專利名稱：一種魷魚內(nèi)臟提取的小肽及其制備方法、組合物和作為海洋水產(chǎn)飼料蛋白源的用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種新的小肽物質，具體來說涉及一種魷魚內(nèi)臟提取的小肽及其制備方法，還涉及這種物質的組合物以及該組合物作為海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖中的飼料蛋白源的用途。
背景技術：
隨著我國遠洋漁業(yè)的迅速發(fā)展，魷魚的捕獲量逐年增加，2009年魷魚捕獲量已超過30萬噸，成為我國主要的水產(chǎn)品加工原料。但是我國的魷魚加工技術含量低，在加工處理獲得魚花、魚干、咸魷魚、罐頭及調味品等產(chǎn)品后，一般有20% 30%的廢棄物(內(nèi)臟、 頭、足、表皮和皮墨汁等)，這些廢棄物含有豐富的蛋白質、脂肪、多糖等營養(yǎng)物質，據(jù)珠海市出入境檢驗檢疫局吳莉敏(《農(nóng)產(chǎn)品加工》，2007 (8) 94-96)研究表明，每IOOg魷魚內(nèi)臟中含脂肪21. 15g，蛋白質21. 24g,鈣51. 46mg,鐵609. 07 μ g和磷95. 88 μ g等。但這些物質極易腐爛變質并且含有對人體有害的重金屬鎘。通常對這些廢物的處理方法是就地掩埋，這樣不但對漁業(yè)資源是巨大浪費，而且還存在著環(huán)境污染的隱患。因此，如何有效地處理魷魚廢棄物并進行高值化綜合利用越來越受到國民與社會的重視。中國水產(chǎn)科學院黃海水產(chǎn)研究所的王彩理等(《水產(chǎn)養(yǎng)殖》，2003，24( :40-41) 研究魷魚內(nèi)臟液化蛋白對南美白對蝦的誘食性，發(fā)現(xiàn)魷魚內(nèi)臟漿的誘食效果最佳，強于甜菜堿、?；撬岷痛笏馑?。上海水產(chǎn)品加工技術開發(fā)中心的王建中等(《中國海洋藥物》， 1999,1 :55-58)在對魷魚內(nèi)臟的綜合利用研究中，利用魷魚內(nèi)臟及其它廢棄物進行自生酶水解，開發(fā)了魷魚油、內(nèi)臟水解液，并解決了從水解液中去除鎘的難題。中國海洋大學水生生物制品安全性實驗室的劉春娥等(《食品工業(yè)科技》，2004，9 :83-86)在魷魚內(nèi)臟蛋白質酶解工藝的研究中，以氨基酸得率為主要指標，采用不同蛋白酶對魷魚內(nèi)臟蛋白質進行了水解工藝研究。研究表明，中性蛋白酶，堿性蛋白酶，胰蛋白酶和木瓜蛋白酶具有較好的分解效果，氨基酸轉化率可達到50%以上。浙江工商大學的勵建榮等人的專利一種秘魯魷魚內(nèi)臟綜合利用技術(申請?zhí)?00610053372. 6)，將魷魚內(nèi)臟蒸煮，酶液化，加熱，離心等步驟，得到的下層魷魚多肽制成用于水產(chǎn)動物飼料蛋白源的魷魚膏，對對蝦的飼喂試驗表明，添加魷魚膏能明顯增加餌料的攝取量，提高幼蝦的存活率和體重。福建融鑫海生物技術有限公司的蘇祖鳳的專利一種用魷魚內(nèi)臟制備水產(chǎn)飼料誘食劑的生產(chǎn)方法(申請?zhí)?00810071073. 4)，通過將魷魚內(nèi)臟蒸煮、靜置、自然酶解發(fā)酵，油料分離后的沉淀進行 80 90°C和60 65°C兩次低溫真空濃縮。由于現(xiàn)有的飼料蛋白源的制作工藝中主要采取酶解后高溫蒸煮、濃縮的方式獲得，這些工藝過程容易使蛋白質變性，產(chǎn)生膠原蛋白，不僅降低了營養(yǎng)成分，而且大大損害了產(chǎn)品對水產(chǎn)動物的誘食性。