專利名稱：曼氏裂頭蚴病es抗原的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)及血清學(xué)診斷技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種曼氏裂頭蚴病ES 抗原的制備方法。
背景技術(shù)：
曼氏裂頭蚴病是由曼氏迭宮絳蟲的幼蟲——曼氏裂頭蚴侵入人體引起的疾病。曼 氏迭宮絳蟲的中間宿主以蛙為主，人可以作為曼氏迭宮絳蟲的第二中間宿主或終宿主。在 我國(guó)部分地區(qū)，民間偏方傳說蛙肉有清涼解毒作用，由此產(chǎn)生了用蛙肉、皮等貼敷局部傷口 或膿腫，生吞蝌蚪、生食或半生食蛙肉等陋習(xí)，使曼氏裂頭蚴得以從傷口侵入或直接被吞食 而造成感染，這是我國(guó)目前曼氏裂頭蚴感染人體的主要途徑；此外，生食或半生食其他轉(zhuǎn)續(xù) 宿主(如蛇等)的肉、飲用生水或游泳時(shí)誤吞被感染的第一中間宿主劍水蚤，也可造成感染。 曼氏裂頭蚴可侵入皮下形成游走性結(jié)節(jié)，也能夠侵犯腹腔內(nèi)臟器、組織，還可以穿過橫膈侵 犯胸腔內(nèi)臟器，危害最大的則是侵入眼部和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，可致殘甚至危及生命。曼氏裂頭 蚴在人體內(nèi)的生存期可達(dá)12年之久。由于曼氏裂頭蚴可以在人體內(nèi)移行，寄生部位多變，致使臨床表現(xiàn)各不相同，并且 缺乏特異性表現(xiàn)，誤診、漏診較為普遍。病原學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)裂頭蚴雖然是曼氏裂頭蚴病確診的 依據(jù)，但通常人的感染強(qiáng)度低，在深部臟器等寄生部位不易發(fā)現(xiàn)病灶，尤其是中樞神經(jīng)系統(tǒng) 曼氏裂頭蚴病，絕大多數(shù)病例報(bào)道只有1條裂頭蚴，病原學(xué)檢查難以查見蟲體，漏檢率高， 手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)較大，故病原學(xué)診斷存在著很大的局限性。血清學(xué)檢測(cè)方法不僅創(chuàng)傷小，而且敏感 性高、特異性強(qiáng)、簡(jiǎn)便快速經(jīng)濟(jì)，尤其對(duì)輕度感染、隱性感染、早期感染、深部組織寄生的病 例，是較理想的診斷手段，可以在一定程度上彌補(bǔ)病原學(xué)和影像學(xué)診斷的不足。此外，在我 國(guó)部分農(nóng)村地區(qū)，蛙肉可清涼解毒等民間偏方根深蒂固，絕大多數(shù)報(bào)告病例有使用此偏方 的流行病學(xué)史，人群暴露率高，感染風(fēng)險(xiǎn)大，在對(duì)數(shù)量較大的易感人群進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)血清流行病 學(xué)調(diào)查或蹄檢時(shí)，血清學(xué)診斷是唯一可行的有效方法。已有學(xué)者將曼氏裂頭蚴可溶性粗抗原用于該病的血清學(xué)診斷，但是，由于曼氏裂 頭蚴與其它蠕蟲之間普遍存在有共同抗原，應(yīng)用可溶性粗抗原進(jìn)行血清學(xué)診斷雖然可獲得 較高的敏感性，但其特異性差，與其他蠕蟲感染者的交叉反應(yīng)率高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種可廣泛應(yīng)用于人和動(dòng)物且能提高曼氏裂頭蚴病診斷 特異性的曼氏裂頭蚴ES抗原的制備方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取下述技術(shù)方案
