專利名稱：制備氧化磷脂的改進(jìn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及合成化學(xué)領(lǐng)域，且更具體而言，涉及用于制備氧化磷脂、其衍生物、類 似物及鹽的新的合成方法。
背景技術(shù)：
藥理學(xué)領(lǐng)域中，修飾的磷脂在許多應(yīng)用中是已知的。在美國(guó)專利號(hào)5，985，292中， 公開(kāi)了經(jīng)皮和經(jīng)膜應(yīng)用的組合物，其混合了含脂溶性活性化合物的磷脂。在美國(guó)專利號(hào) 6，261，597,6, 017，513和4，614，796中，公開(kāi)了混合了用于藥物遞送的脂質(zhì)體和生物載體 的磷脂衍生物。在美國(guó)專利號(hào)5，660，855中，公開(kāi)了氨基甘露糖衍生化的膽固醇的類脂結(jié) 構(gòu)，其適于以平滑肌細(xì)胞和組織為靶標(biāo)，在脂質(zhì)體中制成制劑。這些制劑的目標(biāo)是使用PTCA 操作以減少動(dòng)脈中的再狹窄。脂質(zhì)體治療動(dòng)脈粥樣硬化的用途已進(jìn)一步公開(kāi)于如1095/^23592的PCT專利申請(qǐng) 公布中。其中公開(kāi)了單室脂質(zhì)體的藥物組合物，其可以包含磷脂。在WO 95/23592中公開(kāi) 的磷脂最佳地針對(duì)于從動(dòng)脈粥樣化斑塊中溢出的膽固醇，且通常是非氧化磷脂。已知模仿血小板激活因子(PAF)結(jié)構(gòu)的修飾的磷脂衍生物是具有藥學(xué)活性的，發(fā) 揮例如血管滲透性、血壓和心臟功能抑制的功能。在美國(guó)專利號(hào)4，778，912中，顯示一組這 類衍生物具有抗癌活性。在美國(guó)專利號(hào)4，329，302中，公開(kāi)了合成的1_0_烷基醚或1_0_脂肪酰基磷酸甘 油化合物，其為可用于調(diào)節(jié)血小板激活的溶血卵磷脂衍生物。在美國(guó)專利號(hào)4，329，302中， 公開(kāi)了溶血卵磷脂的短鏈?；饔茫洚a(chǎn)生帶血小板激活生物載體的化合物，與長(zhǎng)鏈的酰 化作用相反，并公開(kāi)了在模仿PAF方面，1-0-烷基醚在生物學(xué)上優(yōu)于相應(yīng)的1-0-脂肪?；?衍生物。關(guān)于高血壓，各種磷脂的生物活性的結(jié)構(gòu)效應(yīng)已被Tokumura等研究(Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. Julyl981, Vol. 219,No. 1)及在美國(guó)專禾丨J 號(hào)4，827，011中研究。在瑞士專利CH 642，665中，公開(kāi)了有一定生理效應(yīng)的修飾的磷脂醚衍生物。Davies等(J. Biol. Chem. 2001,276 16015)教導(dǎo)了氧化磷脂作為過(guò)氧化物酶體增 生物激活受體激動(dòng)劑的用途。在美國(guó)專利號(hào)6，838，452和在WO 04/106486中(其作為參考引入，如同完全闡述 于此)，通過(guò)本代理人，公開(kāi)了定義明確的氧化磷脂以及其它合成的氧化LDL(低密度脂蛋 白)組分的制備。據(jù)報(bào)道，該公開(kāi)的化合物在治療動(dòng)脈粥樣硬化和相關(guān)疾病，以及自身免疫 疾病和炎性病癥中是非常有效的。有進(jìn)一步報(bào)道，氧化磷脂調(diào)節(jié)了對(duì)氧化LDL的免疫應(yīng)答。有進(jìn)一步報(bào)道，作為治療劑，醚化的氧化磷脂通常優(yōu)于對(duì)應(yīng)的酯化的氧化磷脂。通過(guò)動(dòng)脈粥樣化斑塊中豐富的自由基作用和酶促反應(yīng)而在體內(nèi)發(fā)生磷脂氧化。在 體外，氧化磷脂的制備通常包括天然LDL或LDL磷脂組分的簡(jiǎn)單化學(xué)氧化作用。研究氧化 LDL作用的研究者使用了例如亞鐵離子和抗壞血酸(Itabe，H.等，J. Biol. Chem. 1996 ；271 33208-217)以及硫酸銅(George，J.等，Atherosclerosis. 1998 ；138 147-152 ；Ameli, S.等，Arteriosclerosis Thromb Vase Biol 1996 ； 16 1074-79)以產(chǎn)生氧化的，或輕度 氧化的磷脂分子，其與那些與斑塊組分相關(guān)的分子相似。同樣地，在小鼠中已顯示制備的 分子與動(dòng)脈粥樣化形成相關(guān)的自動(dòng)抗原相同(Watson A.D.等，J. Biol. Chem. 1997 ;272 13597-607)，并能誘發(fā)保護(hù)性的抗動(dòng)脈粥樣硬化的免疫耐受(1999年9月30日提交的 Shoenfeld等的美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?9/806，400)。同樣地，在美國(guó)專利號(hào)5，561，052中，公開(kāi) 了制備氧化類脂和磷脂的方法，其使用磷酸銅和超氧物歧化酶以制備氧化精氨基琥珀酸或 亞油酸和氧化LDL，作為診斷用途。上述用于制備氧化磷脂的氧化技術(shù)涉及非特異性反應(yīng)并產(chǎn)生氧化產(chǎn)物的混合物。 當(dāng)該產(chǎn)物合并于藥物組合物中時(shí)，非特異性反應(yīng)降低了產(chǎn)量，需要進(jìn)一步的分離步驟，并增 加了不期望的副反應(yīng)的擔(dān)憂。1-棕櫚酰-2-(5-0X0Valer0y)-Sn-甘油_3_磷酰膽堿(POVPC)及其衍生物如 1-棕櫚酰-2-戊二酰-sn-甘油-3-磷酰膽堿(PGPC)是輕度氧化酯化磷脂的典型實(shí)例， 其關(guān)于動(dòng)脈粥樣化形成已被研究(見(jiàn)，例如，Boullier等，J. Biol. Chem. · 2000，275 9163 ； Subbanagounder 等，Circulation Research, 1999, PP.311)。已經(jīng)研究了屬于這類氧化磷 脂的不同結(jié)構(gòu)類似物的作用(見(jiàn)，例如，Subbanagounder等，Arterioscler. Thromb. Nasc. Biol. 2000，pp. 2248 ；Leitinger 等，Proc. Nat. Ac. Sci. 1999,96 12010)。通常制備POVPC是通過(guò)提供含不飽和脂肪酸的磷脂酰膽堿，以及例如通過(guò)臭氧分 解(氧化裂解)或使用高碘酸作為氧化劑的氧化該脂肪酸的不飽和鍵。該合成途徑通常包 含多步合成，并需要通過(guò)柱層析法的方式分離大多數(shù)已形成的中間體。如上面引用的美國(guó)專利號(hào)6，838，452所述，醚化的氧化磷脂已同樣通過(guò)氧化與磷 脂主鏈連接的脂肪酸不飽和鍵而制備。更具體而言，根據(jù)本發(fā)明教導(dǎo)的技術(shù)，醚化的氧化磷 脂是通過(guò)將不飽和短鏈脂肪酸引入甘油脂，將磷酸鹽部分引入得到的中間體，以及通過(guò)以 下方法氧化脂肪酸鏈中的不飽和鍵而制備(i)過(guò)氧化氫和甲酸，以便獲得二醇，接著用高 碘酸鉀，以便得到醛；或(ii)臭氧分解。當(dāng)不飽和鍵氧化解裂產(chǎn)生醛部分時(shí)，其它氧化的部 分(例如羧酸、縮醛等)是通過(guò)進(jìn)一步氧化醛部分而獲得。該多步合成途徑時(shí)常具有相對(duì) 較低的總產(chǎn)率的特征，此外，需要通過(guò)柱層析法的方式分離大多數(shù)已形成的中間體。研究已證明，在體內(nèi)使用如上制備的酯化氧化磷脂具有對(duì)體內(nèi)活性成分的識(shí)別、 結(jié)合和代謝敏感的缺點(diǎn)，使施用后的劑量和穩(wěn)定性成為重點(diǎn)考慮的因素。醚化的氧化磷脂， 如那些在美國(guó)專利號(hào)6，838，452和在WO 04/106486中描述的，顯示出較高的生物穩(wěn)定性和 高度的治療活性。因此，當(dāng)前已知的制備醚化的以及酯化的氧化磷脂的方法包括復(fù)雜的多步驟操 作，其適于實(shí)驗(yàn)室制備，然而在工業(yè)化規(guī)模的制備中顯示出低效性和復(fù)雜性。特別地，這些 多步驟操作在合成方法的不同階段，需要工業(yè)上不適用的分離技術(shù)如柱層析法?？紤]到通常氧化磷脂而且特別是醚化氧化磷脂的有益的治療活性，擁有制備醚化的氧化磷脂的改進(jìn)方法而沒(méi)有至少本領(lǐng)域內(nèi)已知方法中的某些缺點(diǎn)，這是廣泛認(rèn)為有必要 而且是非常有利的。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供了一種制備含有甘油骨架和至少一個(gè)通過(guò)醚鍵與甘油 骨架相連的含氧化部分的殘基的化合物的方法，其包含提供第一個(gè)，其第一個(gè)含有甘油骨 架和至少一個(gè)游離羥基基團(tuán)；提供第二個(gè)，其含有至少一個(gè)不飽和鍵和至少一個(gè)能與游離 羥基基團(tuán)形成醚鍵的反應(yīng)基團(tuán)；第一個(gè)化合物和第二個(gè)化合物反應(yīng)從而以獲得第三個(gè)化合 物，該第三個(gè)化合物含有甘油骨架和通過(guò)醚鍵與甘油骨架相連的含不飽和鍵的殘基，從而 獲得純化的第三個(gè)化合物；所述純化的第三個(gè)化合物與氧化劑反應(yīng)，從而得到第四個(gè)化合 物，此第四個(gè)化合物含有甘油骨架和通過(guò)醚鍵與甘油骨架相連的含氧化部分的殘基；并且 分離所述第四個(gè)化合物以獲得純化的第四個(gè)化合物，從而獲得所述化合物，其含有甘油骨 架和至少一個(gè)通過(guò)醚鍵與甘油骨架相連的含氧化部分的殘基，該方法不用柱層析法。根據(jù)下述的在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中的另一個(gè)特征，第一個(gè)化合物與第二個(gè)化 合物的反應(yīng)在堿存在下進(jìn)行。根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案中的再另一個(gè)特征，所述的堿選自氫氧化鈉、氫氧化鋰、 氫氧化鈣、氫氧化鋇和氫氧化鉀。根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案中的再另一個(gè)特征，反應(yīng)基團(tuán)是鹵化物。根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案中的再另一個(gè)特征，分離第三個(gè)化合物包含收集第三 個(gè)化合物；提供第三個(gè)化合物在溶劑中的溶液，該溶劑是經(jīng)選擇的，以便第三個(gè)化合物在其 中是可溶的，而反應(yīng)期間形成的雜質(zhì)在其中不溶，從而提供一種混合物，其包括在溶劑中的 此第三個(gè)化合物的溶液和不溶性雜質(zhì)；除去不溶性雜質(zhì)；并除去溶劑，從而得到純化的第 三個(gè)化合物。根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案中的再另一個(gè)特征，溶劑選自汽油醚、己烷和苯。根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案中的再另一個(gè)特征，氧化劑選自甲酸、過(guò)氧化氫、高碘酸 鹽、高氯酸、鉍酸鹽、高錳酸鹽、亞氯酸鹽、臭氧、氧化銀、四氧化鋨及其任意組合。根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案中的再另一個(gè)特征，氧化部分選自羧酸、酯、醛、縮醛、縮 酮和二元醇。根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案中的再另一個(gè)特征，氧化部分是醛，并且純化的第三個(gè) 化合物和氧化劑的反應(yīng)包含將純化的第三個(gè)化合物轉(zhuǎn)化為含甘油骨架和通過(guò)醚鍵與甘油 骨架相連的含二元醇的殘基的化合物；并氧化該含有甘油骨架和與甘油骨架相連的含二元 醇的殘基的化合物，從而以獲得第四個(gè)化合物，其含有甘油骨架和通過(guò)醚鍵與甘油骨架相 連的含醛的殘基。根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案中的再另一個(gè)特征，所述的轉(zhuǎn)化通過(guò)純化的第三個(gè)化合 物和第一個(gè)氧化劑反應(yīng)進(jìn)行，此氧化劑選自高碘酸鹽、鉍酸鹽、高錳酸鹽和其任意組合。根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案中的再另一個(gè)特征，所述的轉(zhuǎn)化通過(guò)所述化合物，其含 有甘油骨架和與甘油骨架相連的含二元醇的殘基，與選自高碘酸鹽、鉍酸鹽、高錳酸鹽和亞 氯酸的第二個(gè)氧化劑的反應(yīng)進(jìn)行。根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案中的再另一個(gè)特征，分離第四個(gè)化合物包含收集第四個(gè)化合物；提供第四個(gè)化合物的水溶性加合物；將水溶性加合物置于兩相系統(tǒng)中，從而提 供包含加合物的水相和含有在與氧化劑反應(yīng)期間形成的水不溶性雜質(zhì)的有機(jī)相；收集水 相；分解加合物；并收集第四個(gè)化合物，從而獲得純化的第四個(gè)化合物。根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案中的再另一個(gè)特征，提供的水溶性加合物包含第四個(gè) 化合物與紀(jì)臘德試劑反應(yīng)。根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案中的再另一個(gè)特征，氧化部分是羧酸，并且純化的第三 個(gè)化合物與氧化劑的反應(yīng)包含將純化的第三個(gè)化合物轉(zhuǎn)化為含甘油骨架和通過(guò)醚鍵與甘 油骨架相連的含醛的殘基的化合物；氧化含有甘油骨架和與甘油骨架相連的含醛殘基的化 合物，從而得到含有甘油骨架和通過(guò)醚鍵與甘油骨架相連的含羧酸的殘基的化合物。