專利名稱：一種從霞水母刺絲囊毒素內(nèi)分離熱激蛋白60的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)，具體的說(shuō)是一種從霞水母(Cyanea nozakii)刺絲囊細(xì)胞毒素中分離純化熱激蛋白60 (Heat Shock Protein60, Hsp60)的方法。
背景技術(shù)：
熱激蛋白(Hsp)又稱熱休克蛋白或應(yīng)激蛋白，是細(xì)胞在應(yīng)激原刺激下所生成的一組蛋白質(zhì)。根據(jù)其分子量的大小可將Hs ρ分為高分子量熱激蛋白(HMW-Hsp)和低分子量熱激蛋白(LMW-Hsp)。HMW-Hsp主要合成于哺乳動(dòng)物、昆蟲和酵母等細(xì)胞中，可以和激素結(jié)合，維持其特殊構(gòu)象，LMW-Hsp主要合成于植物中。按照SDS電泳的表觀分子量大小可以把 Hsp分為五大類Hspl00、Hs p90、Hsp70、Hsp60及小分子量熱激蛋白sHsp。Hsp的生理功能一致認(rèn)為其具有分子伴侶作用，即協(xié)助蛋白質(zhì)跨膜運(yùn)輸，防止蛋白質(zhì)前體積累并協(xié)助蛋白質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)移，與未折疊蛋白質(zhì)形成絡(luò)合物以維持其轉(zhuǎn)移能力，維持蛋白質(zhì)的正常折疊狀態(tài)，促進(jìn)錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)降解；在蛋白質(zhì)從頭折疊及應(yīng)激條件下能起到穩(wěn)定多肽鏈、防止蛋白質(zhì)失活的作用。它參與靶蛋白活性和功能調(diào)節(jié)，卻不是靶蛋白的組成部分。熱激蛋白的提取純化方法根據(jù)不同的材料其具體方法也不盡相同，例如從鯉魚的肝臟中提取熱激蛋白的方法是，先將鯉魚肝臟組織破碎后超聲波破碎提取，然后在將其鹽析后上DEAE纖維素離子交換層析和凝膠過濾G75后獲得Hsp70。此外有人采用低滲勻漿、 超速離心、ConA-S^harose親和層析、ADP-Agarose親和層析和DEAE離子交換的親和層析， 從熱處理的小鼠肝癌細(xì)胞中分離純化到Hsp70。還有研究者用腺苷二磷酸瓊脂糖柱免疫親和層析法從水牛淋巴細(xì)胞中純化到Hsp70。但是到目前為止還很少有關(guān)Hs p60的提取研究報(bào)道。Hsp60是熱激蛋白重要的成員之一，它的結(jié)構(gòu)高度保守，在電子顯微鏡照片上， Hsp60分子均由14個(gè)亞基組成，每七個(gè)亞基構(gòu)成一個(gè)環(huán)狀，整體結(jié)構(gòu)象兩個(gè)面包圈壘成的桶，這個(gè)桶的內(nèi)腔為折疊蛋白提供了一個(gè)保護(hù)性環(huán)境。Hsp60s最重要的功能之一就是作為分子伴侶參與新生肽鏈的折疊、寡聚蛋白質(zhì)組裝和蛋白質(zhì)的跨膜運(yùn)輸線粒體。Hsp60主要參與核編碼的運(yùn)輸入線粒體的蛋白質(zhì)的加工、定位和裝配。它還能夠影響線粒體膜上F1-ATP 酶復(fù)合體的裝配和線粒體蛋白Fieskei^e/s和eytobz正確加工和定位。葉綠體內(nèi)Hsp60是由核基因編碼，在非熱激條件下含量很高。Hsp60另一重要功能是在脅迫下的起到保護(hù)作用。當(dāng)在熱激或是外界刺激下，體內(nèi)變性蛋白急劇增加，此時(shí)Hsp60可與變性蛋白結(jié)合，維持它們的可溶狀態(tài)，在有Mg2+和ATP存在下能夠使解折疊的蛋白質(zhì)重新折疊成有活性的構(gòu)象，或者降解。霞水母屬刺胞動(dòng)物門，缽水母綱，旗口水母目，霞水母科，觸須4m_6m.廣泛分布于我國(guó)沿海，尤其夏季會(huì)在近海區(qū)域集中出現(xiàn)，給漁業(yè)生產(chǎn)、生態(tài)環(huán)境以及游泳者都造成了嚴(yán)重的影響，尤其是毒素能使被蜇傷者出現(xiàn)皮疹、瘙癢、水腫、肌肉疼痛、血壓降低、呼吸困難甚至死亡等現(xiàn)象。水母毒素中含有重要的功能蛋白和生物活性蛋白，其中科學(xué)家已經(jīng)從其中分離出具有溶血活性、神經(jīng)毒性以及致死活性的蛋白質(zhì)(文獻(xiàn)1 :Chimg，J.J.，
