專利名稱：一種束絲藻毒素的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域、分析化學(xué)及環(huán)境毒理學(xué)領(lǐng)域和水環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域，更具體涉及一種束絲藻毒素的提取和純化方法。
背景技術(shù)：
藍藻被認為是地球上第一種產(chǎn)氧的光合生物，在長期的進化過程中，這類生物形成了一套獨特的形態(tài)和生理生化機制，能夠在各種不同生境中生衍，并成為這些極端生境中唯一或主要的初級生產(chǎn)者。當(dāng)環(huán)境條件適宜時，某些藍藻能快速生長和繁殖，并能在較短時間內(nèi)形成優(yōu)勢種群，當(dāng)達到一定生物量時，這些藻類在水體表層大量聚集，形成肉眼可見的藻類聚集物，即“藍藻水華”。水華藻類在水面堆積，不但散發(fā)出腥臭味，影響景觀和旅游業(yè)，而且很多水華種類有毒性，引起牲畜、家禽、魚類等中毒甚至死亡，嚴重影響?zhàn)B殖業(yè)發(fā)展；同時，藻類過度繁殖是導(dǎo)致湖泊水環(huán)境惡化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，有害藻類的過度增殖，尤其產(chǎn)毒素藍藻的危害是抑制湖泊中其他生物種群、造成種群單一化的重要原因，同時給人類健康構(gòu)成了潛在的威脅。藍藻水華引起的一系列環(huán)境和健康問題，正受到全世界各國的高度重視。目前在藍藻水華種類中約有30多種是產(chǎn)毒的，主要包括微囊藻(Microcystis)、魚腥藻(Anabanena)、束絲藻(Aphanizomenon)、顫藻(Oscillatoria)、節(jié)球藻(Nodularia)等。其中，束絲藻是一種較為常見的水華優(yōu)勢種類，它產(chǎn)生的麻痹性貝毒素是一種典型Na+離子阻滯劑，通過阻滯Na+通過膜進入細胞內(nèi)，使細胞失去極化狀態(tài)，從而廣泛阻斷神經(jīng)沖動的傳導(dǎo)。其作用時間一般在一到幾分鐘，因而被稱為“快速致死因子(VFDF)”。目前由于麻痹性貝毒毒素在國際間的傳送受到了嚴格的限制，而我國正處于研究的初始階段，且由于缺乏毒素標準品，因此對束絲藻毒素的研究就更受到限制。對藍藻毒素的提取，目前一般采用甲醇抽提的方法，提取液過Sep-pak C18固相萃取柱純化時，一般也都采用甲醇—水溶液洗脫，但在束絲藻毒素分析中，這些方法會造成毒素的降解，使分析結(jié)果偏低甚至全部呈現(xiàn)陰性結(jié)果，因此是不可行的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種束絲藻毒素的提取方法，該方法不僅簡便易行、容易操作，且可以有效地對提取物進行純化，方便進一步的分析和檢測，使分析結(jié)果更加可靠。
為達到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施針對我國目前的研究狀況易于進行推廣，可有效地對日益嚴重的水體富營養(yǎng)化和有毒束絲藻水華進行監(jiān)測和預(yù)警工作，其步驟如下1.材料的采集與處理用孔徑為60-70μm濾網(wǎng)收集培養(yǎng)或于自然水華中采集水華束絲藻，-70--100℃冷凍干燥；2.提取步驟稱取0.3-1.0克冷凍干燥的束絲藻藻粉，加入15-25毫升提取液，先用超聲波破碎10-15分鐘，然后于20-25℃下磁力攪拌提取25-40分鐘。0-4℃，6000-10000r/min離心10-15分鐘，收集上清，并將離心殘渣用10-15毫升提取液重復(fù)提取一次，合并上清液，得毒素粗提物；3.提取液濃縮用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將樣品濃縮，然后用2-3毫升雙蒸水溶解樣品；4.提取液純化將步驟2所得樣品過預(yù)先用8-10毫升100％甲醇活化、8-10毫升雙蒸水平衡的Sep-pak C18固相萃取柱；5.