根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案中的再另一個(gè)特征，轉(zhuǎn)化純化的第三個(gè)化合物為所述的 化合物，其含有甘油骨架和通過(guò)醚鍵與甘油骨架相連的含醛的殘基，包含轉(zhuǎn)化純化的第三 個(gè)化合物為含有甘油骨架和通過(guò)醚鍵與甘油骨架相連的含二元醇的殘基的化合物；并且氧 化所述化合物，其含有甘油骨架和與甘油骨架相連的含二元醇的殘基，從而以獲得含有甘 油骨架和通過(guò)醚鍵與甘油骨架相連的含醛的殘基的化合物。根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案中的再另一個(gè)特征，所述的方法進(jìn)一步包含分離該化合 物，其含有甘油骨架和通過(guò)醚鍵與甘油骨架相連的含醛的殘基，從而以獲得純化的化合物， 其含有甘油骨架和通過(guò)醚鍵與甘油骨架相連的含醛的殘基。根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案中的再另一個(gè)特征，分離包含收集所述化合物，其含有 甘油骨架和通過(guò)醚鍵與甘油骨架相連的含醛的殘基；提供所述化合物的水溶性加合物，其 含有甘油骨架和通過(guò)醚鍵與甘油骨架相連的含醛的殘基，其如上文所述；將水溶性加合物 置于兩相系統(tǒng)中，從而以提供含復(fù)合物的水相和含在轉(zhuǎn)化和/或氧化期間形成的水不溶性 雜質(zhì)的有機(jī)相；收集水相；分解加合物；并收集所述化合物，其含甘油骨架和通過(guò)醚鍵與甘 油骨架相連的含醛的殘基，從而得到純化的化合物，其含有甘油骨架和通過(guò)醚鍵與甘油骨 架相連的含醛的殘基。根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案中的再另一個(gè)特征，氧化部分是羧酸，且純化的第三個(gè) 化合物與氧化劑反應(yīng)，包含轉(zhuǎn)化純化的第三個(gè)化合物為化合物，其含有甘油骨架和通過(guò)醚 鍵與甘油骨架相連的含環(huán)氧化物的殘基；并氧化上述化合物，其含有甘油骨架和與甘油骨 架相連的含環(huán)氧化物的殘基，從而獲得一種化合物，其含有甘油骨架和通過(guò)醚鍵與甘油骨 架相連的含羧酸的殘基。根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案中的再另一個(gè)特征，所述轉(zhuǎn)化包含第三個(gè)化合物與過(guò)氧 化物反應(yīng)。根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案中的再另一個(gè)特征，第一個(gè)化合物含有至少兩個(gè)游離羥 基基團(tuán)，所述方法進(jìn)一步包含，在第一個(gè)化合物和第二個(gè)化合物反應(yīng)之前周保護(hù)基團(tuán)保護(hù) 至少兩個(gè)基團(tuán)中的至少一個(gè)。根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案中的再另一個(gè)特征，保護(hù)基團(tuán)是三苯甲基。根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案中的再另一個(gè)特征，第一個(gè)化合物含有至少兩個(gè)游離的 羥基基團(tuán)，所述方法進(jìn)一步包含，第一個(gè)化合物與第二個(gè)化合物反應(yīng)之前用保護(hù)基團(tuán)，優(yōu) 選三苯甲基，保護(hù)至少兩個(gè)基團(tuán)中的至少一個(gè)。根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案中的再另一個(gè)特征，當(dāng)所述方法包括形成含環(huán)氧化物的如上文所述的化合物時(shí)，所述的方法進(jìn)一步包含，在第三個(gè)化合物和氧化劑反應(yīng)之前用選 自醋酸鹽、特戊酸鹽或苯甲酸鹽的保護(hù)基團(tuán)取代三苯甲基。根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案中的再另一個(gè)特征，所述的化合物含有甘油骨架和至少 一個(gè)與甘油骨架相連的含氧化部分的殘基，進(jìn)一步包含與甘油骨架相連的含磷的部分，并 且所述方法進(jìn)一步包含，在第一個(gè)化合物與第二個(gè)化合物反應(yīng)之前，在分離第三個(gè)化合物 之前，在第三個(gè)化合物與氧化劑反應(yīng)之前，在分離第四個(gè)化合物之前或在分離第四個(gè)化合 物之后第一個(gè)化合物、第三個(gè)化合物、純化的第三個(gè)化合物、第四個(gè)化合物或純化的第四 個(gè)化合物與含磷的部分反應(yīng)，從而以獲得所述化合物，其含有甘油骨架和至少一個(gè)與甘油 骨架相連的含氧化部分的殘基，并且進(jìn)一步含有與甘油骨架相連的含磷的部分。根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案中的再另一個(gè)特征，至少一個(gè)含磷部分是通過(guò)磷酸二酯 鍵與甘油骨架相連的磷酸鹽部分。根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案中的再另一個(gè)特征，至少一個(gè)含磷的部分選自磷酸、磷 酰膽堿、磷酸乙醇胺、磷酸絲氨酸、磷?；募×字⒘柞；〈?、乙基磷酰膽堿、磷?；?醇、磷?；掖肌⒘柞；?、磷?；〈?、磷酸乙醇胺-N-乳糖、磷酸乙醇胺-N-[甲氧基 (丙二醇)]、磷酸肌醇-4-磷酸鹽、磷酸肌醇_4，5-雙磷酸脂、焦磷酸鹽、磷酸乙醇胺-二亞 乙基三胺_戊醋酸鹽、二硝基苯基_磷酸乙醇胺和磷酸甘油。根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案中的再另一個(gè)特征，所述的含磷的部分連接于化合物的 甘油骨架的sn-3位。根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案中的再另一個(gè)特征，第一個(gè)化合物、第三個(gè)化合物、純化 的第三個(gè)化合物、第四個(gè)化合物或純化的第四個(gè)化合物與含磷的部分反應(yīng)包含提供第一 個(gè)化合物、第三個(gè)化合物、純化的第三個(gè)化合物、第四個(gè)化合物或純化的第四個(gè)化合物，其 含游離羥基基團(tuán)；第一個(gè)化合物、第三個(gè)化合物、純化的第三個(gè)化合物、第四個(gè)化合物或純 化的第四個(gè)化合物與含磷的活性化合物反應(yīng)，該化合物含有第二個(gè)反應(yīng)基團(tuán)和第三個(gè)反應(yīng) 基團(tuán)，所述第二個(gè)反應(yīng)基團(tuán)能與游離羥基基團(tuán)和第二個(gè)反應(yīng)基團(tuán)反應(yīng)，從而以提供第一個(gè) 化合物、第三個(gè)化合物、純化的第三個(gè)化合物、第四個(gè)化合物或純化的第四個(gè)化合物，其含 有與甘油骨架相連的含磷的基團(tuán)；并且將含磷的反應(yīng)基團(tuán)轉(zhuǎn)化為含磷的部分。根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案中的再另一個(gè)特征，含磷的活性化合物是氧氯化磷 (POCl3)。根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案中的再另一個(gè)特征，所述反應(yīng)在堿存在下進(jìn)行。根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案中的再另一個(gè)特征，所述的含磷的部分是磷酸，且所述 的轉(zhuǎn)化包含水解含磷的反應(yīng)基團(tuán)。根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案中的再另一個(gè)特征，所述的含磷的部分包含氨基烷基基 團(tuán)，且所述的轉(zhuǎn)化包含含磷的反應(yīng)基團(tuán)與氨基烷基基團(tuán)的衍生物反應(yīng)，此衍生物是經(jīng)選擇 的能與第三個(gè)反應(yīng)基團(tuán)反應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了制備含有甘油骨架和至少一個(gè)通過(guò)醚鍵與甘油骨 架相連的含氧化部分的殘基的化合物的另一種方法，該方法包含提供第一個(gè)化合物，其含 有甘油骨架和至少一個(gè)游離羥基；提供第五個(gè)化合物，其含有至少一個(gè)氧化的部分和至少 一個(gè)第四個(gè)反應(yīng)基團(tuán)；第一個(gè)化合物和第五個(gè)化合物反應(yīng)從而以獲得含第六個(gè)化合物的反
9應(yīng)混合物，所述第六個(gè)化合物是含有甘油骨架和至少一個(gè)通過(guò)醚鍵與甘油骨架相連的含氧 化部分的殘基的化合物；并分離此化合物，其含有甘油骨架和至少一個(gè)通過(guò)醚鍵與甘油骨 架相連的含氧化部分的殘基。根據(jù)以下所述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中的另一個(gè)特征，第一個(gè)化合物和第五個(gè)化 合物的反應(yīng)在堿存在下進(jìn)行。根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案中的再另一個(gè)特征，所述的堿選自氫化鈉、氫化鋁鋰、氨 基鈉、氫氧化鈉及其任意混合物。根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案中的再另一個(gè)特征，第四個(gè)反應(yīng)基團(tuán)是鹵化物。根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案中的再另一個(gè)特征，氧化部分選自羧酸、酯、酰鹵、醛、縮 醛、縮酮和二元醇。根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案中的再另一個(gè)特征，第五個(gè)化合物包含少于4個(gè)碳原子。根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案中的再另一個(gè)特征，第五個(gè)化合物包含5個(gè)以上的碳原子。根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案中的再另一個(gè)特征，第五個(gè)化合物含有至少兩個(gè)游離羥 基，所述的方法進(jìn)一步包含，在第一個(gè)化合物和第五個(gè)化合物反應(yīng)之前用保護(hù)基團(tuán)保護(hù)至 少兩個(gè)基團(tuán)中的至少一個(gè)。根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案中的再另一個(gè)特征，所述保護(hù)基團(tuán)是三苯甲基。根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案中的再另一個(gè)特征，所述化合物，其含有甘油骨架和至 少一個(gè)與甘油骨架相連的含氧化部分的殘基，進(jìn)一步包含與甘油骨架相連的含磷的部分， 所述方法進(jìn)一步包含，第一個(gè)化合物和第五個(gè)化合物反應(yīng)之前或之后，或分離第六個(gè)化合 物之后第一個(gè)化合物或第六個(gè)化合物與含磷的部分反應(yīng)，從而以獲得化合物，其含有甘油 骨架和至少一個(gè)與甘油骨架相連的含氧化部分的殘基，且進(jìn)一步含有與甘油骨架相連的含 磷的部分，其如上文所述。根據(jù)以下所述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中的另一個(gè)特征，在此處所述的任意方法 中，第一個(gè)化合物進(jìn)一步包含至少一個(gè)含1-30個(gè)碳原子的烯基鏈。根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案中的再另一個(gè)特征，所述烯基鏈通過(guò)醚鍵與甘油骨架相 連。根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案中的再另一個(gè)特征，所述烯基鏈連接于第一個(gè)化合物的 甘油骨架的sn-Ι位。根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案中的再另一個(gè)特征，所述含氧化部分的殘基與化合物的 sn-2位相連，且進(jìn)一步地其中甘油骨架的至少一個(gè)游離羥基基團(tuán)中的至少一個(gè)是在第一個(gè) 化合物的sn-2位。根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案中的再另一個(gè)特征，第一個(gè)化合物具有通式I