即使采用蘇祖鳳等人的方法，利用SJN2-2000 二效蒸發(fā)器對酶解液進行二次濃縮，使蒸發(fā)溫度控制在90°C以下，大大降低了濃縮溫度，但是依然無法從根本上解決這一難題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于摒棄高溫蒸煮方法，利用超濾膜從魷魚內(nèi)臟提取出一種新的小肽，另一目的是開發(fā)出該小肽的制備方法，又一目的是開發(fā)出含有該小肽的組合物及其用途。我們將日本魷魚(Todarodes pacificus)內(nèi)臟經(jīng)有機溶劑脫脂后，用愛爾卡酶和胰蛋白酶酶解，然后用超濾膜過濾脫脂后的酶解液，再用凝膠色譜分離純化，得到含有氨基酸結構片段-ILGGSDPKHYTG-的小肽物質，加入山梨酸鉀攪勻、干燥。將本發(fā)明小肽、豆粕粉、玉米粉、淀粉、魚粉等按配比制粒，得到的組合物可用作海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料蛋白源，對魚蝦貝類等有非常好的誘食作用，從而實現(xiàn)了本發(fā)明的目的。本發(fā)明的魷魚內(nèi)臟提取的小肽，其特征是含有氨基酸結構片段-ILGGSDPKHYTG-， 相對分子質量范圍為1400 5800，并通過下述方法制備得到(1)將日本魷魚內(nèi)臟攪碎，加水攪勻，用石油醚或正己烷或石油醚和正己烷的混合溶劑脫脂，去除有機溶劑層，水層在室溫下晾1 3小時，50 60°C下烘1 3小時，加入溫度為50 60°C的水，調節(jié)pH值至 8. 0 8. 5，然后在50 60°C保溫狀態(tài)下，按每克原料2000 3000單位的比例用愛爾卡酶酶解1 3小時后，再按每克原料2000 3000單位的比例用胰蛋白酶酶解1 3小時，去除不溶物質，得到酶解液；(2)將步驟(1)得到的酶解液用截留分子質量ISOOODa超濾膜過濾，再用凝膠色譜分離純化，得到含有氨基酸結構片段-ILGGSDPKHYTG-的小肽物質。本發(fā)明的魷魚內(nèi)臟提取的小肽還可以加入防腐劑，例如山梨酸鉀，最好在步驟⑵ 得到的小肽物質每IOOOg中加入0. 025 0. 050g山梨酸鉀，攪勻，干燥。在中試制備中，小肽物質的純度值為51% 63%時有利于成本控制。本發(fā)明的魷魚內(nèi)臟提取的小肽的制備方法，其特征是包括以下的步驟(1)將日本魷魚內(nèi)臟攪碎，加水攪勻，用石油醚或正己烷或石油醚和正己烷的混合溶劑脫脂，去除有機溶劑層，水層在室溫下晾1 3小時，50 60°C下烘1 3小時，加入溫度為50 60°C的水，調節(jié)pH值至8. 0 8. 5，然后在50°C 60°C保溫狀態(tài)下，按每克原料2000 3000單位的比例用愛爾卡酶酶解1 3小時后，再按每克原料2000 3000單位的比例用胰蛋白酶酶解1 3小時，去除不溶物質，得到酶解液；(2)將步驟(1)得到的酶解液用截留分子質量ISOOODa超濾膜過濾，再用凝膠色譜分離純化，得到含有氨基酸結構片段-ILGGSDPKHYTG-的小肽物質。本發(fā)明的魷魚內(nèi)臟提取的小肽的制備方法，還可以在步驟(2)得到的小肽物質中加入防腐劑，例如山梨酸鉀，最好在每IOOOg小肽物質中加入0. 025 0. 050g山梨酸鉀，攪勻，干燥。魷魚內(nèi)臟提取的小肽的分子質量計算方法IogMw = -b Kav+c ；有效分配系數(shù)Kav是表示被排阻的程度，Mw表示物質的分子質量，b，c為常數(shù)與凝膠柱本身性質相關，可通過標準蛋白質樣品計算b，c值。凝膠色譜分離純化和分子質量測定的操作包括(1)采用中大型凝膠色譜柱進行分離純化。將日本魷魚內(nèi)臟按上述本發(fā)明方法脫脂處理后進行酶解，截留分子質量ISOOODa超濾膜過濾魷魚內(nèi)臟酶解液。