專利名稱：一種濃縮干燥肽段樣品的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)及多肽加工處理領域，特別是涉及一種濃縮干燥肽段樣品的方法。
背景技術：
隨著人類基因組計劃的實施和推進，生命科學研究已進入了后基因組時代。在這個時代，生命科學的主要研究對象是功能基因組學，包括結(jié)構基因組研究和蛋白質(zhì)組研究等。盡管現(xiàn)在已有多個物種的基因組被測序，但在這些基因組中通常有一半以上基因的功能是未知的。目前功能基因組中所采用的策略，如基因芯片、基因表達序列分析等，都是從細胞中mRNA的角度來考慮的，其前提是細胞中mRNA的水平反映了蛋白質(zhì)表達的水平。但事實并不完全如此，從DNA、mRNA到蛋白質(zhì)，存在三個層次的調(diào)控，即轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控，翻譯水平調(diào)控，翻譯后水平調(diào)控。從mRNA角度考慮，實際上僅包括了轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控，并不能全面代表蛋白質(zhì)表達水平。更重要的是，蛋白質(zhì)復雜的翻譯后修飾、蛋白質(zhì)的亞細胞定位或遷移、 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用等則幾乎無法從mRNA水平來判斷。毋庸置疑，蛋白質(zhì)是生理功能的執(zhí)行者，是生命現(xiàn)象的直接體現(xiàn)者，對蛋白質(zhì)結(jié)構和功能的研究將直接闡明生命在生理或病理條件下的變化機制。蛋白質(zhì)本身的存在形式和活動規(guī)律，如翻譯后修飾、蛋白質(zhì)間相互作用以及蛋白質(zhì)構象等問題，仍依賴于直接對蛋白質(zhì)的研究來解決。雖然蛋白質(zhì)的可變性和多樣性等特殊性質(zhì)導致了蛋白質(zhì)研究技術遠遠比核酸技術要復雜和困難得多，但正是這些特性參與和影響著整個生命過程。傳統(tǒng)的對單個蛋白質(zhì)進行研究的方式已無法滿足后基因組時代的要求。要對生命的復雜活動有全面和深入的認識，必然要在整體、動態(tài)、網(wǎng)絡的水平上對蛋白質(zhì)進行研究。 因此在上世紀90年代中期，國際上產(chǎn)生了一門新興學科-蛋白質(zhì)組學(Proteomics)，它是以細胞內(nèi)全部蛋白質(zhì)的存在及其活動方式為研究對象。可以說蛋白質(zhì)組研究的開展不僅是生命科學研究進入后基因組時代的里程碑，也是后基因組時代生命科學研究的核心內(nèi)容之一。國際上蛋白質(zhì)組研究進展十分迅速，不論基礎理論還是技術方法，都在不斷進步和完善。相當多種細胞的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫已經(jīng)建立，相應的國際互聯(lián)網(wǎng)站也層出不窮。蛋白質(zhì)組學一經(jīng)出現(xiàn)，就有兩種研究策略。一種可稱為“竭澤法”，即采用高通量的蛋白質(zhì)組研究技術分析生物體內(nèi)盡可能多乃至接近所有的蛋白質(zhì)，這種觀點從大規(guī)模、系統(tǒng)性的角度來看待蛋白質(zhì)組學，也更符合蛋白質(zhì)組學的本質(zhì)。但是，由于蛋白質(zhì)表達隨空間和時間不斷變化，要分析生物體內(nèi)所有的蛋白質(zhì)是一個難以實現(xiàn)的目標。另一種策略可稱為“功能法”，即研究不同時期細胞蛋白質(zhì)組成的變化，如蛋白質(zhì)在不同環(huán)境下的差異表達， 以發(fā)現(xiàn)有差異的蛋白質(zhì)種類為主要目標。