專(zhuān)利名稱(chēng)：對(duì)蝦中的胰島素樣基因和其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼淡水對(duì)蝦羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii (M. rosenbergii))的促雄性腺的胰島素樣因子的分離的核酸分子。本發(fā)明進(jìn)一步涉及在甲殼 綱十足目的生物體，特別是在羅氏沼蝦中沉默胰島素樣因子基因表達(dá)的方法，其可用于產(chǎn) 生單雄性群體。
背景技術(shù)：
性別分化和第二性征的發(fā)育是由進(jìn)化的不同機(jī)制控制的。在脊椎動(dòng)物和一些無(wú)脊 椎動(dòng)物群體中，這些過(guò)程處于性激素控制之下。考慮到最近證實(shí)昆蟲(chóng)很可能不具有性激素， 負(fù)責(zé)節(jié)肢動(dòng)物性成熟的物質(zhì)仍在討論中。進(jìn)化上接近昆蟲(chóng)的甲殼綱動(dòng)物具備負(fù)責(zé)雄性性別 分化的促雄性腺(AG)。通過(guò)在移除AG或移植AG之后觀(guān)察第一性征和第二性征，在多種甲殼綱物種中證 明了 AG在雄性性別分化中的作用。在片腳類(lèi)動(dòng)物跳蝦(Orchestia gamarella)中，切除 雙側(cè)AG減少了精子發(fā)生并阻礙雄性第二性征的發(fā)育。在小龍蝦克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)中，注射AG提取物使得外部雄性特征突出。在羅氏沼蝦中，切除和移植雙側(cè)AG分 別造成從雄性到新雌性(neo-female)和從雌性到新雄性(neo-male)的完全功能的性別逆 轉(zhuǎn)。在等足目動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)，第一種AG激素和其兩種緊密相關(guān)的直系同源物是激素胰 島素家族的成員，因?yàn)樗鼈兙邆鋷в斜Ｊ氐陌腚装彼釟埢羌艿腂鏈和A鏈，且B鏈和A鏈 被前激素中存在的C肽分隔，被裂解以產(chǎn)生成熟激素(Ohira等人，Zoolog. Sci. 20 =75-81, 2003)。肽的胰島素樣家族是各異和普遍的。許多多細(xì)胞生物體顯示為差異地表達(dá)多種不 同胰島素樣肽。在無(wú)脊椎動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的胰島素樣肽不限于葡萄糖代謝，在代謝、生長(zhǎng)和生 殖中具有作用。蠶家蠶(Bombyx mori)具有三種在其腦中表達(dá)并調(diào)節(jié)蛻化類(lèi)固醇水平的 胰島素樣促前胸腺激素(家蠶素I、II和HI) (Ebbernick等人，Biol. Bull. 177 =176-182, 1989)。淡水蝸牛靜水椎實(shí)螺(Lymnaea stagnalis)保留在其腦和消化系統(tǒng)中表達(dá)的七 種胰島素樣生長(zhǎng)因子，在殼和身體生長(zhǎng)以及能量代謝中起作用(Smit等人，Neurosci. 70 589-596，1996)。在線(xiàn)蟲(chóng)秀麗線(xiàn)蟲(chóng)(Caenorhabditis elegans)中，十種胰島素樣肽分為三個(gè) 不同家族。來(lái)自這些家族中的兩個(gè)家族的胰島素樣肽很可能包括另外的二硫鍵(Duret等 人.Genome Res. 8 :348_353，1998)，表明其是三種等足目動(dòng)物胰島素樣AG因子的情形。不 包括胰島素樣生長(zhǎng)因子的大多數(shù)胰島素樣基因編碼帶有信號(hào)肽和相鄰的B肽、C肽和A肽 的單獨(dú)的前-原-肽。通過(guò)由二硫鍵橋連接A肽和B肽，然后蛋白水解性裂解C肽，原-肽 被加工為活性形式(Riehle 等人，Peptides 27 =2547-2560,2006)。由于AG對(duì)甲殼綱十足目動(dòng)物的雄性第一性征和第二性征具有極大影響，認(rèn)為它 不僅是雄性性別分化調(diào)節(jié)器官，而且是負(fù)責(zé)維持雄性形態(tài)學(xué)特征的器官。