專利名稱：用于治療豚草變態(tài)反應(yīng)的包含Amb a 1肽的疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于預(yù)防或治療對(duì)豚草的變態(tài)反應(yīng)的組合物。
背景技術(shù)：
T細(xì)胞抗原識(shí)別需要抗原呈遞細(xì)胞(APC)在其細(xì)胞表面上呈遞與主要組織相容性復(fù)合物(MHC)的分子締合的抗原片段(肽)。T細(xì)胞使用其抗原特異性T細(xì)胞受體(TCR) 來識(shí)別由APC呈遞的抗原片段。這樣的識(shí)別作為免疫系統(tǒng)的觸發(fā)器起作用來產(chǎn)生一系列應(yīng)答以根除已被識(shí)別的抗原。生物體如人類的免疫系統(tǒng)對(duì)外部抗原的識(shí)別可在某些情況下造成疾病，其被稱作特應(yīng)性疾患。后者的實(shí)例是變應(yīng)性疾病，包括哮喘、特應(yīng)性皮炎和變應(yīng)性鼻炎。在這一組疾病中，B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生對(duì)外源產(chǎn)生的抗原結(jié)合的IgE類抗體(在人類中)，所述抗原在本文稱為變應(yīng)原，因?yàn)檫@些分子引發(fā)變應(yīng)性應(yīng)答。變應(yīng)原特異性IgE的產(chǎn)生依賴于也被變應(yīng)原活化(并對(duì)其有特異性)的T淋巴細(xì)胞。借助于諸如嗜堿性細(xì)胞和肥大細(xì)胞的細(xì)胞對(duì)IgE 表面受體的表達(dá)，變應(yīng)原特異性的IgE抗體結(jié)合到這些細(xì)胞表面。變應(yīng)原對(duì)結(jié)合在表面的IgE分子的交聯(lián)造成這些效應(yīng)細(xì)胞脫粒，導(dǎo)致炎癥介質(zhì)諸如組胺、5-羥色胺和脂質(zhì)介質(zhì)如硫橋白三烯(sulphidoleukotriene)的釋放。除了 IgE依賴性事件，某些變應(yīng)性疾病諸如哮喘的特征為IgE獨(dú)立性事件。目前用提供癥狀緩解或預(yù)防的劑來治療IgE介導(dǎo)的變應(yīng)性疾病。這種劑的實(shí)例是抗組胺劑、β 2激動(dòng)劑和糖皮質(zhì)類固醇。此外，通過包括變應(yīng)原成分或提取物的定期注射的去敏化程序來治療一些IgE介導(dǎo)的疾病。去敏化治療可誘導(dǎo)與IgE競爭變應(yīng)原的IgG應(yīng)答， 或可誘導(dǎo)阻斷針對(duì)變應(yīng)原的IgE的合成的特定抑制性T細(xì)胞。這種形式的治療不是總有效， 并且具有激起嚴(yán)重副作用特別是一般變應(yīng)性休克的風(fēng)險(xiǎn)。這可以是致命的，除非立即意識(shí)到并用腎上腺素治療。將減少或消除針對(duì)特定變應(yīng)原的不想要的變應(yīng)性-免疫應(yīng)答的、而不改變對(duì)其它外來抗原的免疫反應(yīng)性的、或不觸發(fā)本身變應(yīng)性應(yīng)答的治療性處理將對(duì)變應(yīng)性個(gè)體大有益處。普遍認(rèn)為，豚草變應(yīng)原是包括哮喘、變應(yīng)性鼻炎和變應(yīng)性皮炎在內(nèi)的人類和動(dòng)物變應(yīng)性疾病的主要原因。豚草花粉中存在的蛋白尤其重要。例如，美國大約75%的枯草熱患者對(duì)豚草花粉是變應(yīng)性的。枯草熱是一種形式的季節(jié)性變態(tài)反應(yīng)的統(tǒng)稱，其特征是噴嚏、 流鼻涕和目癢。術(shù)語“枯草熱”出現(xiàn)是因?yàn)檫@種形式的變應(yīng)性疾病在“采干草季節(jié)”期間最流行，這對(duì)應(yīng)許多植物的開花季節(jié)，此時(shí)其釋放最大量的花粉。這從夏末到早秋尤其流行， 尤其是從六月末到九月末(在北半球)。
已計(jì)算獲得，對(duì)于美國成年人，枯草熱是第5種主要的慢性病，是缺勤的主要原因，導(dǎo)致每年失去或減少近400萬個(gè)工作日，造成總生產(chǎn)力損失方面共超過7億美元的損失。變態(tài)反應(yīng)還是最頻繁報(bào)告的兒童慢性疾患，限制了多于40%兒童的活動(dòng)。每年在美國， 變態(tài)反應(yīng)占多于1700萬門診辦公室拜訪；季節(jié)性變態(tài)反應(yīng)諸如枯草熱占這些變態(tài)反應(yīng)拜訪的多于一半。因此，治療性或預(yù)防性治療對(duì)于患有豚草變態(tài)反應(yīng)或處于患豚草變態(tài)反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)中的人們將大有益處。發(fā)明概述豚草變態(tài)反應(yīng)通常是由豚草(Ambrosia artemisiifolia)造成的。豚草花粉中的主要變應(yīng)原是Amb a 1。這種蛋白以大量不同同種型存在，Amb a 1. 1、1. 2、1. 3和1. 4。本發(fā)明的發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，來源于Amb a 1蛋白的肽片段的某些組合對(duì)于使個(gè)體對(duì)這些變應(yīng)原去敏化特別有用。