就現(xiàn)有的蛋白質(zhì)組研究技術，無論是哪種研究策略都需要將大分子的蛋白質(zhì)酶解消化成肽段之后才能較好地應用質(zhì)譜技術進行肽段信息分析，進而獲得復雜的大分子蛋白質(zhì)的信息。酶解消化后的肽段樣品，經(jīng)脫鹽等處理后，其肽段濃度一般偏低，需要進一步濃縮干燥后重新定容定濃度才適合上質(zhì)譜儀進行分析鑒定。目前肽段樣品的濃縮干燥方法主要有真空凍干和常溫真空抽干，兩者共有的缺點是較大的時間成本，且真空凍干機價格昂貴，常溫真空抽干在抽干過程中肽段樣品容易被蛋白酶進一步降解，不利于準確信息的獲取。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對上述濃縮干燥方法中存在的時間長、成本高、肽段樣品容易降解等問題，提供一種簡便、快速、低成本、高效率的濃縮干燥肽段樣品的方法。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術方案本發(fā)明公開了一種濃縮干燥肽段樣品的方法，所述方法包括采用加熱蒸干的方式使肽段樣品溶液蒸發(fā)，且肽段樣品溶液為中性溶液。需要說明的是，本發(fā)明中，加熱蒸干的溫度不能太高或太低，加熱溫度過低所需加熱時間長，溫度過高容易沸騰，兩種情況均可能會導致肽段分子的損失或破壞，因此，優(yōu)選的，加熱溫度不超過90°c，為了減少蒸干所用的時間，更優(yōu)選的加熱溫度為50 90°C，最優(yōu)選為80 90°C。本發(fā)明中，進一步的，所述方法包括如下步驟A.對蛋白質(zhì)樣品進行酶解消化，制備得到中性的肽段樣品溶液，需要指出的是，樣品溶液呈過酸或過堿狀態(tài)均會使肽段容易發(fā)生降解，因此肽段樣品溶液不能酸性或者堿性太高，優(yōu)選的肽段樣品溶液的PH值為pH6. 5-7. 5 ；B.用加熱蒸干的方式使肽段樣品溶液蒸發(fā)。優(yōu)選的，上述步驟B包括將肽段樣品溶液置于1.5mL離心管內(nèi)，加熱使離心管內(nèi)樣品溶液蒸發(fā)至體積剩余100-200 μ L時，對離心管進行震蕩處理，使蒸發(fā)過程中殘留在管壁的肽段溶解于離心管內(nèi)剩余的樣品溶液中，離心，使樣品溶液甩至離心管底，繼續(xù)加熱， 直至溶液完全蒸發(fā)；需要指出的是，上述溶液蒸發(fā)至體積剩余100-200 μ L是相對于1. 5mL 離心管的，對于其它容量較大的離心管，溶液體積剩余量按比例擴大。更進一步的，上述方法在步驟A和步驟B之間還包括將步驟A處理后的樣品，進行高效液相色譜分離和/或除鹽處理。本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述酶解消化為溶液內(nèi)酶解消化或者膠內(nèi)酶解消化；所述溶液內(nèi)酶解消化是指蛋白質(zhì)樣品在溶液中以溶解狀態(tài)的形式被酶解消化；膠內(nèi)酶解消化是指蛋白質(zhì)樣品以在膠體(如聚丙烯酰胺凝膠)內(nèi)的形式直接被酶解消化。本發(fā)明中，上述方法的步驟B中加熱使用的儀器優(yōu)選為金屬浴。優(yōu)選的，上述方法中對離心管進行震蕩處理為渦旋震蕩處理l-5min，離心為 13000-15000g，離心 3-10min。由于采用以上技術方案，本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明針對肽段的濃縮干燥方法，克服了蛋白質(zhì)研究領域中通常具有的“肽段受熱容易變性、降解或斷裂”的技術偏見，突破了“肽段干燥必須在低溫或常溫條件下進行”的傳統(tǒng)思維，采用直接加熱蒸干的方式，具有操作簡易、快速有效、成本低廉等優(yōu)點，且能保證干燥后的肽段不變性不降解。本發(fā)明的方法與其他濃縮干燥方法相比，是其他方法如常溫真空抽干時間的3/20，大大縮短了樣品處理時間；整個操作過程只需要幾個簡單的手工操作，簡單方便；處理時間短且有效地抑制了蛋白酶對肽段的進一步降解，有利于后期得到更好的數(shù)據(jù)結(jié)果；只需要幾個簡單常用的儀器，所獲得的濃縮干燥樣品適合于后續(xù)的蛋白質(zhì)組學研究。