采用中大型凝膠色譜進行分離，凝膠色譜型號S印hadex G-25，柱型號200X 10cm，緩沖液為0.05mol/L磷酸鹽緩沖液(含0. 16mol/L NaCl), pH = 7. 0，溶劑流速10mL/min，柱床體積約12000mL，將樣品配成濃度為50 lOOmg/mL的溶液，用0. 45m微孔濾膜過濾，取500 IOOOmL進樣分離純化，采用下述步驟方法分析檢測。(2)采用小型凝膠色譜進行分子質量測定。分析條件選擇凝膠色譜型號 Sephadex G-25 ；柱型號=IOOXlcm,緩沖液為0. 05mol/L磷酸鹽緩沖液(含0. 16mol/L NaCl)，pH = 7. 0，溶劑流速0. 20mL/min,檢測波長280nm，柱床體積約60mL。(3)將標準蛋白質樣品配成濃度為5mg/mL的溶液，用0. 30m微孔濾膜過濾，取 0. 5mL 進樣，獲得(Kav, IogMw)的對應點三個(28. 5,4. 16)、(53. 7，3. 13)、(74. 9,2. 26), 過計算獲得公式logMw = -0. 041Kav+5. 33 (R2 = 0. 9998)。(4)將步驟(1)分離純化的日本魷魚內(nèi)臟酶解液經(jīng)0. 30m微孔濾膜過濾后，調整濃度至10mg/mL。采用小型凝膠色譜，取0. 5mL進樣，得出魷魚內(nèi)臟提取的小肽在直線上的 (Kav，IogMw)點分別為(53. 3,3. 15)、(38. 2,3. 76)，計算其對應分子質量為1400和5800。本發(fā)明含有魷魚內(nèi)臟提取的小肽的組合物，其特征是按總質量分數(shù)100%計，由魷魚內(nèi)臟提取的小肽6% 8%，豆粕粉50% 60%，魚粉3% 6%，玉米粉27% 33%和制粒用淀粉2% 5%組成。所用的豆粕粉，魚粉，玉米粉和制粒用淀粉為水產(chǎn)飼料用，從市場購買。本發(fā)明的組合物的制備方法，是按上述比例將魷魚內(nèi)臟提取的小肽、豆粕粉、魚粉和玉米粉攪勻，以配料水=1 4(質量比)的比例加入適量的水，攪勻，噴霧干燥，得干膏粉；按配方比例向干膏粉中加入制粒用淀粉，制粒，晾干得到。本發(fā)明的組合物可用作海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖中的飼料蛋白源，包括海洋魚、蝦、貝類等的飼料蛋白源，特別適合海洋水產(chǎn)魚類的飼料蛋白源。本發(fā)明中魷魚內(nèi)臟提取的小肽的制作過程中溫度不超過60°C，干燥時采用噴霧干燥器進行干燥，時間短、效果好，保證了該物質不水解、不變性。本發(fā)明的組合物具有強的魚類誘食性，其主要成分魷魚內(nèi)臟提取的小肽具有濃郁的腥香味，是水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料蛋白源的佳品。利用本發(fā)明提供的組合物養(yǎng)殖海洋魚類，可大幅度的提高魚類的攝食量，增加魚類個體的單位重量。
具體實施例方式以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，不是對本發(fā)明的限制。實施例中主要原材料、主要儀器設備、主要生物和化學試劑等如下主要原材料從廣州市黃沙海產(chǎn)品市場收集日本魷魚(Todarodes pacificus)內(nèi)臟，儲存于-15°C下備用，使用前12小時在室溫下解凍?！按蠼啤背Ｒ?guī)魚用配合飼料，上海大江(集團)股份有限公司。所用豆粕粉，玉米粉購自濟寧雙華工貿(mào)有限公司，所用魚粉購自榮成新希望魚粉有限公司。