3et al,2001. Partial purificationand characterization of a hemolysin (CAHl) from Hawaiian box jellyfish(Carybdea alata)venom. Toxicon 39,981-990. t ■ 2 : Sanchez-Rodriguez, J et al. Partial purification and characterization of a novel neurotoxin and three cytolysins from box jellyfish(Carybdea marsupialis) nematocyst venom. Archives of Toxicology,2006,80 :163-168.文獻(xiàn)3 :Nagai,Hiroshiet al, Isolation and Characterization of a Novel Protein Toxin from the Hawaiian Box Jellyfish(Sea Wa sp)Carybdea alata, Biochemical and Biophysical Research Communications. 2000,275 :589-594)，但是到目前為止還沒有從霞水母毒素中分離到熱激蛋白60的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供了一種從霞水母刺絲囊毒素內(nèi)分離熱激蛋白60(Hsp60)的方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種從霞水母刺絲囊毒素中分離熱激蛋白60的方法1)將從霞水母觸手中得到的霞水母刺絲囊細(xì)胞加入預(yù)冷緩沖液中破碎，破碎后低溫離心，收集上清液，待用；2)步驟1)所得上清液即為霞水母刺絲囊細(xì)胞毒素于2-6°C下對(duì)pH7.820mM Tris-HCl緩沖液透析過夜，然后低溫離心，收集上清液，待用；3)將步驟2~)所得上清液過濾，而后將其上含DEAE Sepharose Fast Flow的陰離子交換樹柱進(jìn)行分離，首先采用PH7. 820mMTris-HCl緩沖液洗脫，而后采用含有濃度分別為0. 1-2M不同濃度的NaCl的pH7. 820mM Tris-HCl緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，收集各洗脫峰， 而后用截留分子量為3kDa的超濾管濃縮，待用；4)將步驟3)用截留分子量為3kDa的超濾管濃縮的濃縮物用凝膠樹脂 Superdex75柱純化分離，采用含有濃度為0. 15-0. 5M的NaCl的pH7. 820mM Tris-HCl緩沖液洗脫，流速為0. 2-0. SmLmin-1,收集各洗脫峰，其中流出體積50mL_80mL內(nèi)的組分(第一個(gè)洗脫峰)即為熱激蛋白60。所述步驟1)霞水母觸手中得到的霞水母刺絲囊細(xì)胞為將置于-80至_20°C的低溫下保存的霞水母觸手于2-6°C自溶12-48h，自溶后利用20-60目的標(biāo)準(zhǔn)分樣篩濾去觸手殘片，而后在2-6°C下10000-15000g離心5-20min，收集下部沉淀，2_6°C冷凍干燥，待用，所述步驟1)霞水母觸手中得到的霞水母刺絲囊細(xì)胞加入pH7. 820mM Tris-HCl預(yù)冷緩沖液中，而后將其置于冰浴下用超聲波功率為200-400kw下破碎20-60min中，工作/ 間隙為5s/30s。所述步驟2)離心條件為在2-6°C下，10000-15000g離心5-20min。所述步驟3)中的過濾時(shí)將步驟2)收集的上清液用孔徑為0. 22 μ m的微孔濾膜過濾。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)1.本發(fā)明從霞水母中分離純化熱激蛋白60的方法，為獲得Hsp60提供了新的方法。2.本發(fā)明采用陰離子交換劑DEAE Sepharose Fast Flow和Superdex75分離純化