選擇本發(fā)明的多肽組合是由于它們的如下能力結(jié)合許多MHC II類分子、高度可溶、不觸發(fā)來自從一組豚草變應(yīng)性個(gè)體提取的嗜堿性細(xì)胞的組胺釋放、和在一組豚草變應(yīng)性個(gè)體的高比例受治療者中誘導(dǎo)細(xì)胞因子應(yīng)答。因此，可向個(gè)體提供本發(fā)明的組合物、產(chǎn)物、載體和制劑以通過免疫耐受作用預(yù)防或治療對(duì)豚草的變態(tài)反應(yīng)。通過計(jì)算機(jī)模擬方法選擇本發(fā)明的肽為可能的T細(xì)胞表位。當(dāng)鑒定包含表位的區(qū)域時(shí)，進(jìn)一步分析它們來確定其中哪些在四種不同Ambal同種型之間是高度保守的。然后進(jìn)一步篩選這些候選多肽在免疫耐受中的潛在用途。更具體地，分析其溶解度特征、和誘導(dǎo)細(xì)胞因子從來源于豚草變應(yīng)性個(gè)體的PBMC的釋放能力。在一些情形，改造肽序列以改進(jìn)溶解度和/或減少二聚體形成。與基于肽免疫的去敏化方法相關(guān)的困難在于如何選擇變應(yīng)原的合適的大小和區(qū)域作為用于免疫的肽的基礎(chǔ)。所選擇的肽的大小是關(guān)鍵的。如果肽太小，疫苗將不能有效引起免疫應(yīng)答。如果肽太大，或如果將完整抗原引入個(gè)體，則存在引起副作用諸如過敏反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，這可能是致命的。如果肽可溶性差，這種風(fēng)險(xiǎn)可能更大。已經(jīng)選擇本發(fā)明的多肽以保持T細(xì)胞特異性，同時(shí)所述多肽的尺寸足夠小以不具備將使其保留完整分子的IgE結(jié)合表位的構(gòu)象的顯著三級(jí)結(jié)構(gòu)。因此，本發(fā)明的多肽不引起細(xì)胞諸如肥大細(xì)胞和嗜堿性細(xì)胞上相鄰的特異性IgE分子的顯著交聯(lián)，并已顯示不導(dǎo)致來自人類嗜堿性細(xì)胞的顯著組胺釋放。本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)是肽廣泛地靶向主要組織相容性復(fù)合物(MHC)分子的能力。T細(xì)胞受體(TCR)在其特異性方面是高度可變的。如同抗體分子一樣，經(jīng)由細(xì)胞中的基因重組事件產(chǎn)生變異性。TCR識(shí)別結(jié)合到由主要組織相容性復(fù)合物(MHC)的基因所編碼的分子的短肽形式的抗原。這些基因產(chǎn)物是產(chǎn)生用于移植中的“組織型”的相同分子，并且還被稱為人類白細(xì)胞抗原分子(HLA)，該術(shù)語可被互換地使用。單獨(dú)的MHC分子具備肽結(jié)合溝，由于它們的形狀和電荷，其只能夠結(jié)合有限的一組肽。被一個(gè)MHC分子結(jié)合的肽可能不一定被其它MHC分子結(jié)合。當(dāng)?shù)鞍追肿又T如抗原或變應(yīng)原被抗原呈遞細(xì)胞諸如B淋巴細(xì)胞、樹突細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞吸收時(shí)，該分子在細(xì)胞中被酶促降解。降解過程產(chǎn)生所述分子的肽片段，如果它們具有合適的大小、電荷和形狀，則可能結(jié)合到某些MHC分子的肽結(jié)合溝之內(nèi)，并隨后展示在抗原呈遞細(xì)胞表面上。如果肽/MHC復(fù)合物以足夠數(shù)量呈遞在抗原呈遞細(xì)胞表面上，則它們可能活化帶有合適的肽/MHC特異性T細(xì)胞受體的T細(xì)胞。由于MHC的多態(tài)性質(zhì)，遠(yuǎn)系繁殖群體諸如人類中的個(gè)體將在其細(xì)胞表面上表達(dá)不同組合的MHC分子。由于不同MHC分子可基于肽的大小、電荷和形狀而結(jié)合來自同一分子的不同肽，不同個(gè)體將展示與其MHC分子結(jié)合的不同庫的肽。鑒定遠(yuǎn)系繁殖群體諸如人類中的通用MHC-結(jié)合肽表位比在近親繁殖的動(dòng)物(諸如實(shí)驗(yàn)小鼠的某些品系)中更困難。基于個(gè)體之間MHC的差異表達(dá)以及其帶來的肽結(jié)合與呈遞的固有差異，不太可能鑒定可用于人類去敏化治療的單種肽。本發(fā)明的另一益處是基于在豚草變應(yīng)性個(gè)體新鮮分離的PBMC中觀察的應(yīng)答來選擇肽和肽組合。不同于其中為了檢驗(yàn)T細(xì)胞應(yīng)答而從變應(yīng)性患者建立克隆細(xì)胞系的人造情況，評(píng)價(jià)新鮮分離的PBMC的先體外后體內(nèi)應(yīng)答允許代表性地觀察不同肽的相對(duì)群體重要性而沒有培養(yǎng)過程引起的可能的變形。然而，本發(fā)明的肽組合通過靶向多種不同MHC分子而提供對(duì)人類群體覆蓋面廣泛的效力。這種廣泛的覆蓋面由本發(fā)明的肽組合在群體的許多個(gè)體中導(dǎo)致陽性細(xì)胞因子應(yīng)答的能力來闡釋。因此，以本發(fā)明的肽配制的疫苗將具有廣泛的應(yīng)用。本發(fā)明人的工作產(chǎn)生了具有以下特征的肽組合-該組合在來自一組豚草變應(yīng)性個(gè)體的高比例受治療者中誘導(dǎo)細(xì)胞因子應(yīng)答；-組合中的肽是可溶的；-組合中的肽在一組豚草變應(yīng)性個(gè)體中不引起顯著的組胺釋放。