOg離心20 min以去除不溶的細胞碎片，沉淀重懸于Bug Buster Master Mix，吸打渦旋，重懸沉淀，渦旋1 min ;4°C，5，000g離心15 min，移去上清，收集沉淀，沉淀即包涵體； 將包涵體重懸于相當(dāng)于原培養(yǎng)體系體積一半的經(jīng)1:10稀釋的Bug Buster Master Mix中， 渦旋混勻，離心；取沉淀再渦旋混勻離心，再次重懸，于4°C，16，000 g離心15min并去除上清；最終沉淀(IFNy 1包涵體)加鹽酸胍裂解液洗滌，這樣抽提得到的可溶蛋白溶液可以直接上樣，經(jīng)固定化金屬配體親和層析純化，收集洗脫的蛋白。優(yōu)選鹽酸胍裂解液的PH 7.8， 含 500mmol/L NaCl。所述酶切是用rEK酶，上述步驟獲得的重組蛋白N端含有Trx融合蛋白，根據(jù)融合蛋白上含有S-tag標(biāo)簽，可以結(jié)合到S-protein Agarose上，而目的蛋白IFN γ 1不結(jié)合，可被洗脫，在經(jīng)過EKapture Agarose去除重組蛋白中的rEK酶，可得到單一的IFN γ 1目的蛋白。通過對培養(yǎng)時間、誘導(dǎo)時間和溫度等條件的摸索和優(yōu)化，使得到的蛋白的表達量較高，IFNyl處于不溶狀態(tài)，純化時要經(jīng)過變性，復(fù)性，得到可溶的IFNy 1重組蛋白；優(yōu)化了重組蛋白的純化條件后，表達產(chǎn)物的超聲裂解液經(jīng)固定化金屬配體親和層析，得到的蛋白純度在90%以上。本發(fā)明制備的黑青斑河飩干擾素IFNY 1在制備魚類免疫調(diào)節(jié)添加劑或魚類免疫佐劑中的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果
本發(fā)明利用黑青斑河飩基因組數(shù)據(jù)庫結(jié)合分子生物學(xué)方法設(shè)計了特異性引物，PCR擴增克隆得到IFNy 1基因的ORF序列，并構(gòu)建表達載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中培養(yǎng)，可大量表達黑青斑河飩干擾素IFN γ 1基因所編碼的蛋白。本發(fā)明黑青斑河飩干擾素IFN γ 1能夠影響黑青斑河飩頭腎細胞中的MX和ISG15基因的表達，豐富了魚類干擾素系統(tǒng)信號通路的理論，并能有效促進疫苗產(chǎn)生的免疫佐劑，還可作為增強魚類免疫的餌料添加劑。


圖1.黑青斑河飩干擾素IFN γ 1氨基酸序列與部分脊椎動物IFN γ氨基酸序列的比較結(jié)果圖，其中，在比較中采用空格以獲得最大的同源性序列，“——”表示此位置無此
氨基酸；
圖2.黑青斑河飩干擾素IFNyI成熟肽編碼序列PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果，其中，M為 100 bp DNA Marker, NC為陰性對照，1為帶有酶切位點的IFN γ 1核苷酸目的片段；
圖3. Real Time-PCR分析黑青斑河飩干擾素IFN γ 1基因在LPS和Poly I:C不同孵育刺激時間下頭腎細胞中的表達，其中，A是LPS刺激下IFN γ 1基因的表達量變化，B是 Poly I:C刺激下IFNyI基因的表達量變化，LPS為脂多糖，Poly I:C為雙鏈RNA類似物； 圖4.基因IFNy 1的重組表達質(zhì)粒構(gòu)建圖；圖5.在N端含有Trx融合蛋白的黑青斑河飩干擾素IFN γ 1重組蛋白表達和純化的 SDS-PAGE (A)及Western雜交(B)分析圖，其中，M為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，1為未誘導(dǎo)總菌蛋白，2為誘導(dǎo)后總菌蛋白，3為經(jīng)純化透析后的蛋白樣品；
圖6.切除黑青斑河飩干擾素IFNyI重組蛋白上的Trx融合蛋白后的IFNyI的 SDS-PAGE分析圖，M為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，1為IFN γ 1蛋白，2為Trx融合蛋白；
圖7.黑青斑河飩IFN Yl對頭腎免疫細胞中ISG15和MX基因表達的影響，A為IFN Yl 對ISG15基因表達的影響，B為IFN γ 1對MX基因表達的影響，*表示與對照組有顯著差異 (P<0. 05)。
具體實施例方式實施例1.黑青斑河飩干擾素IFNYl編碼基因的制備 1.黑青斑河飩頭腎總RNA的提取
