專利名稱：蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽融合體及其獲得方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽融合體及其獲得方 法，具體地說，本發(fā)明涉及系列蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽融合體或該系列融合體的部分片段 或該系列融合體衍生物、類似物的結(jié)構(gòu)及其制備方法，以及作為鎮(zhèn)痛藥物和抗腫瘤藥物在 醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蝎作為傳統(tǒng)中藥已有2000多年的藥用歷史，是我國(guó)的傳統(tǒng)名貴中藥，具有較大的開發(fā)價(jià)值。近年來人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種具有抗腫瘤、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗癲癇等藥理作用的蝎毒 單組分多肽。天然蝎毒產(chǎn)量極低，因此，采用基因工程方法，用簡(jiǎn)單的原核或真核生物表達(dá) 宿主生產(chǎn)具有藥用價(jià)值的活性蝎毒多肽的方法顯得尤為重要。提高抗腫瘤藥物之腫瘤細(xì)胞特異選擇性的一種方法是優(yōu)先向腫瘤細(xì)胞表面遞送 藥物?？山柚鷰追N方法將藥物導(dǎo)向腫瘤細(xì)胞。其中方法之一是依賴存在于腫瘤細(xì)胞表面上 的特異性受體分子。被稱為“導(dǎo)向劑”的分子可以識(shí)別這些細(xì)胞表面受體并與之特異性結(jié) 合。所說的“導(dǎo)向劑”可包括抗體、生長(zhǎng)因子或激素等。識(shí)別特異性細(xì)胞表面受體的“導(dǎo)向 齊U”可將藥物導(dǎo)向具有這些表面受體的細(xì)胞。功能蛋白融合體是近年來發(fā)展起來的具有廣泛應(yīng)用前景的生物治療新方法，主要 是通過導(dǎo)向部分將藥物特異且高效地聚集于病灶部位，從而實(shí)現(xiàn)靶向殺傷病變細(xì)胞的目 的。一般情況多在導(dǎo)向部分和蛋白藥物之間添加一部分柔性連接物序列，可以有效地保持 兩端蛋白的各自構(gòu)型，改善分子的空間柔曲性，以有利融合體蛋白導(dǎo)向部分與相應(yīng)受體的 結(jié)合以及蛋白藥物發(fā)揮固有的治療作用?；诖耍腥嗽眯∈蟀捉樗? (mIL-3)作為導(dǎo)向部分與白喉毒素結(jié)合，并在 兩個(gè)部分之間插入一個(gè)短肽接頭序列Gly4Ser,得到融合蛋白質(zhì)DAB389-Gly4Ser-mIL-3， 體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與不帶接頭序列的融合蛋白DAB389-mIL-3相比，前者對(duì)腫瘤 細(xì)胞的特異性細(xì)胞毒作用提高約5-10倍(參見Domunique. et al，F(xiàn)EBS Letters 406 157-161,1997)。Amotz Nechushtan等首次報(bào)道并應(yīng)用GnRH 10肽作為導(dǎo)向肽構(gòu)建嵌 合毒素(GnRH-PE66)，經(jīng)過體內(nèi)外相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究并探討了其針對(duì)腺癌細(xì)胞的靶向殺傷活 性，從而為促黃體生成素釋放激素的更廣泛應(yīng)用開闊了思路(Amotz Nechushtan, Shai Yarkoni, IrinaMarianovsky etal.Adenocarcinoma Cel Is Are Targeted by the New GnRH_PE66Chimeric Toxin through Specific Gonadotropin-releasing Hormone BindingSites. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY，272 :11597-11063，1997)。最近 也報(bào)導(dǎo)了一種基于接頭序列的，有假單胞菌外毒素(PE)和促性腺激素釋放素(GnRH)組成 的嵌合蛋白(GnRH-L-PE66或GnRH-L-PE40)。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GnRH-L-PE對(duì)多 種腫瘤細(xì)胞系具有細(xì)胞毒活性和腫瘤生長(zhǎng)抑制活性，并且活性顯著高于不帶有接頭序列的 GnRH-PE0因此，帶有柔性連接物的嵌合毒素將會(huì)成為一種潛在的腫瘤治療藥物。專利名稱為蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽及獲得方法(發(fā)明專利號(hào)ZL01128235. 5)的發(fā)明提供了一種具有較好鎮(zhèn)痛效果和抗腫瘤的蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽及獲得方法，而要得 到具有鎮(zhèn)痛和抗腫瘤生物活性，同時(shí)又對(duì)腫瘤細(xì)胞實(shí)現(xiàn)靶向殺傷功能的系列融合體或該系 列融合體的部分片段或該系列融合體衍生物、類似物及其獲得方法卻有待于進(jìn)一步研究。本發(fā)明所選擇的與蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽融合的五種小分子癌細(xì)胞導(dǎo)向肽， 文獻(xiàn)報(bào)道其特異性識(shí)別受體在肝癌細(xì)胞表面高表達(dá)而正常細(xì)胞幾乎不表達(dá)或表達(dá)量 很低(Schally AV, Srkalovic G, etal. Antitumor effects of analogsof LHRH and somatostatin !experimental and clinical studies. J steroidBiochem Mol Biol,1990, 37 1061-1067 ；Raderer Μ, Hejna ΜΗ, Muller C, etal. Treatment of hepatocellular cancer with the long actingsomatostatin analog lanreotide in vitro and in vivo. Int J oncol, 2000,16(6) :1197_1201 ；周筱梅，陳淵卿。人胰島素樣生長(zhǎng)因子受體及其生長(zhǎng) 因子在原發(fā)性肝癌中同時(shí)過量表達(dá)。腫瘤，1991，11 :241)，這些研究就為特異性靶向殺傷肝 癌細(xì)胞提供了理論基礎(chǔ)。同時(shí)有報(bào)道本發(fā)明所選擇的癌細(xì)胞導(dǎo)向肽的特異性高表達(dá)受體不 僅僅局限于肝癌細(xì)胞表面，同樣存在于如肺癌、前列腺癌等其他癌組織的細(xì)胞膜上。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供由蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽和不同癌細(xì)胞導(dǎo)向肽兩部分組成的融合體蛋白，并且在兩者之間插入了適當(dāng)?shù)慕宇^序列。