圖1是本發(fā)明實施例中第一批平行實驗的總離子流圖，由上往下分別為90°C加熱蒸干、70°C加熱蒸干、50°C加熱蒸干、常溫真空抽干處理肽段的總離子流圖；圖2是本發(fā)明實施例中第二批平行實驗的總離子流圖，由上往下分別為90°C加熱蒸干、70°C加熱蒸干、50°C加熱蒸干、常溫真空抽干處理肽段的總離子流圖。
具體實施例方式本發(fā)明采用直接加熱蒸干濃縮方法對肽段樣品進行濃縮處理，具體的包括對蛋白質(zhì)樣品進行酶解消化，獲得肽段樣品溶液，優(yōu)選的可以采用蛋白質(zhì)溶液內(nèi)酶解消化或者膠內(nèi)酶解消化；所述溶液內(nèi)酶解消化是指蛋白質(zhì)樣品在溶液中以溶解狀態(tài)的形式被酶解消化；膠內(nèi)酶解消化是指蛋白質(zhì)樣品以在膠體(如聚丙烯酰胺凝膠)內(nèi)的形式直接被酶解消化，例經(jīng)過SDS-PAGE分離后的蛋白質(zhì)可以直接以在膠內(nèi)的形式被酶解消化(需要將膠塊切碎成小膠粒，以增加酶解效率)。膠內(nèi)消化的優(yōu)點是蛋白質(zhì)樣品被固定在膠體內(nèi)，可通過簡單的清洗步驟去除其他雜質(zhì)后再酶解消化，得到較純的肽段樣品。缺點是消化效率較低。 并且，在本發(fā)明的處理過程中，溶液呈過酸或過堿狀態(tài)均會使肽段容易發(fā)生降解，因此肽段樣品溶液不能酸性或者堿性太高，優(yōu)選的肽段樣品溶液的PH值為pH6. 5-7. 5。然后，將上述處理的肽段樣品溶液轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，加熱使溶液蒸發(fā)，優(yōu)選的，將肽段樣品轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，打開離心管蓋進行加熱蒸發(fā)，更優(yōu)選的采用金屬浴進行加熱，需要指出的是，在上述優(yōu)選方案中，采用的離心管在加熱過程中不能有管壁多聚物的溶出，以保證肽段樣品不被污染或者破壞，而采用金屬主要是利用其加熱速度快的優(yōu)點，其它能夠快速加熱的儀器也具有同等效果；在離心管內(nèi)樣品溶液蒸干至體積剩余 100-200 μ L時，對樣品進行震蕩處理，使蒸發(fā)過程中殘留在管壁的肽段溶解于離心管內(nèi)剩余的樣品溶液中；優(yōu)選的，采用渦旋震蕩使蒸發(fā)過程中殘留在管壁的肽段溶解，震蕩時間為 l-5min;需要指出的是渦旋震蕩具有快速有效的效果，其它能到達同等目的的方法也同樣可行；并且，離心管內(nèi)剩余溶液的體積也是基于使蒸干后肽段盡量聚集在一起的考慮，因此根據(jù)不同的離心管，離心管內(nèi)樣品溶液體積剩余量可以相應調(diào)整，使得溶液剛好夠覆蓋于管底即可。最后，將上述震蕩處理的樣品溶液甩至離心管底，優(yōu)選的離心速度為 13000-15000g，離心3-lOmin ；需要指出的是離心只是為了讓溶液甩至管底，在試驗允許范圍內(nèi)調(diào)整離心速度或離心時間都是可行的；將樣品繼續(xù)加熱，直至溶液完全蒸發(fā)，即獲得濃縮蒸干的肽段；需要指出的是，蒸干后管底的固體即肽段樣品，根據(jù)試驗目的的要求，還可以采用不同的溶劑復溶肽段樣品，然后用于后續(xù)試驗。進一步的，本發(fā)明的方法中，在樣品進行加熱蒸干前還包括對樣品進行高效液相色譜分離和/或除鹽處理。