專利名稱：評估二肽基肽酶i活性的高通量測定法的制作方法
評估二肽基肽酶I活性的高通量測定法相關(guān)申請的交叉參考本申請要求2008年10月21日提交的美國臨時(shí)專利申請?zhí)?1/107，046的權(quán)益， 其內(nèi)容通過引用整體結(jié)合到本文中。發(fā)明背景 1.發(fā)明領(lǐng)域提供用于以高通量形式鑒定二肽基肽酶I的激動劑和拮抗劑的方法。該方法使用無標(biāo)記并與二肽基肽酶I多個底物結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的肽底物。2.相關(guān)技術(shù)的說明二肽基肽酶I(DPPI)或組織蛋白酶C是溶酶體木瓜蛋白酶型半胱氨酸蛋白酶家族的成員，該家族還包括組織蛋白酶B、K、H、L、0和S(Bouma and Gruber，1996，Biochem. Biophys. Acta 113:350-358 ；Turk et al,2000,Biochem. Biophys. Acta 1477 :98-111)。這種蛋白酶家族激活免疫和炎癥細(xì)胞中的絲氨酸蛋白酶。DPPI的生理學(xué)作用是通過脫除免疫和炎癥細(xì)胞中酶原N-端的兩個氨基酸作為二肽單元將無活性酶原轉(zhuǎn)化為活性酶(Caughey，G. H.評述，2002，MolecularImmunology 38 :1353-1357 ；Wolters et al. ,2001, J.Biol. Chem. 276 :18551-18556 ；McGuire et al. ，1993, J. Biol. Chem. 268 :2458-2467 ；Pham and Ley,1999, Proc. Natl. Acad. Sci. 96 8627-8632 ；Pham et al.，2004，J. Immunol. 173 :7277-7281)。DPPI 激活許多絲氨酸蛋白酶包括糜蛋白酶、類胰蛋白酶、組織蛋白酶G、彈性蛋白酶和中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶、來自 T淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的粒酶A和B;和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎蛋白酶(Adkison et al., 2002，J.Clin. Invest. 109 :363-371)。由DPPI激活的酶或絲氨酸蛋白酶為防御反應(yīng)所需。此外，已顯示未調(diào)節(jié)的DPPI導(dǎo)致與蛋白酶過度活化有關(guān)的疾病包括慢性阻塞性肺病、 Papillon-Lefevre綜合征、膿毒癥、關(guān)節(jié)炎及其它炎性疾病。因此，DPPI是用于治療性治療的潛在靶。據(jù)提議DPPI由四種相同的單體組成。各單體由前體多肽產(chǎn)生，其裂解為N-端排阻區(qū)、激活肽和木瓜蛋白酶樣區(qū)。木瓜蛋白酶樣區(qū)進(jìn)一步裂解為重鏈和輕鏈。接著，N-端排阻區(qū)、重鏈和輕鏈折疊成單體，其四體化成約200kDa的成熟DPPI (Turk et al, 2001EMB0 J. ,20 :6570-6582)。DPPI的最新結(jié)晶確認(rèn)一些結(jié)構(gòu)，包括活性位點(diǎn)裂口和底物結(jié)合位點(diǎn)，涉及二肽基蛋白水解活性。底物結(jié)合位點(diǎn)位于木瓜蛋白酶樣結(jié)構(gòu)的外部，與底物形成氫鍵。在底物斷裂鍵N-端側(cè)與第一氨基酸結(jié)合的位點(diǎn)稱為S1結(jié)合位點(diǎn)，在N-端側(cè)與第二氨基酸結(jié)合的位點(diǎn)稱為&結(jié)合位點(diǎn)。而且，在底物斷裂鍵C-端側(cè)與第一氨基酸結(jié)合的位點(diǎn)稱為S1'結(jié)合位點(diǎn)，在C-端側(cè)與第二氨基酸結(jié)合的位點(diǎn)稱為S2'結(jié)合位點(diǎn)等(Turk et al. ,2001,EMBO J.， 20 :6570-6582 ；Molgaard et al.，2007，Biochem. J.