本發(fā)明的另一個(gè)目的是構(gòu)建蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽與不同癌細(xì)胞導(dǎo)向肽的融合 體蛋白的載體，該系列融合體蛋白的表達(dá)純化方法及體內(nèi)外生物活性研究。不同癌細(xì)胞導(dǎo) 向肽分別為導(dǎo)向部分，與不同的柔性連接肽連接后，通過柔性連接肽融合在蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤 纈精甘肽的N端或C端而構(gòu)成相應(yīng)的載體。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供生產(chǎn)如上限定的嵌合蛋白質(zhì)的方法，該方法包括(1)提供攜帶不同癌細(xì)胞導(dǎo)向肽、不同的柔性連接肽、蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽的編 碼DNA的重組表達(dá)載體；(2)用步驟(1)的重組載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞(原核或真核細(xì)胞)；(3)在適合于表達(dá)蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽融合體的條件下培養(yǎng)步驟(2)的被轉(zhuǎn)化 的宿主細(xì)胞；(4)收獲并純化所得到的蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽融合體蛋白質(zhì)。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供含有如上限定的融合體蛋白質(zhì)及一種或多種醫(yī)藥上 可接受的載體或賦形劑的藥物組合物。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供如上限定的融合蛋白質(zhì)在生產(chǎn)鎮(zhèn)痛和抗腫瘤藥物中 的應(yīng)用。本發(fā)明提供的系列蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽融合體蛋白或該系列融合體的部分片 段或該系列融合體衍生物、類似物均是從基因工程宿主細(xì)胞中分離純化得到的?？墒褂名} 析沉淀、超濾、離子交換層析、疏水作用層析和凝膠過濾等方法從細(xì)胞的溶胞產(chǎn)物及培養(yǎng)液 中分離并純化所需的蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物。在產(chǎn)物的分離和純化過程中，可使用十二烷基磺 酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)或蛋白免疫印跡法 (WESTERN)檢測(cè)產(chǎn)物的存在及相應(yīng)分子大小。本發(fā)明還提供了系列蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽融合體蛋白或該系列融合體的部分片段或該系列融合體衍生物、類似物在生物制藥領(lǐng)域的應(yīng)用，具體地說包括鎮(zhèn)痛和抗腫瘤 生物活性。本發(fā)明首次利用不同的癌細(xì)胞導(dǎo)向肽和蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽融合以及在兩者 之間引入長(zhǎng)度不同及氨基酸組成成分不同的柔性連接肽序列。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中連接肽序列是(Gly4Ser)n, η = 1。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中連接肽序列是(Gly4Ser)n, η = 2。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中連接肽序列是(Gly4Ser)n, η = 3。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中連接肽序列是(Gly4Ser)n, η = 4。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中連接肽序列是(Gly4Ser)n, η = 5。本發(fā)明首次進(jìn)行系列蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽融合體蛋白或該系列融合體的部分 片段或該系列融合體衍生物、類似物的小鼠體內(nèi)鎮(zhèn)痛活性和體外抗腫瘤細(xì)胞生物學(xué)活性實(shí) 驗(yàn)。本發(fā)明進(jìn)一步涉及含有上述融合體蛋白和至少一種醫(yī)藥上可接受的惰性載體 或賦形劑的藥物組合物?？砂凑罩扑幑I(yè)領(lǐng)域已知的基本原則和方法制備適于胃腸道 夕卜途徑給藥的藥物組合物(如參見Remington，s PharmaceuticalScience, 15th.，Mack Publishing Company, 1980) 0可通過各種給藥途徑，特別是靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、腹腔 內(nèi)、鼻內(nèi)、皮內(nèi)、皮下等胃腸道外途徑投用本發(fā)明的藥物組合物?？墒褂帽景l(fā)明的融合體蛋白或含有該融合體蛋白質(zhì)的藥物組合物作為治療劑，用 于治療特定類型人體細(xì)胞的各種疾病。一種優(yōu)選的用途是用于治療其表面上過度表達(dá)促黃 體生成素釋放激素受體、胰島素樣生長(zhǎng)因子II受體或生長(zhǎng)抑素受體之細(xì)胞相關(guān)的疾病。本 發(fā)明的融合體蛋白質(zhì)或含有該融合體蛋白質(zhì)的藥物組合物的治療有效劑量一般應(yīng)根據(jù)疾 病的性質(zhì)、嚴(yán)重程度及對(duì)藥物的敏感適應(yīng)性，以及給藥途徑等諸多因素由臨床醫(yī)生按照個(gè) 體化原則來確定。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞，常用的原核宿主細(xì)胞的 例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物 細(xì)胞等。在本發(fā)明中，英文縮寫“BmkAGAP”是指蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽。X是指癌細(xì)胞 導(dǎo)向肽，Xl 為 Q冊(cè)SYGLRPG，X2 為 Q冊(cè)SYGWRPG，X3 為 Q冊(cè)SYGFRPG，X4 為 EPFRSPDLALETYG， X5 為 PFCFWKTCT。J 是指連接肽，Jl 為 SSHHHHHHSSGLVPRGSHM，J2 為 GGGSGGGS，J3 為 SGGSGGSGGGSGGGSGGGGSGGGGS, J4 為 GSGGGGSGGGGS 和(G4S)n (η = 1 或2或3或4或5)。可使用文獻(xiàn)中的各種檢測(cè)方法對(duì)本發(fā)明的融合體蛋白質(zhì)的性質(zhì)及生物學(xué)活性進(jìn) 行鑒定。