因此，本發(fā)明提供用于通過免疫耐受作用預(yù)防或治療對(duì)豚草的變態(tài)反應(yīng)的組合物，所述組合物包括選自SEQ ID NO 1至31的至少一種多肽。通常，該組合物包括至少四種多肽，其中所述多肽獨(dú)立地選自以下任一種(i)SEQ ID NO 1 至 31 的多肽；或(ii)根據(jù)⑴的多肽的變體，其中所述變體是長度為9至30個(gè)氨基酸的多肽，所述多肽包含由以下組成的區(qū)域-⑴的任何序列；或-與(i)的任何序列具有至少65%同源性的序列，該序列能夠使得個(gè)體免疫耐受(i)的任何序列；或(iii)根據(jù)⑴的多肽的變體，其中所述變體是長度為9至30個(gè)氨基酸的多肽，所述多肽包含由表示以下任一個(gè)的序列組成的區(qū)域-(i)的任何序列的片段；或-(i)的任何序列的片段的同系物，該序列能夠使得個(gè)體免疫耐受(i)的任何序列并具有至少9個(gè)氨基酸的長度，而且其中所述同系物與(i)的任何序列中任何9個(gè)連續(xù)氨基酸具有至少65%的同源性。附圖簡述

圖1顯示由IL-13或IFN-Y的產(chǎn)生測(cè)量的對(duì)本發(fā)明的不同肽組合應(yīng)答的個(gè)體百分比。圖2顯示以本發(fā)明的不同肽刺激來自豚草變應(yīng)性個(gè)體的PBMC時(shí)IL-10的平均產(chǎn)生量(pg/ml)。圖3顯示以不同肽組合刺激來自豚草變應(yīng)性個(gè)體的PBMC時(shí)產(chǎn)生IL-10的水平(pg/ml) ο本文提及的序列的描述SEQ ID NO :1至31提供本發(fā)明的多肽序列。SEQ ID NO 32及其后提供另外的序列。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及可用于免疫耐受作用的肽和肽組合。這樣的肽可包括以下顯示的序列、由以下顯示的序列組成或基本上由以下顯示的序列組成SEQ ID NO 1至31的任一個(gè)。 還可使用這些特定肽的變體。所述變體可包括以下序列、由以下序列組成或基本上由以下序列組成所述序列是SEQ ID NO 1至31任一個(gè)的片段或SEQ ID NO 1至31任一個(gè)的同系物的片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于預(yù)防或治療對(duì)豚草的變態(tài)反應(yīng)的組合物。組合物通常包括至少四種、五種、六種、七種、八種、九種、十種、十一種或十二種、最多達(dá)十三種多肽，或由其組成。換言之，組合物包括四種至十三種多肽。多肽獨(dú)立地選自以下任一種(i)SEQ ID NO 1 至 31 的多肽；或(ii)根據(jù)⑴的多肽的變體，其中所述變體是長度為9至30個(gè)氨基酸的多肽，所述多肽包含由以下組成的區(qū)域-⑴的任何序列；或-與(i)的任何序列具有至少65%同源性的序列，該序列能夠使得個(gè)體免疫耐受 (i)的任何序列，或(iii)根據(jù)⑴的多肽的變體，其中所述變體是長度為9至30個(gè)氨基酸的多肽，所述多肽包含由表示以下任一個(gè)的序列組成的區(qū)域-(i)的任何序列的片段；或-(i)的任何序列的片段的同系物，該序列能夠使得個(gè)體免疫耐受(i)的任何序列并具有至少9個(gè)氨基酸的長度，而且其中所述同系物與(i)的任何序列中任何9個(gè)連續(xù)氨基酸具有至少65%的同源性。本發(fā)明還提供包括本發(fā)明的多肽的產(chǎn)物和制劑，以及組合物、產(chǎn)物和載體，所述組合物、產(chǎn)物和載體包括能夠表達(dá)用于通過免疫耐受作用預(yù)防或治療豚草變態(tài)反應(yīng)的本發(fā)明的多肽的多核苷酸。這種免疫耐受作用通常將是針對(duì)存在于SEQ ID NO 1至31任一個(gè)中的表位(例如II類MHC表位)。豚草物種豚草物種豚草(Ambrosia artemisiifolia) (common ragweed)和在較低程度上的三裂葉豚草(Ambrosia trifida) (giant ragweed)在全世界造成高比例的豚草變態(tài)反應(yīng)， 尤其是豚草花粉相伴的變態(tài)反應(yīng)，諸如枯草熱。豚草是北美土生的，但已擴(kuò)散到全世界的大多數(shù)大陸。在北半球，豚草從七月初至八月中開花，或直到更冷的天氣到來。豚草是一種先鋒植物，充分適應(yīng)于開拓新的受影響的土地。盡管在自然生境中它通常被與其它植物的競爭限制，但在人類清除了現(xiàn)有植被的地方，豚草很快變得廣泛和侵略性地建立。因此，豚草沿著鄉(xiāng)村路邊、柵欄線、荒地地帶、新挖掘地、耕地、花園、和疏于修剪的草坪極為豐富。如此，其充分適應(yīng)于寬范圍的氣候，能夠耐受寬的土壤PH范圍(從約4. 5至約8. 5)，還耐受高鹽度。豚草花粉變應(yīng)原的肽片段豚草花粉中的主要變應(yīng)原是Amb a 1。這種蛋白以大量不同同種型Amb a 1.1、 1. 2、1. 3和1. 4存在。這些同種型在實(shí)施例1中全部列出。本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)鑒定出Amb a 1中的區(qū)域，其包含結(jié)合MHC II類的T細(xì)胞表位，并在各同種型之間高度保守(參見實(shí)施例1的分析)?