4Hsp60，具有流速快、分辨率高的特點(diǎn)，而且分離步驟少，只經(jīng)過兩步柱層析分離就能夠得到較純的Hs p60，有效地縮短了分離時(shí)間，減少了 Hsp60的活性損失。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的陰離子交換劑DEAE Sepharose !^stFlow分離霞水母毒素層析圖。圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的分子篩Superdex75分離DEAES印harose Fast Flow 0. 3M洗脫液的層析3本發(fā)明實(shí)施例提供的分子篩Superdex75Hsp60峰的SDS-PAGE電泳圖。圖4本發(fā)明實(shí)施例提供的目的蛋白Hsp60的N-端15氨基酸殘基測(cè)序鑒定結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例11)霞水母毒素刺絲囊細(xì)胞的制備將Ikg冰凍的霞水母觸手于4°C下自溶過夜后，利用20-60目(例如20、40、50、60)的標(biāo)準(zhǔn)分樣篩濾去觸手殘片，然后取上清液并在 10000g、4°C下冷凍高速離心20min并收集下層沉淀，用生理鹽水(0. 154mol .I^NaCl溶液) 于4°C反復(fù)洗滌3次至上層液澄清，并將刺絲囊細(xì)胞沉淀冷凍干燥后，-20°C下冷凍保存?zhèn)溆谩?)霞水母毒素的提取取步驟1)霞水母刺絲囊細(xì)胞0. 5g和30mLpH7.820mM Tris-HCl預(yù)冷緩沖液置于燒杯中，在冰浴下用超聲波功率為200kw下破碎30min中，工作/ 間隙為5s/30s。破碎完畢后在4°C下，IOOOOg離心20min，上清液即為霞水母刺絲囊細(xì)胞毒素，并用考馬斯亮藍(lán)法，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)定上清液中霞水母刺絲囊細(xì)胞毒素的蛋白濃度為1. Oang.mL—1。3)陰離子交換劑DEAE Sepharose Fast Flow分離霞水母毒素①上樣前樣品的預(yù)處理將提取到的霞水母刺絲囊毒素于4°C下對(duì)pH7.820mM Tris-HCl緩沖液透析過夜，然后IOOOOg冷凍離心20min，棄沉淀，收集上清液。②上樣和洗脫將上述處理好的樣品上DEAE Sepharose FastFlow柱 (1. 0X20cm)，流速為0. SmLmirT1，然后以分別含有濃度為0、0. 1,0. 2,0. 3、2M的NaCl的 PH7. 820mM Tris-HCl進(jìn)行梯度洗脫，收集各洗脫峰，同時(shí)用紫外檢測(cè)器同步檢測(cè)并收集各洗脫峰，而后用截留分子量為3kDa的Millipore超濾管濃縮，待用通過截留分子量為3kDa 的Millipore超濾管濃縮的洗脫組分即為含濃度為0. 3M的NaCl的pH7. 820mM Tris-HCl 洗脫液洗脫下的組分(參見圖1)。4)分子篩 Superdex75 分離①上樣前樣品的預(yù)處理將上述組分濃縮至lmL，然后IOOOOg冷凍離心20min，棄
沉淀，收集上清液。②上樣和洗脫取上述處理好的樣品ImL上分子篩Superdex75(l. OX 100cm)，然后以分別含有濃度為0. 15M的NaCl的pH7. 820mM Tris-HCl洗脫，流速0. ZmLmirT1，紫外檢測(cè)器同步檢測(cè)并收集各洗脫峰，其中流出體積50mL-80mL內(nèi)的組分(第一個(gè)洗脫峰)即為熱激蛋白60 (參見圖2)。 5) SDS-PAGE純度檢測(cè)將步驟4)分子篩SuperdeX75分離到的洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)。6)N_端序列測(cè)定同時(shí)將步驟4)分子篩SuperdeX75分離到的洗脫液進(jìn)行N-端序列測(cè)定(參見圖4)由上述圖3和圖4可知SuperdeX75的第一個(gè)洗脫峰為單一條帶，分子量為60kDa， 并且經(jīng)Edman降解法，測(cè)定該條帶N-端序列為APKEIKFGADAKSLM，經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)搜索結(jié)果顯示，該蛋白為熱機(jī)蛋白60。HSP60是由14個(gè)相同亞基構(gòu)成雙層環(huán)柱狀體結(jié)構(gòu)，每個(gè)環(huán)包括7個(gè)亞基，其中突出在環(huán)狀空心內(nèi)的2個(gè)亞基的疏水C-末端，能夠與新合成的、定位蛋白以及變性蛋白疏水相互作用。HSP60有3個(gè)區(qū)域一個(gè)是與其它的伴侶蛋白如HSPlO相互作用的頂端區(qū)域，一個(gè)是ATP結(jié)合位點(diǎn)，最后一個(gè)是中間的鉸鏈區(qū)域。