羅氏沼蝦有三種 不同的成熟雄性形態(tài)型，其行為和生長(zhǎng)率不同。較大、主要的藍(lán)色螯(BC)雄性在交配前積 極地追求和保護(hù)雌性。橙色螯(OC)雄性在主要雄性存在時(shí)表現(xiàn)生殖活動(dòng)率的減少，小的雄性(SM)進(jìn)行悄悄交配的形式，這與其小的體型和較高移動(dòng)性一致。解剖學(xué)研究證明BC和 SM中高的生殖腺_身體指數(shù)，支持其與OC雄性相比更強(qiáng)烈的生殖行為，證明OC雄性較差 的生殖技能并在身體生長(zhǎng)上投入更多精力。在羅氏沼蝦中，從OC雄性移除AG導(dǎo)致與模擬 操作的OC雄性相比，消弱其向BC雄性形態(tài)型的轉(zhuǎn)化。SM的相同程序阻止解剖的個(gè)體在OC 雄性形態(tài)型。Sun 等人(Aquaculture Internation. 8 :329_334，1996)發(fā)現(xiàn)，AG 總多肽含量 在雄性形態(tài)型之間逐漸增加，最高多肽含量見(jiàn)于BC雄性。Sim進(jìn)一步假設(shè)，基于與見(jiàn)于等足 目中的AG激素的大小相似性，表觀(guān)分子量為 16和 ISkDa的兩種多肽可能是AG激素， 并報(bào)道這些多肽在性不活躍的OC形態(tài)型中不存在，在性活躍的雄性形態(tài)型中存在。Manor 等人(Gen. Comp. Endocrin. 150 :326_336，2007)報(bào)道在十足目紅螯的小龍 蝦紅螯螯蝦(Cherax quadricarinatus)中鑒定了 AG-特異性基因，稱(chēng)為Cq-IAG。Cq-IAG 顯示在AG中專(zhuān)門(mén)地表達(dá)，且發(fā)現(xiàn)其推導(dǎo)蛋白在其半胱氨酸骨架和3D結(jié)構(gòu)上與胰島素樣家 族成員相似(Manor等人，同上)。Malecha等人的美國(guó)專(zhuān)利第6，740，794號(hào)公開(kāi)了從雄性對(duì)蝦羅氏沼蝦的AG獲得的 表觀(guān)分子量為8、13、14、16、18和23_26kDa的多種未鑒定的多肽。推測(cè)這些多肽中的兩種， 16和ISkDa的多肽，是產(chǎn)生雄性征的性激素(AH)。美國(guó)專(zhuān)利第6，740，794號(hào)進(jìn)一步公開(kāi)AH 在處理遺傳雌性小蝦或?qū)ξr來(lái)產(chǎn)生新雄性中的用途，該新雄性能夠與基因型雌性交配來(lái)產(chǎn) 生雌性單性小蝦或?qū)ξr后代。美國(guó)專(zhuān)利第6，740，794號(hào)教導(dǎo)用AH處理雌性小蝦或?qū)ξr的 益處，因?yàn)檫@種處理產(chǎn)生雌性小蝦和淡水對(duì)蝦(羅氏沼蝦)的群體，具有超過(guò)其雄性對(duì)應(yīng)群 體的顯著經(jīng)濟(jì)益處。美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)第2005/0080032號(hào)公開(kāi)了在無(wú)脊椎動(dòng)物中誘導(dǎo)系統(tǒng)性、非特 異性、和/或序列特異性免疫應(yīng)答的方法，包括向無(wú)脊椎動(dòng)物施用賦予針對(duì)病原體特別是 病毒的免疫性，或調(diào)節(jié)影響生長(zhǎng)、生殖和總體健康的基因表達(dá)的至少一種dsRNA。在美國(guó)專(zhuān) 利申請(qǐng)公開(kāi)第2005/0080032號(hào)中具體地研究了兩種基因，STAT-樣基因和I-KB-激酶樣基 因(IKK)；選擇這兩種是因?yàn)槠渲毕低次镌诿庖邞?yīng)答中的已知作用。美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi) 第2005/0080032號(hào)既未公開(kāi)也未暗示在無(wú)脊椎動(dòng)物中沉默特定胰島素樣肽。包括淡水大型對(duì)蝦羅氏沼蝦的多種甲殼綱物種表現(xiàn)出雙模態(tài)的生長(zhǎng)模式，其中雄 性表現(xiàn)出優(yōu)于雌性的生長(zhǎng)。