本發(fā)明所述的曼氏裂頭蚴病ES抗原的制備方法，包括下述步驟 第一步，曼氏裂頭蚴的采集曼氏裂頭蚴采集自自然感染曼氏裂頭蚴的野生動(dòng)物體內(nèi) 或?qū)嶒?yàn)感染的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)；
第二步，曼氏裂頭蚴的體外培養(yǎng)將分離出的曼氏裂頭蚴用滅菌的生理鹽水充分洗滌后，將其加入準(zhǔn)備好的1640培養(yǎng)液中，同時(shí)加入100U/ml的青霉素和100U/ml的鏈霉素，5% CO2 37 °C 培養(yǎng) 18h ；
第三步，曼氏裂頭蚴ES抗原的制備將培養(yǎng)后的曼氏裂頭蚴培養(yǎng)液用離心機(jī)4°C下2 000 g離心5 min，然后吸取上清4°C透析，至透析袋內(nèi)培養(yǎng)液變?yōu)闊o色；將透析好的培養(yǎng)液 放入大離心管中，用封口膜封口，并在封口膜上留排氣孔，置一 80°C冷凍后，用快速真空濃 縮系統(tǒng)濃縮干燥，即可得到曼氏裂頭蚴ES抗原；檢測(cè)該抗原的蛋白濃度，分裝，-80°C保存所述第三步中透析袋的處理方法為根據(jù)樣本量將透析袋剪切成合適的長(zhǎng)度，在 2%NaHC03* lmmol/L EDTA的溶液中煮沸l(wèi)Omin，用蒸餾水徹底清洗透析袋，在蒸餾水中煮 沸l(wèi)Omin，冷卻后使透析袋浸沒在水中置于4°C保存；使用前在透析袋中裝滿水，然后排出， 反復(fù)數(shù)次，將之清洗干凈。采用棋盤滴定法確定上述曼氏裂頭蚴ES抗原的最佳包被濃度為2. 5 μ g/mL。最佳血清(抗體)稀釋倍數(shù)為1 100。曼氏裂頭蚴ES抗原與抗體最佳反應(yīng)時(shí)間為lh。酶標(biāo)二抗最佳稀釋倍數(shù)為1 :5 000。ES抗原ELISA法診斷曼氏裂頭蚴病的方法為以曼氏裂頭蚴ES抗原包被濃度包 被酶標(biāo)反應(yīng)板，將待檢血清樣品稀釋至最佳反應(yīng)濃度與ES抗原反應(yīng)，加入酶標(biāo)二抗，最后 加入底物顯色，根據(jù)測(cè)定樣品的OD值來判定檢測(cè)結(jié)果，對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行血清學(xué)診斷。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于為曼氏裂頭蚴病的診斷提供了一種高度敏感和特異的診斷抗 原，尤其是提高了診斷的特異性，在曼氏裂頭蚴感染宿主及其在宿主體內(nèi)移行的過程中，曼 氏裂頭蚴的ES抗原直接暴露于宿主的免疫系統(tǒng)，是誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生免疫應(yīng)答的主要靶抗原， 在曼氏裂頭蚴病的免疫病理、免疫診斷及免疫預(yù)防等方面較可溶性粗抗原具有更大的價(jià) 值，避免了以往使用曼氏裂頭蚴蟲體可溶性抗原時(shí)交叉反應(yīng)率高的現(xiàn)象。本發(fā)明將體外培 養(yǎng)制備的曼氏裂頭蚴ES抗原作為診斷抗原，借助ELISA方法將ES抗原應(yīng)用于曼氏裂頭蚴 病的診斷，具有高度的敏感性和特異性，且穩(wěn)定性和重復(fù)性良好，可實(shí)現(xiàn)對(duì)曼氏裂頭蚴病早 期、輕度感染的快速診斷，應(yīng)用靈活且范圍廣，可用于現(xiàn)場(chǎng)血清流行病學(xué)調(diào)查，易于大范圍 推廣。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所述的曼氏裂頭蚴病ES抗原的制備方法，包括下述步驟