具體包括(1)小鼠體內(nèi)鎮(zhèn)痛活性實(shí)驗(yàn)該方法是根據(jù)融合體蛋白質(zhì)中的蝎鎮(zhèn)痛抗 腫瘤纈精甘肽部分具有明顯的鎮(zhèn)痛活性，檢測(cè)其對(duì)小鼠醋酸扭體鎮(zhèn)痛的抑制率；(2)ΜΤΤ細(xì) 胞存活率實(shí)驗(yàn)該方法是根據(jù)活細(xì)胞將MTT轉(zhuǎn)化成蘭紫色甲瓚結(jié)晶體的能力檢測(cè)對(duì)腫瘤細(xì) 胞的影響；(3)受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)該方法是根據(jù)融合體蛋白質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)性置換與靶細(xì)胞漿膜結(jié)合 125I-GnRH的能力檢測(cè)其特異性受體結(jié)合活性；(4)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)該方法是根 據(jù)融合體蛋白質(zhì)對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的抑制能力檢測(cè)其對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向殺傷活性。以五種癌細(xì)胞導(dǎo)向肽分別為導(dǎo)向的系列蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽融合體或該系列 融合體的部分片段或該系列融合體衍生物、類似物可以導(dǎo)向性地選擇作用于腫瘤原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶，同時(shí)毒副作用小，并且本發(fā)明的系列融合體蛋白亦能起到較好的鎮(zhèn)痛作用，治療疾病的同時(shí)還能減輕患者的病痛，因此其應(yīng)用前景將是非常廣闊的。
具體實(shí)施例方式下面的實(shí)施例可以使本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，而不是以任何方式限 制本發(fā)明特批權(quán)利要求的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件， 如分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)。實(shí)施例1 Xl-Jl-BmkAGAP融合體及其衍生物、類似物的獲得1.X1-J1 -BmkAGAP融合體基因的構(gòu)建本實(shí)施例列舉描述用于表達(dá)本發(fā)明Xl-Jl-BmkAGAP融合體及其衍生物、類似物基 因的構(gòu)建策略和基本方法。根據(jù)癌細(xì)胞導(dǎo)向肽-Xl (QHWSYGLRPG)和蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽(BmkAGAP)的氨 基酸序列，設(shè)計(jì)相應(yīng)寡核苷酸上游引物和下游引物，以構(gòu)建好的pET28a-Tag(ms)-BmkAGAP質(zhì) 粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)物并進(jìn)行核酸片段的凝膠回收，經(jīng)過限制 性核酸內(nèi)切酶NcoI和BamHI雙酶切后與同樣進(jìn)行雙酶切的質(zhì)粒pSYPU在T4 DNA Iigase 的作用下進(jìn)行連接，熱轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH 5 α，經(jīng)過菌落PCR和限制性核酸內(nèi)切 酶酶切驗(yàn)證篩選獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子后提交生物技術(shù)服務(wù)公司進(jìn)行DNA核酸序列測(cè)定。結(jié)果 表明，通過基因工程的方法成功構(gòu)建并獲得重組質(zhì)粒pSYPU-Xl-Jl-BmkAGAP，得到癌細(xì)胞導(dǎo) 向肽-QHWSYGLRPG、連接肽-SSHHHHHHSSGLVPRGSHM和蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽的融合基因序 列。2. Xl-Jl-BmkAGAP融合體及其衍生物、類似物的獲得利用基因工程技術(shù)，構(gòu)建Xl-Jl-BmkAGAP融合體蛋白表達(dá)質(zhì)粒，提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。該重組表達(dá)質(zhì)粒編碼表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特征為MGQHWSYGLRPGSSHHHHHHSSGLVPRGSH MVRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCNGGo經(jīng)測(cè)序確認(rèn)后按常規(guī)方法發(fā)酵表達(dá)并分離大腸桿菌宿主細(xì)胞的表達(dá)產(chǎn)物。首先將 陽(yáng)性重組質(zhì)粒熱轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 ( λ DE3)，然后從該LB固體平板上挑取單菌落后接種至 3ml LB (含氨芐抗生素，60 μ g/ml)，于37°C，200r/min振蕩過夜培養(yǎng)。按照1 %接種量將過 夜培養(yǎng)物接種至400ml含相應(yīng)抗生素的新鮮LB培養(yǎng)基的三角瓶中，于37°C，200r/min振 蕩培養(yǎng)至OD值為0. 6-0. 8，加入終濃度為0. 166mmol/L的誘導(dǎo)物異丙基β _D_硫代半乳糖 苷(IPTG)，培養(yǎng)4h。結(jié)束發(fā)酵，4°C離心收集菌體。用40ml裂解緩沖液(0. IM PBS, 0. 15M NaCl，50mM咪唑)重懸菌體，進(jìn)行超聲破碎，超聲結(jié)束后于12，000g、4°C離心20min，得上清 液，所得沉淀按照上述步驟重復(fù)破碎一次，合并兩次上清液，直接上樣于0. IM PBS (pH 8.0) 預(yù)先平衡好的金屬離子螯合層析柱，經(jīng)過兩個(gè)不同階段的PH緩沖液分別充分洗滌5個(gè)柱床 體積后，使用0. 5M咪唑(pH 9. 0)進(jìn)行洗脫并收獲該洗脫液。所得產(chǎn)物經(jīng)過15% SDS-PAGE 驗(yàn)證其純度。由柱層析色譜圖和SDS-PAGE圖譜說明，重組融合體蛋白質(zhì)獲得高效表達(dá)，經(jīng) 過兩步常規(guī)柱層析后獲得單一目的蛋白條帶，達(dá)到電泳純度。按照上述策略和基本方法，Xl-Jl-BmkAGAP融合體衍生物、類似物的結(jié)構(gòu)特征為MGQHWSYGLRPGSSHHHHHHSSGLVPRGSHVRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACW CYKLPDKVPIRVPGKCNGG。利用化學(xué)法在M處斷裂去除M，從而獲得Xl-Jl-BmkAGAP融合體衍生 物、類似物，結(jié)構(gòu)特征為GQHWSYGLRPGSSHHHHHHSSGLVPRGSHVRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECK KNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCNGG。3. Xl-Jl-BmkAGAP融合體蛋白在酵母中的表達(dá)及其純化將編碼Xl-Jl-BmkAGAP或Xl-Jl (_M) -BmkAGAP融合體蛋白基因進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反 應(yīng)所使用的5'寡核苷酸引物序列含有EcoRV限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)和蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈 精甘肽的N末端區(qū)域氨基酸序列的編碼序列。3'端引物序列含有EcoR I限制性內(nèi)切酶的 酶切位點(diǎn)、一個(gè)翻譯終止密碼子和蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤活性肽C末端區(qū)域 氨基酸序列的編碼序列。引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于酵母表達(dá)載體pPIC9K上的限制性內(nèi)切 酶酶切位點(diǎn)(其中EcoRV和SnaB I的內(nèi)切酶切口為平末端)，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性 (Amplr和KarO，一個(gè)來自2 μ質(zhì)粒的復(fù)制子，一個(gè)AOXl啟動(dòng)子，在畢赤酵母中可由甲醇誘導(dǎo) 高效表達(dá)，一個(gè)α -因子的信號(hào)肽序列，一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，一個(gè)HIS4選擇性標(biāo)記以及整合 序列。用SnaB I和EcoR I消化pPIC9K載體，用EcoR V和EcoR I消化插入片段，隨后 將插入片段連入PPIC9K載體，連接產(chǎn)物熱轉(zhuǎn)化E. coli DH 5 α菌株，在含有Amp的LB培養(yǎng) 皿上篩選轉(zhuǎn)化子，在含有Amp (100 μ g/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)含所需構(gòu)建物的克 隆。抽提質(zhì)粒，測(cè)序驗(yàn)證插入片段正確插入。取質(zhì)粒線性化后，電轉(zhuǎn)化入酵母細(xì)胞，線性化的重組載體通過與宿主基因組的同 源序列發(fā)生同源重組產(chǎn)生穩(wěn)定的酵母轉(zhuǎn)化體。利用G418篩選出高拷貝的整合轉(zhuǎn)化子。 將篩選得到的菌株接種于裝有25ml MGY、BMG或BMGY培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，于28 300C /250 300轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)至OD6tltl = 2 6 (16 18h)；室溫下3000轉(zhuǎn)/分離心5min，收 集菌體，用1/5到1/10原培養(yǎng)體積的匪、BMM或BMMY重懸菌體(約10 20ml)；將步驟2所 得的菌液置于IOOml的搖瓶中，用雙層紗布或粗棉布封口，放置于28 30°C /250 300轉(zhuǎn) /分的搖床上繼續(xù)生長(zhǎng)；每24h向培養(yǎng)基中添加100%甲醇至終濃度為0. 5 1. 0%;分離樣 品的上清液，用截留分子量為3000Da的超濾膜超濾除去色素，用SDS-PAGE、Western-Blot 及活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)與鑒定重組蛋白的表達(dá)。涉及的表達(dá)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)特征為1. GQHWSYGLRPGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMVRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQ WAGVYGNACffCYKLPDKVP I RVPGKCNGG。2. QHWSYGLRPGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMVRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQW AGVYGNACffCYKLPDKVPIRVPGKCNGG。 3. GQHWSYGLRPGSSHHHHHHSSGLVPRGSHVRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQW AGVYGNACffCYKLPDKVPIRVPGKCNGG。4. QHWSYGLRPGSSHHHHHHSSGLVPRGSHVRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWA GVYGNACffCYKLPDKVPIRVPGKCNGG。實(shí)施例2 X2-Jl-BmkAGAP融合體及其衍生物、類似物的獲得
本實(shí)施例的策略、基本方法和基本過程同實(shí)施例1。X2-Jl-BmkAGAP融合體及其衍生物、類似物的結(jié)構(gòu)特征為1. QHWSYGWRPGSSHHHHHHSSGLVPRGSHM-BmkAGAP。2. QHWSYGWRPGSSHHHHHHSSGLVPRGSH-BmkAGAP。3. MQHWSYGWRPGSSHHHHHHSSGLVPRGSHM-BmkAGAP。4. MQHWSYGWRPGSSHHHHHHSSGLVPRGSH-BmkAGAP。實(shí)施例3:X3-Jl-BmkAGAP融合體及其衍生物、類似物的獲得本實(shí)施例的策略、基本方法和基本過程同實(shí)施例1。X3-Jl-BmkAGAP融合體及其衍生物、類似物的結(jié)構(gòu)特征為1. QHWSYGFRPGSSHHHHHHSSGLVPRGSHM-BmkAGAP。2. QHWSYGFRPGSSHHHHHHSSGLVPRGSH-BmkAGAP。3. MQHWSYGFRPGSSHHHHHHSSGLVPRGSHM-BmkAGAP。4. MQHWSYGFRPGSSHHHHHHSSGLVPRGSH-BmkAGAP。實(shí)施例4 X4-Jl-BmkAGAP融合體及其衍生物、類似物的獲得本實(shí)施例的策略、基本方法和基本過程同實(shí)施例1。X4-Jl-BmkAGAP融合體及其衍生物、類似物的結(jié)構(gòu)特征為1. MEPFRSPDLALETYGSSHHHHHHSSGLVPRGSHM-BmkAGAP。2. MEPFRSPDLALETYGSSHHHHHHSSGLVPRGSH-BmkAGAP。3. EPFRSPDLALETYGSSHHHHHHSSGLVPRGSHM-BmkAGAP。4. EPFRSPDLALETYGSSHHHHHHSSGLVPRGSH-BmkAGAP。實(shí)施例5 X5-Jl-BmkAGAP融合體及其衍生物、類似物的獲得本實(shí)施例的策略、基本方法和基本過程同實(shí)施例1。X5-Jl-BmkAGAP融合體及其衍生物、類似物的結(jié)構(gòu)特征為