需要指出的是，高效液相色譜分離可以降低肽段樣品的復雜性， 有利于質(zhì)譜鑒定，但是會造成部分樣品的損失并增加成本，具體實驗中可根據(jù)研究需要進行選擇。鹽離子會對肽段的后續(xù)質(zhì)譜檢測造成影響，影響電噴霧離子化以及質(zhì)譜信號靈敏度等，因此需要進行除鹽處理，但對于樣品中不含鹽離子的肽段溶液則不需要進行該步驟。 本發(fā)明中，優(yōu)選的采用Strata X除鹽柱進行除鹽處理。本發(fā)明中，在加熱蒸干時，加熱的溫度不能太高或太低，加熱溫度過低所需加熱時間長，溫度過高容易沸騰，均可能會導致肽段分子的損失或破壞，因此，本發(fā)明的加熱溫度不超過90°C，為了減少加熱蒸干的時間，優(yōu)選的加入溫度為50 90°C，更優(yōu)選為80 90 "C。下面以酵母蛋白酶解消化后得到的肽段的濃縮干燥過程為例對本發(fā)明的方法作進一步詳細說明，以下實施例僅僅對本發(fā)明進行進一步的說明，不應理解為對本發(fā)明的限制。實施例1酵母蛋白的提取制備及還原烷基化(1)酵母蛋白的提取制備取液體培養(yǎng)的酵母細胞5X IO8個，SOOOg離心5min，去培養(yǎng)基；用去離子水懸浮洗滌酵母細胞，8000g離心5min去上清，重復三次，除去培養(yǎng)基成分；在酵母細胞中加ImL Lysis Buffer (0. lmol/L Na0H+0. 05mol/L EDTA+2% SDS+30mmol/L DTT)，制成細胞懸浮液， 90°C煮 IOmin ；加 25yL 4mol/L 的乙酸(LysisBuffer 4M 乙酸=40 1)渦旋震蕩 30s， 90°C煮IOmin ；20000g，離心5min，取上清；在上清中加入4倍體積的甲醇(甲醇于_20°C預冷)，渦旋震蕩；20000g離心IOmin,去上清，風干沉淀；加200 μ L-500 μ L裂解液(8mol/L 尿素 +50mmol/LTris base (pH8. 0))，終濃度為 lmmol/L 的 PMSF、2mmol/L 的 EDTA 混勻，置于冰上5min后加入10mmol/L DTT混勻，再冰浴超聲5min，超聲波周期lsec/2sec ；30000g離心15min，上清即為蛋白溶液。定量，電泳檢測。(2)還原烷基化取120 μ g制備好的酵母蛋白，加入lmol/L的DTT至終濃度為lOmmol/L，震蕩混勻，短暫離心，56°C水浴Ih ；加入lmol/L的IAM至終濃度為lOOmmol/L，震蕩混勻，短暫離心，室溫暗室放置45min ；加入4倍體積的冷丙酮_20°C沉淀濁；20000g離心30min。實施例2酵母蛋白的酶解消化還原烷基化后的酵母蛋白加入100 μ L 25mmol/L的NH4HCO3超聲輔助復溶后，按胰蛋白酶酵母蛋白=1 50的量加入胰蛋白酶，酶解消化16h。實施例3肽段的除鹽用strata X試劑盒除鹽，甲醇ImL活化柱子，用注射器和轉(zhuǎn)接筒推，保持流速為3 滴/秒過柱。5 %乙腈ImL平衡柱子，保持流速為1滴/秒過柱。消化后的肽段樣品用水稀釋至500 μ L，加到柱中，保持流速為1滴/秒過柱。5%乙腈ImL沖洗除鹽，保持流速為1滴/秒過柱。80%乙腈400 μ L洗脫肽段，保持流速為1滴/秒，加入三次洗脫，收集樣品并編號。實施例4肽段樣品的加熱蒸干將除鹽后的肽段樣品用1.5mL進口離心管平均分裝成四等分，每等份體積為 300 μ L，分別用90°C加熱蒸干、70°C加熱蒸干、50°C加熱蒸干和常溫真空抽干(作對照)對肽段樣品進行濃縮干燥。90°C加熱蒸干打開離心管蓋，置于金屬浴90°C加熱至管內(nèi)液體剩 100yL-200yL時，取出離心管，蓋上管蓋，漩渦震蕩Imin后15000g離心5min。打開管蓋后放回金屬浴90°C加熱至蒸干。