，401 :645-650)。在 DPPI 底物中的相應(yīng)位點(diǎn)稱為P1U'、p2‘等，其中底物的P1與DPPI的S1位點(diǎn)結(jié)合，底物的P2與DPPI的 S2結(jié)合，底物的P/與DPPI的S1'位點(diǎn)結(jié)合等。根據(jù)DPPI與6種氨基酸底物的結(jié)合復(fù)合物的結(jié)晶學(xué)結(jié)果，Molgaard et al.提出其中DPPI包含S2-S1和S1' -S4'底物結(jié)合位點(diǎn)的模型。因?yàn)镈PPI在體內(nèi)與較大的底物例如2 個氨基酸的人前類糜蛋白酶(prochymase) 結(jié)合；DPPI的底物結(jié)合位點(diǎn)可包含超過S-S1-S/ -S4'，甚至至S-S1-S1' -S18'因?yàn)镈PPI是潛在的治療靶，通常已使用幾種測定法分析DPPI活性(Gelman et al.，J. Clin. Invest. 1980,65 :1398-1406 ； (Tran et al.，Arch. Biochem. Biophys. 2002， 403:160-170)。Gelman et al.使用Gly-Phe-β -萘基酰胺的標(biāo)記二肽作為底物，通過用熒光分光光度計(jì)測量游離萘基酰胺的濃度確定DPPI活性。同樣，Tran et al.使用幾種用7-氨基-4-甲基香豆素標(biāo)記的二肽作為DPPI底物，通過用熒光分光光度計(jì)測量游離甲基香豆素的濃度確定DPPI活性。Tran et al.顯示Ala-Hph-7-氨基-4-甲基香豆素的二肽底物是DPPI的最佳底物，即使底物包含非生理學(xué)殘基Hph (同型苯丙氨酸)。這些具有熒光標(biāo)記的常用二肽底物有幾個問題。首先，二肽底物只與S1和&位點(diǎn)結(jié)合。同與除了 S1*^位點(diǎn)之外的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的體內(nèi)生物學(xué)底物相比，這是部分或不完全的。不完全或部分結(jié)合可能非特異性，從而導(dǎo)致鑒定假陽性或陰性化合物。而且，需要附加熒光檢測步驟檢測DPPI活性。這種附加步驟使該測定法難以適合用于高通量形式。因此，仍然需要發(fā)展使用無標(biāo)記和生物學(xué)相關(guān)底物的測定法用于分析DPPI活性。 而且，有需要發(fā)展適合用于高通量形式的DPPI測定法以能夠有效篩選大量化合物或試劑用于藥物開發(fā)。已將無標(biāo)記技術(shù)與質(zhì)譜系統(tǒng)聯(lián)合以分析酶促反應(yīng)。Quercia et al. (J. Biomol. Screen. 12 :473-480，2007)在多反應(yīng)監(jiān)測中用質(zhì)譜鑒定激酶ΑΚΤΙ/ΡΚΒα抑制劑。同樣， Forbes et al. (J. Biomol. Screen. 11 =628-634,2007)在多反應(yīng)監(jiān)測中用質(zhì)譜在 96 孔板中評估磷脂?；z氨酸脫羧酶。高通量形式的質(zhì)譜檢測系統(tǒng)尚未用于分析DPPI活性。本申請?zhí)峁y定DPPI活性的方法。該方法利用包含生物學(xué)相關(guān)氨基酸序列和結(jié)合特異性的無標(biāo)記肽底物。該測定法可用質(zhì)譜系統(tǒng)檢測，可以高通量形式操作，減少加工時(shí)間和增加篩選化合物所需的通量。該方法還可用于片段基化合物的差異追蹤用于藥物開發(fā)，評估其它二肽基蛋白水解反應(yīng)用于功能研究。概述本申請的一個目的是提供篩選調(diào)節(jié)DPPI活性的化合物的方法。該方法包括以下步驟將DPPI的底物加入含有DPPI和化合物的反應(yīng)混合物內(nèi)，其中底物具有3-100個氨基酸，與除了 S1^2位點(diǎn)之外的DPPI結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，測量底物分子量的變化和/或底物與產(chǎn)物質(zhì)量比的變化，其中底物分子量或質(zhì)量比的變化提示DPPI活性的存在。根據(jù)本發(fā)明一個實(shí)施方案，化合物可以是2_(哌啶-1-基羰基)苯酚或2_(哌啶-1-基羰基)苯胺。