主要儀器設備發(fā)酵罐LABF0RS實驗室臺式小型發(fā)酵罐，產(chǎn)地瑞士 ；勻漿機予華A8G型，產(chǎn)地 河南鞏義；落地式離心機=Bechman J2_Hs高速冷凍離心機，產(chǎn)地美國；中大型凝膠色譜型號S印hadex G-25，柱型號:200 X 10cm，緩沖液為0. 05mol/L磷酸鹽緩沖液(含0. 16mol/ LNaCl)，pH= 7. 0，溶劑流速50mL/min，柱床體積約12000mL ；835-50氨基酸自動分析儀(日本 Hitachi 公司)；色譜儀 Waters 2690，質譜儀 Waters Platform ZMD 4000。主要生物和化學試劑胰蛋白酶100萬活力單位/g，大連保稅區(qū)聯(lián)合博泰生物技術有限公司，產(chǎn)品編號RM00102。愛爾卡(Alcalase)蛋白酶50萬活力單位/g，諾維信公司。有機試劑有機試劑購自廣州試劑公司(分析純)。無機試劑無機試劑購自廣州試劑公司(分析純)。純水實施例中用水均為純水，使用MiniQ純水制備系統(tǒng)制備。實施例1 收集20kg日本魷魚內(nèi)臟，予華A8G型勻漿機攪拌破碎，加入2L水，再加入20L沸程為60 90°C的石油醚攪拌脫脂，去除石油醚層，將水層在室溫下晾3小時，50°C烘箱中烘3 小時；加入溫度為50°C的水8L，攪勻，用飽和NaOH溶液調節(jié)pH值至接近8. 5，再用5mol/L 濃度的NaOH溶液調節(jié)pH值至8. 5，50°C保溫狀態(tài)下，將魷魚內(nèi)臟放入發(fā)酵罐中，按3000單位/g原料加入6 X IO7單位愛爾卡酶酶解3小時后，再按3000單位/g原料加入6 X IO7單位胰蛋白酶酶解3小時；用Bechman J2_Hs高速冷凍離心機以5000轉/分鐘離心分離，去除不溶物質；利用截留分子質量ISOOODa超濾膜過濾脫脂后的酶解液，獲得富含小肽的成分，再用中大型kphadex G-25凝膠色譜分離純化，獲得含有氨基酸結構片段-ILGGSDPKHYTG-的小肽物質，按每IOOOg小肽中加入0. 025g山梨酸鉀的配比加入0. 0059g山梨酸鉀；干燥后得魷魚內(nèi)臟提取的小肽。稱取魷魚內(nèi)臟提取的小肽80g，豆粕粉600g，魚粉30g，玉米粉270g，加入4L水，攪拌均勻后噴霧干燥，得到干膏粉；再稱取制粒用淀粉20g，制粒，晾干，得到組合物。實施例2 收集20Kg日本魷魚內(nèi)臟，予華A8G型勻漿機攪拌破碎，加入12L水，再加入20L 石油醚和正己烷混合溶劑(1 1)攪拌脫脂，去除石油醚層，將水層在室溫下晾1小時， 60°C烘箱中烘1小時；加入溫度為60°C的水8L，攪勻，用飽和NaOH溶液調節(jié)pH值至接近 8. 0，再用稀濃度的NaOH溶液調節(jié)pH值至8. 0 ；60°C保溫狀態(tài)下，將魷魚內(nèi)臟放入發(fā)酵罐中，加入4X IO7單位愛爾卡酶酶解1小時后，再加入4X107單位胰蛋白酶酶解1小時；用 Bechman J2_Hs高速冷凍離心機以5000轉/分鐘離心分離，去除不溶物質；利用截留分子質量ISOOODa超濾膜過濾脫脂后的酶解液，獲得富含小肽的成分，再用中大型kphadex G-25 凝膠色譜分離純化，獲得含有氨基酸結構片段-ILGGSDPKHYTG-的小肽物質，按每IOOOg小肽中加入0. 050g山梨酸鉀的配比加入0. 0078g山梨酸鉀，干燥后得魷魚內(nèi)臟提取的小肽。稱取魷魚內(nèi)臟提取的小肽60g，豆粕粉500g，魚粉60g，玉米粉330g，加入4L水，攪拌均勻后噴霧干燥，得干膏粉；再稱取制粒用淀粉50g，制粒，晾干，得到組合物。實施例3 稱取實施例1的魷魚內(nèi)臟提取的小肽65g，豆粕粉535g，魚粉30g，玉米粉330g，加入4L水，攪拌均勻后噴霧干燥，得干膏粉；再稱取制粒用淀粉40g，制粒，晾干，得到組合物。實施例4 稱取實施例2的魷魚內(nèi)臟提取的小肽75g，豆粕粉575g，魚粉50g，玉米粉^Og,加入4L水，攪拌均勻后噴霧干燥，得干膏粉；再稱取制粒用淀粉20g，制粒，晾干，得到組合物。實施例5:氨基酸組成分析