1. MPFCFWKTCTSSHHHHHHSSGLVPRGSHM-BmkAGAP。2. MPFCFWKTCTSSHHHHHHSSGLVPRGSH-BmkAGAP。3. PFCFWKTCTSSHHHHHHSSGLVPRGSHM-BmkAGAP。4. PFCFWKTCTSSHHHHHHSSGLVPRGSH-BmkAGAP。實(shí)施例6 以J2為連接肽的BmkAGAP融合體及其衍生物、類似物的獲得本實(shí)施例的策略、基本方法和基本過程同實(shí)施例1。在此實(shí)施例中，以 J2(GGGSGGGS)為連接肽形成BmkAGAP融合體及其衍生物、類似物，其結(jié)構(gòu)特征為1. MQHffSYGLRPGGGGSGGGS-BmkAGAP, 2. QHffSYGLRPGGGGSGGGS-BmkAGAP, 3.M-BmkAGAP-GGGSGGGSQHffSYGLRPG,4.BmkAGAP-GGGSGGGSQHffSYGLRPG, 5. MQHffSYGffRPGGGGSGGGS-BmkAGAP,6. QHffSYGffRPGGGGSGGGS-BmkAGAP, 7.M-BmkAGAP-GGGSGGGSQHffSYGffRPG,8.BmkAGAP-GGGSGGGSQHffSYGffRPG, 9.MQHffSYGFRPGGGGSGGGS-BmkAGAP,10.QHffSYGFRPGGGGSGGGS-BmkAGAP,11.M-BmkAGAP-GGGSGGGSQHWSYGFRPG,12. BmkAGAP-GGGSGGGSQHWSYGFRPG,13. MEPFRSPDLALE TYGGGGSGGGS-BmkAGAP，14. EPFRSPDLALETYGGGGSGGGS-BmkAGAP，15. M-BmkAGAP-GGGSGGGSEP FRSPDLALETYG,16. BmkAGAP-GGGSGGGSEPFRSPDLALETYG，17. MPFCFffKTCTGGGSGGGS-BmkAGAP, 18.PFCFffKTCTGGGSGGGS-BmkAGAP,19.M-BmkAGAP-GGGSGGGSPFCFffKTCT, 20. BmkAGAP-GGGSGGGSPFCFWKTCT。實(shí)施例7 以J3為連接肽的BmkAGAP融合體及其衍生物、類似物的獲得本實(shí)施例的策略、基本方法和基本過程同實(shí)施例1。在此實(shí)施例中，以 J3 (SGGSGGSGGGSGGGSGGGGSGGGGS)為連接肽形成BmkAGAP融合體及其衍生物、類似物，其結(jié) 構(gòu)特征為
1. MQHWSYGLRPG-J3-BmkAGAP,2. QHWSYGLRPG-J3-BmkAGAP, 3. M-BmkAGAP-J3-QHWSYGLRPG,4. BmkAGAP-J3-QHWSYGLRPG,5. MQHffSYGffRPG-J3-BmkAGAP, 6. QHWSYGWRPG-J3-BmkAGAP,7. M-BmkAGAP-J3-QHffSYGffRPG,8. BmkAGAP-J3-QHffSYGffRPG, 9. MQHWSYGFRPG-J3-BmkAGAP,10. QHWSYGFRPG-J3-BmkAGAP,11. M-BmkAGAP-J3-QHWSYGFRPG, 1 2. BmkAGAP-J3-QHffSYGFRPG, 13. MEPFRSPDLALETYG_J3_BmkAGAP， 14.EPFRSPDLALETYG-J3-BmkAGAP,15.M-BmkAGAP-J3-EPFRSPDLALETYG, 1 6. BmkAGAP-J3-EPFRSPDLALETYG, 17. MPFCFWKTCT-J3-BmkAGAP, 18. PFCFffKTCT-J3-BmkAGAP,19. M-BmkAGAP-J3-PFCFWKTCT,20. BmkAGAP-J3_PFCFWKTCT。實(shí)施例8 以J4為連接肽的BmkAGAP融合體及其衍生物、類似物的獲得本實(shí)施例的策略、基本方法和基本過程同實(shí)施例1。在此實(shí)施例中，以 J4(GSGGGGSGGGGS)為連接肽形成BmkAGAP融合體及其衍生物、類似物，其結(jié)構(gòu)特征為1. MQHWSYGLRPG-J4-BmkAGAP,2. QHWSYGLRPG-J4-BmkAGAP, 3. M-BmkAGAP-J4-QHWSYGLRPG,4. BmkAGAP-J4-QHWSYGLRPG,5. MQHffSYGffRPG-J4-BmkAGAP,
6.QHffSYGffRPG-J4-BmkAGAP,7.M-BmkAGAP-J4-QHWSYGWRPG,8. BmkAGAP-J4-QHWSYGWRPG, 9. MQHWSYGFRPG-J4-BmkAGAP,10. QHWSYGFRPG-J4-BmkAGAP,11. M-BmkAGAP-J4-QHWSYGFRPG,
12.BmkAGAP-J4-QHffSYGFRPG,13.MEPFRSPDLALETYG_J4_BmkAGAP， 14.EPFRSPDLALETYG-J4-BmkAGAP,15.M-BmkAGAP-J4-EPFRSPDLALETYG, 1 6. BmkAGAP-J4-EPFRSPDLALETYG, 1 7. MPFCFWKTCT-J4-BmkAGAP, 18. PFCFffKTCT-J4-BmkAGAP,19. M-BmkAGAP-J4-PFCFWKTCT,20. BmkAGAP-J4-PFCFWKTCT。實(shí)施例9 以(G4S)工為連接肽的BmkAGAP融合體及其衍生物、類似物的獲得本實(shí)施例的策略、基本方法和基本過程同實(shí)施例1。在此實(shí)施例中，以(G4S)1為連 接肽形成BmkAGAP融合體及其衍生物、類似物，其結(jié)構(gòu)特征為1. MQHffSYGLRPG- (G4S)「BmkAGAP，2. QHffSYGLRPG- (G4S)「BmkAGAP， 3. M-BmkAGAP-(G4S)1-QHWSYGLRPG，4· BmkAGAP-(G4S)「QHWSYGLRPG， 5. MQHffSYGffRPG-(G4S) !-BmkAGAP,6. QHffSYGffRPG-(G4S)1-BmkAGAP,
7.M-BmkAGAP-(G4S)1-QHWSYGWRPG，8· BmkAGAP-(G4S)「QHWSYGWRPG， 9. MQHWSYGFRPG-(G4S) !-BmkAGAP, 10. QHffSYGFRPG-(G4S)1-BmkAGAP,11. M-BmkAGAP- (G4S)「QHWSYGFRPG，12. BmkAGAP- (G4S)「QHWSYGFRPG，13. MEPFRSPDLALE TYG- (G4S)!-BmkAGAP, 14. EPFRSPDLALETYG- (G4S)「BmkAGAP，15. M-BmkAGAP- (G4S)「EPF RSPDLALETYG, 16. BmkAGAP- (G4S)「EPFRSPDLALETYG，17. MPFCFffKTCT- (G4S)「BmkAGAP， 18. PFCFWKTCT -(G Jh-BmkAGAP，19. M-BmkAGAP -(G4S)1-PFCFWKTCT， 20. BmkAGAP- (G4S) fPFCFWKTCT。實(shí)施例10 以(G4S) 5為連接肽的BmkAGAP融合體及其衍生物、類似物的獲得本實(shí)施例的策略、基本方法和基本過程同實(shí)施例1。