取健康黑青斑河飩(Tfeiraoi/o/ nigriviridis、八救物3 5cm，體重約4 6g，以20 300C循環(huán)過濾的水飼養(yǎng)，每天以赤蟲喂食一次。馴養(yǎng)2周后取健康的魚進行實驗。以冰浴麻醉約2 min后，殺魚取樣，分離出肝、脾、腸、頭腎、腮、心臟、皮膚及肌肉，存放于-80°C 冰箱備用。采用Trizol試劑法提取獲得黑青斑河飩頭腎總RNA，其OD26W = 1.85。2. cDNA第一鏈的合成
取5 μ g黑青斑河飩頭腎總RNA樣品進行DNA酶處理以去除基因組DNA的污染，與RNA Oligo dT (序列如SEQ ID NO:3所示)混合，進行反轉(zhuǎn)錄，所得產(chǎn)物置于-20°C保存?zhèn)溆谩?.黑青斑河飩IFN y 1基因cDNA全序列的克隆
根據(jù)Ensembl及NCBI的Tetraodon nigriviridis基因組數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)，在 IFNy開放讀碼框兩端設(shè)計特異引物，上游引物序列如SEQ ID NO:4，下游引物序列如SEQ ID NO: 5，以步驟2合成的第一鏈cDNA為模板，進行PCR擴增，擴增片段大小為540 bp。所得PCR產(chǎn)物上樣至1. 8%瓊脂糖凝膠，以低電壓電泳分離DNA片段，從凝膠中純化回收目的產(chǎn)物。將純化后的目的產(chǎn)物連接至PTZ57 R/T載體轉(zhuǎn)化DH5ci大腸桿菌，挑選陽性克隆測序。Blast同源分析表明，目的產(chǎn)物為IFNy 1基因的cDNA序列片段。實施例2.黑青斑河飩干擾素IFNYl基因在分裂原活化的頭腎細胞中的表達
使用不同分裂原刺激黑青斑河飩頭腎細胞，檢測該基因在離體受到外界刺激時，是否直接參與應(yīng)激反應(yīng)。用剪刀分離黑青斑河飩的頭腎組織，用烘好的磨砂玻片磨砂面進行研磨，磨至末狀；將磨好的細胞與培養(yǎng)基一起過細胞濾網(wǎng)(BD Falcon, 70 ynuNylon)轉(zhuǎn)移至50 ml離心管中；洗滌、離心后使用完全培養(yǎng)基(RPMI 1640含2 mM L-glutamine, 10% FBS和1% penicillin /streptomycin) 2 ml重懸細胞，計數(shù)后將細胞數(shù)調(diào)整至合適水平，加入含分裂素Poly I :C和LPS的完全培養(yǎng)基至終濃度分別為100 μ g/ml和10 μ g/ml，另以不含刺激劑的完全培養(yǎng)基作為陰性對照組；將細胞培養(yǎng)板置于27°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別孵育1 h，2 h和4 h后收集各孔細胞，提取總RNA并進行反轉(zhuǎn)錄。18s rRNA作為內(nèi)參基因來調(diào)節(jié)各樣品模板cDNA量。18s rRNA基因的上游引物序列如SEQ ID N0:8，下游引物序列如SEQ ID N0:9, IFNy 1編碼基因的上游引物如SEQ ID N0:10，下游引物序列如SEQ ID N0:11，進行RealTimePCR擴增，利用羅氏LightCyCle480軟件分析數(shù)據(jù)結(jié)果，數(shù)據(jù)表示為平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差(means士S. Ε. M)，取5個獨立樣品的數(shù)據(jù)平均值(η = 5)，結(jié)果見圖3。 實驗結(jié)果表明Poly I:C和LPS短時間刺激后，IFN γ 1基因在頭腎細胞中的表達量明顯增加，隨著刺激時間的增加，基因表達量逐漸下降。實施例3黑青斑河飩干擾素IFN γ 1的制備 1.重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建
根據(jù)IFNyI編碼基因的兩端序列合成一對引物，上游引物含有ife H I切割位點，序列如SEQ ID NO:6所示，下游引物含有歷·/ d III切割位點，其序列如SEQ ID N0:7所示。以含有IFNY 1編碼基因的PTZ57R/T質(zhì)粒為模板，進行PCR擴增，得到特異擴增的單一條帶，產(chǎn)物大小在550 bp左右，電泳結(jié)果如圖2。將PCR擴增產(chǎn)物克隆至原核表達載體 pET22b上，得到重組表達載體(其構(gòu)建過程如圖4所示)。表達載體中的外源基因序列經(jīng)測序鑒定正確。2.黑青斑河飩干擾素IFNYl基因的表達