第一步，曼氏裂頭蚴的采集曼氏裂頭蚴采集自自然感染曼氏裂頭蚴的野生動(dòng)物體內(nèi) 或?qū)嶒?yàn)感染的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)；剖殺感染裂頭蚴的動(dòng)物，解剖鏡下檢查并分離出曼氏裂頭蚴， 將分離出的曼氏裂頭蚴用滅菌的生理鹽水充分洗滌3次后備用；
第二步，曼氏裂頭蚴的體外培養(yǎng)將分離出的曼氏裂頭蚴用滅菌的生理鹽水充分洗滌 后，按每2ml 1640培養(yǎng)液(不加血清)中加入1條曼氏裂頭蚴的比例，將其加入準(zhǔn)備好的 1640培養(yǎng)液中，同時(shí)加入青霉素(100U/ml)和鏈霉素(100U/ml)，然后將培養(yǎng)皿放入5% CO2 37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h;
第三步，曼氏裂頭蚴ES抗原的制備
透析袋的處理根據(jù)樣本量將透析袋剪切成合適的長(zhǎng)度(15cnT20Cm)，在2%NaHC03和lmmol/L EDTA (pH8. 0)的溶液中煮沸l(wèi)Omin，用蒸餾水徹底清洗透析袋，在蒸餾水中煮沸 lOmin，冷卻后使透析袋浸沒在水中置于4°C保存；使用前在透析袋中裝滿水，然后排出，反 復(fù)2 3次，將之清洗干凈；
將培養(yǎng)后的曼氏裂頭蚴培養(yǎng)液用高速低溫離心機(jī)4°C下2000 g離心5 min，然后吸取 上清裝入備好的透析袋中，將透析袋放入盛有去離子水的大燒杯中，用磁力攪拌器在4°C透 析3、天，每4飛h換一次去離子水，直至透析袋內(nèi)培養(yǎng)液變?yōu)闊o色；將透析好的培養(yǎng)液放入 大離心管中，用封口膜封口，并在封口膜上用針頭扎若干排氣孔，置一 80°C冷凍后，用快速 真空濃縮系統(tǒng)濃縮干燥，即可得到曼氏裂頭蚴ES抗原；采用考馬斯亮藍(lán)G-250蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲 線測(cè)定法測(cè)定抗原的蛋白濃度，分裝，一 80°C保存?zhèn)溆?。整個(gè)抗原制備過程嚴(yán)格要求無菌， 所用的器皿及去離子水均需高壓滅菌。曼氏裂頭蚴病ES抗原ELISA診斷方法的建立
一、棋盤滴定法確定ES抗原最佳包被濃度、待測(cè)血清最佳稀釋度 1、包被抗原用包被緩沖液將已知濃度的曼氏裂頭蚴ES抗原以1.25yg/ml、2.5yg/ ml、5 μ g/ml包被酶標(biāo)板，100 μ 1/孔每個(gè)濃度包被36孔，其中12孔加不同稀釋度的陽性血 清，另外12孔加不同稀釋度的陰性血清，其余12孔作為空白對(duì)照，將酶標(biāo)板放在37°C箱溫 中孵育Ih。2、洗滌倒空酶標(biāo)板孔中的液體，加滿洗滌液，靜置3min，再倒空酶標(biāo)板孔中液 體，反復(fù)3次，最后將酶標(biāo)板倒置在吸水紙上，使孔中洗滌液流凈。3、加待檢血清用稀釋液將被檢血清及陰性血清按1 :50、1 =IOOU :200稀釋，每 個(gè)稀釋度分別于ES抗原不同包被濃度的酶標(biāo)板上各加2個(gè)孔，100 μ 1/孔，空白對(duì)照同樣包 被抗原，不加血清和酶結(jié)合物，但加底物和終止液(2 mol/L H2SO4). 37°C放置lh。4、洗滌同 2。5、加酶標(biāo)二抗用稀釋液將辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗小鼠IgG稀釋至1 5 000，100 μ 1/孔加入酶標(biāo)板，37°C放置Ih06、洗滌同 2。7、加底物于各反應(yīng)孔中加入新鮮配制的底物溶液100μ 1，37°C放置30min。