實(shí)施例21)將2kg冰凍的霞水母觸手于6°C下自溶過夜后，用濾篩過濾去除霞水母觸手殘片，收集上清液后15000g，4°C下冷凍高速離心15min并收集下層沉淀，用生理鹽水 (0. 15mol -Γ1 NaCl溶液)于4°C反復(fù)洗滌3次至上層液澄清，并將刺絲囊細(xì)胞沉淀冷凍干燥后，-20°C下冷凍保存?zhèn)溆谩?)取1. Og步驟1)的霞水母刺絲囊細(xì)胞和50mL pH7. 820mMTris_HCl預(yù)冷緩沖液置于燒杯中，在冰浴下用超聲波功率為400kw下破碎60min中，工作/間隙為k/30s。破碎完畢后在4°C下，15000g離心15min，上清液即為霞水母刺絲囊細(xì)胞毒素，并用考馬斯亮藍(lán)法，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)定上清液中霞水母刺絲囊細(xì)胞毒素蛋白的濃度1. 26mg. ml/1。3)陰離子交換劑DEAE Sepharose Fast Flow分離霞水母毒素①上樣前樣品的預(yù)處理將提取到的霞水母刺絲囊毒素于4°C下對(duì)pH7.820mM Tris-HCl緩沖液透析過夜，然后12000g冷凍離心15min，棄沉淀，收集上清液。②上樣和洗脫將上述處理好的樣品上DEAE Sepharose Fast Flow柱 (1. 6X20cm)，流速為lmLmirT1，然后以分別含有濃度為0、0. 1、0· 2、0· 3、2Μ的NaCl的 pH7. 820mM Tris-HCl進(jìn)行梯度洗脫，收集各洗脫峰，同時(shí)用紫外檢測(cè)器同步檢測(cè)并收集各洗脫峰，而后用截留分子量為3kDa的Millipore超濾管濃縮，待用通過截留分子量為3kDa 的Millipore超濾管濃縮的洗脫組分即為含濃度為0. 3M的NaCl的pH7. 820mM Tris-HCl 洗脫液洗脫下的組分。4)分子篩 Superdex75 分離①上樣前樣品的預(yù)處理將上述組分濃縮至1. 5mL，然后12000g冷凍離心15min，
棄沉淀，收集上清液。②上樣和洗脫取上述處理好的樣品ImL上分子篩SuperdeX75 (1. 6 X 70cm)，然后以含有濃度為0. 3M的NaCl的pH7. 820mM Tris-HCl進(jìn)行洗脫，流速0. SmLmin"1,紫外檢測(cè)器同步檢測(cè)并收集各洗脫峰，其中流出體積50mL-80mL內(nèi)的組分(第一個(gè)洗脫峰)即為熱激蛋白60。實(shí)施例31)將Ikg冰凍的霞水母觸手于4°C下自溶過夜后，用濾篩過濾去除霞水母觸手殘片，收集上清液倒掉。然后10000g、4°C下冷凍高速離心20min并收集下層沉淀，用生理鹽水 (0. 154mol -L-1NaCl溶液)于4°C反復(fù)洗滌3次至上層液澄清，并將刺絲囊細(xì)胞沉淀冷凍干燥后，-20°C下冷凍保存?zhèn)溆谩?br> 2)將1. Og的霞水母刺絲囊細(xì)胞和50mL pH7. 820mM Tris-HCl預(yù)冷緩沖液置于燒杯中，在冰浴下用超聲波功率為400kw下破碎60min中，工作/間隙為5s/30s。破碎完畢后在4°C下，15000g離心15min，上清液即為霞水母刺絲囊細(xì)胞毒素，并用考馬斯亮藍(lán)法，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)定上清液中霞水母刺絲囊細(xì)胞毒素蛋白的濃度為1. 32mg. Hir103)陰離子交換劑DEAE Sepharose Fast Flow分離霞水母毒素①上樣前樣品的預(yù)處理將提取到的霞水母刺絲囊毒素于4°C下對(duì)pH7.820mM Tris-HCl緩沖液透析過夜，然后15000g冷凍離心5min，棄沉淀，收集上清液。②上樣和洗脫將上述處理好的樣品上DEAE Sepharose Fast Flow柱 (2. 6X20cm)，流速為SmLmirT1，然后以分別含有濃度為0、0. 1、0· 2、0· 3、2Μ的NaCl的 pH7. 820mM Tris-HCl進(jìn)行梯度洗脫，收集各洗脫峰，同時(shí)用紫外檢測(cè)器同步檢測(cè)并收集各洗脫峰，而后用截留分子量為3kDa的Millipore超濾管濃縮，待用通過截留分子量為3kDa 的Millipore超濾管濃縮的洗脫組分即為含濃度為0. 3M的NaCl的pH7. 820mM Tris-HCl 洗脫液洗脫下的組分。4)分子篩 Superdex75 分離①上樣前樣品的預(yù)處理將上述組分濃縮至2mL，然后15000g冷凍離心5min，棄沉
