專利名稱：用分子印跡聚合物分離鹽酸克倫特羅的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種化學(xué)工程技術(shù)領(lǐng)域的方法，具體是一種用分子印跡聚合物分離鹽 酸克倫特羅的方法。
背景技術(shù)：
鹽酸克倫特羅(簡稱CLB)是一種人工合成的13 2-腎上腺受體激動劑，又稱"瘦肉 精"、"克喘素"等，臨床一般用其鹽酸鹽。因其對|32-受體選擇性高，作用強(qiáng)，副作用較小， 早期用于防治人、畜支氣管哮喘和痙攣，是理想的平喘藥，臨床應(yīng)用最為廣泛。由于鹽酸克 倫特羅能實(shí)現(xiàn)動物營養(yǎng)再分配，改善胴體品質(zhì)，導(dǎo)致瘦肉率增加。1984年，國外首次將鹽酸 克倫特羅作為飼料添加劑應(yīng)用在羊、肉雞和豬的生產(chǎn)中，并取得了較好的效果，從此鹽酸克 倫特羅作為一種飼料添加劑被大量應(yīng)用。但長期食用含有"瘦肉精"的豬肉和內(nèi)臟會引起 人體心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的疾病。人誤食鹽酸克倫特羅，一般在食用后15min-6h出現(xiàn)癥 狀，癥狀可持續(xù)90min-6天。近年來，國際上紛紛開展動物性食品中鹽酸克倫特羅殘留檢測 的研究，以建立起一個完整的動物性食品檢測系統(tǒng)，保障人民的健康安全。我國于2003年 制定了國標(biāo)《動物性食品中克倫特羅殘留量的測定》(GB/T50091192-2003)，提出了動物性 食品中鹽酸克倫特羅殘留監(jiān)控方法，即酶聯(lián)免疫法(ELISA)篩選、高效液相色譜法(HPLC) 定量到氣質(zhì)聯(lián)機(jī)法(GC-MS)確證和定量。 目前國際上對動物組織中鹽酸克倫特羅殘留的監(jiān)測方法主要分為色譜技術(shù)、免疫 分析技術(shù)和生物傳感技術(shù)及其它三大類。這些方法各有自身的優(yōu)缺點(diǎn)，但是當(dāng)用于從動物 性食品中檢測痕量存在的鹽酸克倫特羅時，為減少復(fù)雜基質(zhì)的干擾，一般都需要樣品前處 理。目前常用的前處理的方法有固相萃取、液液萃取、免疫柱層析技術(shù)等，與液液萃取相比， 固相萃取技術(shù)操作簡單，處理速度快，節(jié)約試劑，并可同時處理多個樣品。但是，目前常用的 固相萃取的填料與吸附目標(biāo)物的作用缺乏選擇性，易受復(fù)雜基質(zhì)中類似物的干擾。而免疫 柱層析雖然有特異性，但所用抗體價(jià)格昂貴，且穩(wěn)定性不足，不能用于強(qiáng)酸、強(qiáng)堿和高溫等 極端環(huán)境。因此，研制新型的固相萃取填料，能夠特異地識別樣品中的鹽酸克倫特羅，從而 高效地選擇性富集、純化檢測物，有很好的現(xiàn)實(shí)需要。 分子印跡技術(shù)是基于分子識別的新型聚合物的制備技術(shù)，在印跡中形成的特異性 識別位點(diǎn)能和被分析物選擇性作用，并且這種作用是可逆的。這種化學(xué)合成的材料機(jī)械強(qiáng) 度和化學(xué)穩(wěn)定性好，能在極端環(huán)境中使用。近年來，分子印跡技術(shù)應(yīng)用于固相萃取，將分子 印跡聚合物作為固相萃取填料，產(chǎn)生了一個具有廣闊應(yīng)用前途的領(lǐng)域，主要用于生物樣品 中物質(zhì)的提取，特別是生物流體中樣品的分析。目前，分子印跡技術(shù)在固相萃取技術(shù)方面的 應(yīng)用，尤其是在痕量物質(zhì)的檢測方面，模板殘留問題已經(jīng)嚴(yán)重阻礙了分子印跡聚合物在此