在此實(shí)施例中，以(G4S)5為連接肽形成BmkAGAP融合體及其衍生物、類似物，其結(jié)構(gòu)特征為1. MQHffSYGLRPG- (G4S) 5_BmkAGAP，2. QHffSYGLRPG- (G4S)「BmkAGAP， 3. M-BmkAGAP-(G4S)5-QHWSYGLRPG，4· BmkAGAP-(G4S) 5-QHffSYGLRPG, 5. MQHWSYGWRPG-(G4S) 5-BmkAGAP，6· QHffSYGffRPG-(G4S)5-BmkAGAP, 7. M-BmkAGAP-(G4S) S-QHffSYGffRPG,8. BmkAGAP-(G4S) 5-QHffSYGffRPG, 9. MQHWSYGFRPG-(G4S)5-BmkAGAP，10. QHffSYGFRPG-(G4S)5-BmkAGAP, 11. M-BmkAGAP-(G4S) 5-QHWSYGFRPG,12. BmkAGAP-(G4S) 5-QHWSYGFRPG,13. MEPFRSPDLALE TYG-(G4S) 5-BmkAGAP,14. EPFRSPDLALETYG-(G4S) 5_BmkAGAP，15. M-BmkAGAP-(G4S) 5_EPF RSPDLALETYG,16. BmkAGAP-(G4S)「EPFRSPDLALETYG，17. MPFCFffKTCT-(G4S) 5_BmkAGAP， 18. PFCFWKTCT-(G4S ) [BmkAGAP，19. M-BmkAGAP-(G4S)5-PFCFWKTCT， 20. BmkAGAP- (G4S) 5_PFCFWKTCT。實(shí)施例11 系列BmkAGAP融合體及其衍生物、類似物體內(nèi)鎮(zhèn)痛活性一小鼠醋酸扭體法本實(shí)施例通過小鼠體內(nèi)鎮(zhèn)痛模型旨在驗(yàn)證BmkAGAP融合體及其衍生物、類似物的
鎮(zhèn)痛活性。小鼠醋酸扭體法鎮(zhèn)痛模型將冰醋酸作為化學(xué)刺激物注入昆明種小鼠腹腔內(nèi)，繼 而引起深部的、大面積而較持久的疼痛刺激，致使小鼠產(chǎn)生“扭體”反應(yīng)(腹部?jī)?nèi)凹、軀干與 后腿伸張、臀部高起)。18-22g昆明種小鼠，雌雄各半，隨機(jī)分組，每組8只，腹腔注射BmkAGAP融合體及 其衍生物、類似物樣品，20min后按0. 2ml/20g腹腔注射0. 6% (ν/ν)醋酸引起內(nèi)臟痛，5min 后記錄小鼠IOmin內(nèi)的扭體次數(shù)。以嗎啡為陽(yáng)性對(duì)照，生理鹽水為空白對(duì)照，按照下述公式 計(jì)算各個(gè)給藥組的扭體反應(yīng)抑制率。
觸I安空白組扭體次數(shù)-給藥組扭體次數(shù)1ΛΛ0/ 抑辭=-空白組扭體次數(shù)-χ100%鎮(zhèn)痛生物活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明1.生理鹽水空白組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物扭體次數(shù)(Mean士SEM)為46. 75士3. 65 ；陽(yáng)性對(duì)照組 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物扭體次數(shù)(Mean士SEM)為29. 37士 1. 85，扭體抑制率為37. 17%。2.蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽組的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物扭體抑制率為55. 6%。3. BmkAGAP融合體及其衍生物、類似物組(I)Xl-Jl-BmkAGAP融合體及其衍生物、類似物組
樣品MGQ冊(cè)SYGLRPGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMVRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAES GYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCNGG的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物扭體抑制率為54. 1%。本組選擇上述樣 品進(jìn)行鎮(zhèn)痛活性實(shí)驗(yàn)，是由于該樣品的結(jié)構(gòu)涵蓋Xl-Jl-BmkAGAP融合體及其衍生物、類似 物組的結(jié)構(gòu)，因此，其結(jié)果足以代表Xl-Jl-BmkAGAP融合體及其衍生物、類似物組的鎮(zhèn)痛活性。(2) X2-Jl-BmkAGAP融合體及其衍生物、類似物組樣品MQ冊(cè)SYGWRPGSSHHHHHHSSGLVPRGSHM-BmkAGAP的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物扭體抑制率為 55.1%。本組選擇上述樣品進(jìn)行鎮(zhèn)痛活性實(shí)驗(yàn)，是由于該樣品的結(jié)構(gòu)涵蓋X2-Jl-BmkAGAP 融合體及其衍生物、類似物組的結(jié)構(gòu)，因此，其結(jié)果足以代表X2-Jl_BmkAGAP融合體及其衍 生物、類似物組的鎮(zhèn)痛活性。(3)X3-Jl-BmkAGAP融合體及其衍生物、類似物組樣品MQ冊(cè)SYGFRPGSSHHHHHHSSGLVPRGSHM-BmkAGAP的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物扭體抑制率為 53.8%。本組選擇上述樣品進(jìn)行鎮(zhèn)痛活性實(shí)驗(yàn)，是由于該樣品的結(jié)構(gòu)涵蓋X3-Jl-BmkAGAP 融合體及其衍生物、類似物組的結(jié)構(gòu)，因此，其結(jié)果足以代表X3-Jl-BmkAGAP融合體及其衍 生物、類似物組的鎮(zhèn)痛活性。(4)X4-Jl-BmkAGAP融合體及其衍生物、類似物組樣品MEPFRSPDLALETYGSSHHHHHHSSGLVPRGSHM-BmkAGAP 的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物扭體抑制率為 55.8%。本組選擇上述樣品進(jìn)行鎮(zhèn)痛活性實(shí)驗(yàn)，是由于該樣品的結(jié)構(gòu)涵蓋X4-Jl-BmkAGAP 融合體及其衍生物、類似物組的結(jié)構(gòu)，因此，其結(jié)果足以代表X4-Jl-BmkAGAP融合體及其衍 生物、類似物組的鎮(zhèn)痛活性。(5)X5-Jl-BmkAGAP融合體及其衍生物、類似物組樣品MPFCFWKTCTSSHHHHHHSSGLVPRGSHM-BmkAGAP 的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物扭體抑制率為