；谶@一信息，來源于Amb a 1相關(guān)區(qū)域的肽適于通過免疫耐受作用預(yù)防或治療對(duì)Amb a 1所有同種型的豚草變態(tài)反應(yīng)。術(shù)語“肽”和“多肽”在本文互換地使用。以上蛋白在本文還稱為“變應(yīng)原”。表3、4和6列出本發(fā)明的肽的序列，其中適當(dāng)?shù)刂赋隽嗣糠N肽所衍生自的親本蛋白。肽組合組合物通常包括本發(fā)明的至少三種、最多達(dá)十三種不同多肽的組合。因此，本發(fā)明的組合物可由三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種、十種、十一種、十二種或十三種肽組成。選擇本發(fā)明的組合物中的多肽組合以提供對(duì)人類群體盡可能廣泛的覆蓋面，即， 本發(fā)明的組合物將在高比例的豚草變應(yīng)性個(gè)體中，優(yōu)選地一組或一群這樣的個(gè)體中多于 30 %、40 %、45 %、50 %、60 %或70 %的豚草變應(yīng)性個(gè)體中產(chǎn)生免疫應(yīng)答。豚草變應(yīng)性個(gè)體的群體中的個(gè)體數(shù)目可以是任何適當(dāng)?shù)臄?shù)目，通常為至少20、30、40、50、60、70、80或至少100 個(gè)個(gè)體。優(yōu)選地該群體具有在白種人群體中有代表性的頻率范圍內(nèi)的MHC等位基因頻率。 11個(gè)常見DRBl等位基因家族的參考群體等位基因頻率顯示在表1中(數(shù)據(jù)來自HLAFacts Book (HLA 事件簿)，Parham 和 Barber))。本發(fā)明的組合物通常包括-選自RGWOl、RGWOlA或RGWOlB的多肽的至少一種多肽，或其變體；禾口-選自RGW03、RGW03A或RGWOiBB的多肽的至少一種多肽，或其變體；和-選自RGW04或RGW04A的多肽的至少一種多肽，或其變體。任選地，組合物可另外包括選自RGW02、RGW09、RGW06 或 RGW06A、RGfflO, RGW10A、 RGW05或RGW05A的任何多肽的至少一種另外的多肽，或其變體。任選地，組合物可另外包括選自RGW07、RGW07C、RGW07D的任何多肽的至少一種另外的多肽，或其變體。所述至少一種另外的多肽優(yōu)選地是RGW07D的多肽，或其變體。更具體地，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明因此提供包括三種至十三種多肽的組合物， 該多肽由以下組成a) RGffOURGffOlA或RGWOlB的多肽的至少一種，或其變體，優(yōu)選地RGWOl ；和b) RGW03、RGW03A或RGWOiBB的多肽的至少一種，或其變體，優(yōu)選地RGWOiBB ；和c) RGW04或RGW04A的任何多肽的至少一種，或其變體，優(yōu)選地RGW04A ；和任選地d) RGW02、RGW09、RGW06、RGW06A、RGfflO, RGW10A、RGW05 或 RGW05A 的任何多Jft 的至少一種，優(yōu)選兩種，最優(yōu)選三種，或其變體，優(yōu)選地RGW02和/或RGW06A和/或RGW05 ；和任選地e) RGW07、RGW07C、RGW07D的任何多肽的至少一種，或其變體，優(yōu)選地RGW07D。換言之，本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施方案提供用于通過免疫耐受作用來預(yù)防或治療豚草變態(tài)反應(yīng)的包括三種至十三種肽序列的組合物，其中該組合物由以下組成a)至少一種具有以下序列的多肽RGffOl GMIKSNDGPPI ；RGffOlA GLIKSHDGPPV ；RGffOlB GLIKSNDGPAA ；或其變體，和；b)至少一種具有以下序列的多肽RGW03 KDLLENGAIFVTSG ；RGW03A DVFENGAIFVPSG ；RGW03B RDLLENGAIFLPSG ；或其變體，和；c)至少一種具有以下序列的多肽RGW04 KAGMIPAEPGEA ；RGW4A SAGMIPAEPGEA ；或其變體，和任選地；d)至少一種具有以下序列的多肽RGW02 GSSQIWIDHSSLSKS ；RGW04 KAGMIPAEPGEA ；RGW4A SAGMIPAEPGEA ；RGW06 VVNSDKTIDGRGVKVE ；RGW06A AINNDKTIDGRGAKVE ；RGW09 ETRRSLKTSGAYN ；RGfflO FGFFQVVNNNYD ；RGfflOA HGFFQVVNNNYD ；RGW05 KEGTLRFAAAQNRP ；RGW05A KEGTLRFGAAQNRP ；或其變體，和任選地；e)至少一種具有以下序列的多肽RGW07 GEAAIKLTSSAGVLS ；RGW07C KGEAAIKLTSSAGVLSK ；RGW07D KGEAAIKLTSSAGVLSKK ；或其變體。將理解的是，以上的(a)到(e)代表用于鑒定本發(fā)明的合適組合的嚴(yán)格性和高度選擇性標(biāo)準(zhǔn)。例如，如果想要從本發(fā)明序列隨機(jī)地選擇六種肽，將有將近100萬個(gè)可能組合可以選擇。