3領(lǐng)域的應(yīng)用，采用模板類似物或進(jìn)一步優(yōu)化聚合物的后處理過程及高效去除模板分子的方 法，是研究的重點(diǎn)。 經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，Arndt Ellwanger等在《Analyst》(分析學(xué)家) (2001， 126， 784-792)上發(fā)表的"Evaluation of methods aimed at complete removal of template frommolecularly imprinted polymers，，(對分子印跡聚合物去除模板殘留方法 的評估)中提出各種不同的分子印跡聚合物的模板去除前處理方法。經(jīng)過微波萃取處理后 得到最低的模板殘留是3ng/mL。這樣得到的分子印跡聚合物直接與酶聯(lián)免疫吸附劑測定聯(lián) 用后檢測靈敏度不高。 檢索中還發(fā)現(xiàn)，Anders Blomgren等在《Jo證al of Chromatography A》(色譜 A) (2002， 975， 157-164)上發(fā)表的"Extraction of clenbuterol from calf urine using a molecularlyimprinted polymer followed by qimntitation by high—performance liquid chromatogr即hywith UV detection"(分子印跡聚合物和HPLC-UV聯(lián)用)中提出 以鹽酸克倫特羅的類似物溴布特羅作為模板用本體聚合的方法合成分子印跡聚合物。該法 也存在模板殘留問題，同時在酶聯(lián)免疫吸附劑測定中會造成交叉感染問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提出了一種用分子印跡聚合物分離鹽
酸克倫特羅的方法，通過對洗脫溶劑和洗脫方式的優(yōu)化，減少本體聚合合成得到的分子印
跡聚合物，基本解決了模板分子的滲漏問題，填充在固相萃取小柱中，用于分離、純化動物
組織中殘留的鹽酸克倫特羅，除去食品基質(zhì)中的雜質(zhì)。 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的 本發(fā)明所涉及的分子印跡聚合物的制備方法，包括以下步驟 步驟一，將模板分子克倫特羅、功能單體甲基丙烯酸(MAA)、交聯(lián)劑乙二醇二甲基 丙烯酸酯(EGDMA)按照1 : 2-6 : 15的摩爾比均勻混合，溶解到致孔劑中，置入安培瓶中， 再加入引發(fā)劑偶氮二異丁腈(AIBN)，超聲處理后，充入氮?dú)猓婵辗饪?，熱引發(fā)聚合，形成塊 狀聚合物； 步驟二，將合成的塊狀聚合物磨碎，通過樣品篩過濾，并通過索氏抽提除去大部分 模板分子，將得到的分子印跡聚合物在80°C _150°C的溫度下放置4h-12h，用甲醇勻漿后填 充到固相萃取小柱內(nèi)，然后對固相萃取小柱進(jìn)一步洗脫模板分子； 步驟三，將除去模板分子的分子印跡聚合物進(jìn)行干燥處理，得到克倫特羅分子印 跡聚合物。 所述致孔劑，為氯仿和乙腈的混合液，二者的體積比為3 : 10。所述致孔劑，其體積為5mL-8mL。所述超聲處理，超聲時間為5min-15min。所述充入氮?dú)?，時間為5min-8min 。所述熱引發(fā)，采用60°C -7(rc水浴。 所述索氏抽提，是分別用甲醇與醋酸的混合溶液以及甲醇與甲酸的混合溶液萃 取，各萃取3次-6次，每次4h-6h，最后用純甲醇萃取l次-2次，其中，甲醇與醋酸以及甲醇 與甲酸的體積比均為9 : 1。
所述對固相萃取小柱進(jìn)一步洗脫模板分子，是指先后用甲醇與醋酸的混合液、甲 醇與甲酸的混合液、乙腈、甲醇進(jìn)行洗脫處理，每種溶劑的體積為30mL-60mL，其中，甲醇與 醋酸以及甲醇與甲酸的體積比為9 : 1。
所述樣品篩，其孔徑大小為38. 5 ii m-54 ii m。 本發(fā)明所涉及的分子印跡聚合物用于分離鹽酸克倫特羅的方法，包括以下步驟 步驟一，用甲醇淋洗聚丙烯固相萃取小柱和篩板，將分子印跡聚合物用甲醇勻漿
后填充到固相萃取小柱中，填料的上下兩端加上聚乙烯篩板，在抽真空狀態(tài)下壓緊填料； 步驟二，先后用甲醇與醋酸的混合溶液(9 : 1， v/v)、甲醇沖洗固相萃取小柱，用