56.5%。本組選擇上述樣品進(jìn)行鎮(zhèn)痛活性實(shí)驗(yàn)，是由于該樣品的結(jié)構(gòu)涵蓋X5-Jl-BmkAGAP 融合體及其衍生物、類似物組的結(jié)構(gòu)，因此，其結(jié)果足以代表X5-Jl_BmkAGAP融合體及其衍 生物、類似物組的鎮(zhèn)痛活性。(6)以J2為連接肽的BmkAGAP融合體及其衍生物、類似物組樣品=MQHffSYGLRPGGGGSGGGS-BmkAGAP,M-BmkAGAP-GGGSGGGSQHffSYGLRPG, M-BmkAGAP-GGGSGGGSQHffSYGffRPG， M-BmkAGAP-GGGSGGGSQHffSYGFRPG， M-BmkAGAP-GGGSGG GSEPFRSPDLALETYG, M-BmkAGAP-GGGSGGGSPFCFffKTCT 的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物扭體抑制率均在 52. 5 % 以上。本組選擇上述樣品進(jìn)行鎮(zhèn)痛活性實(shí)驗(yàn)，是由于上述樣品的結(jié)構(gòu)涵蓋以J2為連接肽 的BmkAGAP融合體及其衍生物、類似物組的結(jié)構(gòu)，因此，其結(jié)果足以代表以J2為連接肽的 BmkAGAP融合體及其衍生物、類似物組的鎮(zhèn)痛活性。(7)以J3為連接肽的BmkAGAP融合體及其衍生物、類似物組樣品MQHff SYGLRPG-J3-BmkAGAP, M-BmkAGAP-J3-QHff SYGLRPG , MEPFRSPDLALETYG-J3-BmkAGAP, M-BmkAGAP-J3-EPFRSPDLALETYG, MPFCFWKTCT-J3-BmkAGAP, M-BmkAGAP-J3-PFCFWKTCT的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物扭體抑制率均在57. 5%以上。本組選擇上述樣品進(jìn) 行鎮(zhèn)痛活性實(shí)驗(yàn)，是由于上述樣品的結(jié)構(gòu)涵蓋以J3為連接肽的BmkAGAP融合體及其衍生 物、類似物組的結(jié)構(gòu)，此外，結(jié)合鎮(zhèn)痛生物活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果3中的(1)-(6)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。本組 實(shí)驗(yàn)結(jié)果足以代表以J3為連接肽的BmkAGAP融合體及其衍生物、類似物組的鎮(zhèn)痛活性。
(8)以J4為連接肽的BmkAGAP融合體及其衍生物、類似物組樣品MQ冊(cè)SYGLRPG-J4-BmkAGAP，M-BmkAGAP-J4-QHWSYGLRPG,的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物扭體抑 制率均在54. 7%以上。結(jié)合鎮(zhèn)痛生物活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果3中的(1)-(7)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，本組實(shí)驗(yàn) 結(jié)果足以代表以J4為連接肽的BmkAGAP融合體及其衍生物、類似物組的鎮(zhèn)痛活性。(9)以(G4S)n為連接肽的BmkAGAP融合體及其衍生物、類似物組樣品=MQHWSYGLRPG-(G4S)1-BmkAGAP,M-BmkAGAP-(G4S)1-QHWSYGLRPG, MQHffSYGLRPG - (G4S) 5-BmkAGAP, M-BmkAGAP-(G4S)5-QHffSYGLRPG, MEPFRSPDLALETYG-(G4S)「BmkAGAP，M-BmkAGAP-(G4S )「EPFRSPDLALETYG， MEPFRSPDLALETYG-(G4S)「BmkAGAP，M-BmkAGAP-(G4S)「EPFRSPDLALETYG， MPFCFffKTCT- (G4S) ！-BmkAGAP, M-BmkAGAP- (G4S) ！-PFCFffKTCT, MPFCFffKTCT- (G4S) 5_BmkAGAP， M-BmkAGAP-(G4S)5-PFCFWKTCT的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物扭體抑制率均在50. 6%以上。結(jié)合鎮(zhèn)痛生物活性 實(shí)驗(yàn)結(jié)果3中的(1)-(8)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果足以代表以(G4S)n(^lsa2sa3sa4sa5)* 連接肽的BmkAGAP融合體及其衍生物、類似物組的鎮(zhèn)痛活性。實(shí)施例12 系列BmkAGAP融合體及其衍生物、類似物體外抗腫瘤細(xì)胞生物活性一MTT法本實(shí)施例通過MTT法檢測(cè)本發(fā)明所獲得的系列BmkAGAP融合體及其衍生物、類似 物對(duì)體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化、離心，制成細(xì)胞懸液，吹勻并將密度調(diào)至6X IO5個(gè)/ml， 以100 μ 1/孔加入96孔微量培養(yǎng)板中，其間不斷吹勻細(xì)胞，保證每孔的細(xì)胞數(shù)大致相等。于 37CO2濃度為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。生 長(zhǎng)情況良好，即可加入不同稀釋濃度的樣品。樣品以RPMI 1640培養(yǎng)基溶解，二倍體積稀釋 法稀釋為五個(gè)濃度梯度，每個(gè)濃度設(shè)置三個(gè)復(fù)孔。陰性對(duì)照孔加入相同體積的培養(yǎng)液。另 設(shè)僅加含相應(yīng)的培養(yǎng)液(無(wú)細(xì)胞)為空白調(diào)零孔。于37°C，C02濃度為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中 繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后棄去培養(yǎng)液，每孔加入100 μ 1 MTT (稀釋至終濃度為0. 5mg/ml)，培養(yǎng)4 小時(shí)后，吸棄上清，每孔加入150 μ 1 二甲基亞砜，室溫置搖床上低速振蕩10分鐘，充分溶解 后在酶標(biāo)儀上測(cè)定490nm處各孔的吸光度值，根據(jù)每個(gè)樣品的吸光度值計(jì)算每組樣品對(duì)細(xì) 胞的生長(zhǎng)抑制率，利用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算樣品的半數(shù)抑制濃度IC50值(即在用藥后 存活的細(xì)胞數(shù)量減少一半時(shí)所需的藥物濃度)。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的計(jì)算方法參照如下公式 進(jìn)行
細(xì)艦照組OD值-給藥組ODH
抑制率<%} - X 100%