相比之下，考慮在其中應(yīng)用上述標(biāo)準(zhǔn)的六種多肽的組合的一種實(shí)例是有用的。例如，考慮一種組合，其中選擇以下多肽i) RGffOU RGffOlA 或 RGWOlB 的多肽的任何一種，和 RGW03、RGW03A 或 RGW03B 的多肽的任何一種，和RGW04與RGW04A的多肽的任何一種；和ii)選自 RGW02、RGW09、RGW06、RGW06A、RGWlO、RGW10A、RGW05 或 RGW05A 的任何多肽的三種另外多肽；以及最后基于這樣的選擇，可能的組合的數(shù)目占不應(yīng)用本發(fā)明人確定的標(biāo)準(zhǔn)的情況下總的可得組合的極小部分?；谏鲜?，本發(fā)明特別優(yōu)選的組合包括RGW01、RGW03B、RGW04A、RGW02、RGW05和 RGW06A的多肽或其變體，或者由其組成。進(jìn)一步的優(yōu)選組合包括RGWOl、RGW03B、RGW04A、RGW02、RGW05、RGW06A 和 RGW07D
的多肽，或者由其組成。取決于上述，組合物可任選地包括另外的多肽，最多總共十三種獨(dú)特多肽。這些另外的多肽與其它序列相關(guān)(即，通常是所述其他序列的同系物和/或片段)，其中所述其他序列即不在已經(jīng)選擇的多肽中的SEQ ID N0:1至31。另外的肽通常是SEQ ID NO 1至31 的肽之一的功能變體。另外的多肽可以與SEQ ID NO :1至31任一個(gè)相同。因此，組合物可包括多達(dá)十三種不同的、SEQ ID NO :1至31中任一個(gè)提供的多肽。然而，任選的另外的多肽不必與SEQ ID NO :1至31任一個(gè)100%相同。它們優(yōu)選地與未在此前選擇的多肽中選擇的SEQ ID NO :1至31任一個(gè)中至少9個(gè)(例如至少10、11、12或13)或更多個(gè)連續(xù)氨基酸至少65%相同。這些連續(xù)的氨基酸可包括例如結(jié)合于本文提及的任何MHC分子的II類 MHC表位。換言之，該組合物可任選地包括另外的多肽，最多總共十三種獨(dú)特多肽，其中所述另外的多肽(i)包括與在以上(a)至(e)中未被選擇的以上SEQ ID NO 1至31任一個(gè)中至少9個(gè)或更多個(gè)連續(xù)氨基酸具有至少65%的序列同一性的序列；并且(ii)長度是9至30個(gè)氨基酸。其中每種不同多肽是為了同時(shí)、分別或順序地用于通過免疫耐受作用預(yù)防或治療豚草變態(tài)反應(yīng)。因此更具體地，為了同時(shí)、分別或順序地用于通過免疫耐受作用預(yù)防或治療豚草變態(tài)反應(yīng)，本發(fā)明提供含有如以上(a)至(e)定義的三種至十三種多肽的產(chǎn)物；和任選地(f) 一種多肽:(i)所述多肽包含與在以上a)至d)中未被選擇的SEQ ID NO 1至31任一個(gè)中至少9個(gè)或更多個(gè)連續(xù)氨基酸具有至少65%序列同一性的序列；并且(ii)長度是9至30個(gè)氨基酸；和任選地(g)如f)中定義，但另外地在以上f)中未被選擇的多肽；和任選地(h)如f)中定義，但另外地在以上f)至g)中未被選擇的多肽；和任選地(i)如f)中定義，但另外地在以上f)至h)中未被選擇的多肽；和任選地(j)如f)中定義，但另外地在以上f)至i)中未被選擇的多肽；和任選地(k)如f)中定義，但另外地在以上f)至j)中未被選擇的多肽；和任選地(1)如f)中定義，但另外地在以上f)至k)中未被選擇的多肽；和任選地(m)如f)中定義，但另外地在以上f)至1)中未被選擇的多肽；和任選地(η)如f)中定義，但另外地在以上f)至m)中未被選擇的多肽；和任選地(ο)如f)中定義，但另外地在以上f)至η)中未被選擇的多肽；和任選地(ρ)如f)中定義，但另外地在以上f)至ο)中未被選擇的多肽。本發(fā)明的另一實(shí)施方案是用于通過免疫耐受作用預(yù)防或治療對(duì)豚草的變態(tài)反應(yīng)的、包括一種或多種多肽的組合物，其中所述多肽選自以下任一種(i)SEQ ID NO 1至31的任何多肽；或(ii)根據(jù)⑴的多肽的變體，其中所述變體是長度為9至30個(gè)氨基酸的多肽，所述多肽包含由以下組成的區(qū)域-⑴的任何序列；或-與(i)的任何序列具有至少65%同源性的序列，該序列能夠使得個(gè)體免疫耐受 (i)的任何序列，或(iii)根據(jù)⑴的多肽的變體，其中所述變體是長度為9至30個(gè)氨基酸的多肽，所述多肽包含由表示以下任一個(gè)的序列組成的區(qū)域-⑴的任何序列的片段；或-⑴的任何序列的片段的同系物，該序列能夠使得個(gè)體免疫耐受(i)的任何序列并具有至少9個(gè)氨基酸的長度，而且其中所述同系物與(i)的任何序列中任何9個(gè)連續(xù)氨基酸具有至少65%的同源性。本發(fā)明的組合物或產(chǎn)物可包括以上定義的任何序列的變體。所述變體通常包括 SEQ ID NO 1至31的相應(yīng)肽中存在的1、2、3或更多個(gè)II類MHC表位。本文提及了功能變體。這樣的變體可能能夠使個(gè)體免疫耐受SEQ ID N0:1至31 的相應(yīng)肽中存在的II類MHC表位，并因此通常將包括如下序列其結(jié)合到相同II類MHC分子和/或被識(shí)別SEQ ID NO :1至31的多肽中相應(yīng)的表位的T細(xì)胞所識(shí)別。