另一個目的是提供可用于篩選調(diào)節(jié)DPPI活性的化合物的無標(biāo)記DPPI底物。例示性DPPI底物可選自SEQ ID N0s:l-7。DPPI底物可優(yōu)選包含具有20個氨基酸的肽。DPPI 底物優(yōu)選無標(biāo)記。根據(jù)以下詳細(xì)描述，并結(jié)合附圖考慮，本發(fā)明的其它目的和特征將變得顯而易見。 但是，應(yīng)理解設(shè)計(jì)附圖只用于示例性目的，并非限制本發(fā)明的定義，本發(fā)明的定義應(yīng)參考所附的權(quán)利要求。還應(yīng)理解附圖不一定按比例繪制，除非另外說明，它們只用于在概念上舉例說明本文描述的結(jié)構(gòu)和方法。附圖簡述
在圖中

圖1.在與20-mer底物㈧和二肽底物⑶的反應(yīng)中對DPPI動力學(xué)常數(shù)的初始速度分析。(A)約2nM DPPI用于與GEIIGGTECKPHSRPYMAYL的20_mer底物反應(yīng)，用質(zhì)譜系統(tǒng)監(jiān)測反應(yīng)。(B)約0. 4nM DPPI用于與GR- α -甲基香豆素的二肽底物反應(yīng)，在= 460nm 和& = 380nm用速率基形式監(jiān)測熒光監(jiān)測反應(yīng)。當(dāng)達(dá)到小于7%的底物轉(zhuǎn)換時(shí)從動力學(xué)數(shù)據(jù)中采集初始速率。圖2.用二肽底物㈧和用20-mer肽底物⑶評估兩種測試化合物的DPPI調(diào)節(jié)活性。(A)約0.4nM DPPI和約ΙΟμΜ 二肽底物GR-α-甲基香豆素用于速率基形式， 在仏=460nm和& = 380nm用熒光監(jiān)測。(B)約^M DPPI和20 μ M 20-mer肽底物 GEIIGGTECKPHSRPYMAYL用于反應(yīng)，用質(zhì)譜系統(tǒng)監(jiān)測。將2_(哌啶-1-基羰基)苯酚用實(shí)心方形表示，2-(哌啶-1-基羰基)苯胺用實(shí)心圓形表示。R2-值彡0.95。本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述為了檢測在DPPI激動劑或拮抗劑的存在下二肽基肽酶I(DPPI)的活性，將用作 DPPI底物的肽加入反應(yīng)混合物內(nèi)，以便反應(yīng)混合物包含反應(yīng)緩沖液、DPPI的激動劑或拮抗劑、DPPI和底物。PIPES、HEPES、磷酸鈉緩沖液系統(tǒng)或其中pKa為約7. 0的任何緩沖系統(tǒng)都可用于DPPI測定。優(yōu)選HEPES緩沖液系統(tǒng)。例如，IOX反應(yīng)緩沖液是pH 7. 0的500mM HEPES, IM NaCl，和0. 05% Tween-20。也可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員通常已知的其它緩沖液系統(tǒng)。在反應(yīng)之前，將DTT或谷胱甘肽加入IX反應(yīng)緩沖液中至終濃度為2mM。DPPI可市售獲得，通過重組DNA技術(shù)制備，或者通過本領(lǐng)域技術(shù)人員通常已知的方法從細(xì)胞分離或純化。與超過DPPI S1-S2底物結(jié)合位點(diǎn)的位點(diǎn)結(jié)合的至少3個氨基酸、優(yōu)選5_100個氨基酸、最優(yōu)選10-50個氨基酸的任何肽可作為底物用于檢測DPPI的蛋白水解活性。肽底物的底物結(jié)合位點(diǎn)數(shù)可以是3-100，優(yōu)選5-50，最優(yōu)選6-20。因此，肽底物在S1-S2底物結(jié)合位點(diǎn)和S1' -S98'、優(yōu)選S/ -S48'、最優(yōu)選S/ -S4'的至少一個附加底物結(jié)合位點(diǎn)與DPPI
