專利名稱：：一種具有抗炎活性的三萜類化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，是從中藥金櫻葉中提取分離得到的7個(gè)新的具有抗炎活性的三萜類化合物。
背景技術(shù)：
：金櫻葉為薔薇科薔薇屬植物金櫻子(RosalaevigataMichx.)的嫩葉。在我國(guó)分布很廣，主要分布于華東、中南、西南等地區(qū)。金櫻葉為民間常用中藥，是古方“軍中一捻金”的主要成分之一，主治金瘡出血。已從金櫻葉中提取到三萜類化合物烏蘇酸、薔薇酸、坡模酸、齊墩果酸、山楂酸、等三萜酸類活性成分和金櫻子皂苷A、野薔薇苷、委陵菜酸-28-0-β-D-吡喃葡萄糖苷等三萜皂苷類活性成分，它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)通式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>其中，R1表示氫或羥基，R2表示氫或羥基，R3表示氫或吡喃葡萄糖基，R4表示氫或甲基，R5表示氫或羥基，R6表示氫或甲基，R7表示甲基或羥甲基。但至今未見本發(fā)明提供的從金櫻葉中分離得到的7個(gè)新的具有抗炎活性的三萜類化合物的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種從中藥金櫻葉中分離得到的新的具有抗炎活性的7個(gè)三萜類化合物，它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)式分別如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>化合物2<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>化合物3<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>化合物4<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>化合物5<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>化合物6<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>化合物7經(jīng)體外抗炎活性試驗(yàn)，它們均能顯著抑制脂多糖(LPS)引起的293-nfkb細(xì)胞中熒光素酶表達(dá)，且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，表明具有明顯的抗炎活性。因此，可用于制備新的抗炎藥物。本發(fā)明化合物的制備方法如下1.制備金櫻葉提取物將中藥金櫻葉按常規(guī)用4095%乙醇水溶液浸泡過夜，加熱回流提取23次，每次13小時(shí)，合并提取液，減壓回收溶劑，得提取物浸膏；2.提取三萜類化合物將浸膏加水溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，分別得到石油醚和乙酸乙酯萃取液，取乙酸乙酯萃取液，減壓回收溶劑，得乙酸乙酯部位粉末；3.分離純化將乙酸乙酯部位粉末按常規(guī)上硅膠減壓柱色譜，用二氯甲烷-甲醇系統(tǒng)以501-201-101-51-11進(jìn)行梯度洗脫，共收集洗脫液20份，每份2000ml，將12-16份合并，減壓回收溶劑后再次上硅膠減壓柱色譜，用石油醚-丙酮系統(tǒng)以201-101-51-11進(jìn)行梯度洗脫，共收集洗脫液10份，每份2000ml，將5-7份合并，減壓回收溶劑后再用反相ODS填料開放柱進(jìn)行柱色譜分離，用甲醇-水梯度洗脫，分別取60%甲醇-水洗脫部分，減壓回收溶劑后進(jìn)行反相高效液相，用70%甲醇-水洗脫，分離得到化合物1，化合物2，化合物3；取70%甲醇-水洗脫部分，減壓回收溶劑后進(jìn)行反相高效液相，用75%甲醇-水洗脫，分離得到化合物7；取80%甲醇-水洗脫部分，減壓回收溶劑后進(jìn)行反相高效液相，用85%甲醇-水洗脫，分離得到化合物4，化合物5，化合物6。具體實(shí)施例方式現(xiàn)結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)描述。實(shí)施例1.制備本發(fā)明三萜類化合物171.制備金櫻葉提取物取中藥金櫻葉2公斤，用10倍體積量的70%乙醇水溶液浸泡過夜，加熱回流提取3次，每次2小時(shí)，合并提取液，減壓回收溶劑，得金櫻葉提取物浸膏；2.提取三萜類化合物將浸膏加水溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，分別得到石油醚和乙酸乙酯萃取液，取乙酸乙酯萃取液，減壓回收溶劑，得乙酸乙酯部位粉末；3.