磷酸溶液和乙腈的混合液活化固相萃取小柱，加入含有鹽酸克倫特羅的樣品液，用淋洗液
淋洗固相萃取小柱，用洗脫液洗脫鹽酸克倫特羅，收集鹽酸克倫特羅。 所述的篩板，其孔徑大小為20 ii m。 所述將分子印跡聚合物用甲醇勻漿后填充到固相萃取小柱中，其填充的分子印跡 聚合物質(zhì)量為20mg-200mg。 所述磷酸溶液和乙腈的混合液，其中磷酸溶液和乙腈的體積比為3 : 7，磷酸溶液 濃度為3mM， pH = 3. 4。 所述淋洗液，為水、乙酸與乙腈的混合溶液、乙腈與水的混合溶液、乙腈，其中，乙 酸與乙腈的體積比為2 : 98，乙腈與水的體積比為7 : 3。 所述的洗脫液，為甲醇與醋酸的混合液，甲醇與醋酸的體積比為9 : 1。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果 本發(fā)明合成的克倫特羅分子印跡聚合物是一種多孔的結(jié)構(gòu)，內(nèi)部具有和模板分子 相互補(bǔ)的集團(tuán)，具有"記憶"功能，所以對模板分子具有很高的特異性和選擇性。本發(fā)明采 用制備的克倫特羅分子印跡聚合物作為固相萃取小柱的填料，可以用于動物源性食品和水 溶液中實(shí)際樣品的前處理實(shí)踐，從而實(shí)現(xiàn)對干擾檢測的動物基質(zhì)的去除，富集痕量殘留的 克倫特羅，提高檢測的靈敏度。本發(fā)明與常規(guī)的C18固相萃取小柱相比，具有特異性好，容 量高的特點(diǎn)。如在0. 5 ii g/kg水平豬肉樣品上，C18固相萃取小柱無法檢測到，但分子印跡 聚合物固相萃取小柱的回收率可達(dá)到107. 0±3. 97%。
具體實(shí)施例方式
下面對本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行 實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施 例。 實(shí)施例一 —、制備分子印跡聚合物 步驟一，將模板分子克倫特羅0.5mol，功能單體甲基丙烯酸(MAA)，交聯(lián)劑乙二醇 二甲基丙烯酸脂(EGDMA)，按照1 : 2 : 15的摩爾比例混勻，溶解到6.5mL致孔劑(氯仿 乙腈=3 : 10)中，置入安培瓶中，再加入引發(fā)劑偶氮二異丁腈(AIBN)0.021g，超聲10min， 然后充入氮?dú)?min，真空封口，6(TC水浴24h，得克倫特羅分子印跡聚合物；
步驟二，取出塊狀聚合物，用研缽磨碎，用孔徑為38iim的樣品篩進(jìn)行篩分，用丙
酮懸浮棄去過細(xì)微粒。烘干聚合物后，甲醇醋酸(9 : i， v/v)和甲醇甲酸(9 : i， v/
5v)索氏抽提各3次去除大部分模板分子，每次6h，最后用純甲醇萃取1次，再12(TC熱處理 8h，然后用甲醇將聚合物勻漿后填充到固相萃取小柱內(nèi)，依次以甲醇醋酸(9 : 1，v/v)、
甲醇甲酸(9 : i， v/V)、乙腈和甲醇為洗脫液進(jìn)一步洗脫模板分子，每種溶劑的體積為
40mL ; 步驟三，將除去模板分子的分子印跡聚合物在6(TC環(huán)境下烘干處理24h，得到克 倫特羅分子印跡聚合物。 二、采用上述制備的分子印跡聚合物分離鹽酸克倫特羅 步驟一，首先用甲醇沖洗固相萃取小柱和篩板，將合成的分子印跡聚合物20mg用 甲醇勻漿，填充到聚丙烯固相萃取小柱中，柱體積為3mL，在抽真空狀態(tài)下壓緊填料，最后加 上聚乙烯篩板； 步驟二，克倫特羅分子印跡固相萃取小柱純化、富集豬肉中的鹽酸克倫特羅殘留 先后用10mL甲醇醋酸(9 : 1， v/v) 、2mL甲醇沖洗固相萃取小柱，2mL磷酸溶液(3mM， pH 3.4):乙腈(3 : 7，v/v)活化固相萃取小柱，使之不抽干。將3mL經(jīng)處理后的豬肉樣品液 (樣品液)加入到固相萃取小柱后，依次用lmL水，lmL乙酸:乙腈(2 : 98， v/v) ， lmL乙 腈水(7 : 3， v/v) ， lmL乙腈淋洗小柱，抽干，然后用3X lmL甲醇醋酸(9 : 1， v/v)洗 脫鹽酸克倫特羅。將洗脫液用氮?dú)獯蹈桑蛩玫臍堄辔锛尤雔OOyL水，用ELISA檢測樣 品中鹽酸克倫特羅的濃度。 本實(shí)施例合成的分子印跡聚合物可以特異的識別鹽酸克倫特羅，可以用于動物源