顯示與全雌性羅氏沼蝦群體相比，全雄性羅氏沼蝦群體產(chǎn)生更 高的可銷(xiāo)售的產(chǎn)量，生長(zhǎng)更快，且因此需要更短的時(shí)間段來(lái)收獲，并提供更高的每單位面積 收益。發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生單雄性羅氏沼蝦群體的手段效率低，且包括冗長(zhǎng)的方案，諸如人工分隔和從 不成熟雄性顯微外科地移除AG，這兩種方案都要求高的技能。對(duì)有效、技術(shù)上改進(jìn)和經(jīng)濟(jì)上有益的產(chǎn)生甲殼綱十足目動(dòng)物，特別是羅氏沼蝦的 單雄性群體的方法仍存在需求。發(fā)明概述本發(fā)明首次提供包含SEQ ID NO 1中所列的核苷酸序列的分離的核酸分子，其編 碼在十足目羅氏沼蝦(M rosenbergii)促雄性腺中特異性表達(dá)的胰島素樣因子。本發(fā)明進(jìn) 一步提供在羅氏沼蝦促雄性腺中表達(dá)的胰島素樣因子的推斷的氨基酸序列?，F(xiàn)在公開(kāi)了，胰島素樣因子基因在羅氏沼蝦的雄性形態(tài)型的促雄性腺(AG)中差 異地表達(dá)，即，其表達(dá)水平在生殖活躍的藍(lán)色螯雄性和小的雄性中高，而在生殖較不活躍的 橙色螯雄性中較低。
進(jìn)一步公開(kāi)，向幼蟲(chóng)后羅氏沼蝦雄性施用雙鏈RNA，其中兩條鏈之一包括與羅氏沼 蝦促雄性腺(AG)的胰島素樣因子基因的開(kāi)放讀碼框的至少一部分互補(bǔ)的核苷酸序列，造 成沉默胰島素樣因子基因在這些羅氏沼蝦淡水對(duì)蝦中的表達(dá)。胰島素樣因子基因在羅氏沼 蝦雄性表達(dá)的沉默導(dǎo)致暫時(shí)阻止雄性附肢(AM)的再生并抑制精子發(fā)生，這伴有脫皮間隔 的延遲和體重累積的減少。因此，胰島素樣因子基因在羅氏沼蝦淡水對(duì)蝦雄性中的沉默導(dǎo) 致從雄性向新雌性的完全功能性性別逆轉(zhuǎn)，新雌性即遺傳上是雄性但表型是雌性，可與雄 性交配產(chǎn)生全雄性后代。因此，本發(fā)明提供暫時(shí)沉默胰島素樣因子基因在甲殼綱十足目，特別是羅氏沼蝦 中的表達(dá)，從而產(chǎn)生單性雄性群體的方法。由于雄性十足目羅氏沼蝦淡水對(duì)蝦比雌性淡水 對(duì)蝦生長(zhǎng)更快和獲得更高的體重，本發(fā)明提供了在顯著短的時(shí)間段產(chǎn)生大量雄性淡水對(duì)蝦 的手段。根據(jù)一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種包含編碼來(lái)源于羅氏沼蝦的促雄性腺的胰島素樣 因子的SEQ ID NO :1中所列的核苷酸序列(在本文命名為Mr-IAG)或其互補(bǔ)鏈、同系物或 片段的分離的核酸分子，其中所述同系物具有與SEQ ID NO :1至少70%的序列同一性。應(yīng) 理解的是，SEQ ID NO :1具有1824個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。根據(jù)一些實(shí)施方案，所述同系物具有 與SEQ IDNO :1至少80%的序列同一性，可選地與SEQ ID NO :1至少90%、95%或至少99% 的序列同一性。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，分離的核酸分子的片段包含SEQ ID NO :2中所列的核 苷酸序列，即，編碼來(lái)源于羅氏沼蝦促雄性腺的胰島素樣因子的前激素原形式的Mr-IAG的 開(kāi)放讀碼框、或其同系物。應(yīng)理解的是，SEQ ID NO :2具有519個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。根據(jù)另一 實(shí)施方案，分離的核酸分子的片段包含SEQ ID NO :3中所列的、編碼來(lái)源于羅氏沼蝦促雄性 腺的胰島素樣因子的激素原形式的核苷酸序列、或其同系物。根據(jù)進(jìn)一步的實(shí)施方案，分離 的核酸分子的片段包含SEQ ID NO :4中所列的、編碼來(lái)源于羅氏沼蝦促雄性腺的胰島素樣 因子的成熟B鏈和A鏈的核苷酸序列、或其同系物。