8、加終止液于各反應(yīng)孔中加入終止液50 μ 1。9、結(jié)果觀察用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(λ =490nm)測(cè)吸光(OD)值(即A490值)。10、結(jié)果判定以包被濃度和加入血清稀釋度相同的2個(gè)孔的OD值做均值，比較 其與陰性對(duì)照的比值，以待測(cè)的樣品OD值/陰性對(duì)照的平均OD值彡2. 1者為陽性。以比 值最大的包被濃度和血清稀釋度作為最佳包被濃度和最佳血清稀釋度，根據(jù)所測(cè)數(shù)據(jù)(見 下表)，得出曼氏裂頭蚴ES抗原最佳包被濃度為2. 5 μ g/mL，待檢血清最佳稀釋度為1 :100。 此后均按最佳包被濃度和最佳稀釋度進(jìn)行ELISA，每板均設(shè)已知陽性血清、陰性血清及空白 對(duì)照；mmm
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ES観包碰
50ES抗原ELISA法診斷曼氏裂頭蚴病
1、包被抗原用包被緩沖液將已知濃度的曼氏裂頭蚴ES抗原以2. 5μ g/ml包被酶標(biāo) 板，100μ 1/孔，同時(shí)設(shè)立陽性血清、陰性血清及空白對(duì)照。37°C溫育lh。2、洗滌倒空酶標(biāo)板孔中的液體，加滿洗滌液，靜置3min，再倒空酶標(biāo)板孔中液 體，反復(fù)3次，最后將酶標(biāo)板倒置在吸水紙上，使孔中洗滌液流凈。3、加待檢血清用稀釋液將被檢血清及陰性血清按1 100稀釋，100 μ 1/孔加入已 包被過ES抗原的孔中，37°C放置lh。4、洗滌同 2。5、加酶標(biāo)二抗用稀釋液將HRP標(biāo)記的羊抗人或羊抗小鼠IgG稀釋至1 :5 000, 100 μ 1/孔加入酶標(biāo)板，37°C放置lh。6、洗滌同 2。7、加底物于各反應(yīng)孔中加入新鮮配制的底物溶液100μ 1，37°C放置30min。8、加終止液于各反應(yīng)孔中加入終止液50 μ 1。9、結(jié)果觀察用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(λ =490nm)測(cè)吸光值OD (A490值)。10、結(jié)果判定若對(duì)照孔無異常，則以待測(cè)樣品OD值/陰性對(duì)照的平均OD值彡2. 1 者為陽性，反之為陰性；若對(duì)照孔出現(xiàn)異常，則檢測(cè)無效。ES抗原ELISA診斷方法對(duì)曼氏裂頭蚴病的診斷
將曼氏裂頭蚴ES抗原應(yīng)用于ELISA法診斷曼氏裂頭蚴病。將48只昆明小鼠隨機(jī)分為 6組，每組8只，1至5組分別經(jīng)口接種裂頭蚴1、2、4、6及8條，6組為正常小鼠作為陰性對(duì) 照。感染后1周開始每周尾靜脈采血，分離血清，至感染后18周。應(yīng)用裂頭蚴ES抗原ELISA 檢測(cè)血清中抗裂頭蚴IgG抗體水平。在小鼠感染裂頭蚴后2周，除感染2條裂頭蚴劑量組 小鼠抗體陽性率為87. 5%外，其他劑量感染組小鼠抗體陽性率均為100% ；感染后3周至感 染后第18周，所有感染劑量組小鼠的抗體陽性率均為100%;說明小鼠感染不同劑量裂頭蚴 后2周即可用曼氏裂頭蚴ES抗原檢出血清抗曼氏裂頭蚴抗體。研究還發(fā)現(xiàn)，小鼠感染1條 裂頭蚴后2周血清抗體陽性率即達(dá)100%，說明1條裂頭蚴感染宿主后亦可刺激機(jī)體產(chǎn)生較 強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答，且不同劑量裂頭蚴感染小鼠血清抗體水平之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義， 小鼠感染裂頭蚴后的血清抗體水平有隨裂頭蚴感染劑量的增加而升高的趨勢(shì)。以上結(jié)果均 提示，曼氏裂頭蚴ES抗原可用于早期與輕度感染曼氏裂頭蚴病的血清學(xué)診斷。曼氏裂頭蚴ES抗原及可溶性粗抗原對(duì)感染不同寄生蟲小鼠血清的檢測(cè)