性食品中鹽酸克倫特羅的分離，凈化和富集。對豬肉中添加鹽酸克倫特羅10. 0i! g/kg標(biāo)準(zhǔn)
樣品的回收率為99. 4%，對其它類藥物無特異性吸附。 實(shí)施例二 —、制備分子印跡聚合物 步驟一，將模板分子克倫特羅0. 5mol，功能單體甲基丙烯酸(MAA)，交聯(lián)劑乙二醇 二甲基丙烯酸脂(EGDMA)，按照1 : 3 : 15的摩爾比例混勻，溶解到5mL致孔劑(乙腈氯 仿=10 : 3)中，置入安培瓶中，再加入引發(fā)劑偶氮二異丁腈(AIBN)0.021g，超聲15min，然 后充入氮?dú)?min，真空封口，6(TC水浴24h，得克倫特羅分子印跡聚合物；
步驟二，取出塊狀聚合物，用研缽磨碎，用孔徑為45iim的樣品篩進(jìn)行篩分，用丙
酮懸浮棄去過細(xì)微粒。烘干聚合物后，甲醇醋酸(9 : i， v/v)和甲醇甲酸(9 : i， v/
v)索氏抽提各4次去除大部分模板分子，每次5h，最后用純甲醇萃取2次，再12(TC熱處理
8h，然后用甲醇將聚合物勻漿后填充到固相萃取小柱內(nèi)，依次以甲醇醋酸(9 : 1，v/v)、 甲醇甲酸(9 : i， v/V)、乙腈和甲醇為洗脫液進(jìn)一步洗脫模板分子，每種溶劑的體積為
30mL ; 步驟三，將除去模板分子的分子印跡聚合物在6(TC環(huán)境下烘干處理24h，得到克 倫特羅分子印跡聚合物。 二、采用上述制備的分子印跡聚合物分離鹽酸克倫特羅 步驟一，首先用甲醇沖洗固相萃取小柱和篩板，將合成的分子印跡聚合物60mg用 甲醇勻漿，填充到聚丙烯固相萃取小柱中，柱體積為3mL，在抽真空狀態(tài)下壓緊填料，最后加 上聚乙烯篩板； 步驟二，克倫特羅分子印跡固相萃取小柱純化、富集磷酸溶液(3mM， pH 3.4):乙
6腈(30 : 70， v/v)中的鹽酸克倫特羅殘留先后用10mL甲醇醋酸(9 : 1， v/v)、2mL甲 醇沖洗固相萃取小柱，2mL磷酸溶液(3mM， pH 3.4):乙腈(3 : 7， v/v)活化固相萃取小 柱，注意不能使之抽干。上5mL含鹽酸克倫特羅10iig/mL磷酸溶液(3mM， pH 3.4):乙腈 (30 : 70， v/v)的樣品液到固相萃取小柱后，真空抽氣，使固相萃取小柱處于半干燥狀態(tài)， 用3mL乙腈淋洗固相萃取小柱，抽干，然后用3XlmL甲醇醋酸(9 : 1， v/v)洗脫鹽酸克 倫特羅。將樣品用0. 22 m的濾器過濾后，用HPLC分離樣品并通過紫外檢測器檢測樣品中 鹽酸克倫特的濃度。 本實(shí)施例合成的分子印跡聚合物可以特異的識別鹽酸克倫特羅，可以用于鹽酸克 倫特羅的分離，凈化和富集，本實(shí)施例中的柱容量為9. 6 g/60mg分子印跡聚合物。
實(shí)施例三
—、制備分子印跡聚合物 步驟一，將模板克倫特羅0.5mol，功能單體甲基丙烯酸(MAA)，交聯(lián)劑二甲基丙烯 酸乙二醇脂(EGDMA)，按照1 : 6 : 15的摩爾比例混勻，溶解到8mL致孔劑(乙腈氯仿= 10 : 3)中，置入安培瓶中，再加入引發(fā)劑偶氮二異丁腈(AIBN)0.021g，超聲10min，然后充 入氮?dú)?min，真空封口，6(TC水浴24h，得克倫特羅分子印跡聚合物； 步驟二，取出塊狀聚合物，用研缽磨碎，用孔徑為54iim的樣品篩進(jìn)行篩分，用丙
酮懸浮棄去過細(xì)微粒。烘干聚合物后，甲醇醋酸(9 : i， v/v)和甲醇甲酸(9 : i， v/
v)索氏抽提各6次去除大部分模板分子，每次4h，最后用純甲醇萃取2次，再12(TC熱處理
8h，然后用甲醇將聚合物勻漿后填充到固相萃取小柱內(nèi)，依次以甲醇醋酸(9 : 1，v/v)、 甲醇甲酸(9 : i， v/V)、乙腈和甲醇為洗脫液進(jìn)一步洗脫模板分子，每種溶劑的體積為