分離純化將乙酸乙酯部位粉末按常規(guī)上硅膠減壓柱色譜，用二氯甲烷-甲醇系統(tǒng)以501-201-101-51-11進(jìn)行梯度洗脫，共收集洗脫液20份，每份2000ml，將12-16份合并，減壓回收溶劑后再次上硅膠減壓柱色譜，用石油醚-丙酮系統(tǒng)以201-101-51-11進(jìn)行梯度洗脫，共收集洗脫液10份，每份2000ml，將5-7份合并，減壓回收溶劑后再用反相ODS填料開放柱進(jìn)行柱色譜分離，用甲醇_水梯度洗脫，分別取60%甲醇-水洗脫部分，減壓回收溶劑后進(jìn)行反相高效液相，用65%甲醇-水洗脫，分離得到化合物120mg，化合物215mg，化合物315mg；取70%甲醇-水洗脫部分，減壓回收溶劑后進(jìn)行反相高效液相，用75%甲醇-水洗脫，分離得到化合物730mg，取80%甲醇_水洗脫部分，減壓回收溶劑后進(jìn)行反相高效液相，用85%甲醇-水洗脫，分離得到化合物413mg，化合物525mg，化合物620mg。經(jīng)核磁共振檢測(cè)分析，確定本發(fā)明各化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，它們的理化性質(zhì)和波譜數(shù)據(jù)分別為化合物1白色無定型粉末，mp142146°C。[a]D2°+25°(c=0·16，MeOH)。UV(MeOH)Amax(log□)nm:243(4·26)；IR(KBr)□max:3420(OH)，2937，2837，1712(C=0)，1634，1384CHT1;HRESIMS，m/z481.3291[M+Na]+(calcdforC29H46O4Na,481.3294)；13Cand1HNMR數(shù)據(jù)見表1和表2。化合物2白色無定型粉末，mp220225°C。[α]D2°-13°(c=0.173，MeOH)。UV(MeOH)Amax(logD)nm240(4.26)；IR(KBr)□max3446(OH),2925,2873,2832,1636cm-1；HRESIMS,m/z465.3343[M+Na]+(calcdforC29H46O3Na,465.3345)；13Cand1HNMR數(shù)據(jù)見表1和表2?；衔?白色無定型粉末，mp259263°C。[a]D2°+10°(c=0·07，MeOH)。UV(MeOH)Amax(log□)nm240(4.26)；IR(KBr)□max3406(OH),2935,2868,1701(C=0)，1458，1384CHT1;HRESIMS，m/z525.3188[M+Na]+(calcdfOrC30H46O6Na,525.3192)；13Cand1HNMR數(shù)據(jù)見表1和表2。化合物4白色無定型粉末，mp248252C。[α]D18+0°(c=0.08，MeOH)。IR(KBr)□max:3421(OH)，2941，1698(C=0),1384cm-1；HRESIMS,m/z495.3451[M+Na]+(cacldforC30H48O4Na,495.3450)；13Cand1HNMR數(shù)據(jù)見表1和表2?；衔?白色無定型粉末，mp216220°C。[α]D20+24°(c=0·22，MeOH)。IR(KBr)□max3420(OH)，2940，1695(C=0),1384cm-1；HRESIMS,m/z527.3344[M+Na]+(calcdforC30H48O6Na,527.3349)；13Cand1HNMR數(shù)據(jù)見表1和表2?；衔?白色無定型粉末，mp292295C。[α]D20+63°(c=0.085，MeOH)。IR(KBr)□max3420(OH)，2946，1700(C=0),1384cm-1；HRESIMS,m/z511.3396[M+Na]+(calcdforC30H48O5Na,511.3399)；13Cand1HNMR數(shù)據(jù)見表1和表2?；衔?白色無定型粉末，mp290294°C。[α]D20+3°(c=0·173，CH2Cl2)。IR(KBr)□max:3425(0H),2939,1740(C=0)cm-1；HRESIMS,m/z611.3925[M+Na]+(calcdforC35H56O7Na,611.3924)；13Cand1HNMR數(shù)據(jù)見表1禾口表2。表1.化合物1-7的13C-WR譜數(shù)據(jù)(pyridine_d5，125MHz)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>aInCDCl3表2.化合物1-7的1H-NMR譜數(shù)據(jù)(pyridine_d5，500MHz)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>aInCDCl3本發(fā)明化合物抗炎活性試驗(yàn)采用化合物17對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的NF-KB-Iuc293CellLine細(xì)胞中熒光素酶強(qiáng)度的影響來證明其抗炎活性。1.藥物溶液的配制1)將化合物17分別用DMSO配制成終濃度為20mg/ml溶液，置于_4°C保存；2)LPS:L2654(sigma)，用dH20配制成濃度為100μg/ml溶液，-20°C保存。2.細(xì)胞株使用抗炎藥物篩選工具細(xì)胞株NF-κB-Iuc293CellLine，由第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室提供。3.