纟口口。本申請的肽底物不用任何熒光劑或顯色劑標(biāo)記或修飾。肽底物可以化學(xué)合成，用重組DNA技術(shù)表達(dá)，或者通過本領(lǐng)域技術(shù)人員通常已知的方法從細(xì)胞分離或純化。用于本文時(shí)，術(shù)語多肽指通過肽鍵或修飾的肽鍵即肽等排體相互連接的三個或更多個氨基酸。多肽指短鏈，通常稱為肽、低聚肽或低聚物，和長鏈，通常稱為蛋白質(zhì)。多肽可包含不同于20種天然存在的氨基酸的氨基酸。多肽包括通過天然過程如翻譯后加工，或者通過本領(lǐng)域熟知的化學(xué)修飾技術(shù)修飾的氨基酸序列。此類修飾充分的描述于研究文獻(xiàn)中。 修飾可發(fā)生在多肽中的任何地方，包括肽主鏈、氨基酸側(cè)鏈和氨基或羧基端。將5-50 μ 1、優(yōu)選10或20 μ 1反應(yīng)體積等份分入常用于實(shí)驗(yàn)室的試管或板內(nèi)，通過測量底物轉(zhuǎn)換測定DPPI活性。用于本文時(shí)，底物轉(zhuǎn)換指底物量的減小和隨后產(chǎn)物量的增加。可通過監(jiān)測底物和產(chǎn)物的分子質(zhì)量測量底物轉(zhuǎn)換。優(yōu)選質(zhì)譜系統(tǒng)。例如，可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的具備Agilent Chemstation軟件等的Agilent MSD通過單離子監(jiān)測(SIM)技術(shù)確定底物和產(chǎn)物的濃度。用 Agilent Chemstation 禾口 BioTrove Rapidfire Integrator 分析數(shù)據(jù)。將測定法設(shè)計(jì)為默認(rèn)小于10%的底物轉(zhuǎn)換用于化合物測試。通用酶促反應(yīng)的平衡如下所示
權(quán)利要求
1.一種篩選調(diào)節(jié)二肽基肽酶I (DPPI)活性的化合物的方法，所述方法包括以下步驟a.將DPPI的底物加入包含DPPI和所述化合物的反應(yīng)混合物內(nèi)，其中所述DPPI底物包含至少3個氨基酸并與除了 S1^2位點(diǎn)之外的DPPI結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合；和b.測量所述底物和產(chǎn)物的分子量和/或質(zhì)量比的變化， 其中所述底物的分子量下降提示所述DPPI活性的存在。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述底物無標(biāo)記。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述底物具有3-100個氨基酸。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述底物具有約10-約50個氨基酸。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述底物選自SEQID NOs :1_7。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述底物是SEQID NO :1。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述化合物是2-(哌啶-1-基羰基)苯酚。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述化合物是2-(哌啶-1-基羰基)苯胺。
9.一種DPPI底物，所述底物選自SEQ ID NOs :1_7。
10.SEQ ID NO 1 的 DPPI 底物。
全文摘要
一種篩選調(diào)節(jié)二肽基肽酶I(DPPI)活性的化合物的方法，包括以下步驟將DPPI的肽底物加入含有DPPI和化合物的反應(yīng)混合物內(nèi)，其中DPPI的肽底物具有至少3個氨基酸，與除了S1-S2位點(diǎn)之外的DPPI結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合；測量底物的分子量，其中底物分子量的變化提示DPPI活性的存在。
文檔編號C07K7/06GK102216469SQ200980142454
公開日2011年10月12日 申請日期2009年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月21日
發(fā)明者M·奧爾森, M·托德 申請人:強(qiáng)生醫(yī)藥研究及開發(fā)有限責(zé)任公司