10 式 I其中A1不存在或選自CH2、CH = CH和C = 0 ；R1選自H和含1-30個(gè)碳原子的烴鏈；并且R3選自氫、烷基、芳基、磷酸、磷酰膽堿、磷酸乙醇胺、磷酸絲氨酸、磷脂酰膽堿、磷 脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰心肌磷酯、磷脂酰肌醇、磷?；募×字?、磷?；〈肌?乙基磷酰膽堿、磷?；状?、磷?；掖肌⒘柞；肌⒘柞；〈肌⒘姿嵋掖及?N-乳糖、 磷酸乙醇胺-N_[甲氧基(丙二醇)]、磷酸肌醇-4-磷酸鹽、磷酸肌醇-4，5-雙磷酸脂、焦磷 酸鹽、磷酸乙醇胺_ 二亞乙基三胺_戊醋酸鹽、二硝基苯基_磷酸乙醇胺、磷酸甘油。根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案中的再另一個(gè)特征，所述化合物，其含有甘油骨架和至 少一個(gè)通過(guò)醚鍵與甘油骨架相連的氧化部分，具有通式II 式II其中A1 選自 CH2、CH = CH 和 C = 0 ；A2 是 CH2 ；R1是含1-30個(gè)碳原子的烷基；R2 是 而X是含1-24個(gè)碳原子的烷基鏈；Y選自氫、羥基、烷基、烷氧基、鹵化物、乙酰氧基和芳香族官能團(tuán)；和Z 選自其中R4是烷基或芳基；以及R3選自氫、烷基、芳基、磷酸、磷酰膽堿、磷酸乙醇胺、磷酸絲氨酸、磷脂酰膽堿、磷 脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰心肌磷酯、磷脂酰肌醇、磷?；募×字?、磷?；〈?、 乙基磷酰膽堿、磷?；状?、磷?；掖?、磷?；?、磷酰基丁醇、磷酸乙醇胺-N-乳糖、 磷酸乙醇胺-N_[甲氧基(丙二醇)]、磷酸肌醇-4-磷酸鹽、磷酸肌醇-4，5-雙磷酸脂、焦磷 酸鹽、磷酸乙醇胺-二亞乙基三胺-戊醋酸鹽、二硝基苯基_磷酸乙醇胺、磷酸甘油。根據(jù)本發(fā)明的再另一方面，提供了將磷酸鹽部分引入含有甘油骨架和含有通過(guò)醚 鍵與其相連的含氧化部分或含前氧化部分的殘基的化合物的方法，其包含提供一種化合 物，其含有甘油骨架和通過(guò)醚鍵與甘油骨架相連的含氧化部分或前氧化部分的殘基及至少 一個(gè)游離羥基基團(tuán)；上述化合物與含磷的化合物反應(yīng)，后者含有第二個(gè)反應(yīng)基團(tuán)和第三個(gè) 反應(yīng)基團(tuán)，所述第二個(gè)反應(yīng)基團(tuán)能與游離羥基基團(tuán)反應(yīng)，從而以提供化合物，其含有含氧化 部分或前氧化部分的殘基和含磷的反應(yīng)基團(tuán)；并將含磷的反應(yīng)基團(tuán)轉(zhuǎn)化為磷酸鹽部分，從 而將磷酸鹽部分弓I入上述化合物。根據(jù)以下所述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中的另一個(gè)特征，含有甘油骨架的化合物包 含至少一個(gè)含1-30個(gè)碳原子的烯基鏈。根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案中的再另一個(gè)特征，所述烯基鏈通過(guò)醚鍵與甘油骨架相 連根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案中的再另一個(gè)特征，所述烯基鏈連接于所述化合物的甘 油骨架的sn-Ι位。根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案中的再另一個(gè)特征，所述氧化部分選自羧酸、酯、酰鹵、 酸、縮醛、二元醇和縮酮。根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案中的再另一個(gè)特征，所述前氧化部分是不飽和部分。根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案中的再另一個(gè)特征，所述含磷的化合物是P0C13。根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案中的再另一個(gè)特征，所述反應(yīng)在堿存在下進(jìn)行。根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案中的再另一個(gè)特征，所述堿是叔胺。根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案中的再另一個(gè)特征，所述含磷的化合物是POCl3,且含磷 的反應(yīng)基團(tuán)是二氯磷酸基團(tuán)。根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案中的再另一個(gè)特征，所述含甘油骨架的化合物含有通過(guò) 醚鍵與其相連的含前氧化部分的殘基。根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案中的再另一個(gè)特征，所述磷酸鹽部分選自磷酸、磷酰膽
堿、磷酸乙醇胺、磷酸絲氨酸、磷酰基心肌磷脂、磷?；〈肌⒘柞；募×字?、乙基磷酰膽堿、磷?；状?、磷?；掖?、磷?；?、磷酰基丁醇、磷酸乙醇胺-N-乳糖、磷酸乙醇 胺-N_[甲氧基(丙二醇)]、磷酸肌醇-4-磷酸鹽、磷酸肌醇-4，5-雙磷酸脂、焦磷酸鹽、磷 酸乙醇胺_ 二亞乙基三胺_戊醋酸鹽、二硝基苯基_磷酸乙醇胺、磷酸甘油。根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案中的再另一個(gè)特征，所述磷酸鹽部分是磷酸，并且所述 轉(zhuǎn)化包含水解含磷的反應(yīng)基團(tuán)。根據(jù)所述的優(yōu)選實(shí)施方案中的再另一個(gè)特征，磷酸鹽部分包含烷基氨基，并且所 述轉(zhuǎn)化包含含磷的活性部分與氨基烷基衍生物反應(yīng)，該衍生物能與含磷的反應(yīng)基團(tuán)反應(yīng)。通過(guò)提供新的合成路線，本發(fā)明成功講述了目前已知的構(gòu)型的缺點(diǎn)，此路線能有 利地用于規(guī)模化制備氧化磷脂。除另有說(shuō)明外，此處使用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域內(nèi)的普通技術(shù) 人員之一通常理解相同的含義。盡管與此處所述相似或相當(dāng)?shù)姆椒ê筒牧峡捎糜趯?shí)踐中或 檢驗(yàn)本發(fā)明，但是以下描述了適宜的方法和材料。如果發(fā)生沖突，將管理本發(fā)明說(shuō)明書(shū)，包 括定義。另外，材料、方法和實(shí)施例僅用作說(shuō)明，并不是限制。如此處使用的，術(shù)語(yǔ)“混合物”描述包括一種以上物質(zhì)的混合物，且其可在任意形 式中，例如，作為同質(zhì)的溶液、混懸液、分散系、二相性溶液和更多的。如本申請(qǐng)中使用的，單數(shù)形式“一”、“一”和“此”包括復(fù)數(shù)關(guān)系，除上下文另外清 楚地指出外。整篇本公開(kāi)內(nèi)容中，本發(fā)明的不同方面可以范圍格式存在。應(yīng)當(dāng)理解，范圍格式的 說(shuō)明只是為了方便和簡(jiǎn)短，并且不應(yīng)被解釋為本發(fā)明范圍的固定的限制。相應(yīng)地，應(yīng)當(dāng)理解 范圍的描述已明確地公開(kāi)了所有可能的亞范圍以及該范圍內(nèi)的各數(shù)值。例如，如1-6的范 圍描述應(yīng)被認(rèn)為已明確地公開(kāi)了亞范圍如1-3、1-4、1-5、2-4、2-6、3-6等，以及該范圍內(nèi)的 各數(shù)字，例如，1、2、3、4、5和6。這一應(yīng)用不管范圍的寬度。每當(dāng)在此處指定數(shù)字范圍時(shí)，表示包括任意引用的在指定范圍內(nèi)的數(shù)字(分?jǐn)?shù)或 整數(shù))。短語(yǔ)“范圍/范圍在”第一個(gè)指定數(shù)字和第二個(gè)指定數(shù)字之間以及“范圍/范圍從” 第一個(gè)指定數(shù)字“到”第二個(gè)指定數(shù)字在此處可交換使用，并表示包括第一個(gè)和第二個(gè)指定 數(shù)字以及所有其間的分?jǐn)?shù)和整數(shù)。如在此處普遍使用的，術(shù)語(yǔ)“包含”、“包括”和“含有”表示可加入不影響最終結(jié)果 的其它步驟和成分。這些術(shù)語(yǔ)包含術(shù)語(yǔ)“由...組成”和“基本上由...組成”。術(shù)語(yǔ)“基本上由...組成”表示組合物或方法可以包括另外的成分和/或步驟，但 是只要另外的成分和/或步驟實(shí)質(zhì)上不改變所要求的組合物或方法的基本的和新的特征。術(shù)語(yǔ)“方法”或“過(guò)程”指的是為完成給予的任務(wù)的方法、手段、技術(shù)和操作，包括 但不限于那些已知的方法、手段、技術(shù)和操作，或由化學(xué)、藥理學(xué)、生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的從業(yè) 者從已知的方法、手段、技術(shù)和操作很容易發(fā)展出來(lái)的方法、手段、技術(shù)和操作。術(shù)語(yǔ)“磷脂”在此處用于共同描述包括非極性類脂基團(tuán)和高極性末端磷酸基團(tuán)的 化合物。在磷脂化合物的天然家族中特別的和最普遍的一個(gè)是化合物的磷酸甘油酯族。因 此，除另外指出，此處普遍使用的術(shù)語(yǔ)“磷脂”通常用于描述磷酸甘油酯。因此，術(shù)語(yǔ)“磷酸甘油酯”在此處用于描述含有甘油骨架、一個(gè)或多個(gè)類脂部分和 一個(gè)或多個(gè)磷酸末端基團(tuán)的化合物，其與甘油骨架連接。多數(shù)天然發(fā)生的甘油脂包括兩個(gè) 與sn-Ι和sn-2位相連的類脂部分和一個(gè)與甘油骨架的sn-3位相連的磷酸鹽部分。
因此，術(shù)語(yǔ)“氧化磷脂”在此處用于描述磷脂以及磷酸甘油酯，其包括一個(gè)或多個(gè) 氧化部分，此術(shù)語(yǔ)如在下文所述的。通常，在氧化磷脂中，氧化的部分包括在類脂部分中。術(shù)語(yǔ)“甘油脂”描述含有甘油骨架和與其相連的一個(gè)或多個(gè)類脂部分的化合物。類 脂部分可通過(guò)酯和/或醚鍵與甘油骨架相連。如此處使用的，術(shù)語(yǔ)“類脂”描述含有3-30個(gè)碳原子的烴類殘基。在天然生成的化 合物中，磷脂和甘油脂中的類脂得自脂肪酸，并因此通過(guò)0-酰基(酯)鍵與骨架相連。在 此處，類脂部分可通過(guò)醚或酯鍵與骨架相連。如此處使用的，關(guān)于磷脂或甘油脂的術(shù)語(yǔ)“單_酯化”和“二 _酯化”描述氧化的 或非氧化的磷脂或甘油脂，其中一個(gè)或兩個(gè)類脂部分分別通過(guò)酯(例如，0-脂肪酰基)鍵 與甘油骨架相連。如在此處使用的，關(guān)于磷脂或甘油脂的術(shù)語(yǔ)“單_醚化”和“二 _醚化”描述氧化 的或非氧化的磷脂或甘油脂，其中一個(gè)或兩個(gè)類脂部分分別通過(guò)醚鍵與甘油骨架相連。術(shù)語(yǔ)“甘油磷脂”描述含有甘油骨架和與其一位相連的磷酸基團(tuán)的化合物。術(shù)語(yǔ)“磷酸甘油酯”描述含甘油骨架、一個(gè)或兩個(gè)類脂部分和與其相連的磷酸鹽部 分的化合物。術(shù)語(yǔ)“單_醚化磷酸甘油酯”描述磷酸甘油酯，其中類脂部分通過(guò)醚鍵與甘油骨架 相連。如此處使用的，術(shù)語(yǔ)“部分”描述形成化合物一部分的功能性成分或官能團(tuán)。術(shù)語(yǔ)“殘基”，如本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的那樣，用于描述連接于另一分子的一個(gè)分子 的主要部分。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明是制備氧化磷脂的新方法，其可有效用于這類氧化磷脂的規(guī)?；a(chǎn)。特 別地，本發(fā)明是將氧化部分引入含有甘油骨架的化合物的新方法，并且進(jìn)一步地是將含磷 部分引入這類化合物的新方法。此處所述的新方法不用柱層析法，且通常使用市售可得的 和環(huán)境友善的試劑。根據(jù)本發(fā)明，新合成方法的原理和操作可參考所附的說(shuō)明被更好的理解。在詳細(xì)解釋至少一個(gè)本發(fā)明的實(shí)施方案之前，應(yīng)理解，本發(fā)明在其應(yīng)用中不限于 以下說(shuō)明書(shū)中闡述的或通過(guò)實(shí)施例舉例說(shuō)明的細(xì)節(jié)。本發(fā)明能其它實(shí)施方案或能通過(guò)各種 方法被實(shí)踐或操作。同樣地，應(yīng)理解此處使用的措辭和術(shù)語(yǔ)是為了說(shuō)明，且不應(yīng)認(rèn)為是限 制。如上文所討論的，最近有報(bào)道，明確定義的、綜合制備的氧化磷脂能調(diào)節(jié)對(duì)氧化 LDL的免疫應(yīng)答，且因此在治療動(dòng)脈粥樣硬化和相關(guān)疾病，以及自身免疫疾病和炎性病癥中 是非常有效的。有進(jìn)一步報(bào)道，作為治療劑，醚化氧化磷脂普遍優(yōu)于對(duì)應(yīng)的酯化氧化磷脂。這些非常有益的氧化磷脂通常包括甘油骨架，其與類脂殘基、磷酸鹽殘基和含氧 化部分的類脂殘基相連，例如，如美國(guó)專利號(hào)6，838，452和WO 04/106486中詳細(xì)描述的。如上文所進(jìn)一步討論的，目前已知的制備這類明確定義的合成的氧化磷脂的方法 包含多步合成。盡管發(fā)現(xiàn)這些多步合成是相對(duì)有效的，產(chǎn)生適度至良好的產(chǎn)率，但是這些方 法被需要對(duì)各種在合成過(guò)程中形成的中間體進(jìn)行艱苦的分離和純化操作所限制。尤其是，這些操作通常包含技術(shù)，如柱層析法，其被熟練技術(shù)人員廣泛公認(rèn)是工業(yè)上不適用的技術(shù)， 或至少?gòu)某杀镜挠^點(diǎn)是無(wú)效的，復(fù)雜性和使用過(guò)量的有機(jī)溶劑，其是有害的并需要特別小 心廢物治理。在這些方法中需要使用柱層析法起源于該事實(shí)，在這些多步合成中形成的中 間體以及終產(chǎn)物通過(guò)更常規(guī)的技術(shù)如提取、結(jié)晶等不能被分離和/或純化。由于這些綜合制備的氧化磷脂發(fā)揮特別有益的治療活性，非常希望制備高純度的 這些化合物。此外，由于這些氧化磷脂的制備包含多步合成，為了使這類方法得到適量的產(chǎn) 量和最小量的副產(chǎn)品，所以要求中間體的純化。在尋找制備氧化磷脂的新方法中，其能有效用于這些化合物的規(guī)?；a(chǎn)，雖然 其設(shè)法避開(kāi)了需要使用艱苦技術(shù)如柱層析法，但是本發(fā)明者已設(shè)計(jì)并成功將新合成方法學(xué) 實(shí)踐于將氧化部分和/或磷酸鹽部分引入含甘油骨架的化合物中，其設(shè)法避開(kāi)了柱層析法 的不利用途并導(dǎo)致了相對(duì)高的純化合物的產(chǎn)量。