試驗(yàn)方法按常規(guī)復(fù)蘇細(xì)胞并且傳代培養(yǎng)，使用DMEM+10%FBS的完全培養(yǎng)基；取P2代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，使用胰酶消化的方法制備細(xì)胞懸液，接種細(xì)胞到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔細(xì)胞懸液為100μ1，細(xì)胞數(shù)為IXIO4個(gè)；每個(gè)化合物按每孔不同藥物濃度分成6組，即0μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/m和200μg/ml組，每組3個(gè)復(fù)孔，S5%CO2培養(yǎng)箱于37°C培養(yǎng)細(xì)胞4小時(shí)，加入LPS(終濃度為1μg/ml)’繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，按常規(guī)分別收集各組細(xì)胞樣本，進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)。對(duì)熒光素酶的檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以確定藥物預(yù)處理對(duì)于LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是否具有抑制作用。結(jié)果見表3。表3.化合物1-7對(duì)LPS(lug/ml)誘導(dǎo)的NF_kB_1uc293CellLine細(xì)胞中熒光素酶強(qiáng)度檢測(cè)(RLU)(平均值土方差)組別藥物濃度(μ^ηι)(η=3)0_1Ζ5_25_50_100_20068083.33±43781.00±31161.00±22865.67士15709.67±11618.33士化合物18264.194193.53*1650.81**2191.11**985.60**410.88**68083.33士29835.33±11658.33±8507.33±5730.00士4063.67土化合物28264.194090.25**966.93**819.38**614.14**874.08**68083.33±46232.51±42918.92士28463.82土18974.00士10639.83±化合物3°8264.194889.56*3233.07*2524.94**1214.71**606.23**68083.33士29257.67士19901.00士9263.33士5713.00士4927.00士化合物4_8264.194484.83**1849.31**932-47**1596.32**1379.15**68083.33±33725.13±28743.93±20746.61土13748.23士10295.42土化合物58264.193204.56**2264.87**1848.81**1000.47**6267.56**入^68083.33±52143.67土42646.67士35156.67±29839.00士21680.00士化合物68264.194485.46*2282.72**2098.09**2601.78**2026.83**,,68083.33±33879.67士25803.67士17191.00土11977.67士7953.00士化合物7_8264.193746.20**3078.08**1899.05**1273.49**1636.05**^—■\注*P<0·05，<0·01；藥物預(yù)處理組vs模型組由表3可見，在293細(xì)胞中，化合物1_7可以明顯抑制LPS引起的NF-κB激活，且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，表明本發(fā)明化合物具有顯著的抗炎活性，因此，可用于制備抗炎藥物。權(quán)利要求一種具有抗炎活性的三萜類化合物，其特征在于化學(xué)結(jié)構(gòu)式分別為FSA00000126230700011.tif2.權(quán)利要求1所述的三萜類化合物在制備抗炎藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，是從中藥金櫻葉中提取分離得到的7個(gè)新的具有抗炎活性的三萜類化合物。經(jīng)體外抗炎活性試驗(yàn)，它們均能顯著抑制脂多糖(LPS)引起的293-nfkb細(xì)胞中熒光素酶表達(dá)，且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，表明具有明顯的抗炎活性。因此，可以用于制備新的抗炎藥物。本發(fā)明為制備抗炎藥物提供了新的來源。文檔編號(hào)C07J63/00GK101830964SQ20101017955公開日2010年9月15日申請(qǐng)日期2010年5月21日優(yōu)先權(quán)日2010年5月21日發(fā)明者曾娜,樸淑娟,林厚文,沈陽,陳萬生申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)