根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供一種來(lái)源于羅氏沼蝦的促雄性腺的分離的胰島素樣因 子多肽(在本文命名為Mr-LAG多肽)，所述多肽包含SEQ IDNO :5中所列的氨基酸序列、或 其類(lèi)似物或片段，其中所述類(lèi)似物具有與SEQ ID NO :5至少70%的氨基酸序列同一性。根 據(jù)一些實(shí)施方案，所述類(lèi)似物具有與SEQ ID NO :5至少80%、90%、95%或至少99%的氨基 酸序列同一性。根據(jù)某一實(shí)施方案，來(lái)源于羅氏沼蝦促雄性腺的分離的胰島素樣因子多肽 (Mr-IAG)包含SEQ ID NO 6中所列的氨基酸序列，即成熟B鏈和A鏈的氨基酸序列、或其 類(lèi)似物或片段。根據(jù)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供一種下調(diào)羅氏沼蝦的促雄性腺的胰島素樣因子基 因(Mr-IAG)表達(dá)的雙鏈RNA分子，所述雙鏈RNA分子包括有義鏈和反義鏈，所述有義鏈與 所述反義鏈一起形成雙鏈體，所述反義鏈包含與SEQ ID NO :1中所列的核苷酸序列或其同 系物或片段至少70%互補(bǔ)的核苷酸序列。根據(jù)一些實(shí)施方案，所述反義鏈包含與SEQ ID NO :1或其同系物或片段至少 80 %、可選地至少90 %、95 %或至少99 %互補(bǔ)的核苷酸序列。根據(jù)示例性的實(shí)施方案，所述 反義鏈包含與SEQ ID NO 1或其片段100%互補(bǔ)的核苷酸序列。根據(jù)另外的實(shí)施方案，所述反義鏈包含與SEQ ID NO 2中所列的核苷酸序列或其 同系物或片段至少70%互補(bǔ)的核苷酸序列，其中SEQ ID NO :2是編碼來(lái)源于羅氏沼蝦促雄性腺的胰島素樣因子的前激素原形式的Mr-IAG的開(kāi)放讀碼框。根據(jù)進(jìn)一步的實(shí)施方案，所 述反義鏈包含與SEQ IDNO :2或其同系物或片段至少80%、可選地至少90%、進(jìn)一步可選地 至少95%或99%互補(bǔ)的核苷酸序列。根據(jù)某一實(shí)施方案，所述反義鏈由與SEQID NO :2中 所列的Mr-IAG的開(kāi)放讀碼框100%互補(bǔ)的核苷酸序列組成。根據(jù)進(jìn)一步的實(shí)施方案，所述反義鏈包含與SEQ ID NO 3中所列的核苷酸序列或 其同系物或片段至少70%互補(bǔ)的核苷酸序列，其中SEQ IDNO 3編碼從羅氏沼蝦促雄性腺 分泌的胰島素樣因子的激素原形式。根據(jù)進(jìn)一步的實(shí)施方案，所述反義鏈包括與SEQ ID NO 4中所列的核苷酸序列或 其同系物或片段至少70%互補(bǔ)的核苷酸序列，其中SEQ IDNO 4編碼從羅氏沼蝦的促雄性 腺分泌的胰島素樣因子的成熟形式。根據(jù)進(jìn)一步的實(shí)施方案，所述有義鏈包括具有與選自SEQ ID NO :1至SEQ ID NO 4組成的組的核苷酸序列至少70%的序列同一性的核苷酸序列。根據(jù)另外的實(shí)施方案，所 述有義鏈具有與SEQ ID N0:2至少80%，可選地至少90%、95%或99%的序列同一性。根 據(jù)某一實(shí)施方案，所述有義鏈由SEQ ID NO :2中所列的核苷酸序列組成。根據(jù)又進(jìn)一步的實(shí)施方案，所述有義鏈和反義鏈各包括長(zhǎng)度是從約20到約800個(gè) 核苷酸?？蛇x地，所述有義鏈和反義鏈各包括長(zhǎng)度是從約100到約700個(gè)核苷酸，進(jìn)一步可 選地，每條鏈包括從約200到約600個(gè)核苷酸，又進(jìn)一步可選地，每條鏈包括長(zhǎng)度是從約450 到約520個(gè)核苷酸。