在此處所述的方法進(jìn)一步通常使用商業(yè)上 可得的、無(wú)害的試劑，其進(jìn)一步供給其工業(yè)上的適用性。此處所述的新合成方法學(xué)可分解如下(i)通過(guò)引入不飽和部分和氧化不飽和部分，將氧化部分引入含甘油骨架的化合 物的新方法，而緊接著所述的氧化，含氧化部分的化合物可被分離并通過(guò)水溶性加合物的 方法純化；(ii)通過(guò)引入不飽和部分和氧化不飽和部分，將氧化部分引入含甘油骨架的化合 物的新方法，而所述的氧化是通過(guò)環(huán)氧化物中間體及在選擇性保護(hù)基團(tuán)存在下進(jìn)行的；(iii)通過(guò)直接引入氧化部分，將氧化部分引入含甘油骨架的化合物的新方法； 以及(iV)通過(guò)引入含磷反應(yīng)基團(tuán)，將磷酸鹽弓I入任選含與其連接的氧化或前氧化部分 的甘油脂。由于氧化磷脂的優(yōu)良性能，其含氧化部分的殘基通過(guò)醚鍵與骨架相連，這些方法 都涉及含氧化部分的殘基通過(guò)醚鍵與甘油骨架的連接。如以下實(shí)施例部分所證明的，使用這些方法學(xué)，明確定義的氧化磷脂以相對(duì)高的 產(chǎn)量和純度已被成功制備。因而，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種制備含有甘油骨架和至少一個(gè)通過(guò)醚 鍵與甘油骨架相連的含氧化部分殘基的化合物的方法，其無(wú)需柱層析法。根據(jù)本發(fā)明的此 方面，所述方法通過(guò)以下實(shí)現(xiàn)提供第一個(gè)化合物，其含有甘油骨架和至少一個(gè)游離羥基基團(tuán)；提供第二個(gè)化合物，其含有至少一個(gè)不飽和鍵和至少一個(gè)能與所述游離羥基基團(tuán) 形成醚鍵的活性基團(tuán)；第一個(gè)化合物與第二個(gè)化合物反應(yīng)，從而以獲得第三個(gè)化合物，其含有甘油骨架 和通過(guò)醚鍵與甘油骨架相連的含不飽和鍵的殘基；分離第三個(gè)化合物，從而以獲得純化的第三個(gè)化合物；純化的第三個(gè)化合物與氧化劑反應(yīng)，從而以獲得第四個(gè)化合物，其含有甘油骨架 和通過(guò)醚鍵與甘油骨架相連的含氧化部分的殘基；以及分離第四個(gè)化合物，從而以得到純化的第四個(gè)化合物，從而得到所述化合物，其含 有甘油骨架和至少一個(gè)通過(guò)醚鍵與甘油骨架相連的含氧化部分的殘基。
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如在此普遍使用的，短語(yǔ)“含甘油骨架的化合物”，其在此也指的是可互換的“甘油 的化合物”或“甘油化合物”，描述了包括以下骨架的化合物 當(dāng)所述化合物是甘油時(shí)，各甘油位sn-1、sn-2和sn-3被游離羥基取代。如在此普遍使用的，短語(yǔ)“氧化部分”和“含氧化部分的殘基，其在此可互換使用， 描述了有機(jī)部分，其中至少一個(gè)碳原子被氧原子取代。實(shí)例，不限于，包括醛、羧酸、羧酸酯、 二元醇、縮醛和縮酮。短語(yǔ)“含有含氧化部分殘基的化合物”和“含氧化部分的化合物”在 此也可互換使用。根據(jù)本發(fā)明此方面的方法是依據(jù)將不飽和部分引入甘油化合物并將不飽和鍵氧 化解裂。然而，當(dāng)這一合成路線在目前已知的甘油氧化磷脂中使用時(shí)，本發(fā)明者已設(shè)計(jì)并成 功應(yīng)用這一方法，其中含有與其相連的氧化部分的甘油化合物可被分離并且無(wú)需使用柱層 析法純化。將不飽和部分引入甘油化合物通常使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法進(jìn)行如，例如在美國(guó) 專利號(hào)6，838，452中所述的。通常，選擇第一個(gè)化合物，其含有甘油骨架和至少一個(gè)游離羥基基團(tuán)，作為起始原 料。獲得含有不飽和部分和第一個(gè)反應(yīng)基團(tuán)的化合物，其在此也指的是第二個(gè)化合 物，可以是商業(yè)可得或使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法，并與甘油起始原料反應(yīng)。第一個(gè)反應(yīng)基團(tuán)是選擇性的能與游離羥基基團(tuán)反應(yīng)。與游離羥基基團(tuán)反應(yīng)以便形 成醚鍵通常是通過(guò)親核機(jī)理進(jìn)行，并且因此第一個(gè)反應(yīng)基團(tuán)優(yōu)選其特征為好的離去基團(tuán)， 且可以是，例如，鹵化物、磺酸鹽和任意其它離去基團(tuán)。優(yōu)選地，反應(yīng)基團(tuán)是商化物，且更優(yōu)選地，是溴化物。優(yōu)選地，第二個(gè)化合物是經(jīng)選擇的，以便不飽和部分存在于其末端，以便促進(jìn)后面 的氧化反應(yīng)。對(duì)于“不飽和部分”在此表示包括至少兩個(gè)碳原子的部分，該碳原子于其間通 過(guò)不飽和鍵連接，例如雙鍵或三鍵，優(yōu)選雙鍵。進(jìn)一步優(yōu)選地，第二個(gè)化合物包含4-30個(gè)碳原子，更優(yōu)選4-27個(gè)碳原子，更優(yōu)選 4-16碳原子，更優(yōu)選4-10個(gè)碳原子，更優(yōu)選4-8個(gè)碳原子，并且最優(yōu)選第二個(gè)化合物包含6 個(gè)碳原子。在此處所述的第一個(gè)化合物與第二個(gè)化合物反應(yīng)通常在堿存在下進(jìn)行。本發(fā)明的 上下文中使用的適宜的堿包括，不限于，無(wú)機(jī)堿如氫氧化鈉、氫氧化鋰、氫氧化鈣、氫氧化鋇 和氫氧化鉀。第一個(gè)化合物和第二個(gè)化合物反應(yīng)通常在溶劑存在下進(jìn)行。本發(fā)明的上下文中使 用的適宜的溶劑包括，不限于，非極性溶劑如汽油醚、己烷、苯和甲苯。如果希望選擇性地進(jìn)行反應(yīng)，即將不飽和部分引入甘油骨架的某一位置，如果存在，游離羥基而非反應(yīng)羥基應(yīng)在反應(yīng)前被保護(hù)。因此，遇此情況，根據(jù)本發(fā)明的此方面的方法，任選并優(yōu)選進(jìn)一步包含，第一個(gè)化 合物和第二個(gè)化合物反應(yīng)之前，保護(hù)一個(gè)或多個(gè)在第一個(gè)化合物內(nèi)存在的另外的游離羥基。已知的任意羥基保護(hù)基團(tuán)可在本發(fā)明的上下文中使用。根據(jù)本發(fā)明該方面優(yōu)選的 實(shí)施方案，保護(hù)基團(tuán)是三苯甲基。由于空間位阻，三苯甲基是一龐大的基團(tuán)，其通常用作選擇性保護(hù)基團(tuán)。因此，當(dāng) 含一個(gè)以上游離羥基基團(tuán)的化合物反應(yīng)時(shí)，三苯甲基通常將與位阻較小的基團(tuán)反應(yīng)。如上文所指出的及在美國(guó)專利號(hào)6，838，452和WO 04/106486中詳細(xì)進(jìn)一步討論 的，與氧化部分相連的甘油骨架的位置將影響化合物的活性。因此，進(jìn)行制備此處選擇性描 述的甘油化合物是非常有利的，以便含氧化部分的殘基將在希望的位置上連接。如在美國(guó) 專利號(hào)6，838，452中所進(jìn)一步證明的，含有連接于甘油骨架的sn-2位的含氧化部分的殘基 的氧化磷脂發(fā)揮優(yōu)良的性能。至結(jié)束時(shí)，當(dāng)將上述的第二個(gè)化合物引入甘油骨架時(shí)，使用三苯甲基作為保護(hù)基 團(tuán)是非常有利的，因?yàn)橛捎谄潺嫶笮?，將影響在sn-Ι和/或sn-3位的羥基末端基團(tuán)的保 護(hù)，離去可用于進(jìn)一步取代的在sn-2的羥基基團(tuán)。一旦第一個(gè)化合物和第二個(gè)化合物的反 應(yīng)完成，得到反應(yīng)混合物，其包含含甘油骨架和通過(guò)醚鍵與其相連的含不飽和部分的殘基。 這一化合物在此也指的是可互換的第三個(gè)化合物。依據(jù)使用的起始原料，第三個(gè)化合物可進(jìn)一步包括一個(gè)或多個(gè)保護(hù)基團(tuán)，保護(hù)可 存在于甘油骨架內(nèi)的游離羥基。然后，從反應(yīng)混合物分離第三個(gè)化合物，保護(hù)的或脫保護(hù)的，并處理以便得到純化 的化合物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，分離第三個(gè)化合物通過(guò)首先收集形成的第三個(gè)化合物形 成。收集第三個(gè)化合物通常使用常規(guī)技術(shù)進(jìn)行，如提取、除去溶劑、過(guò)濾等，包括其任意聯(lián) 用。一旦收集，將粗品產(chǎn)物溶于溶劑中，而溶劑是經(jīng)選擇的，以便第三個(gè)化合物在其中是可 溶的而在第一個(gè)和第二個(gè)化合物反應(yīng)期間形成的雜質(zhì)在其中不溶。術(shù)語(yǔ)“雜質(zhì)”在此處用于描述存在于最終粗品產(chǎn)物中且不是產(chǎn)物本身的任何物質(zhì)， 且包括，例如，未反應(yīng)的起始原料和副產(chǎn)物。使用這一溶劑，獲得混合物，其包括在這一溶劑中的第三個(gè)化合物的溶液和不溶 性物質(zhì)。在本發(fā)明的上下文中使用的適宜的溶劑包括，不限于，汽油醚、己烷、苯、庚烷和甲 苯。優(yōu)選地，溶劑是汽油醚。然后，將不溶性雜質(zhì)從混合物中除去，優(yōu)選地通過(guò)過(guò)濾，除去溶劑并得到純化的第 三個(gè)化合物，同時(shí)設(shè)法避開(kāi)了在其純化步驟中使用柱層析法的必要。然后，純化的第三個(gè)化合物于氧化劑反應(yīng)，以便氧化不飽和部分，并從而獲得第四 個(gè)化合物，其中含氧化部分的殘基通過(guò)醚鍵與甘油骨架相連。氧化劑的選擇依據(jù)希望被氧化的部分，如以下詳述的，且可以是例如過(guò)氧化物、高 碘酸鹽、鉍酸鹽、高錳酸鹽、亞氯酸鹽、臭氧、氧化銀、四氧化鋨和其任意組合。如此處使用的，術(shù)語(yǔ)“高碘酸鹽”描述了含有式乂104的化合物，其中X可以是氫(對(duì) 于高碘酸)或金屬一價(jià)陽(yáng)離子(例如，鈉、鉀)。
術(shù)語(yǔ)“鉍酸鹽”描述了含有式XBiO3的化合物，其中X可以是氫或金屬一價(jià)陽(yáng)離子 (例如，鈉、鉀)。術(shù)語(yǔ)“高錳酸鹽”描述了含有式XMnO4的化合物，其中X可以是氫或金屬一價(jià)陽(yáng)離 子(例如，鈉、鉀)。術(shù)語(yǔ)“亞氯酸鹽”描述了含有式XClO2的化合物，其中X可以是氫或金屬一價(jià)陽(yáng)離 子(例如，鈉、鉀)。如此處使用的，術(shù)語(yǔ)“過(guò)氧化物”包括含有式R-O-O-H的化合物，其中 R可以是氫、烷基、環(huán)烷基、芳基、氧基烷基、氧基環(huán)烷基和氧基芳基，如這些術(shù)語(yǔ)在此處所確 定的。如在此普遍使用的，術(shù)語(yǔ)“烷基”指的是飽和脂肪烴包括直鏈和支鏈基團(tuán)。優(yōu)選地， 烷基基團(tuán)含有1-20個(gè)碳原子。“環(huán)烷基”基團(tuán)指的是所有碳的單環(huán)或稠和環(huán)(即，共享一對(duì)鄰近碳原子的環(huán))基 團(tuán)，其中多個(gè)環(huán)中的一個(gè)不含有完全共軛的η-電子系統(tǒng)。環(huán)烷基基團(tuán)的實(shí)例，不限于，是 環(huán)丙烷、環(huán)丁烷、環(huán)戊烷、環(huán)戊烯、環(huán)己烷、環(huán)己二烯、環(huán)庚烷、環(huán)庚三烯和金剛烷胺。“芳基”基團(tuán)指的是所有碳的單環(huán)或稠和環(huán)的多環(huán)(即，共享鄰近碳原子對(duì)的環(huán)) 基團(tuán)，其含有完全共軛的η-電子系統(tǒng)。芳基基團(tuán)的實(shí)例，不限于，是苯基、萘基和蒽基。術(shù)語(yǔ)“氧基烷基”、“氧基環(huán)烷基”和“氧基芳基”描述了 R' -C( = 0)-基團(tuán)，其中 R'分別是烷基、環(huán)烷基或芳基，以便過(guò)氧化物是過(guò)氧羧酸。優(yōu)選地，過(guò)氧化物是過(guò)氧化氫或過(guò)氧羧酸。因此，在本發(fā)明的此方面的一個(gè)實(shí)施方案中，氧化部分是醛，且第三個(gè)化合物與氧 化劑反應(yīng)是通過(guò)首先轉(zhuǎn)化第三個(gè)化合物中的不飽和部分為二元醇部分進(jìn)行的，優(yōu)選地通過(guò) 氧化劑，其在此指的是第一個(gè)氧化劑；然后用第二個(gè)氧化劑，進(jìn)一步氧化二元醇部分為醛部 分。第一個(gè)和第二個(gè)氧化劑可以相同或不同，且可以是，例如，過(guò)氧化物、高碘酸鹽、鉍
酸鹽、高錳酸鹽、亞氯酸鹽、臭氧和其任意組合。如果第一個(gè)和第二個(gè)氧化劑是相同的，且依據(jù)使用的氧化劑，轉(zhuǎn)化不飽和部分為 二元醇部分及氧化二元醇部分可同時(shí)進(jìn)行。在此方面使用的適宜的氧化劑包括能誘導(dǎo)不飽 和部分氧化解裂的氧化劑例如臭氧、四氧化鋨和高錳酸鉀。如果第一個(gè)第二個(gè)氧化劑是不同的，優(yōu)選第一個(gè)氧化劑是過(guò)氧化物，如過(guò)氧化氫， 且第二個(gè)氧化劑是，例如，高碘酸鹽或鉍酸鹽。在其中可進(jìn)行轉(zhuǎn)化和氧化操作的反應(yīng)條件根據(jù)使用的氧化劑確定。在本發(fā)明的此方面的優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一個(gè)和第二個(gè)氧化劑是不同的，且轉(zhuǎn) 化不飽和部分為二元醇部分和氧化二元醇部分連續(xù)地進(jìn)行。進(jìn)一步地，根據(jù)本發(fā)明的此方 面優(yōu)選的實(shí)施方案，一旦得到二元醇，保護(hù)基團(tuán)，如果存在，被除去以便獲得含有三個(gè)或更 多游離羥基基團(tuán)的化合物(此處為三元醇)。由于其唯一的化學(xué)特征，通過(guò)結(jié)晶的方法，在 其氧化為醛之前，這一化合物容易被純化，如在以下實(shí)施例(見(jiàn)，實(shí)施例1)部分中確定的。 一旦被純化，在下一合成步驟之前，可能影響在sn-Ι和/或sn-3位游離羥基基團(tuán)的選擇性 保護(hù)。因此，將形成的含醛甘油化合物從反應(yīng)化合物分離并純化。在本發(fā)明的此方面的優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)形成其水溶性加合物來(lái)純化醛。