將步驟1中所構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)?；蚬こ叹暳呀馍锨褰?jīng) SDS-PAGE電泳分析表明，工程菌在受IPTG誘導(dǎo)后與無IPTG誘導(dǎo)的總菌蛋白相比在約35 kDa的地方出現(xiàn)一條蛋白條帶，與軟件估算的含有Trx融合蛋白的IFN γ 1重組蛋白分子量大小相近(圖5)。經(jīng)rEK酶切除Trx融合蛋白后，SDS-PAGE電泳分析表明，IFN γ 1重組目的蛋白約在18.0—25.0 kDa之間的地方出現(xiàn)一條蛋白條帶，與軟件估算的重組IFN γ 1蛋白分子量大小相近(圖6)。對培養(yǎng)時間，誘導(dǎo)濃度，溫度等條件的優(yōu)化得出基因工程菌的最佳培養(yǎng)條件為接單菌落至5 ml的含氨芐青霉素LB加富液體培養(yǎng)基中，37°C，250 rpm，振蕩培養(yǎng)過夜；按1 50體積比接種到200 ml 37°C預(yù)熱的含氨芐青霉素TB液體培養(yǎng)基中，37°C，250 rpm，培養(yǎng)至0D600達到0. 6 ；在30°C，加入IPTG至終濃度0. 3mM,對IFN γ 1蛋白表達工程菌誘導(dǎo)7h， 可獲得最大的可溶性重組蛋白表達量。3.重組黑青斑河飩干擾素IFNYl蛋白的純化
將IFNyI蛋白表達工程菌總菌體用鹽酸胍裂解液洗滌，再用結(jié)合緩沖液重懸，超聲處理后，高速離心獲得裂解上清液，經(jīng)固定化金屬配體親和層析純化，收集洗脫的蛋白， SDS-PAGE分析重組蛋白的表達和層析的結(jié)果。從SDS-PAGE結(jié)果可以得出6XHis-黑青斑河飩干擾素IFNy 1基因編碼的蛋白能被固定化鎳金屬親和層析柱所吸附，用洗脫緩沖液洗鎳層析柱時，能把目的蛋白洗下，經(jīng)透析后獲得黑青斑河飩干擾素IFN y 1重組蛋白(如圖5中3)。獲得的IFNy 1重組蛋白N端含有Trx融合蛋白，經(jīng)rEK酶切除融合蛋白后，獲得單一的IFNyI目的蛋白(圖6中1)。實施例4.黑青斑河飩干擾素IFNYl對免疫相關(guān)基因表達影響的活性分析
頭腎細胞分離如實施例2，將細胞數(shù)調(diào)整至1 X IO7 /mL，分別向6孔培養(yǎng)板各孔中加入2 mL上述細胞懸浮液；分別向各分組孔中加入終濃度為1 ng/mL，10 ng/mL和100 ng/ mLIFNYl蛋白的完全培養(yǎng)基2 mL，并設(shè)置陰性對照組(細胞懸浮液和完全培養(yǎng)基各2 mL)。 將細胞培養(yǎng)板置于27°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，孵育4 h后收集各孔細胞，Real Time-PCR 檢測IFN Yl蛋白對ISG15和MX基因表達的影響。其中ISG15基因表達所用引物上游引物序列如SEQ ID NO: 12，下游引物序列如SEQ ID NO: 13 ;MX基因表達所用引物上游引物序列如SEQ ID NO: 14，下游引物序列如SEQ ID NO: 15。18s rRNA作為內(nèi)參基因來調(diào)節(jié)各樣品模板cDNA量，反映IFN y 1蛋白的活化能力及對下游基因表達的影響。18s rRNA基因的上游引物序列如SEQ ID N0:8，下游引物序列如SEQ ID N0:9。每組六個重復(fù)，數(shù)據(jù)用平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤表示，*表示與對照組有顯著差異(P<0. 05)，結(jié)果如圖7所示。結(jié)果表明，在頭腎細胞中，1 ng/ml和10 ng/ml的IFN γ 1蛋白孵育頭腎細胞4小時后能顯著上調(diào)ISG15 mRNA水平，而高濃度的蛋白則對ISG15轉(zhuǎn)錄沒有顯著影響。
魚類所特有的IFN γ 1各濃度均能顯著性抑制MX基因的表達，表明IFN γ 1可能是I型IFN起效的負調(diào)控因子。
權(quán)利要求
1.一種黑青斑河飩干擾素IFNY 1，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
2.權(quán)利要求1所述黑青斑河飩干擾素IFNy1的編碼基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