SEQ ID NO 1至31的變體可以是由截短所衍生的片段。截短是指從SEQ ID NO. 1 至31的多肽的N和/或C-末端除去一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)、七個(gè)、八個(gè)、九個(gè)、 十個(gè)或更多個(gè)氨基酸。還可通過一個(gè)或多個(gè)內(nèi)部缺失來產(chǎn)生片段，條件是構(gòu)成T細(xì)胞表位的核心9個(gè)氨基酸基本未被破壞。例如，SEQ ID NO 1的變體可包括SEQ ID NO 1的片段，即較短的序列。這可包括從SEQ ID NO :1的N-末端或從SEQ ID NO 1的C-末端缺失一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、 六個(gè)、七個(gè)、八個(gè)、九個(gè)、十個(gè)或更多個(gè)氨基酸。這樣的缺失可從SEQ ID NO :1的兩端進(jìn)行。 SEQ ID NO 1的變體可包括延伸超出SEQ ID NO 1的末端的另外的氨基酸(例如來自衍生肽的親本蛋白的序列)。變體可包括以上討論的缺失和添加的組合。例如，可從SEQ ID NO 1的一端缺失氨基酸，但可在SEQ ID NO :1的另一端添加來自全長親本蛋白序列的另外的氨基酸。以上變體的相同討論還適用于SEQ ID N0:2至31。SEQ ID NO 20的優(yōu)選變體是肽 KKGEAAIKLTSSAGVLSK。變體肽可包括SEQ ID NO 1至31任一個(gè)或其片段的氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代。變體肽可包括與SEQ ID NO :1至31任一個(gè)中至少9個(gè)或更多個(gè)連續(xù)氨基酸具有至少65%序列同一性的序列。更優(yōu)選地，合適的變體可包括與SEQ ID NO :1至31任一個(gè)的至少9個(gè)連續(xù)氨基酸至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 % 或至少98%的氨基酸同一性。這一水平的氨基酸同一性可見于肽的任何區(qū)段，盡管它優(yōu)選地是核心區(qū)域。氨基酸同一性的水平是至少9個(gè)連續(xù)氨基酸的范圍內(nèi)，但它可以是至少10、 11、12、13、14、15或至少16或17個(gè)氨基酸，這取決于比較的肽的大小。因此，任何以上指明的同一性水平可跨越序列的完整長度。
關(guān)于氨基酸序列，“序列同一性”是指當(dāng)使用ClustalW(Thompson等人，Nucleic Acids Res. 1994 Nov 11 ；22 (22) :4673-80)用以下參數(shù)評(píng)價(jià)時(shí)具有指定值的序列成對(duì)的比對(duì)參數(shù)-方法準(zhǔn)確，矩陣PAM，缺口開放罰分10. 00，缺口延伸罰分0. 10 ；多比對(duì)參數(shù)-矩陣PAM，缺口開放罰分10. 00，延遲百分比同一性30，處罰末端缺口 開，缺口間距0，負(fù)矩陣不，缺口延伸罰分0. 20，殘基特異性缺口罰分開，親水缺口罰分開，親水殘基GPSNDQEKR。在特定殘基的序列同一性意在包括僅僅被衍生化的相同殘基。變體肽可包括SEQ ID NO :1至31任一個(gè)中的1、2、3、4、5或更多個(gè)或者多達(dá)10個(gè)氨基酸取代。取代變體優(yōu)選地包括用相同數(shù)目的氨基酸代替一個(gè)或多個(gè)氨基酸并進(jìn)行保守的氨基酸取代。例如，氨基酸可被具有相似特征的替代性氨基酸取代，例如，另一堿性氨基酸、另一酸性氨基酸、另一中性氨基酸、另一帶電荷氨基酸、另一親水氨基酸、另一疏水氨基酸、另一極性氨基酸、另一芳香族氨基酸或另一脂肪族氨基酸。可用于選擇合適的取代基的 20種主要氨基酸的一些特征如下
權(quán)利要求
1.一種用于通過免疫耐受作用預(yù)防或治療對(duì)豚草的變態(tài)反應(yīng)的組合物，該組合物包括(i)選自RGW03B、RGW03A或RGW03(SEQID NO. 9、8或7)的至少一種原始多肽或其變體；(ii)選自RGWO1、RGWOIA或RGWOlB(SEQ ID NO. 1、2或3)的至少一種原始多肽或其變體；iii)選自RGW04或RGW04A(SEQ ID No :10或11)的至少一種原始多肽或其變體；禾口 (iv)任選地，獨(dú)立地選自SEQ ID NO. 4-6和12-31的任一種的一種或多種原始多肽或其變體；其中所述變體是(a)長度為9至20個(gè)氨基酸的多肽，所述多肽包含由以下所組成的區(qū)域 -等效的原始肽序列；或-與等效的原始肽序列具有至少65%同源性的同源序列，所述序列能夠使得個(gè)體免疫耐受所述等效的原始肽序列，或(b)長度為9至20個(gè)氨基酸的多肽，所述多肽包含由表示以下任一個(gè)的序列所組成的區(qū)域-等效的原始肽序列的片段；或 -等效的原始肽序列的片段的同系物，所述序列能夠使得個(gè)體免疫耐受所述等效的原始肽序列并具有至少9個(gè)氨基酸的長度，而且其中所述同系物與所述等效的原始肽序列中任何9個(gè)連續(xù)氨基酸具有至少65%的同源性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組合物a)能夠使得一組豚草變應(yīng)性個(gè)體的群體中至少50%或至少60%免疫耐受；和/或b)包括至少一種另外的多肽，最多總共十三種獨(dú)特的/不同的多肽，其中所述另外的多肽-包含與以上SEQ ID NO :1至31中任一個(gè)的至少9個(gè)或更多個(gè)連續(xù)氨基酸具有至少 65%的序列同一性、在⑴至(iv)中未被選擇的序列；且 -長度是9至30個(gè)氨基酸；和/或c)包括最多達(dá)十三種多肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的組合物，所述組合物包括至少一種根據(jù)權(quán)利要求2(b)的多肽，所述多肽長度是9至20或13至17個(gè)氨基酸，和/或其中所述多肽與SEQ ID NO=I 至31中任一個(gè)的至少9個(gè)或更多個(gè)連續(xù)氨基酸具有至少70%的序列同一性。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的組合物，所述組合物包括多肽RGWOl或權(quán)利要求 1(a)或(b)定義的其變體；多肽RGWOiBB或權(quán)利要求1(a)或(b)定義的其變體；和多肽 RGW04A或權(quán)利要求1 (a)或(b)定義的其變體。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的組合物，所述組合物包括選自RGW02、RGW09、 RGW06、RGW06A、RGW10 或 RGW10A、RGW05 或 RGW05A 的多肽(SEQ ID NO. 4、26、14、15、27、12 或 13)、或權(quán)利要求1(a)或(b)定義的其變體的至少一種多肽；任選地還包括RGW07、RGW07C 或RGW07D的多肽(SEQ ID NO. 16、19或20)、或權(quán)利要求1 (a)或(b)定義的其變體。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的組合物，所述組合物包括RGWOl或權(quán)利要求1(a)或 (b)定義的其變體；RGWOiBB或權(quán)利要求1 (a)或(b)定義的其變體；RGW04A或權(quán)利要求1 (a) 或(b)定義的其變體；RGW02或權(quán)利要求1 (a)或(b)定義的其變體；RGW05或權(quán)利要求1 (a) 或(b)定義的其變體；RGW06A或權(quán)利要求1 (a)或(b)定義的其變體；和RGW07D或權(quán)利要求1(a)或(b)定義的其變體。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的組合物，其中(i)所述多肽中的一種或多種具有選自以下的一種或多種修飾(a)N末端乙酰化；(b)C末端酰胺化；(c)精氨酸和/或賴氨酸側(cè)鏈胺上的一個(gè)或多個(gè)氫被亞甲基代替；(d)糖基化；和(e)磷酸化；和/或( )所述肽的至少一種已被改造為可溶以使其包含(a)在T細(xì)胞表位側(cè)翼的所述肽的殘基的N末端一個(gè)至六個(gè)連續(xù)氨基酸，它們與衍生所述肽的蛋白序列中所述殘基的N末端緊接的兩個(gè)至六個(gè)連續(xù)氨基酸相對(duì)應(yīng)；和/或(b)在T細(xì)胞表位側(cè)翼的所述肽的殘基的C末端一個(gè)至六個(gè)連續(xù)氨基酸，它們與衍生所述肽的蛋白序列中所述殘基的C末端緊接的一個(gè)至六個(gè)連續(xù)氨基酸相對(duì)應(yīng)；或(c)在T細(xì)胞表位側(cè)翼的所述肽的殘基的N末端和/或C末端，選自精氨酸、賴氨酸、組氨酸、谷氨酸和天冬氨酸的至少一個(gè)氨基酸，其中所述多肽具有至少3. 5mg/ml的溶解度，而且所述T細(xì)胞表位具有少于3. 5mg/ml 的溶解度；和/或(iii)所述肽的至少一種已被改造為可溶以使另外地(a)所述肽的天然序列中的任何半胱氨酸殘基被絲氨酸或2-氨基丁酸代替；和/或(b)缺失了在所述肽的天然序列的N末端和/或C末端的最多三個(gè)氨基酸中、不包含在 T細(xì)胞表位中的任何疏水殘基；和/或(c)缺失了在所述肽的天然序列的N末端和/或C末端的最多四個(gè)氨基酸中包含序列 Asp-Gly的、不包含在T細(xì)胞表位中的任何兩個(gè)連續(xù)氨基酸；和/或(iv)每種多肽具有在0. 03nmol/ml 至 200nmol/ml、0. 3nmol/ml 至 200nmol/ml 或 30nmol/ml至120nmol/ml的范圍內(nèi)的濃度。
8.一種用于通過免疫耐受作用預(yù)防或治療對(duì)豚草的變態(tài)反應(yīng)的組合物，所述組合物包括至少三種多核苷酸序列，所述多核苷酸序列在被表達(dá)時(shí)導(dǎo)致權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)定義的組合物的產(chǎn)生，其中任選地，能夠表達(dá)不同多肽的每種多核苷酸序列存在于相同或不同的多核苷酸載體中。