因此，一旦與氧化劑的反應(yīng)完全，則使用如上所述的常規(guī)技術(shù)收集含醛的第四個(gè) 化合物，且此后將粗品產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為其水溶性加合物。通過(guò)在兩相系統(tǒng)中進(jìn)行這一轉(zhuǎn)化，得到 含有水溶性加合物的水相和含有水不溶性雜質(zhì)的有機(jī)相。由于在氧化反應(yīng)期間形成的多數(shù) 副產(chǎn)物和未反應(yīng)的原料是有機(jī)物質(zhì)，通過(guò)收集水相，這些有機(jī)物質(zhì)很容易從水溶性加合物 分離。此后，通過(guò)分解水溶性加合物，恢復(fù)含醛化合物。在本發(fā)明的上下文中使用的適宜的水溶性加合物優(yōu)選通過(guò)含醛化合物與紀(jì)臘德 試劑反應(yīng)獲得。紀(jì)臘德試劑是能與含羰基化合物形成水溶性腙加合物的一族物質(zhì)，因此可從其它 有機(jī)非羰基化合物分離含羰基的化合物。紀(jì)臘德試劑是氨基脲的離子衍生物。T形式是(羧甲基)三甲基氯化銨酰胼 因此，通過(guò)用紀(jì)臘德試劑將含醛化合物轉(zhuǎn)化為其水溶性加合物，很容易和方便地 獲得純化的第四個(gè)化合物，而避免了使用柱層析法。如果氧化部分是羧酸，第三個(gè)化合物和氧化劑反應(yīng)可以通過(guò)首先提供含醛化合物 進(jìn)行，任選且優(yōu)選如上文所述的，并且進(jìn)一步地任選且優(yōu)選，通過(guò)提供純化的含醛化合物， 使用上文所述的方法學(xué)，并且此后進(jìn)一步氧化醛為羧酸。氧化醛為羧酸優(yōu)選通過(guò)醛和氧化劑如亞氯酸鹽反應(yīng)進(jìn)行。或者，不飽和部分可通過(guò)環(huán)氧化物中間體被氧化為羧酸。因此，第三個(gè)化合物和氧化劑反應(yīng)可以通過(guò)轉(zhuǎn)化不飽和部分為環(huán)氧化物，并轉(zhuǎn)化 環(huán)氧化物為羧酸進(jìn)行。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)化環(huán)氧化物為羧酸通過(guò)轉(zhuǎn)化環(huán)氧化物為二元醇并氧化二 元醇進(jìn)行，以便獲得羧酸部分。將第三個(gè)化合物轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化物優(yōu)選通過(guò)第三個(gè)化合物與過(guò)氧化物反應(yīng)進(jìn)行，如 上文所述的，且更優(yōu)選用過(guò)氧羧酸。D形式是(羧甲基)二甲基氯化銨酰胼 以及P形式是1_(羧甲基)吡啶鐺氯化物酰胼 轉(zhuǎn)化環(huán)氧化物為二元醇優(yōu)選通過(guò)環(huán)氧化物與高氯酸(HClO4)反應(yīng)進(jìn)行?；蛘?，通 過(guò)其與硫酸反應(yīng)，過(guò)氧化物被轉(zhuǎn)化為二元醇。然后，通過(guò)與第三個(gè)氧化劑反應(yīng)，二元醇被轉(zhuǎn)化為羧酸。第三個(gè)氧化劑可選自高碘 酸鹽、鉍酸鹽、高錳酸鹽、亞氯酸鹽及其任意組合。優(yōu)選地，通過(guò)其與高碘酸鹽反應(yīng)將二元醇 轉(zhuǎn)化為羧酸，接著通過(guò)亞氯酸鹽。因此，獲得第四個(gè)化合物，其含有甘油骨架和通過(guò)醚鍵與其連接的含羧酸的部分， 然后純化，以便獲得純化的產(chǎn)物。本發(fā)明者現(xiàn)已驚訝地發(fā)現(xiàn)如果其游離羥基是被保護(hù)基團(tuán)如醋酸鹽、特戊酸鹽或苯 甲酸鹽保護(hù)的，通過(guò)環(huán)氧化物中間體得到的第四個(gè)化合物很容易被純化，而避免了使用柱 層析法。如上文提及的，如果在甘油骨架中存在，游離羥基基團(tuán)優(yōu)選被保護(hù)，而優(yōu)選的、選 擇性的保護(hù)基團(tuán)是三苯甲基。然而，由于三苯甲基是巨大的、龐大的且是極性部分，在某些 情況下，其存在使各種中間體和終產(chǎn)物的分離和純化操作復(fù)雜。本發(fā)明者現(xiàn)已揭露與三苯甲基相關(guān)的缺陷容易被設(shè)法避開(kāi)，通過(guò)(i)通過(guò)形成 其水溶性加合物分離含醛化合物，如上文廣泛所述的；或(ii)用較小的基團(tuán)取代三苯甲基 保護(hù)基團(tuán)，然后引入第二個(gè)化合物。另外，如上文所述，當(dāng)氧化第三個(gè)化合物包含形成二元 醇時(shí)，一旦形成二元醇，三苯甲基保護(hù)基團(tuán)可被除去且得到的三元醇可通過(guò)結(jié)晶作用被分 罔。因此，根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，方法進(jìn)一步包含，提供純化的第三個(gè)化合物之 后和/或第三個(gè)化合物與氧化劑反應(yīng)之前用選自醋酸鹽、特戊酸鹽或苯甲酸鹽的保護(hù)基 團(tuán)取代三苯甲基基團(tuán)。取代三苯甲基基團(tuán)通常通過(guò)除去三苯甲基基團(tuán)進(jìn)行，以便獲得游離羥基基團(tuán)并用 希望的保護(hù)基團(tuán)保護(hù)羥基基團(tuán)。用醋酸鹽基團(tuán)保護(hù)羥基基團(tuán)通過(guò)第三個(gè)化合物與例如醋酸酐容易進(jìn)行。用特戊酸 鹽基團(tuán)保護(hù)羥基基團(tuán)通過(guò)第三個(gè)化合物與例如特戊酰氯反應(yīng)很容易進(jìn)行。用苯甲酸鹽基團(tuán) 保護(hù)羥基通過(guò)第三個(gè)化合物與例如苯甲酰氯很容易進(jìn)行。純化如此處所述的第四個(gè)化合物，其含有醋酸鹽、特戊酸鹽或苯甲酸鹽保護(hù)基團(tuán)， 可以通過(guò)常規(guī)提取技術(shù)進(jìn)行，優(yōu)選在提取操作期間使用硅膠。如在以下實(shí)施例部分中所證明的(見(jiàn)，實(shí)施例2)，研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)形成含有醋酸鹽 基團(tuán)的含環(huán)氧化物的中間體，制備含有通過(guò)醚鍵與其相連的含氧化部分基團(tuán)的甘油化合 物，產(chǎn)生高純度的化合物和高的反應(yīng)產(chǎn)量。如果得到的第四個(gè)化合物有保護(hù)基團(tuán)，其如上文所述的，一旦得到并純化第四個(gè) 化合物，就除去保護(hù)基團(tuán)。如果氧化部分是酯，則方法通過(guò)提供含羧酸部分的化合物，然后將羧酸轉(zhuǎn)化為酯 進(jìn)行。使用本領(lǐng)城內(nèi)眾所周知的方法，這能很容易地進(jìn)行。如上文所討論的化合物，其含有甘油骨架和至少一個(gè)與甘油骨架相連的含氧化部 分的殘基，且進(jìn)一步含有與甘油骨架相連的含磷部分，優(yōu)選含磷酸鹽部分，被稱為氧化磷脂 且在治療各種癥狀中是很有益的。因此，此處所述的方法任選并優(yōu)選進(jìn)一步包含將這一含 磷部分引入甘油骨架。
如此處使用的，短語(yǔ)“含磷的部分”描述了包括一個(gè)或多個(gè)磷原子的部分，如此處 定義的。典型實(shí)例包括，不限于，磷酸鹽、碳磷酸鹽化合物、磷化氫、磷化氫氧化物、亞磷酸 鹽、焦磷酸鹽等。如此處使用的，術(shù)語(yǔ)“碳磷酸鹽化合物”描述了 _P( = 0) (OR' ) (OR")基團(tuán)，其中 R'和R"各自獨(dú)立地是氫，或者取代的或未取代的烷基、環(huán)烷基或芳基，如此處所定義的。術(shù)語(yǔ)“亞磷酸鹽”描述了-PR' R"基團(tuán)，R'和R〃如上文所定義。術(shù)語(yǔ)“磷化氫氧化物”描述了 _P( = 0) (R' ) (R〃 )末端基團(tuán)或-P( = 0) (R')-連 接基團(tuán)，如這些短語(yǔ)在上文所定義，R'和R"如此處所定義。術(shù)語(yǔ)“焦磷酸鹽”描述了-O-P( = 0) (OR' )-0-P( = 0) (OR' ) (OR" ) (0R〃 ‘) 基團(tuán)，R'、R"如此處所定義的，且R〃 ‘定義為R'或R"。術(shù)語(yǔ)“亞磷酸鹽”描述了 -0-ΡΗ( = 0) (OR')基團(tuán)，R'如此處所定義。術(shù)語(yǔ)“磷酸鹽”描述了-O-P ( = 0)2 (OR')基團(tuán)，R'如此處所定義。術(shù)語(yǔ)“硫代磷酸鹽”描述了 -0_P( = 0) ( = S) (OR')基團(tuán)，R'如此處所定義。將含磷的部分引入甘油化合物可在第一個(gè)化合物與第二個(gè)化合物反應(yīng)之前、分離 第三個(gè)化合物之前、第三個(gè)化合物與氧化劑反應(yīng)之前、分離第四個(gè)化合物之前或分離第四 個(gè)化合物之后進(jìn)行，并可使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何方法進(jìn)行。因此，將含磷部分引入含有甘油化合物的化合物通過(guò)以下進(jìn)行上述的任意第一個(gè)化合物、第三個(gè)化合物、純化的第三個(gè)化合物、第四個(gè)化合物或 純化的第四個(gè)化合物與含磷的部分反應(yīng)，以便獲得化合物，其含有甘油骨架和至少一個(gè)與 甘油骨架相連的含氧化部分的殘基，且進(jìn)一步含有與甘油骨架相連的含磷的部分。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，含磷的部分是磷酸鹽部分，其通過(guò)磷酸二酯鍵與甘 油骨架相連。因此，含磷部分可以是，例如磷酸、磷酰膽堿、磷酸乙醇胺、磷酸絲氨酸、磷?；?肌磷脂、磷?；〈?、乙基磷酸膽堿、磷?；状?、磷?；掖?、磷?；?、磷?；〈?、 磷酸乙醇胺-N-乳糖、磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(丙二醇)]、磷酸肌醇-4-磷酸鹽、磷酸肌 醇-4，5-雙磷酸脂、焦磷酸鹽、磷酸乙醇胺-二亞乙基三胺-戊醋酸鹽、二硝基苯基_磷酸 乙醇胺和磷酸甘油。優(yōu)選地，含磷部分連接于甘油骨架的sn-3位，且因此引入這一部分選擇性地進(jìn) 行，通過(guò)適當(dāng)?shù)乇Ｗo(hù)其它存在于反應(yīng)化合物中的游離羥基基團(tuán)或在希望的位置脫保護(hù)被保
護(hù)的羥基基團(tuán)。在目前已知的制備氧化磷脂的方法中，含磷部分通常在提供含氧化部分的化合物 之前引入。另外，如果含磷部分是磷酰膽堿，其在這類化合物中是廣泛使用的且是有益的部 分，目前已知的方法包含N-烷基化反應(yīng)，其包含危險(xiǎn)的且環(huán)境不友善的試劑例如三甲胺。本發(fā)明者現(xiàn)已揭露(i)含磷的部分可以很容易地在提供含氧化部分的化合物之 后引入；以及(ii)通過(guò)反應(yīng)引入含磷的部分可以通過(guò)含磷的反應(yīng)中間體有效地進(jìn)行。根據(jù)上述，本發(fā)明者已設(shè)計(jì)并成功實(shí)踐了將含磷部分引入含有甘油骨架和通過(guò)醚 鍵與其相連的氧化部分殘基的化合物的新方法。與上述制備含氧化部分化合物的方法并用的此方法，可有益地用于制備治療上有
21益的上述氧化磷脂。因此，根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，引入含磷部分在生成第三個(gè)化合物之后或生 成第四個(gè)化合物之后進(jìn)行，后者是優(yōu)選的。然而，應(yīng)該指出，在此所列的引入含磷部分的方 法也適用于任意其它階段。因此，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，將含磷部分引入甘油化合物優(yōu)選通過(guò)如下進(jìn)行如 上所述的第一個(gè)化合物、第三個(gè)化合物、純化的第三個(gè)化合物、第四個(gè)化合物或純化的第四 個(gè)化合物，其含有游離羥基基團(tuán)，與含磷反應(yīng)基團(tuán)反應(yīng)，以便生成含有含磷反應(yīng)基團(tuán)的化合 物；并轉(zhuǎn)化含磷的反應(yīng)基團(tuán)為含磷的部分。含磷的活性化合物是經(jīng)選擇的，以便根據(jù)所述的反應(yīng)，獲得與甘油骨架相連的含 磷的反應(yīng)基團(tuán)。因此，選擇含磷的活性化合物作為含有第二個(gè)反應(yīng)基團(tuán)和第三個(gè)反應(yīng)基團(tuán)， 從而第二個(gè)反應(yīng)基團(tuán)是經(jīng)選擇的能與游離羥基基團(tuán)反應(yīng)且第三個(gè)反應(yīng)基團(tuán)是經(jīng)選擇的能 被轉(zhuǎn)化為含磷的部分。能與游離羥基基團(tuán)反應(yīng)的反應(yīng)基團(tuán)包括，例如鹵化物、磺酰氯、酰鹵等。優(yōu)選地，第二個(gè)反應(yīng)基團(tuán)是鹵化物，且更優(yōu)選的為氯化物。雖然如上文所述，優(yōu)選的含磷的部分是磷酸鹽部分，但是將含磷的化合物轉(zhuǎn)化為 希望得到的含磷部分通常包含磷酸鹽酯鍵的形成。這一鍵能，例如，通過(guò)磷衍生物如磷酰氯 與含羥基的部分反應(yīng)。因此，根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，含磷的反應(yīng)化合物是氧氯化磷(POCl3),以便第三個(gè) 和第二個(gè)反應(yīng)基團(tuán)兩者都是氯化物，且含有含磷反應(yīng)基團(tuán)的化合物含有甘油骨架和與其連 接的磷酰氯殘基。