應(yīng)用曼氏裂頭蚴ES抗原與可溶性粗抗原分別對(duì)裂頭蚴感染小鼠血清(30份)，旋毛蟲、 日本血吸蟲及弓形蟲感染小鼠血清(分別為25、15、14份)及正常小鼠血清(30份)進(jìn)行了
6ELISA檢測(cè)。結(jié)果顯示，兩種抗原的敏感性均達(dá)100%(30/30)，特異性也均達(dá)100%(84/84)。 說明曼氏裂頭蚴ES抗原用于小鼠曼氏裂頭蚴感染診斷時(shí)其敏感性和特異性不低于目前應(yīng) 用的曼氏裂頭蚴可溶性粗抗原。曼氏裂頭蚴ES抗原及可溶性粗抗原對(duì)不同寄生蟲病患者血清的檢測(cè)
應(yīng)用曼氏裂頭蚴ES抗原與可溶性粗抗原分別對(duì)裂頭蚴病(11例)、并殖吸蟲病(20例)、 棘球蚴病(10例)、豬囊尾蚴病(11份)、華支睪吸蟲病(4例)、日體血吸蟲病(4例)患者及 健康人(12例)血清進(jìn)行了 ELISA檢測(cè)。結(jié)果顯示，兩種抗原的敏感性均達(dá)100% (11/11)， 曼氏裂頭蚴ES抗原的特異性為96. 7%(59/61)，而曼氏裂頭蚴可溶性粗抗原的特異性只有 72. 1% (44/61)，兩種不同抗原特異性間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ 2=14. 027，P<0. 05)。說 明曼氏裂頭蚴ES抗原在用于人體曼氏裂頭蚴病的診斷時(shí)，其敏感性和目前應(yīng)用的曼氏裂 頭蚴可溶性粗抗原相當(dāng)，但其特異性卻明顯優(yōu)于曼氏裂頭蚴可溶性粗抗原，因此，應(yīng)用曼氏 裂頭蚴ES抗原對(duì)人曼氏裂頭蚴病進(jìn)行診斷時(shí)可獲得更高的準(zhǔn)確率。曼氏裂頭蚴ES抗原與可溶性粗抗原的SDS-PAGE分析
通過TotalLab TL100軟件分析曼氏裂頭蚴ES抗原和可溶性粗抗原的SDS-PAGE圖像 發(fā)現(xiàn)，曼氏裂頭蚴可溶性粗抗原經(jīng)SDS-PAGE后顯示出19條蛋白帶，分子量分別為134、129、 124、108、100、80、70、56、47、45、43、40、38、36、35、32、27、24、16 kDa。曼氏裂頭蚴 ES 抗原共 有7條蛋白帶，分子量分別為66、53、42、36、29、24、20 kDa，其中分子量為66、53 kDa的蛋白 含量占ES抗原總蛋白量的78. 43%。SDS-PAGE分析結(jié)果表明，曼氏裂頭蚴可溶性粗抗原的 蛋白帶比ES抗原多，可溶性粗抗原用于診斷時(shí)產(chǎn)生交叉反應(yīng)的概率比ES抗原高，說明ES 抗原用于診斷的特異性優(yōu)于可溶性粗抗原。曼氏裂頭蚴ES抗原與可溶性粗抗原的Western-blot鑒定
通過使用Western-blot分別對(duì)曼氏裂頭蚴ES抗原和可溶性粗抗原的鑒定發(fā)現(xiàn)，曼氏 裂頭蚴可溶性粗抗原的35、32及24kDa蛋白與感染裂頭蚴的小鼠血清IgG抗體反應(yīng)，可與 裂頭蚴病患者血清IgG抗體反應(yīng)的蛋白組分除上述3種外還有16kDa蛋白，另外在79 108 kDa范圍內(nèi)也存在具有較強(qiáng)抗原性的蛋白，而且該分子量范圍內(nèi)的蛋白與并殖吸蟲病人血 清存在較強(qiáng)交叉反應(yīng)。曼氏裂頭蚴ES抗原中36kDa及29kDa兩種蛋白組分與感染裂頭蚴 小鼠及患者血清IgG抗體反應(yīng)，其中29kDa蛋白與并殖吸蟲病、包蟲病及血吸蟲病患者血清 有輕微交叉反應(yīng)。鑒定結(jié)果表明，曼氏裂頭蚴可溶性粗抗原中與其他寄生蟲感染者血清出 現(xiàn)交叉反應(yīng)的蛋白組分多于ES抗原，并且比ES抗原產(chǎn)生的交叉反應(yīng)強(qiáng)，說明ES抗原的特 異性高于可溶性粗抗原。