70°C加熱蒸干打開離心管蓋，置于金屬浴70°C加熱至管內(nèi)液體剩 100yL-200yL時，取出離心管，蓋上管蓋，漩渦震蕩Imin后15000g離心5min。打開管蓋后放回金屬浴70°C加熱至蒸干。50°C加熱蒸干打開離心管蓋，置于金屬浴50°C加熱至管內(nèi)液體剩 100yL-200yL時，取出離心管，蓋上管蓋，漩渦震蕩Imin后15000g離心5min。打開管蓋后放回金屬浴50°C加熱至蒸干。常溫真空抽干打開離心管蓋，放入常溫真空抽干機抽干為止。上述四種方式處理的相同肽段樣品所需時間如表1所示。由表1可以看出，優(yōu)選 90°C加熱蒸干時，快速高效，大大縮短了處理時間。表1不同濃縮干燥方式所需時間
權利要求
1.一種濃縮干燥肽段樣品的方法，其特征在于所述方法包括采用加熱蒸干的方式使肽段樣品溶液蒸發(fā)，且肽段樣品溶液為中性溶液。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述加熱蒸干的溫度不超過90°C。
3.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于所述加熱蒸干的溫度為50 90°C。
4.根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征在于所述加熱蒸干的溫度為80 90°C。
5.根據(jù)權利要求1 4任意一項所述的方法，其特征在于所述方法包括如下步驟A.對蛋白質(zhì)樣品進行酶解消化，制備得到中性的肽段樣品溶液；B.用加熱蒸干的方式使肽段樣品溶液蒸發(fā)。
6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于所述步驟B包括將肽段樣品溶液置于 1. 5mL離心管內(nèi)，加熱使離心管內(nèi)樣品溶液蒸發(fā)至體積剩余100-200 μ L時，對離心管進行震蕩處理，使蒸發(fā)過程中殘留在管壁的肽段溶解于離心管內(nèi)剩余的樣品溶液中，離心，使樣品溶液甩至離心管底，繼續(xù)加熱，直至溶液完全蒸發(fā)。
7.根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于所述方法在步驟A和步驟B之間還包括將步驟A處理后的樣品，進行高效液相色譜分離和/或除鹽處理。
8.根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于所述酶解消化為溶液內(nèi)酶解消化或者膠內(nèi)酶解消化。
9.根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于所述步驟B中加熱蒸干采用的儀器為金屬浴。
10.根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征在于所述對離心管進行震蕩處理為渦旋震蕩處理 l-5min，離心為 13000_15000g，離心 3-lOmin。
全文摘要
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)和多肽加工處理方法，具體公開了一種濃縮干燥肽段樣品的方法，包括采用加熱蒸干的方式使肽段樣品溶液蒸發(fā)，加熱溫度為不超過90℃，且肽段樣品溶液為中性溶液。本發(fā)明的濃縮干燥方法具有操作簡易、快速有效、成本低廉等優(yōu)點，整個處理時間是其他方法如常溫真空抽干時間的3/20，所獲得的濃縮肽段樣品能夠滿足后續(xù)研究分析的需要。
文檔編號C07K1/00GK102180946SQ201110062169
公開日2011年9月14日 申請日期2011年3月15日 優(yōu)先權日2011年3月15日
發(fā)明者劉瑤謹, 李啟沅, 李鑫, 林志龍, 林梁 申請人:深圳華大基因科技有限公司