第一個(gè)化合物、第三個(gè)化合物、純化的第三個(gè)化合物、第四個(gè)化合物或純化的第四 個(gè)化合物與氧氯化磷反應(yīng)通常在堿存在下進(jìn)行。適宜的堿包括有機(jī)和無(wú)機(jī)堿，優(yōu)選有機(jī)堿。 因此，反應(yīng)優(yōu)選在堿存在下如，例如，三烷基胺(例如，三乙胺)進(jìn)行。該反應(yīng)進(jìn)一步優(yōu)選在溶劑存在下進(jìn)行，優(yōu)選極性溶劑如THF。通過(guò)此處所述的方法獲得的含磷酰氯的含甘油的化合物可容易地被轉(zhuǎn)化為任何 希望得到的含磷的部分，且因此是非常有用的中間體。因此，例如通過(guò)其簡(jiǎn)單的水解能被轉(zhuǎn)化為磷酸，如在以下的實(shí)施例部分所舉例說(shuō) 明的。或者，能與含羥基的部分反應(yīng)，并且任選且優(yōu)選也和水反應(yīng)，從而以得到其它的磷 酸鹽部分?；旌嫌谥委熜匝趸字?例如，磷酰膽堿、磷酸乙醇胺)中的優(yōu)選的磷酸鹽部分通 常包括氨基烷基基團(tuán)，其能進(jìn)一步被N-烷基化。因此，轉(zhuǎn)化磷酰氯中間體為此磷酸鹽部分能通過(guò)與希望的烷基氨基基團(tuán)衍生物反 應(yīng)容易地進(jìn)行，經(jīng)選擇的能與第三個(gè)反應(yīng)基團(tuán)(是氯化物)反應(yīng)。因此，例如，含氨基烷基的磷酸鹽部分能通過(guò)磷酰氯中間體與氨基醇反應(yīng)獲得。如 果需要，此后氨基乙醇能進(jìn)一步被烷基化，以便產(chǎn)生N-烷基化的氨基烷基磷酸鹽部分，如 磷酰膽堿部分。使用上述方法獲得的這一與甘油骨架相連的N-烷基化氨基烷基磷酸鹽部分是非 常有用的，由于其設(shè)法避開(kāi)了使用有害的原料如三甲胺通的需要，其通常用于獲得此類化合物。如上文所討論的，引入含磷的部分可在將含氧化部分殘基引入甘油化合物之前或 之后進(jìn)行。如在以下實(shí)施例部分中所證明的，磷酰膽堿部分被成功引入甘油化合物中，其含 有含氧化部分的殘基或含不飽和部分的殘基(見(jiàn)實(shí)施例4和5)。因此通過(guò)此處所列的含磷 的反應(yīng)中間體引入磷酸鹽部分的方法可與甘油化合物進(jìn)行，其含有通過(guò)醚鍵與其連接的氧 化部分或前氧化部分。在其尋找制備氧化磷脂的改良方法中，本發(fā)明者已進(jìn)一步設(shè)計(jì)和實(shí) 施了另外的制備含有通過(guò)醚鍵與其相連的氧化部分的甘油化合物的方法，其通過(guò)將含氧化 部分的殘基直接引入甘油化合物進(jìn)行。因此，根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種制備化合物的方法，此化合物含有甘油 骨架和至少一個(gè)通過(guò)醚鍵與甘油骨架相連的含氧化部分的殘基，方法通過(guò)以下進(jìn)行提供第一個(gè)化合物，其含有甘油骨架和至少一個(gè)游離羥基基團(tuán)，其如上文所述；提供第五個(gè)化合物，其含有至少一個(gè)氧化的部分，其如上文所述，以及至少一個(gè)第 四個(gè)反應(yīng)基團(tuán)；第一個(gè)化合物和第五個(gè)化合物反應(yīng)，從而以獲得含有第六個(gè)化合物的反應(yīng)混合 物，該化合物含有甘油骨架和至少一個(gè)通過(guò)醚鍵與甘油骨架相連的含氧化部分的殘基；以 及分離化合物，其含有甘油骨架和至少一個(gè)通過(guò)醚鍵與甘油骨架相連的含氧部分的殘基。因此，根據(jù)本發(fā)明的此方面，所述方法包含上文所述的第一個(gè)化合物與所述化合 物反應(yīng)，其含有能與第一個(gè)化合物的游離羥基反應(yīng)的反應(yīng)基團(tuán)，在此處指的是第四個(gè)反應(yīng) 基團(tuán)和氧化的部分。這一化合物在此指的是第五個(gè)化合物。第五個(gè)化合物中的氧化的部分可以是上述的任意氧化部分，S卩，醛、二元醇、羧酸、 酯、縮醛和縮酮。任選地，氧化部分可以是半氧化部分，即，是不與氧化劑反應(yīng)而容易被轉(zhuǎn)化 為希望的氧化部分。這一半氧化部分的實(shí)例是腈，其通過(guò)簡(jiǎn)單的水解可容易地被轉(zhuǎn)化為羧酸。在第五個(gè)化合物中的第四個(gè)反應(yīng)基團(tuán)如在此對(duì)于第一個(gè)反應(yīng)基團(tuán)所述的那樣，且 優(yōu)選商化物，并且更優(yōu)選溴化物。第一個(gè)化合物和第五個(gè)化合物反應(yīng)優(yōu)選在堿存在下進(jìn)行。相對(duì)強(qiáng)的無(wú)機(jī)堿如，例 如，氫化鈉、氫化鋁鋰、氨基鈉、氫氧化鈉及其任意混合物是優(yōu)選的。在這種反應(yīng)條件下，含有4或5個(gè)碳原子的第五個(gè)化合物在反應(yīng)期間可被環(huán)化，因 此不利地影響反應(yīng)效率。因此，優(yōu)選地，第五個(gè)化合物優(yōu)選含少于4個(gè)或多于5個(gè)碳原子。如上文所述的，如果第一個(gè)化合物含有一個(gè)以上與其相連的羥基基團(tuán)，則羥基基 團(tuán)任選且優(yōu)選在第一個(gè)化合物和第五個(gè)化合物反應(yīng)之前，被保護(hù)基團(tuán)保護(hù)。一旦獲得第六個(gè)化合物，可除去保護(hù)基團(tuán)，且使用常規(guī)的純化方法純化該化合物。根據(jù)本發(fā)明的此方面，由于能在一步合成中制備所述的含氧化部分的化合物，所 述的方法很有用。使用該方法，通過(guò)引入含磷的部分，可容易得到如上文詳細(xì)描述的氧化磷脂，在與 第一個(gè)化合物反應(yīng)之前或之后。含磷部分的弓I入優(yōu)選使用上文列出的方法進(jìn)行。
在此處所述的任意方法中，第一個(gè)化合物可包括與其連接的烯基鏈。優(yōu)選地，烯基 鏈與第一個(gè)化合物的sn-Ι位相連。烯基鏈能與甘油化合物相連，通過(guò)，例如，酯鍵或醚鍵。優(yōu)選的烯基鏈通過(guò)醚鍵連 接，以便終產(chǎn)物是二醚化的甘油化合物。因此，在此處所述的各方法中，第一個(gè)化合物是如此處所述的甘油脂，且優(yōu)選 單_醚化甘油脂，其中類脂部分與甘油的sn-Ι位連接。因此，該第一個(gè)化合物含有一個(gè)如 上文所述的游離羥基基團(tuán)，其優(yōu)選在任意反應(yīng)之前被保護(hù)。因此，第一個(gè)化合物可以是例如甘油、甘油脂、單_醚化甘油脂、二 _醚化甘油脂、 磷酸甘油、磷酸甘油酯、單_醚化磷酸甘油酯和溶血卵磷脂。如上文詳細(xì)討論的，含氧化部分的殘基與甘油骨架連接的位置影響所得化合物的 活性，因此如上文進(jìn)一步討論的，其優(yōu)選進(jìn)行選擇性反應(yīng)。優(yōu)選地，在此處所述的任意方法中，含氧化部分的殘基與化合物的sn-2位相連。 因此通過(guò)適宜的選擇和/或保護(hù)第一個(gè)化合物，進(jìn)行含氧化部分的殘基的選擇性連接。因此，在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一個(gè)化合物具有以下通式I 式I其中 A1不存在或選自CH2、CH = CH和C = 0 ；R1選自H和含有1-30個(gè)碳原子的烴鏈；以及R3選自氫、烷基、芳基、磷酸、磷酰膽堿、磷酸乙醇胺、磷酸絲氨酸、磷脂酰膽堿、磷 脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰心肌磷脂、磷脂酰肌醇、磷?；募×字?、磷酰基肌醇、 乙基磷酸膽堿、磷酰基甲醇、磷酰基乙醇、磷?；〈肌⒘柞；〈?、磷酸乙醇胺-N-乳糖、 磷酸乙醇胺-N_[甲氧基(丙二醇)]、磷酸肌醇-4-磷酸鹽、磷酸肌醇-4，5-雙磷酸脂、焦磷 酸鹽、磷酸乙醇胺-二亞乙基三胺-戊醋酸鹽、二硝基苯基_磷酸乙醇胺、磷酸甘油。因此，使用上文所述的任意方法，可獲得具有以下通式II的化合物 式II其中A1 選自 CH2、CH = CH 和 C = 0，且優(yōu)選 CH2 ；A2 是 CH2 ；R1是含1-30個(gè)碳原子的烷基；R2 是 而X是含1-24個(gè)碳原子的烷基鏈；Y選自氫、羥基、烷基、烷氧基、鹵化物、乙酰氧基和芳香族的官能團(tuán)；以及Z 選自 其中R4是烷基或芳基；以及R3選自氫、烷基、芳基、磷酸、磷酰膽堿、磷酸乙醇胺、磷酸絲氨酸、磷脂酰膽堿、磷 脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰心肌磷酯、磷脂酰肌醇、磷酰基心肌磷脂、磷?；〈?、 乙基磷酰膽堿、磷?；状?、磷酰基乙醇、磷?；?、磷酰基丁醇、磷酸乙醇胺-N-乳糖、 磷酸乙醇胺-N_[甲氧基(丙二醇)]、磷酸肌醇-4-磷酸鹽、磷酸肌醇-4，5-雙磷酸脂、焦磷 酸鹽、磷酸乙醇胺-二亞乙基三胺-戊醋酸鹽、二硝基苯基_磷酸乙醇胺、磷酸甘油。根據(jù)以下實(shí)施例的試驗(yàn)，本發(fā)明另外的目的、優(yōu)點(diǎn)和新特征對(duì)于本領(lǐng)域內(nèi)的普通 技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的，實(shí)施例不是用于限制。另外，如上文所描述的和如以下權(quán)利要求中 所要求的，本發(fā)明各個(gè)不同的實(shí)施方案和方面可在以下實(shí)施例中找到實(shí)驗(yàn)支持。實(shí)施例與以上描述一起，參考以下實(shí)施例以非限制性的形式闡述本發(fā)明。
一般合成途徑根據(jù)本發(fā)明教導(dǎo)的內(nèi)容，一些一般合成概念用于制備氧化磷脂，如下(i)通過(guò)不飽和殘基與甘油脂相連并氧化不飽和鍵，制備甘油脂類化合物，其含有 至少一個(gè)通過(guò)醚鍵與其相連的含氧化部分的殘基，同時(shí)使用紀(jì)臘德試劑和/或含三元醇化 合物的結(jié)晶作用分離氧化產(chǎn)物，如實(shí)施例1和方案I-V中所舉例說(shuō)明的；(ii)通過(guò)不飽和殘基與甘油脂相連并通過(guò)環(huán)氧化物中間體氧化不飽和鍵，制備甘 油脂類化合物，其含有至少一個(gè)通過(guò)醚鍵與其相連的含氧化部分的殘基，同時(shí)使用乙酰氧 基保護(hù)基團(tuán)，如實(shí)施例2和方案VI-X中所舉例說(shuō)明的；(iii)通過(guò)直接引入含氧化部分的化合物，制備甘油脂化合物，其含有至少一個(gè)通 過(guò)醚鍵與其相連的含氧化部分的殘基，如實(shí)施例3和方案XI中所舉例說(shuō)明的；以及(iv)使用含磷的活性化合物(例如二氯化磷)以形成反應(yīng)中間體，將含磷的反應(yīng) 部分引入甘油脂化合物，其含有含一個(gè)或兩個(gè)通過(guò)醚鍵與其相連的氧化(或前氧化)部分 的殘基，如實(shí)施例4和5及方案XII-XIV中所舉例說(shuō)明的。實(shí)施例1使用高碘酸鹽和紀(jì)臘德試劑制備消旋-1-十六烷基-2- (5 ‘-戊酸甲酯)_甘油在本實(shí)施例中，將不飽和部分引入甘油骨架中，此后用甲酸、過(guò)氧化氫和高碘酸鹽 氧化。然后，形成的氧化產(chǎn)物用紀(jì)臘德試劑純化。作為典型的實(shí)施例，因此描述了消旋-1-十六烷基-2-(5'-戊酸甲酯)_甘油的 制備。消旋-1-十六烷基-2-(5‘-戊酸甲酯)甘油按照本發(fā)明教導(dǎo)的方法制備，如在以 下方案I-V中所述的。1-十六烷基-3-三苯甲基甘油如美國(guó)專利號(hào)6，838，452中所述制備。簡(jiǎn)單地說(shuō)， D-丙酮甘油(4克)、氫氧化鉀粉末(約10克)和溴代十六烷(9. 3克)在苯(IOOml)中攪 拌并回流5小時(shí)，同時(shí)通過(guò)共沸蒸餾除去形成的水(對(duì)照W. J. Baumann and H. K. Mangold, J. Org. Chem. 29 :3055，1964 和 F. Paltauf ,Monatsh. 99 :1277，1968)。逐漸減少溶劑的體積 至約20ml，且將得到的混合物冷卻至室溫并溶于醚(IOOml)中。得到的溶液用水(2x50ml) 洗滌，并在減壓下除去除去溶劑。將IOOml 90 10 5甲醇水濃鹽酸的混合物加入 上述殘余物中，且混合物回流10分鐘。產(chǎn)物用醚(200ml)洗滌并用水(50ml)、10%氫氧化 鈉(20ml)連續(xù)洗滌，并再用水(20ml體積)洗至中性。減壓下除去溶劑，且產(chǎn)物(8. 8克) 從己烷中被結(jié)晶得7. 4克純1-十六烷基-甘油。1-十六烷氧基-甘油(7. 9克)、三苯基氯甲烷(8. 4克)和干燥的吡啶(40ml)于 100°C加熱12小時(shí)。冷卻后，加入300ml醚和150ml冰冷的水，且將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移至分液 漏斗中。有機(jī)相用50ml冰水、碳酸鉀溶液(至堿性)和50ml水連續(xù)洗滌，然后用無(wú)水 硫酸鈉干燥。蒸發(fā)溶劑，殘余物溶于150ml溫石油醚中，且得到的溶液于4°C冷卻過(guò)夜。過(guò) 濾沉淀物后，蒸發(fā)濾液并將殘余物于-30V從20ml乙酸乙酯中重結(jié)晶，產(chǎn)量8. 2克1-十六 烷基-3-苯甲基甘油，熔點(diǎn)49°C。如在方案I中所述的，1-十六烷基-3-三苯基甘油(14. 78克，0.0265摩爾)、 6-溴-1-己烯(4. 85克)和氫氧化鉀粉末(約10克)在己烷(200ml)中攪拌并回流6小
26時(shí)，同時(shí)通過(guò)共沸蒸餾除去形成的水。反應(yīng)混合物冷卻至室溫，用水(3x100ml)洗滌，并在 減壓下除去溶劑。殘余物溶于氯仿(50ml)中，并通過(guò)硅膠60 (12. 5克)過(guò)濾純化。減壓下 除去氯仿，并將殘余物溶于石油醚(IOOml)中。此溶液維持4°C過(guò)夜，期間生成副產(chǎn)物沉淀。 過(guò)濾并于減壓下除去溶劑得12. 15克(0.0190摩爾)1_十六烷基-2-(5 ‘-己烯基)_3_三 苯甲基甘油(產(chǎn)率72%)。