將實施例1和2獲得的魷魚內(nèi)臟提取的小肽分別置于水解管中，加入6mol/L的鹽酸溶液，真空封口。在110°c下水解Mh，冷卻后定容、過濾和蒸干，再加入0.02mol/L的鹽酸溶液在空氣中放置30min，采用835-50氨基酸自動分析儀(日本Hitachi公司)，測除色氨酸以外的氨基酸含量，結果得到I L G S D P K H Y T = 1. 05 1. 02 3. 01 0. 96 0. 98 1.00 0.97 0.98 0.95 1.00。采用液質聯(lián)用(LC-MS)儀測分子質量液相色譜條件色譜儀Waters 2690,檢測器=Waters 996，分析柱Lichrospher C-18 (2. 6X 250mm)，流動相甲醇-水-0. 5 %乙酸梯度洗脫，檢測波長220nm，柱溫30°C， 進樣量，10yL，流速0. 3mL/min;質譜條件質譜儀Waters Platform ZMD 4000，離子方式 ESI+，毛細管電壓4.80kV，錐孔電壓32V，Gas Flow :4. 2L/h，離子源溫度120°C，脫溶劑氣溫度250°C，質量范圍1000 8000m/z，光電倍增器電壓670V，Analyser Vacuum2. 6e 5mBar。采用液質聯(lián)用儀測定小肽分子質量時沒有發(fā)現(xiàn)其分子離子峰，只得到其脫去部分基團后的碎片峰。氨基酸序列測定采用Edman降解法測魷魚小肽的氨基酸序列。序列分析表明小肽具有-ILGGSDPKHYTG-順序結構鏈接。通過對魷魚內(nèi)臟提取的小肽的氨基酸進行氨基酸組成分析、凝膠色譜分析、小肽分子質量測定和氨基酸序列測定，結果得到其中含有-ILGGSDPKHYTG-小肽結構片段，相對分子質量在1400至5800之間。實施例6 鯔魚的飼喂實驗，2009年4月，取1齡鯔魚50尾，分成不添加本發(fā)明飼料蛋白源的對照組(10尾)、按10%添加實施例1 3的組合物的實驗組(各10尾)和按10%添加魷魚內(nèi)臟鮮液的實驗組(10尾)，而且都喂養(yǎng)相同的普通飼料(“大江牌”常規(guī)魚用配合飼料)。把魚放入5個1. 5立方米左右的池中，前一個月每天換水1/5，后半個月每天換水 1/3，記錄其7天、15天、30天和45天后的總體重和相應時間間隔內(nèi)飼料消耗總量，分析他們的重量變化情況和飼料消耗情況。其中第17天對照組鯔魚死亡1尾，數(shù)據(jù)是按10尾換算后的數(shù)據(jù)。結果見表1，魷魚內(nèi)臟鮮液為魷魚內(nèi)臟經(jīng)過自生酶解3小時后獲得的末經(jīng)加工的物質。從表1可以清楚看到與不添加本發(fā)明飼料蛋白源的對照組和添加一般魷魚內(nèi)臟酶解鮮液的實驗組相比，含魷魚內(nèi)臟提取的小肽的本發(fā)明組合物作為飼料蛋白源可大幅度的提高鯔魚的攝食量，增加鯔魚個體的單位重量。表1實施例1 3的組合物，魷魚內(nèi)臟鮮液和對照組對鯔魚生長的影響
權利要求