根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供一種用于產(chǎn)生能夠下調(diào)羅氏沼蝦的促雄性腺的胰島素 樣因子基因(Mr-IAG)表達(dá)的雙鏈RNA分子的DNA構(gòu)建體，所述DNA構(gòu)建體包含可操作地連 接到轉(zhuǎn)錄為形成雙鏈RNA的RNA分子的核酸分子的啟動(dòng)子，所述核酸分子包含⑴第一核苷酸序列，具有與SEQ ID NO=I或其片段至少70%的序列同一性；和(ii)第二核苷酸序列，具有與SEQ ID NO 1或其片段的互補(bǔ)序列至少70%的序列 同一性，其中從所述DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄的RNA分子下調(diào)所述胰島素樣因子基因的表達(dá)。根據(jù)一些實(shí)施方案，所述DNA構(gòu)建體中的第一核苷酸序列和第二核苷酸序列各包 括長(zhǎng)度是從約20個(gè)核苷酸到約800個(gè)核苷酸，可選地，每個(gè)核苷酸序列包括從約100到約 700個(gè)核苷酸，進(jìn)一步可選地，每個(gè)核苷酸序列包括長(zhǎng)度是從約200到約600、或從約450到 約520個(gè)核苷酸。根據(jù)另外的實(shí)施方案，所述DNA構(gòu)建體中的第一核苷酸序列具有與SEQ ID NO=I 中所列的核苷酸序列或其片段至少80%的序列同一性、或至少90%、95%或至少99%的序 列同一性。根據(jù)某一實(shí)施方案，所述第一核苷酸序列具有與SEQ ID NO :1中所列的核苷酸 序列或其片段100%的序列同一性。根據(jù)進(jìn)一步的實(shí)施方案，所述DNA構(gòu)建體中的第一核苷酸序列具有與SEQ ID NO 2至SEQ ID NO :4任一個(gè)中所列的核苷酸序列或與其片段至少70%的序列同一性。根據(jù)其 它實(shí)施方案，所述載體具有與SEQ ID NO :2至SEQ ID NO :4任一個(gè)中所列的核苷酸序列或 與其片段至少80 %、90 %、95 %或至少99 %的序列同一性。根據(jù)某一實(shí)施方案，所述DNA構(gòu) 建體中的第一核苷酸序列具有與SEQ ID NO 2中所列的核苷酸序列100%的序列同一性。根據(jù)又進(jìn)一步的實(shí)施方案，所述第二核苷酸序列具有與選自SEQ IDNO :1至SEQ IDNO 4組成的組的互補(bǔ)序列、或與其片段至少80%、90%、95%或至少99%的序列同一性。根據(jù)進(jìn)一步的實(shí)施方案，所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列可操作地連 接于同一啟動(dòng)子?？蛇x地，所述第一核苷酸序列可操作地連接于第一啟動(dòng)子，所述第二核苷 酸序列可操作地連接于第二啟動(dòng)子。根據(jù)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供一種轉(zhuǎn)基因雄性甲殼綱十足目動(dòng)物，包含轉(zhuǎn)染有 根據(jù)本發(fā)明主旨的下調(diào)胰島素樣因子基因表達(dá)的雙鏈RNA分子的至少一個(gè)細(xì)胞。根據(jù)一些 實(shí)施方案，所述轉(zhuǎn)基因雄性甲殼綱十足目動(dòng)物選自羅氏沼蝦、馬氏沼蝦(M. malcolmsonii) 和鋸齒長(zhǎng)臂蝦(Palaemon serratus)組成的組。根據(jù)某一實(shí)施方案，所述轉(zhuǎn)基因雄性甲殼 綱十足目動(dòng)物是雄性羅氏沼蝦。根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供一種轉(zhuǎn)基因雄性甲殼綱十足目動(dòng)物，包含轉(zhuǎn)染有根據(jù) 本發(fā)明主旨的用于產(chǎn)生雙鏈RNA (dsRNA)分子的DNA構(gòu)建體的至少一個(gè)細(xì)胞，所述dsRNA能 夠下調(diào)胰島素樣因子基因的表達(dá)。根據(jù)一些實(shí)施方案，所述轉(zhuǎn)基因雄性甲殼綱十足目動(dòng)物 選自羅氏沼蝦、馬氏沼蝦(M. malcolmsonii)和鋸齒長(zhǎng)臂蝦(Palaemon serratus)組成的 組。根據(jù)某一實(shí)施方案，所述轉(zhuǎn)基因雄性甲殼綱十足目動(dòng)物是雄性羅氏沼蝦。