方案 I 1-十六烷基-2-(5‘-己烯基)-3-三苯甲基甘油(19. 80g)溶于甲酸(IOOml)中。 黃色溶液于室溫下攪拌2小時(shí)，然后于冰浴中冷卻。將過(guò)氧化氫33% (25ml)逐滴加入冰冷 的溶液中，歷時(shí)50分鐘。反應(yīng)混合物的顏色幾乎立即從黃變白。完成加入后，在冰浴中繼續(xù) 攪拌另4小時(shí)。此后，反應(yīng)混合物倒在冰(150克)上，并用醚(3x100ml)提取。橙色的醚 溶液用水(IOOml)洗滌，并在減壓下除去溶劑。將殘余物溶于二氯甲烷(150ml)中，用飽和 碳酸氫鈉水溶液(IOOml)洗滌，并在減壓下除去溶劑。然后，將殘余物溶于熱己烷(250ml) 中。立即得到白色化合物沉淀。溶液維持4°C過(guò)夜。過(guò)濾沉淀(0.53克)，接著減壓下除去 溶劑得20. 03克黃色油狀殘余物。該殘余物溶于異丙醇(200ml)中，并加入氫氧化鈉水溶 液(17克在50ml水中)。所得溶液至90°C加熱2小時(shí)，然后冷卻并傾到于冰上(150克)。 然后用二氯甲烷(3x100ml)提取，用水(IOOml)和磷酸二氫鈉飽和水溶液洗滌有機(jī)相，并用 無(wú)水Na2SO4干燥。減壓下除去溶劑后，得到10. 77克粗品產(chǎn)物。然后，將粗品產(chǎn)物溶于80% 甲醇(IOOml)中，并將溶液維持于4°C過(guò)夜。過(guò)濾沉淀物并于減壓下除去多數(shù)溶劑。用二氯 甲烷(3x100ml)提取，用無(wú)水Na2SO4干燥，并在減壓下除去溶劑。從己烷(250ml)重結(jié)晶得 7. 44克純1-十六烷基-2-(5‘，6' 二羥基-己烷基)_甘油。方案II 如方案III中所述，1-十六烷基-2_(5'，6' _ 二羥基_己烷基)_甘油(7.84克) 溶于異丙醇(50ml)和水(12ml)中。加入NaI04(9克)，且反應(yīng)混合物于室溫下攪拌3小時(shí)。 加入水(50ml)，并用氯仿(3x50ml)提取反應(yīng)化合物，用無(wú)水Na2S04干燥，過(guò)濾并減壓下除去 溶劑得5. 56克。粗品產(chǎn)物溶于乙醇(60ml)和冰醋酸(2. 3克)中。加入紀(jì)臘德試劑T(5. 6 克)，且反應(yīng)混合物回流2小時(shí)。反應(yīng)混合物在冰浴中冷卻，加入堿性溶液(2. 3克在45ml水 中)，并用醚(3x25ml)提取混合物。醚相用水和與堿相合并的水洗滌。水相用濃HC1 (4. 4ml) 酸化并用醚(3x25ml)提取。用水、碳酸氫鈉飽和水溶液(3x25ml)、水(2x25ml)洗滌，用無(wú) 水Na2S04干燥并在減壓下除去溶劑得1. 95克(0. 0049mol) 1-十六烷基_2_(5'-氧-戊 烷基)_甘油(產(chǎn)率26.9%)。方案III 如方案IV中所述，1-十六烷基-2-(5 ‘ _氧戊基)_甘油(4. 80克)溶于干燥三乙胺(57ml)中。加入醋酸酐(20ml)，且反應(yīng)化合物于室溫下攪拌2. 5小時(shí)。反應(yīng)混合物傾到 于冰(100克)上，并用二氯甲烷(3x100ml)提取。有機(jī)相用水(100ml)、稀鹽酸(100ml)、 水(100ml)、碳酸氫鈉飽和水溶液(100ml)和再用水(100ml)連續(xù)洗滌，然后用無(wú)水硫酸鈉 干燥。減壓下除去溶劑得4.54克1-十六烷基-2-(5‘ _氧戊基)_3_醋酸甘油酯(產(chǎn)率 86% )。1-十六烷基-2- (5 ‘-氧戊基)-3-醋酸甘油酯(3. 94克)溶于叔丁醇(75ml)中。 將亞氯酸鈉(6. 85克)和磷酸二氫鈉二水合物(15. 50克)溶于水(75ml)中。將水溶液 加入醇溶液中，反應(yīng)混合物于室溫4小時(shí)。然后，反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，并用二氯 甲烷(3x100ml)萃取。合并的有機(jī)相用水(2x100ml)洗滌，且減壓下除去溶劑。殘余物溶 于甲醇(80ml)和10% NaOH水溶液(20ml)混合物中，并于室溫下攪拌過(guò)夜。甲醇溶液用 甲苯和己烷(1 1)的混合物(2x50ml)提取，在冰浴中冷卻，并且緩慢加入濃HC1以達(dá)到 PH 5-6。然后用二氯甲烷(2x100ml)提取溶液。合并的有機(jī)相用水(100ml)洗滌，用無(wú)水 Na2S04干燥，并在減壓下除去溶劑，得到2. 07克粗品產(chǎn)物。從己烷(20ml)中重結(jié)晶得1. 30 克純1-十六烷基-2-(5‘ _羧基)丁基-甘油(產(chǎn)率35%)。方案IV 如方案V中所述，將甲醇(100ml)和10% NaOH水溶液(20ml)加入殘余物中，且所 得溶液于室溫下攪拌2小時(shí)。溶液用石油醚/甲苯(1 l，v/v)的混合物提取，并用濃HC1 酸化甲醇相至pH = 0，然后用氯仿(3x50ml)提取。合并的氯仿相用水(2x0ml)洗滌，用無(wú)水 妝2504干燥，并在減壓下除去溶劑得0.77克(0.00179mol)消旋十六烷基_2_ (5 ‘-戊 酸甲酯)_甘油(產(chǎn)率96.7% )。方案V 實(shí)施例2使用高碘酸鹽和醋酸鹽保護(hù)基團(tuán)制備消旋-1-十六烷基-2- (5 ‘-戊酸甲酯)_甘油在本實(shí)施例中，將不飽和部分引入甘油骨架中，此后，使用醋酸酐、4-氯過(guò)氧苯甲 酸、HC104、高碘酸鹽和甲醇通過(guò)環(huán)氧化物被氧化為醚。進(jìn)行中間體的有效分離通過(guò)使用醋 酸鹽保護(hù)基團(tuán)時(shí)進(jìn)行反應(yīng)。作為典型的實(shí)施例，因此描述了消旋-1-十六烷基-2-(5’_戊酸甲酯)_甘油的制備。消旋-1-十六烷基_2-(5'-戊酸甲酯)_甘油按照本發(fā)明教導(dǎo)的方法制備，如在 以下方案VI-X中所述。如在以下方案VI中所述，按照以上實(shí)施例1中所述制備的1-十六烷 基-2- (5 ‘-己烯基)-3-三苯甲基甘油(4. 90克)溶于甲烷(30ml)和濃鹽酸(3ml)的混 合物中，且所得的溶液加熱回流4小時(shí)。反應(yīng)混合物冷卻至室溫，傾到于冰上(100克)并 用氯仿(3x100ml)提取。有機(jī)相用水(100ml)、碳酸氫鈉水溶液(100ml)并再用水(100ml) 洗滌。此后，有機(jī)相用無(wú)水Na2S04干燥，過(guò)濾并除去溶劑得3. 75克殘余物。殘余物溶于正 己烷中，并維持4°C過(guò)夜。過(guò)濾沉淀物并除去溶劑得3. 17克，其溶于氯仿(200ml)中并加 至硅膠(45grams)中。將溶液過(guò)濾并再用混合物氯仿甲醇(200ml，9 1)和氯仿甲 醇(200ml，l 1)提取硅膠。將兩次最后的提取物合并，并在減壓下除去溶劑得2. 56克 1-十六烷基-2_(5'-乙烯基)_甘油(產(chǎn)率84%)。方案VI
30 如以下方案VII中所述，將干燥吡啶(5ml)和醋酸酐(3ml)加入所得的1_十六烷 基-2-(5'-己烯基)_甘油中，且反應(yīng)混合物于70°C加熱2小時(shí)。反應(yīng)混合物傾到于冰(25 克)上，并用己烷(3x25ml)提取。提取物用水(25ml)、稀硫酸水溶液(25ml)、水(25ml)、 碳酸氫鈉水溶液(25ml)和水連續(xù)洗滌。用無(wú)水Na2S04干燥后，過(guò)濾并除去溶劑得2. 60克。 殘余物溶于二氯甲烷(50ml)中并加入3-氯過(guò)氧苯甲酸(3. 84克)，且反應(yīng)混合物于室溫下 攪拌過(guò)夜。減壓下將溶劑減少至約20ml，并加入正己烷(100ml)。過(guò)濾后將溶劑蒸干。殘 余物溶于正己烷(100ml)中，加入堿性溶液(0.4克NaOH在50ml水中)并分離各相。用水 (25ml)、碳酸氫鈉水溶液(25ml)、水(25ml)連續(xù)洗滌有機(jī)相，用無(wú)水Na2S04干燥，過(guò)濾并除 去溶劑得2.40克1-十六烷基-2-(5 ‘，6'-環(huán)氧己烷基)_3_乙酸甘油酯(產(chǎn)率82%)。方案VII 如以下方案VIII中所述，1-十六烷基-2_(5'，6'-環(huán)氧己烷基)_3_乙酸甘油 酯溶于丙酮(50ml)中。加入7% HC104(5ml)，且反應(yīng)混合物于室溫下攪拌40小時(shí)。加入 水(50ml)，且反應(yīng)混合物用氯仿(3x50ml)提取。用水(25ml)、碳酸氫鈉水溶液(25ml)、水 (25ml)連續(xù)洗滌有機(jī)相，用無(wú)水Na2S04干燥，過(guò)濾并除去溶劑得2. 29克油狀殘余物。殘余 物溶于氯仿(200ml)中并加入硅膠(30克)。過(guò)濾此溶液，且硅膠再用混合物氯仿甲醇 (200ml,8 2)提取。在第二次提取物中，減壓下除去除去溶劑后得到1.45克1-十六烷 基-2-(5' ,6' - 二羥基己烷基)-3-乙酸甘油酯。方案VIII 如以下方案IX中所述，1-十六烷基_2-(5'，6' - 二羥基己烷基)_3_乙酸甘油 酯溶于異丙醇(50ml)中。加入高碘酸鈉水溶液(1. 45克在50ml水中)，且反應(yīng)混合物于室溫下攪拌2小時(shí)。反應(yīng)混合物用氯仿(3x50ml)提取，用無(wú)水妝2304干燥，過(guò)濾并減壓下除 去溶劑得0.96克。殘余物溶于叔丁醇(50ml)中，并加入亞氯酸鈉(1.66克)和磷酸二氫 鈉(3. 76克)的水溶液(50ml)。反應(yīng)混合物于室溫下攪拌4小時(shí)，用氯仿(2x50ml)提取， 并在減壓下除去溶劑。殘余物溶于混合物氯仿己烷(200ml，1 1)中，并加至硅膠(15 克)中。過(guò)濾溶液，并再用氯仿(200ml)和氯仿甲醇(200ml，9 1)提取硅膠。減壓下 除去最后一次提取物中的溶劑，得0. 92克1-十六烷基-2-(5-羧丁基)-3-乙酸甘油酯。
方案 IX 如以下方案X中所述，1-十六烷基-2- (5 ‘-羧丁基)-3-乙酸甘油酯溶于50ml 8 2甲醇和10% NaOH水溶液的混合物中，且反應(yīng)混合物于室溫下劇烈攪拌過(guò)夜。反應(yīng)混 合物用混合物甲苯石油醚(2x25ml，1 1)提取。甲醇相用濃HC1酸化直至達(dá)到pH約為 0，然后用氯仿(2x25ml)提取。減壓下除去溶劑，并將殘余物溶于甲醇(10ml)中。加入濃 HC1 (2滴)，并將溶液于室溫下攪拌過(guò)夜，接著用氯仿(2x25ml)提取，用水(25ml)連續(xù)洗滌 有機(jī)相，接著用碳酸氫鈉水溶液(25ml)、水(25ml)洗滌，接著用無(wú)水Na2S04干燥，過(guò)濾并除 去溶劑，得0. 86克純的消旋-1-十六烷基-2- (5'-戊酸甲酯)_甘油。方案X 實(shí)施例3直接引入氧化部分制備消旋-1-十六烷基-2- (5'-戊酸乙酯)_甘油消旋-1-十六烷基_2-(5'-戊酸乙酯)_甘油按照本發(fā)明教導(dǎo)的方法制備，如以 下方案XI中所述。方案XI
1-十六烷基-3_苯甲基甘油如，例如以上實(shí)施例1中所述或如在美國(guó)專利號(hào)6，838，425中所述制備。將1.0克(l.Ommol)l-十六烷基-3-三苯甲基甘油、0. 78克(3. 6mmol) 5_溴代戊 酸乙酯和75ml 二甲基甲酰胺(DMF)加入配有磁力攪拌器的三頸燒瓶中。將溶于25ml 二甲 基甲酰胺的0. 20克(5mm0l)NaH(60%分散于礦物油中)逐滴加入攪拌的溶液中，歷時(shí)15分 鐘，繼續(xù)攪拌另1小時(shí)直至反應(yīng)完全。加入水(50ml)，且混合物用醚(3x50ml)提取。有機(jī) 相用無(wú)水Na2S04干燥，并在減壓下除去溶劑。粗品產(chǎn)物用硅膠柱層析法純化。如上文所述的三苯甲基基團(tuán)脫保護(hù)得終產(chǎn)物。實(shí)施例4將含磷部分引入甘油脂類化合物根據(jù)本發(fā)明教導(dǎo)的方法，含磷反應(yīng)部分被引入甘油脂類化合物，其含有-個(gè)或兩 個(gè)通過(guò)醚鍵與其連接的含氧化(或前氧化)部分的殘基。引入含磷反應(yīng)部分使用含磷化合 物如，例如，氧氯化磷進(jìn)行。任選地，引入含磷反應(yīng)部分之后，將含磷反應(yīng)部分轉(zhuǎn)化為磷酸鹽 部分。消旋-1-十六烷基-2- (5 ‘-己烯基)-3- 二氯磷酸鹽的制備作為典型的實(shí)施例，消旋-1-十六烷基_2-(5'-己烯基)-3-二氯鹽酸鹽按照本 發(fā)明所教導(dǎo)的方法制備，如以下方案XII所述的。方案XII 因此，將0. 24ml (0. 39克，2. 53mmol)P0Cl3和10ml四氫呋喃(THF)置于配有磁力 攪拌器的冰冷的三頸燒瓶中。向攪拌溶液中逐滴加入0. 87克(2. 2mmol)消旋-1-十六烷 基-2-(5'-己烯基)_甘油、0.34ml (0.25克，2. 44mmol)三乙胺和50ml四氫呋喃(THF)的 混合物，歷時(shí)25分鐘，并在冰浴中繼續(xù)攪拌另10分鐘，且進(jìn)一步于23°C繼續(xù)攪拌45分鐘。水解消旋-1-十六烷基_2-(5'-己烯基)_3_ 二氯鹽酸鹽，從而以生成對(duì)應(yīng)的磷 脂酸，如下