3.權(quán)利要求2所述黑青斑河飩干擾素IFNγ 1的編碼基因的制備方法，其特征在于以黑青斑河飩總mRNA為模板，以RNA Oligo dT，其序列如SEQ ID NO:3為引物，進行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA ；再以cDNA為模板，設(shè)計上游引物SEQ ID N0:4，下游引物SEQ ID N0:5，進行PCR， 得到權(quán)利要求2所述黑青斑河飩干擾素IFN γ 1的編碼基因。
4.權(quán)利要求1所述黑青斑河飩干擾素IFNYl的制備方法，是將黑青斑河飩干擾素 IFNyl的編碼基因克隆至表達載體，得到重組表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，經(jīng)誘導(dǎo)后收集菌體，純化、酶切，得到黑青斑河飩干擾素IFNy 1。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述表達載體為大腸桿菌表達載體 pET32a，重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建包括以下步驟以含黑青斑河飩干擾素IFNy 1編碼基因的質(zhì)粒為模板，設(shè)計上游引物SEQ ID N0:6，下游引物SEQ ID NO: 7進行PCR，PCR產(chǎn)物克隆到 pET32a上，得到重組表達質(zhì)粒。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的培養(yǎng)條件為含氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基，300C，250rpm振蕩培養(yǎng)過夜，再接種到37°C預(yù)熱的含氨芐青霉素TB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至0D600達到0. 6。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述誘導(dǎo)為加入IPTG至終濃度為 0. 3mmol/L，誘導(dǎo)時間為7小時。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述純化是將總菌體用BugBuster Master Mix混勻重懸，室溫下孵育10_20min ;4°C離心、沉淀用Bug Buster Master Mix 重懸、4°C再離心，移去上清，沉淀即包涵體；將包涵體重懸于經(jīng)1:10稀釋的Bug Buster Master Mix中，4°C離心，最終沉淀加鹽酸胍裂解液洗滌，鹽酸胍裂解液的pH7. 8，含 500mmol/L NaCl。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述酶切是用rEK酶。
10.權(quán)利要求1所述黑青斑河飩干擾素IFNy 1在制備魚類免疫調(diào)節(jié)添加劑或魚類免疫佐劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種黑青斑河鲀干擾素IFNγ1蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，該蛋白編碼基因的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示，編碼基因的制備方法，是用引物序列SEQIDNO:4和SEQIDNO:5為引物克隆得到干擾素蛋白IFNγ1的編碼基因；同時還公開了干擾素蛋白IFNγ1的制備方法，是將黑青斑河鲀IFNγ1的編碼基因克隆至表達載體，得到重組表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，經(jīng)誘導(dǎo)后收集菌體，純化、酶切，得到黑青斑河鲀干擾素IFNγ1。本發(fā)明的黑青斑河鲀干擾素IFNγ1可以用于制備魚類免疫調(diào)節(jié)添加劑或免疫佐劑，具有誘導(dǎo)魚類免疫基因表達的作用。
文檔編號C07K14/57GK102180962SQ20111006445
公開日2011年9月14日 申請日期2011年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月17日
發(fā)明者冷婷婷, 盧丹琪, 張旭, 易詩白, 林浩然, 貝錦新, 陳潔琳 申請人:中山大學(xué)