細(xì)■照組OD值-空白調(diào)㈣OD值系列BmkAGAP融合體及其衍生物、類似物體外抗腫瘤細(xì)胞生物活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 表明與蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽組比較，Xl-Jl-BmkAGAP融合體及其衍生物和類似物、 X2-Jl-BmkAGAP融合體及其衍生物和類似物、X3-Jl_BmkAGAP融合體及其衍生物和類似物、 X4-Jl-BmkAGAP融合體及其衍生物和類似物、X5-Jl_BmkAGAP融合體及其衍生物和類似物、 以J2為連接肽的BmkAGAP融合體及其衍生物和類似物、以J3為連接肽的BmkAGAP融合體及 其衍生物和類似物、以J4為連接肽的BmkAGAP融合體及其衍生物和類似物和以(G4S)n為連接肽的BmkAGAP融合體及其衍生物與類似物組的體外抗腫瘤細(xì)胞生物活性沒有明顯降低， 有的BmkAGAP融合體及其衍生物與類似物的體外抗腫瘤細(xì)胞生物活性則有提高。實(shí)施例13 系列BmkAGAP融合體及其衍生物、類似物的靶向特異性試驗(yàn)本實(shí)施例借助細(xì)胞膜受體結(jié)合試驗(yàn)檢測(cè)本發(fā)明的系列BmkAGAP融合體及其衍生 物、類似物的細(xì)胞受體結(jié)合能力。按照Qaycum，A.等人(Br. J. Cancer 62 =96-99,1990)所 述的方法，檢測(cè)本發(fā)明的系列BmkAGAP融合體及其衍生物、類似物競(jìng)爭(zhēng)取代與人乳腺癌細(xì) 胞結(jié)合的125I-GnRH的能力。將培養(yǎng)的人乳腺癌Mcf-7細(xì)胞單層分離到含有IOmM Tris-HCl (pH7. 5) UmMDTT 和lmg/ml牛血清白蛋白的緩沖液中以制備細(xì)胞勻漿。低速離心去掉大的細(xì)胞碎片后，再 以25，OOOg將上清部分4°C離心30分鐘，得到細(xì)胞漿膜部分。將漿膜懸液按每孔100 μ 1 的終體積加于24孔培養(yǎng)板孔中，然后再向各孔中加入5 μ M 125I-GnRH并于37°C溫浴1小 時(shí)。溫浴后再向每孔內(nèi)加入未標(biāo)記的GnRH或蝎鎮(zhèn) 痛抗腫瘤纈精甘肽對(duì)照樣品或本發(fā)明系 列BmkAGAP融合體及其衍生物、類似物樣品(0. 1-100 μ Μ)，并繼續(xù)保溫24小時(shí)。保溫后用 上述緩沖液洗樣品并用Y計(jì)數(shù)儀檢測(cè)結(jié)合的配體。加入漸增濃度的樣品后，可隨著濃度的 增加而逐漸取代與Mcf-7細(xì)胞膜結(jié)合的125I-GnRH。系列BmkAGAP融合體及其衍生物、類似物的靶向特異性試驗(yàn)結(jié)果表明與蝎鎮(zhèn)痛 抗腫瘤纈精甘肽樣品組比較，Xl-Jl-BmkAGAP融合體及其衍生物和類似物、X2-Jl_BmkAGAP 融合體及其衍生物和類似物、X3-Jl-BmkAGAP融合體及其衍生物和類似物、X4-Jl_BmkAGAP 融合體及其衍生物和類似物、X5-Jl-BmkAGAP融合體及其衍生物和類似物、以J2為連接肽 的BmkAGAP融合體及其衍生物和類似物、以J3為連接肽的BmkAGAP融合體及其衍生物和類 似物、以J4為連接肽的BmkAGAP融合體及其衍生物和類似物、以(G4S)n為連接肽的BmkAGAP 融合體及其衍生物和類似物組，與靶細(xì)胞受體結(jié)合能力均得到提高，且這種結(jié)合程度隨樣 品濃度的增加而增加。
權(quán)利要求
蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽融合體，其特征在于，蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽通過連接肽與癌細(xì)胞導(dǎo)向肽形成系列蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽融合體，融合體既具有蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽原有生物活性，同時(shí)也具有癌細(xì)胞導(dǎo)向肽的生物活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽融合體，其特征在于，分別通過蝎鎮(zhèn) 痛抗腫瘤纈精甘肽的N端或C端，通過連接肽與癌細(xì)胞導(dǎo)向肽形成系列蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精 甘肽融合體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽融合體，其特征在于，所述的癌細(xì)胞 導(dǎo)向肽包括Q冊(cè)SYGLRPG，QHWSYGffRPG, Q冊(cè)SYGFRPG，EPFRSPDLALETYG, PFCFWKTCT。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽融合體，其特征在于，所述的連接 肽包括SSHHHHHHSSGLVPRGSHM，GGGSGGGS, >SGGSGGSGGGSGGGSGGGGSGGGGS, GSGGGGSGGGGS, GGGGS，(G4S)2, (G4S)3, (G4S)4,和(G4S)go
5.蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽融合體的衍生物或類似物或活性片段，其特征在于，它包含 權(quán)利要求1-4任何一項(xiàng)所述的氨基酸序列全序或片段。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽融合體及其衍生物或類似物或活性 片段，可以利用基因工程技術(shù)進(jìn)行表達(dá)獲得，其特征在于，表達(dá)宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞或真核 細(xì)胞。
7.蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽融合體及其衍生物或類似物或活性片段在制備鎮(zhèn)痛藥物中 的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述的蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽融合體及 其衍生物或類似物或活性片段可以與藥學(xué)上可接受的載體混合制備臨床上可接受的注射 劑、口服制劑、透皮吸收制劑、粘膜吸收制劑。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽融合體及其衍生物或類似物或活性片段及其獲得方法，具體涉及借助一個(gè)簡(jiǎn)單的短肽接頭序列連接的，由作為蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽和作為癌細(xì)胞導(dǎo)向肽部分的促黃體生成素釋放激素或胰島素樣生長(zhǎng)因子II內(nèi)部部分片段或奧曲肽類似物或上述的類似物組成的嵌合蛋白，以上癌細(xì)胞導(dǎo)向肽分別融合于蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽的N端和C端。本發(fā)明利用DNA重組技術(shù)構(gòu)建了一系列不同接頭序列及癌細(xì)胞導(dǎo)向肽的蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽融合蛋白的載體，收獲嵌合蛋白后驗(yàn)證其具有體內(nèi)鎮(zhèn)痛活性和體外抗腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)活性的雙重功能，且能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)特定腫瘤細(xì)胞的靶向殺傷活性。
文檔編號(hào)C07K19/00GK101880327SQ20101010746
公開日2010年11月10日 申請(qǐng)日期2010年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月9日
發(fā)明者劉巖峰, 吳春福, 崔勇, 張景海, 毛英姿, 郭桂麗 申請(qǐng)人:沈陽(yáng)藥科大學(xué)