將1克冰加入反應(yīng)混合物中并繼續(xù)攪拌30分鐘。然后，加入水(50ml)，且產(chǎn)物用 氯仿Me0H(2 1，v/v，3x25ml)提取。有機(jī)相用水洗滌，并在減壓下除去溶劑。或者，消旋-1-十六烷基-2-(5 ‘-己烯基)-3-二氯磷酸鹽可與各種烷基胺衍生 物反應(yīng)，從而以產(chǎn)生磷酸甘油酯，如下所舉例說(shuō)明的。由消旋-1-十六烷基_2-(5 ‘-己烯基)_3_ 二氯磷酸鹽制備消旋-1-十六烷 基-2-(5'-己烯基)-3-磷酸乙醇胺根據(jù)本發(fā)明所教導(dǎo)的方法制備消旋-1-十六烷基_2_(5’ -己烯基)_3_磷酸乙醇 胺，如在方案XIII中所述的。方案XIII 如上文實(shí)施例2中剛描述的那樣，消旋-1-十六烷基-2- (5，-己烯基)-3- 二氯磷 酸鹽在THF中的溶液在冰浴中冷卻。向該溶液中逐滴加入0. 16ml (0. 16克，2. 7mmol)乙醇 胺、0. 34ml (0. 25克，2. 4mmol)三乙胺和50ml THF的混合物，歷時(shí)10分鐘。加入所有溶液 后，所得溶液攪拌另20分鐘，然后從冰浴中取出，并于室溫下攪拌過(guò)夜。使用濾紙(Whatman#2)過(guò)濾溶液。將剩余在濾紙上的殘余物加壓干燥得1. 2克類 白色殘余物。將1. 2克類白色殘余物溶于24ml冰醋酸和10ml水的混合物中，于70°C維持1小 時(shí)，并冷卻至室溫。通過(guò)用50ml 2 1氯仿甲醇提取溶液洗滌兩次，將產(chǎn)物從乙酸溶液 中提取出來(lái)。蒸發(fā)提取溶液的溶劑，留下0.94克(1.7mm0l)消旋十六烷基_2_(5’_己 烯基)-3-磷酸乙醇胺，相對(duì)于消旋-1-十六烷基-2- (5 ‘-己烯基)-甘油產(chǎn)率為85 %。由消旋-1-十六烷基_2_(5’ -己烯基)_3_磷酸乙醇胺制備消旋-1-十六烷 基-2- (5 ’ -己烯基)-3-磷酸膽堿消旋-1-十六烷基-2-(5’_己烯基)_3_磷酸膽堿按照本發(fā)明所教導(dǎo)的方法制備， 如以下方案XIV中所述的。 向配有磁力攪拌器的三頸燒瓶中加入0.50克(0.99mmol)消旋十六烷 基-2-(5，-己烯基)_3_磷酸乙醇胺、50ml異丙醇和18ml CH2C12。攪拌時(shí)，加入5克K2C03 和10ml水的混合物，并且當(dāng)逐滴加入1. 0ml (1. 3克，llmmol)硫酸二甲酯和10ml異丙醇，歷 時(shí)45分鐘時(shí)，溶液的溫度維持約35°C 約40°C。加入所有溶液后，將溶液攪拌另90分鐘。 溶液冷卻至室溫。通過(guò)用50ml 2 1氯仿甲醇溶液洗滌三次，從溶液中提取所得產(chǎn)物。 蒸發(fā)溶劑的溶液，留下0. 50克(0. 82mmol)消旋十六烷基_2_ (5’-己烯基)-3-磷酸膽 堿，相對(duì)于消旋-1-十六烷基_2-(5'-己烯基)_3_磷酸乙醇胺產(chǎn)率為92%。使用洗脫溶劑氯仿甲醇水(70 26 4)，用礬土薄層色譜法進(jìn)行純化。消 旋-1-十六烷基-2-(5‘-己烯基)-3-磷酸膽堿的鑒別使用13C-NMR進(jìn)行。實(shí)施例51-十六烷基-2- (5 ‘ _羧甲基)丁基-3-磷酸膽堿的制備將1-十六烷基-2-(5 ‘-羧甲基)丁基-甘油(0.86克)、0. 34克(2. 6mmol)三 乙胺和50ml四氫呋喃的溶液逐滴加入0. 24ml (0. 39克，2. 6mmol)P0Cl3和10ml四氫呋喃 (THF)的冰冷的溶液中，歷時(shí)25分鐘。所得的混合物于冰浴中攪拌另10分鐘，且于室溫 下(23°C)攪拌45分鐘。然后將反應(yīng)混合物于冰浴中冷卻，并且于劇烈攪拌下將乙醇胺 (0. 16ml)和三乙胺(0.64ml)在THF(50ml)中的溶液逐滴加入其中。在冰浴中繼續(xù)攪拌另 10分鐘，且進(jìn)-步于室溫下繼續(xù)攪拌過(guò)夜。然后，過(guò)濾反應(yīng)混合物，并于減壓下除去溶劑。 殘余物溶于乙酸(24ml)和水(10ml)的混合物中，并將溶液至70°C加熱1小時(shí)。冷卻至室
37溫后，混合物用氯仿(2x25ml)提取，并于減壓下除去溶劑。殘余物溶于異丙醇(50ml)和二 氯甲烷(18ml)的混合物中。將在水(10ml)中的碳酸鉀(5.0克)加入其中，并將反應(yīng)混合 物加熱至35-40°C。然后，逐滴加入硫酸二甲酯(1ml)在10ml異丙醇中的溶液，歷時(shí)45分 鐘。另90分鐘后，混合物用氯仿(3x50ml)提取，并于減壓下除去溶劑，得1. 10克1-十六 烷基-2-(5'-羧甲基)丁基-3-磷酸膽堿(產(chǎn)率92%)。1-十六烷基_2-(5' _羧基)丁基-3-磷酸膽堿的制備1_十六烷基-2-(5‘-羧 甲基)丁基-3-磷酸膽堿溶于甲醇(25ml)中。將溶于90%甲醇(20ml)中的氫氧化鈉(1.0 克)加入甲醇溶液中，并將反應(yīng)混合物于室溫下攪拌5小時(shí)。通過(guò)加入磷酸二氫鈉將反應(yīng)物 的pH調(diào)至4。加入水(50ml)和氯仿(50ml)，收集有機(jī)相并于減壓下除去溶劑。殘余物溶 于氯仿中，用無(wú)水Na2S04干燥，過(guò)濾，并于減壓下除去溶劑。得到1-十六烷基-2-(5‘-羧 基)丁基-3-磷酸膽堿(0. 71克)(產(chǎn)率66% )。應(yīng)理解，本發(fā)明的某些特征，其清楚地描述于上下文的各獨(dú)立的實(shí)施方案中，還可 以提供于單個(gè)實(shí)施方案中的組合中。相反地，本發(fā)明的各種特征，其簡(jiǎn)要地描述于上下文的 單個(gè)實(shí)施方案中，還可以分開(kāi)提供或在任意適宜的次組合中提供。雖然本發(fā)明已在其特殊的實(shí)施方案結(jié)合中被描述，但是很明顯，許多變更、修飾和 變化對(duì)于本領(lǐng)城內(nèi)的技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。相應(yīng)地，打算包含所有這些變更、修飾和變 化，其落在附加的權(quán)利要求的精神和寬的范圍之內(nèi)。本說(shuō)明書(shū)中提及的所有出版物、專利和 專利申請(qǐng)書(shū)在此整體引入本說(shuō)明中作為參考，在相同的程度上似乎各出版物、專利或?qū)＠?申請(qǐng)書(shū)特別地和各個(gè)地在此引入作為參考。另外，本申請(qǐng)中任意參考文獻(xiàn)的引用和確證不 應(yīng)解釋為認(rèn)為這類參考文獻(xiàn)可用作本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。
權(quán)利要求
一種制備化合物的方法，其含有甘油骨架和至少一個(gè)通過(guò)醚鍵與甘油骨架相連的含氧化部分的殘基，所述方法包含提供第一個(gè)化合物，其含有甘油骨架和至少一個(gè)游離羥基基團(tuán)；提供第五個(gè)化合物，其含有至少一個(gè)氧化部分和至少一個(gè)第四個(gè)反應(yīng)基團(tuán)；所述第一個(gè)化合物和所述第五個(gè)化合物反應(yīng)從而以獲得含有第六個(gè)化合物的反應(yīng)化合物，所述第六個(gè)化合物是含有甘油骨架和至少一個(gè)通過(guò)醚鍵與甘油骨架相連的含氧化部分的殘基的化合物；以及分離所述化合物，其含有甘油骨架和至少一個(gè)通過(guò)醚鍵與甘油骨架相連的含氧化部分的殘基。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一個(gè)化合物和所述第五個(gè)化合物反應(yīng)在堿存在下進(jìn)行。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述第四個(gè)反應(yīng)基團(tuán)是鹵化物。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述氧化部分選自羧酸、酯、酰鹵、醛、縮醛、縮酮和二元醇。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一個(gè)化合物含有至少兩個(gè)游離羥基基團(tuán)，所述方法 進(jìn)一步包含，所述第一個(gè)化合物和所述第五個(gè)化合物反應(yīng)之前用保護(hù)基團(tuán)保護(hù)所述至少兩個(gè)基團(tuán)中的至少一個(gè)。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述含有甘油骨架和至少一個(gè)與甘油骨架相連的含氧化部 分的殘基的化合物，進(jìn)一步包含與甘油骨架相連的含磷的部分，所述方法進(jìn)一步包括，所述 第一個(gè)化合物和所述第五個(gè)化合物反應(yīng)之前或之后，或分離所述第六個(gè)化合物后將所述第一個(gè)化合物或第六個(gè)化合物與所述含磷部分反應(yīng)，從而以獲得所述化合物， 其含有甘油骨架和至少一個(gè)與甘油骨架相連的含氧化部分的殘基，且進(jìn)一步含有與甘油骨 架相連的含磷部分。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述至少一個(gè)含磷的部分是通過(guò)磷酸二酯鍵與所述甘油骨 架相連的磷酸鹽部分。
8.權(quán)利要求6的方法，其中所述含磷的部分連接于所述化合物的所述甘油骨架的sn-3位。
9.權(quán)利要求6的方法，其中所述第一個(gè)化合物或所述第六個(gè)化合物與所述含磷的部分 反應(yīng)，包括提供含有游離羥基的所述第一個(gè)化合物或所述第六個(gè)化合物； 所述第一個(gè)化合物或所述第六個(gè)化合物與含有能與所述游離羥基基團(tuán)反應(yīng)的第二個(gè) 反應(yīng)基團(tuán)和第三個(gè)反應(yīng)基團(tuán)的含磷活性化合物反應(yīng)，從而以提供所述第一個(gè)化合物或第六 個(gè)化合物，其含有與其相連的含磷反應(yīng)基團(tuán)； 轉(zhuǎn)化所述含磷反應(yīng)基團(tuán)為所述含磷的部分。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述含磷的活性化合物是氧氯化磷(POCl3)。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述含磷的部分是磷酸，且所述轉(zhuǎn)化包含水解所述含磷的反應(yīng)基團(tuán)。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述含磷的部分包含氨基烷基基團(tuán)，且所述轉(zhuǎn)化包含所 述含磷的反應(yīng)基團(tuán)與所述氨基烷基基團(tuán)衍生物反應(yīng)，所述衍生物是經(jīng)選擇的能與所述第三 個(gè)反應(yīng)基團(tuán)反應(yīng)。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述含氧化部分的殘基連接于所述化合物的sn-2位，且進(jìn) 一步地其中所述甘油骨架的所述至少一個(gè)游離羥基基團(tuán)的至少一個(gè)在所述第一個(gè)化合物 的sn-2位。
14.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一個(gè)化合物具有通式I 式I 其中A1不存在或選自CH2、CH = CH和C = O ； R1選自H和含1-30個(gè)碳原子的烴鏈；并且R3選自氫、烷基、芳基、磷酸、磷酰膽堿、磷酸乙醇胺、磷酸絲氨酸、磷脂酰膽堿、磷脂酰 乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰心肌磷酯、磷脂酰肌醇、磷酰基心肌磷脂、磷酰基肌醇、乙基 磷酰膽堿、磷?；状?、磷酰基乙醇、磷酰基丙醇、磷?；〈?、磷酸乙醇胺-N-乳糖、磷酸 乙醇胺-N_[甲氧基(丙二醇)]、磷酸肌醇-4-磷酸鹽、磷酸肌醇-4，5-雙磷酸脂、焦磷酸 鹽、磷酸乙醇胺-二亞乙基三胺-戊醋酸鹽、二硝基苯基_磷酸乙醇胺、磷酸甘油。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述化合物，其含有甘油骨架和至少一個(gè)通過(guò)醚鍵與所 述甘油骨架相連的氧化部分，具有通式II 式II 其中A1 選自 CH2, CH = CH 禾Π C = O ；A2 是 CH2 ；R1是含1-30個(gè)碳原子的烷基； R2是 而X是含1-24個(gè)碳原子的烷基鏈；Y選自氫、羥基、烷基、烷氧基、鹵化物、乙酰氧基和芳香族官能團(tuán)；和 Z選自 其中R4是烷基或芳基；以及R3選自氫、烷基、芳基、磷酸、磷酰膽堿、磷酸乙醇胺、磷酸絲氨酸、磷脂酰膽堿、磷脂酰 乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰心肌磷酯、磷脂酰肌醇、磷酰基心肌磷脂、磷?；〈?、乙基 磷酰膽堿、磷?；状肌⒘柞；掖肌⒘柞；肌⒘柞；〈?、磷酸乙醇胺-N-乳糖、磷酸 乙醇胺-N-[甲氧基(丙二醇)]、磷酸肌醇-4-磷酸鹽、磷酸肌醇-4，5-雙磷酸脂、焦磷酸 鹽、磷酸乙醇胺-二亞乙基三胺-戊醋酸鹽、二硝基苯基-磷酸乙醇胺、磷酸甘油。
16.一種將磷酸鹽部分引入化合物的方法，化合物含有甘油骨架且含有通過(guò)醚鍵與其 相連的含氧化部分或含前氧化部分的殘基，所述方法包含提供化合物，其含有甘油骨架和通過(guò)醚鍵與所述甘油骨架相連的含氧化部分或含前氧 化部分的殘基以及至少一個(gè)游離羥基基團(tuán)；所述化合物與含有第二個(gè)反應(yīng)基團(tuán)和第三個(gè)反應(yīng)基團(tuán)的含磷化合物反應(yīng)，所述第二個(gè) 反應(yīng)基團(tuán)能與所述游離羥基基團(tuán)反應(yīng)，從而以提供化合物，其含有含氧化部分或前氧化部 分的殘基及含磷的反應(yīng)基團(tuán)；以及轉(zhuǎn)化所述含磷的反應(yīng)基團(tuán)為所述磷酸鹽部分，從而將磷酸鹽部分引入所述化合物。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述氧化部分選自羧酸、酯、酰鹵、醛、縮醛、二元醇和縮酮。
18.權(quán)利要求16的方法，其中所述前氧化部分是不飽和部分。
19.權(quán)利要求16的方法，所述含磷的化合物是P0C13。
20.權(quán)利要求16的方法，其中所述磷酸鹽部分是磷酸，且所述轉(zhuǎn)化包含水解所述含磷 的反應(yīng)基團(tuán)。
21.權(quán)利要求16的方法，其中所述磷酸鹽部分包含烷基氨基基團(tuán)，且所述轉(zhuǎn)化包含所 述含磷的反應(yīng)部分與氨基烷基衍生物反應(yīng)，所述衍生物能與所述含磷的反應(yīng)基團(tuán)反應(yīng)。
全文摘要
公開(kāi)了新型合成路線，其很適用于在治療上有益的氧化磷脂的工業(yè)制備。尤其是，公開(kāi)了有效制備含甘油骨架和連接于甘油骨架的一個(gè)或多個(gè)氧化部分的化合物的新方法，其沒(méi)有柱層析法。因此，進(jìn)一步公開(kāi)了將含磷部分如磷酸鹽部分引入含甘油骨架的化合物和形成的中間體的新方法。
文檔編號(hào)C07C67/08GK101891760SQ20101012818
公開(kāi)日2010年11月24日 申請(qǐng)日期2005年7月10日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月9日
發(fā)明者E·科瓦勒維斯基-伊沙伊, G·哈爾佩林 申請(qǐng)人:脈管生物生長(zhǎng)有限公司