提取物洗脫先用1-3毫升雙蒸水預(yù)淋洗，再用8-15毫升酸化的甲醇進行洗脫，洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮；6.提取物保存將最終濃縮的提取物用0.01-0.1M的乙酸溶解，調(diào)pH值至2.0-4.0，-20℃以下保存?zhèn)溆谩?br> 本發(fā)明采用乙酸溶液抽提、固相萃取、酸化甲醇洗脫的方法，本發(fā)明方法易行，操作簡便，而且避免了毒素的降解和損失，使分析結(jié)果更安全可靠，能更真實地反映出束絲藻的產(chǎn)毒情況，可有效地對日益嚴重的水體富營養(yǎng)化和有毒束絲藻水華進行監(jiān)測和預(yù)警工作。
具體實施例方式
一種束絲藻毒素的提取方法，包括如下步驟1.材料的采集與處理用孔徑為60μm濾網(wǎng)收集培養(yǎng)或于自然水華中采集束絲藻，-90℃冷凍干燥。
2.提取步驟稱取冷凍干燥的束絲藻藻粉0.5克，加入20毫升提取液，先用超聲波破碎10分鐘，然后于室溫下磁力攪拌提取30分鐘。4℃，8000r/min離心15分鐘，收集上清，并將離心殘渣用15毫升提取液重復(fù)提取一次，合并上清液，得毒素粗提物；3.提取液濃縮用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將提取液濃縮，然后用2毫升雙蒸水溶解提取濃縮物；4.提取液純化將步驟2所得提取液過預(yù)先用10毫升100％甲醇活化、10毫升雙蒸水平衡的Sep-pak C18柱固相萃取柱；5.提取物洗脫先用2毫升雙蒸水預(yù)淋洗，再用10毫升磷酸酸化(pH3.0)的甲醇進行洗脫，洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮；6.提取物保存將最終濃縮提取物用0.01M的乙酸溶液溶解，調(diào)pH值至3.0，-20℃以下保存?zhèn)溆谩?br> 權(quán)利要求
1.、一種束絲藻毒素的提取方法，包括下列步驟A.材料的采集與處理用孔徑為60-70μm濾網(wǎng)收集培養(yǎng)或于自然水華中采集束絲藻，-70--100℃冷凍干燥；B.提取步驟稱取0.3-1.0克冷凍干燥的束絲藻藻粉，加入15-25毫升0.01-0.1M乙酸溶液，先用超聲波破碎10-15分鐘，然后于20-25℃磁力攪拌提取25-40分鐘，0-4℃，6000-10000r/min離心10-15分鐘，收集上清，并將離心殘渣用10-15毫升乙酸溶液提取液重復(fù)提取一次，合并上清液，得毒素粗提物；C.提取液濃縮用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將樣品濃縮，然后用2-3毫升雙蒸水溶解提取濃縮物；D.提取液純化將步驟B所得提取物過預(yù)先用8-10毫升100％甲醇活化、8-10毫升雙蒸水平衡的Sep-pak C18固相萃取柱；E.提取物洗脫先用1-3毫升雙蒸水預(yù)淋洗，再用8-15毫升酸化的甲醇進行洗脫，洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮；F.提取物保存將最終濃縮的提取物用0.01-0.1M的乙酸溶液溶解，調(diào)pH值至2.0-4.0，-20--40℃保存?zhèn)溆谩?br> 全文摘要
本發(fā)明公開了一種束絲藻毒素的提取方法，首先是材料的采集，采集水華束絲藻，冷凍干燥；其次是稱取冷凍干燥的束絲藻藻粉，加入乙酸，破碎，在室溫下磁力攪拌提取，離心，收集上清；第三是粗提物的純化，將粗提物過固相萃取柱，用酸化甲醇洗脫，并將洗脫液濃縮；第四是將濃縮樣品用乙酸溶液溶解，調(diào)pH值，低溫保存。本發(fā)明方法易行，操作簡便，安全可靠，可廣泛地用于對有毒束絲藻水華的監(jiān)測和預(yù)警工作。
文檔編號C07K1/14GK1563024SQ20041001286
公開日2005年1月12日 申請日期2004年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月20日
發(fā)明者劉永定, 劉永梅, 陳偉, 沈銀武, 李敦海, 劉輝宇, 邢偉 申請人:中國科學(xué)院水生生物研究所