60mL ; 步驟三，將除去模板分子的分子印跡聚合物在6(TC環(huán)境下烘干處理24h，得到克 倫特羅分子印跡聚合物。 二、采用上述制備的分子印跡聚合物分離鹽酸克倫特羅 步驟一，首先用甲醇沖洗固相萃取小柱和篩板，將合成的分子印跡聚合物200mg 用甲醇勻漿，填充到聚丙烯固相萃取小柱中，柱體積為3mL，在抽真空狀態(tài)下壓緊填料，最后 加上聚乙烯篩板； 步驟二，克倫特羅分子印跡固相萃取小柱純化、富集豬肉中的鹽酸克倫特羅殘留 先后用10mL甲醇醋酸(9 : 1， v/v) 、2mL甲醇沖洗固相萃取小柱，2mL磷酸溶液(3mM， pH 3.4):乙腈(3 : 7，v/v)活化固相萃取小柱，注意不能使固相萃取小柱抽干。上3mL經(jīng)處 理后的豬肉樣品液(樣品液)到固相萃取小柱后，依次用lmL水，lmL乙酸乙腈(2 : 98， v/v) ， lmL乙腈:水(7 : 3， v/v) ， lmL乙腈淋洗固相萃取小柱，抽干，然后用3X lmL甲醇: 醋酸(9 : 1，v/v)洗脫鹽酸克倫特羅。將洗脫液用氮?dú)獯蹈?，向所得的殘余物加?00i!L 水，用ELISA檢測樣品中鹽酸克倫特羅的濃度。 本實(shí)施例合成的分子印跡聚合物可以特異的識別鹽酸克倫特羅，可以用于動物源 性食品中鹽酸克倫特羅的分離，凈化和富集。對豬肉中添加鹽酸克倫特羅5.0yg/kg標(biāo)準(zhǔn) 樣品的回收率為110. 1%，對其它類藥物無特異性吸附。
權(quán)利要求
一種用分子印跡聚合物分離鹽酸克倫特羅的方法，其特征在于，包括以下步驟步驟一，用甲醇淋洗聚丙烯固相萃取小柱和篩板，將分子印跡聚合物用甲醇勻漿后填充到固相萃取小柱中，填料的上下兩端加上聚乙烯的篩板，在抽真空狀態(tài)下壓緊填料；步驟二，先后用甲醇與醋酸的混合溶液、甲醇沖洗固相萃取小柱，用磷酸溶液和乙腈的混合液活化固相萃取小柱，加入含有鹽酸克倫特羅的樣品液，用淋洗液淋洗固相萃取小柱，用洗脫液洗脫鹽酸克倫特羅，收集鹽酸克倫特羅。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用分子印跡聚合物分離鹽酸克倫特羅的方法，其特征是，所 述將分子印跡聚合物用甲醇勻漿后填充到固相萃取小柱中，其填充的分子印跡聚合物質(zhì)量 為20mg-200mg。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用分子印跡聚合物分離鹽酸克倫特羅的方法，其特征是，所 述淋洗液，為水、乙酸與乙腈的混合溶液、乙腈與水的混合溶液、乙腈，其中，乙酸與乙腈的 體積比為2 : 98，乙腈與水的體積比為7 : 3。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種化學(xué)工程技術(shù)領(lǐng)域的用分子印跡聚合物分離鹽酸克倫特羅的方法，制備方法中將克倫特羅、甲基丙烯酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯按1∶2-6∶15摩爾比混合，溶解到致孔劑中，置入安培瓶中，加入引發(fā)劑，超聲處理后，充入氮?dú)?，真空封口，熱引發(fā)聚合，形成塊狀聚合物；取出塊狀聚合物，磨碎，篩分；烘干聚合物后，用索氏抽提、高溫處理及溶劑洗脫去除模板。分離方法中將分子印跡聚合物勻漿，填充到聚丙烯固相萃取小柱中，填料的上下兩端加上聚乙烯的篩板，壓緊填料；活化固相萃取小柱、淋洗固相萃取小柱、洗脫、收集鹽酸克倫特羅。本發(fā)明制備的分子印跡聚合物選擇性高、特異性高，能耐不良環(huán)境，并能與ELISA聯(lián)用。
文檔編號C07C213/10GK101792395SQ20101012263
公開日2010年8月4日 申請日期2008年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月25日
發(fā)明者張大兵, 武愛波, 鄭素連 申請人:上海交通大學(xué)