權(quán)利要求
一種曼氏裂頭蚴病ES抗原的制備方法，其特征在于它包括下述步驟第一步，曼氏裂頭蚴的采集曼氏裂頭蚴采集自自然感染曼氏裂頭蚴的野生動(dòng)物體內(nèi)或?qū)嶒?yàn)感染的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)；第二步，曼氏裂頭蚴的體外培養(yǎng)將分離出的曼氏裂頭蚴用滅菌的生理鹽水充分洗滌后，將其加入準(zhǔn)備好的1640培養(yǎng)液中，同時(shí)加入100U/ml的青霉素和100U/ml的鏈霉素，5% CO2 37℃培養(yǎng)18h；第三步，曼氏裂頭蚴ES抗原的制備將培養(yǎng)后的曼氏裂頭蚴培養(yǎng)液用離心機(jī)4℃下2 000 g離心5 min，然后吸取上清4℃透析，至透析袋內(nèi)培養(yǎng)液變?yōu)闊o色；將透析好的培養(yǎng)液加入大離心管中，用封口膜封口，并在封口膜上留排氣孔，置－80℃冷凍后，用快速真空濃縮系統(tǒng)濃縮干燥，即可得到曼氏裂頭蚴ES抗原；測(cè)定該抗原的蛋白濃度，分裝，－80℃保存?zhèn)溆谩?br> 2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的曼氏裂頭蚴病ES抗原的制備方法，其特征在于所述第三步 中透析袋的處理方法為根據(jù)樣本量將透析袋剪切成合適的長(zhǎng)度，在2%NaHC03* lmmol/L EDTA的溶液中煮沸l(wèi)Omin，用蒸餾水徹底清洗透析袋，在蒸餾水中煮沸l(wèi)Omin，冷卻后使透 析袋浸沒在水中置于4°C保存；使用前在透析袋中裝滿水，然后排出，反復(fù)數(shù)次，將之清洗 干凈。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種曼氏裂頭蚴ES抗原的制備方法，采集自然感染的野生動(dòng)物或?qū)嶒?yàn)感染的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)的曼氏裂頭蚴；將分離出的曼氏裂頭蚴洗滌后加入培養(yǎng)液中，加入青霉素和鏈霉素，5%CO237℃培養(yǎng)18h；將曼氏裂頭蚴培養(yǎng)液用離心機(jī)4℃下2000g離心，吸取上清4℃透析，至培養(yǎng)液變?yōu)闊o色；將培養(yǎng)液加入大離心管中，用封口膜封口，置－80℃冷凍后，濃縮干燥，即可得到曼氏裂頭蚴ES抗原；分裝，－80℃保存?zhèn)溆?。本發(fā)明將曼氏裂頭蚴ES抗原作為診斷抗原，通過ELISA方法將其應(yīng)用于曼氏裂頭蚴病的診斷，具有高度的敏感性和特異性，穩(wěn)定性和重復(fù)性良好，可實(shí)現(xiàn)對(duì)曼氏裂頭蚴病早期、輕度感染的快速診斷及現(xiàn)場(chǎng)血清流行病學(xué)調(diào)查，易于大范圍推廣。
文檔編號(hào)C07K1/14GK101948520SQ20101028318
公開日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2010年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月16日
發(fā)明者姜鵬, 崔晶, 李楠, 王中全, 王燁 申請(qǐng)人:鄭州大學(xué)