1.一種魷魚內(nèi)臟提取的小肽，其特征是含有氨基酸結構片段-ILGGSDPKHYTG-，相對分子質量范圍為1400 5800，并通過下述方法制備得到(1)將日本魷魚Todarodes pacificus內(nèi)臟攪碎，加水攪勻，用石油醚或正己烷或石油醚和正己烷的混合溶劑脫脂，去除有機溶劑層，水層在室溫下晾1 3小時，50 60°C下烘1 3小時，加入溫度為50 60°C的水，調節(jié)pH值至8.0 8. 5，然后在50 60°C保溫狀態(tài)下，按每克原料2000 3000單位的比例用愛爾卡酶酶解1 3小時后，再按每克原料2000 3000單位的比例用胰蛋白酶酶解1 3小時，去除不溶物質，得到酶解液；(2)將步驟(1)得到的酶解液用截留分子質量ISOOODa超濾膜過濾，再用凝膠色譜分離純化，得到含有氨基酸結構片段-ILGGSDPKHYTG-的小肽物質。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種魷魚內(nèi)臟提取的小肽，其特征是在步驟(2)得到的小肽物質每IOOOg中加入0. 025 0. 050g山梨酸鉀，攪勻，干燥。
3.—種魷魚內(nèi)臟提取的小肽的制備方法，其特征是包括以下的步驟(1)將日本魷魚Todarodespacificus內(nèi)臟攪碎，加水攪勻，用石油醚或正己烷或石油醚和正己烷的混合溶劑脫脂，去除有機溶劑層，水層在室溫下晾1 3小時，50 60°C下烘 1 3小時，加入溫度為50 60°C的水，調節(jié)pH值至8. 0 8. 5，然后在50 60°C保溫狀態(tài)下，按每克原料2000 3000單位的比例用愛爾卡酶酶解1 3小時后，再按每克原料 2000 3000單位的比例用胰蛋白酶酶解1 3小時，去除不溶物質，得到酶解液；(2)將步驟(1)得到的酶解液用截留分子質量ISOOODa超濾膜過濾，再用凝膠色譜分離純化，得到含有氨基酸結構片段-ILGGSDPKHYTG-的小肽物質。
4.根據(jù)權利要求3所述的一種魷魚內(nèi)臟提取的小肽的制備方法，其特征是在步驟⑵ 得到的小肽物質每IOOOg中加入0. 025 0. 050g山梨酸鉀，攪勻，干燥。
5.一種權利要求1所述的魷魚內(nèi)臟提取的小肽的組合物，其特征是按總質量分數(shù) 100 %計，由權利要求2所述的魷魚內(nèi)臟提取的小肽6 % 8 %，豆粕粉50 % 60 %，魚粉 3% 6%，玉米粉27% 33%和制粒用淀粉2% 5%組成。
6.權利要求5所述的組合物作海洋水產(chǎn)飼料蛋白源的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種魷魚內(nèi)臟提取的小肽及其制備方法，特征是這種物質含有氨基酸結構片段-ILGGSDPKHYTG-，相對分子質量范圍為1400～5800，并通過下述方法制得將日本魷魚內(nèi)臟酶解后用截留分子質量18000Da超濾膜過濾，再用凝膠色譜分離純化，得到含有氨基酸結構片段-ILGGSDPKHYTG-的小肽物質，然后加入山梨酸鉀，攪勻，干燥。本發(fā)明還涉及一種組合物，由上述魷魚內(nèi)臟提取的小肽6％～8％，豆粕粉50～60％，魚粉3％～6％，玉米粉27％～33％和制粒用淀粉2％～5％組成。這種組合物可用作包括海洋魚、蝦、貝類等的海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖的飼料蛋白源，特別適合海洋水產(chǎn)魚類的飼料蛋白源。利用這種組合物養(yǎng)殖海洋魚類，可大幅度的提高魚類的攝食量，增加魚類個體的單位重量。
文檔編號C07K2/00GK102180945SQ201010272510
公開日2011年9月14日 申請日期2010年9月1日 優(yōu)先權日2010年9月1日
發(fā)明者尹浩, 張偲, 李慶欣, 羅雄明, 齊振雄 申請人:中國科學院南海海洋研究所