淀，收集上清液。 ②上樣和洗脫將上述處理好的樣品2mL上分子篩SuperdeX75 ()，流速 0. SmLmirT1，用含濃度為0. 5M NaCl的pH7. 820mMTris-HCl洗脫液進(jìn)行洗脫，紫外檢測(cè)器同步檢測(cè)并收集各洗脫峰。取上述處理好的樣品2mL上分子篩SuperdeX75 0. 6X60cm)，然后以分別含有濃度為0. 5M的NaCl的pH7. 820mM Tris-HCl依次洗脫，流速0. SmLmirT1，紫夕卜檢測(cè)器同步檢測(cè)并收集各洗脫峰，其中流出體積50mL-80mL內(nèi)的組分(第一個(gè)洗脫峰)即為熱激蛋白60。 上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種從霞水母刺絲囊毒素中分離熱激蛋白60的方法，其特征在于1)將從霞水母觸手中得到的霞水母刺絲囊細(xì)胞加入預(yù)冷緩沖液中破碎，破碎后低溫離心，收集上清液，待用；2)步驟1)所得上清液即為霞水母刺絲囊細(xì)胞毒素于2-6°C下對(duì)pH7.820mMTris-HCl 緩沖液透析過夜，然后低溫離心，收集上清液，待用；3)將步驟幻所得上清液過濾，而后將其上含DEAESepharoseFast Flow的陰離子交換樹柱進(jìn)行分離，首先采用PH7. 820mMTris-HCl緩沖液洗脫，而后采用含有濃度分別為 0. 1-2M不同濃度的NaCl的pH7.820mM Tris-HCl緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，收集各洗脫峰，而后用截留分子量為3kDa的超濾管濃縮，待用；4)將步驟幻用截留分子量為3kDa的超濾管濃縮的濃縮物用凝膠樹脂SuperdeX75柱純化分離，采用含有濃度為0. 15-0. 5M的NaCl的pH7. 820mM Tris-HCl緩沖液洗脫，流速為 0. 2-0. SmLmirT1，收集各洗脫峰，其中流出體積50mL_80mL內(nèi)的組分即為熱激蛋白60。
2.按權(quán)利要求1所述的從霞水母刺絲囊毒素中分離熱激蛋白60的方法，其特征在于 所述步驟1)霞水母觸手中得到的霞水母刺絲囊細(xì)胞為將置于-80至-20°C的低溫下保存的霞水母觸手于2-6°C自溶12-48h，自溶后利用20-60的標(biāo)準(zhǔn)分樣篩濾去觸手殘片，而后在 2-6°C下10000-15000g離心5_20min，收集下部沉淀，2_6°C冷凍干燥，待用，
3.按權(quán)利要求1所述的從霞水母刺絲囊毒素中分離熱激蛋白60的方法，其特征在于 所述步驟1)霞水母觸手中得到的霞水母刺絲囊細(xì)胞加入pH7.820mM Tris-HCl預(yù)冷緩沖液中，而后將其置于冰浴下用超聲波功率為200-400kw下破碎20-60min中，工作/間隙為 5s/30so
4.按權(quán)利要求1所述的從霞水母刺絲囊毒素中分離熱激蛋白60的方法，其特征在于 所述步驟幻離心條件為在2-6°C下，10000-15000g離心5_20min。
5.按權(quán)利要求1所述的從霞水母刺絲囊毒素中分離熱激蛋白60的方法，其特征在于 所述步驟幻中的過濾時(shí)將步驟幻收集的上清液用孔徑為0.22 μ m的微孔濾膜過濾。
全文摘要
本發(fā)明涉及海洋生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是一種分離純化熱激蛋白60(Heat Shock Protein 60，Hsp60)的方法。其分離方法如下水母刺絲囊細(xì)胞經(jīng)超聲破碎提取得到水母粗毒素，透析除鹽后先后利用陰離子交換和凝膠過濾技術(shù)分離到Hsp60，測(cè)得其分子量為60kDa，本發(fā)明具快速、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，為獲得Hsp60蛋白提供了新的方法。
文檔編號(hào)C07K14/435GK102153639SQ20101059689
公開日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2010年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月10日
發(fā)明者于華華, 馮金華, 劉松, 孟祥濤, 崔金會(huì), 李克成, 李榮鋒, 李鵬程, 秦玉坤, 邢榮娥 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院海洋研究所