9.一種用于通過免疫耐受作用預(yù)防或治療對(duì)豚草的變態(tài)反應(yīng)的載體，所述載體包括各自編碼權(quán)利要求1或2定義的不同多肽的三種到十三種不同的多核苷酸序列，其中至少一種多核苷酸編碼選自以下多肽組的每一組的多肽a)RGWOl、RGWOIA 或 RGWOlB (SEQ ID N0:l、2 或 3)或權(quán)利要求 1 (a)或(b)定義的其變體；b)RGW0;3B、RGW03A或 RGW03(SEQ ID N0:9、8 或 7)或權(quán)利要求 1 (a)或(b)定義的其變體；和c)RGW04或RGW04A(SEQ ID NO :10或11)或權(quán)利要求1 (a)或(b)定義的其變體。
10.一種包括三種到十三種多肽的產(chǎn)物，其中至少一種多肽選自以下多肽組的每一組a)RGWOl、RGWOIA或 RGWOlB(SEQ ID N0:l、2 或 3)或權(quán)利要求 1 (a)或(b)定義的其變體；b)RGW0;3B、RGW03A或 RGW03(SEQ ID N0:9、8 或 7)或權(quán)利要求 1 (a)或(b)定義的其變體；和c)RGW04或RGW04A(SEQ ID NO :10或11)或權(quán)利要求1 (a)或(b)定義的其變體；其中每種不同多肽是為了同時(shí)、分別或順序地用于通過免疫耐受作用預(yù)防或治療對(duì)豚草的變態(tài)反應(yīng)。
11.一種包括各自編碼權(quán)利要求1或2定義的不同多肽的三種到十三種多核苷酸序列的產(chǎn)物，其中至少一種多核苷酸編碼選自以下多肽組的每一組的多肽a)RGWOl、RGWOIA或 RGWOlB(SEQ ID N0:l、2 或 3)或權(quán)利要求 1 (a)或(b)定義的其變體；b)RGW0;3B、RGW03A或 RGW03(SEQ ID N0:9、8 或 7)或權(quán)利要求 1 (a)或(b)定義的其變體；和c)RGW04或RGW04A(SEQ ID NO :10或11)或權(quán)利要求1 (a)或(b)定義的其變體； 而且其中每種不同多肽是為了同時(shí)、分別或順序地用于預(yù)防或治療人類對(duì)豚草的變態(tài)反應(yīng)。
12.一種用于通過免疫耐受作用預(yù)防或治療對(duì)豚草的變態(tài)反應(yīng)的藥物制劑，所述藥物制劑包括根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)的組合物；根據(jù)權(quán)利要求9的載體；或根據(jù)權(quán)利要求 10或11的產(chǎn)物；和藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體或稀釋劑；其中任選地，所述組合物、載體或產(chǎn)物被配制為用于口服施用、鼻內(nèi)施用、表皮施用、皮下施用、舌下施用、皮內(nèi)施用、口腔施用或用于通過吸入或通過注射施用。
13.如權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)定義的組合物或如權(quán)利要求10或11定義的產(chǎn)物，所述組合物或產(chǎn)物另外地包括另外的多肽變應(yīng)原，用于使得個(gè)體免疫耐受所述另外的多肽變應(yīng)原。
14.一種確定T細(xì)胞是否識(shí)別權(quán)利要求1定義的組合物的體外方法，所述方法包括將所述T細(xì)胞與所述組合物接觸并檢測(cè)所述T細(xì)胞是否被所述組合物刺激。
15.一種確定個(gè)體是否患有疾患或處于疾患風(fēng)險(xiǎn)中的體外方法，其中所述疾患以應(yīng)答于豚草變應(yīng)原的變應(yīng)性癥狀為特征，所述方法包括測(cè)試個(gè)體是否具有對(duì)權(quán)利要求1至18任一項(xiàng)定義的組合物應(yīng)答的T細(xì)胞，從而確定所述個(gè)體是否患有疾患或處于疾患風(fēng)險(xiǎn)中；其中任選地，針對(duì)所述組合物的T細(xì)胞免疫應(yīng)答通過如下來測(cè)量在允許所述組合物與所述T細(xì)胞相互作用的條件下將所述組合物與從受治療者獲取的樣品中的T細(xì)胞接觸； 并確定是否有任何T細(xì)胞被刺激了，從而確定是否存在T細(xì)胞免疫應(yīng)答。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于通過免疫耐受作用預(yù)防或治療對(duì)豚草的變態(tài)反應(yīng)的組合物。所述組合物是基于來源于豚草花粉中主要變應(yīng)原Amb a 1的肽片段的組合。本發(fā)明還涉及可用于聯(lián)合提供本發(fā)明多肽的產(chǎn)物、載體和制劑。本發(fā)明還涉及確定T細(xì)胞是否識(shí)別本發(fā)明多肽的體外方法，和確定個(gè)體是否患有疾患或處于疾患風(fēng)險(xiǎn)中的體外方法，其中所述疾患以應(yīng)答于豚草變應(yīng)原的變應(yīng)性癥狀為特征。
文檔編號(hào)C07K7/08GK102170897SQ200980139316
公開日2011年8月31日 申請(qǐng)日期2009年8月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月15日
發(fā)明者保羅·萊德勒, 羅德里克·彼得·哈夫納, 馬克·拉爾什 申請(qǐng)人:切爾卡西亞有限公司