根據(jù)又進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供一種用于喂食對(duì)蝦的轉(zhuǎn)基因飼料活生物體，所 述飼料活生物體轉(zhuǎn)染有根據(jù)本發(fā)明主旨的雙鏈RNA或DNA構(gòu)建體。根據(jù)又進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供一種用于在甲殼綱十足目的雄性生物體中下調(diào) 促雄性腺的胰島素樣因子表達(dá)的方法，包括向所述甲殼綱十足目的雄性生物體的至少一個(gè) 細(xì)胞引入根據(jù)本發(fā)明主旨的雙鏈RNA或DNA構(gòu)建體。根據(jù)一些實(shí)施方案，引入所述雙鏈RNA或DNA構(gòu)建體是通過(guò)注射、浸入、經(jīng)皮或喂 食來(lái)進(jìn)行。根據(jù)某一實(shí)施方案，所述雙鏈RNA或DNA構(gòu)建體是通過(guò)注射來(lái)施用。根據(jù)又進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供一種確定甲殼綱十足目動(dòng)物性別的方法，包括 以下步驟獲得甲殼綱十足目動(dòng)物的血淋巴樣品；和檢測(cè)包含選自SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6組成的組的氨基酸序列的胰島素樣因子多肽或其類(lèi)似物或片段的水平，其中胰島素 樣因子多肽或其類(lèi)似物或片段的存在指示該甲殼綱十足目動(dòng)物是雄性甲殼綱十足目動(dòng)物。 根據(jù)一些實(shí)施方案，檢測(cè)胰島素樣因子多肽或其類(lèi)似物或片段的水平是通過(guò)免疫學(xué)方法進(jìn) 行。根據(jù)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供一種確定甲殼綱十足目動(dòng)物性別的方法，包括以 下步驟獲得甲殼綱十足目動(dòng)物的血淋巴樣品；和檢測(cè)編碼胰島素樣因子的多核苷酸的水 平，該多核苷酸包含選自SEQ ID NO :1至SEQID NO :4組成的組的核苷酸序列或其同系物或 片段，其中編碼胰島素樣因子的多核苷酸或其同系物或片段的存在指示該甲殼綱十足目動(dòng) 物是雄性甲殼綱十足目動(dòng)物。根據(jù)又進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供一種包含SEQ ID NO 1中所列的分離的核酸分 子或其同系物或片段的表達(dá)載體，其中所述同系物具有與SEQID NO 1至少70%的序列同 一性。根據(jù)一些實(shí)施方案，所述表達(dá)載體中的同系物具有與SEQ ID NO :1至少80%的序列 同一性，可選地與SEQ IDN0:1至少90%、95%或至少99%的序列同一性。根據(jù)某一實(shí)施方 案，所述表達(dá)載體包含由選自SEQ ID NO :2至SEQ ID NO :4組成的組的核苷酸序列組成的 分離的核酸分子。
0044]根據(jù)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供包含根據(jù)本發(fā)明的主旨的胰島素樣因子多肽作為活性成分的組合物。根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供包含表達(dá)載體作為活性成分的組合物，該表達(dá)載體包 含根據(jù)本發(fā)明的主旨的包含SEQ ID NO :1中所列的核苷酸序列或其同系物或片段的分離的 核酸分子。根據(jù)又進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供一種用于獲得雄性十足目表型的方法，包括向 甲殼綱十足目動(dòng)物施用包含以下作為活性成分的組合物(i)包含SEQ ID NO :5或SEQ ID NO 6中所列的氨基酸序列或其活性類(lèi)似物或片段的胰島素樣因子多肽；或(ii)根據(jù)本發(fā) 明主旨的包含選自SEQ ID NO :1至SEQ ID NO :4組成的組的核苷酸序列或其同系物或片段 的分離的核酸分子的表達(dá)載體，從而增加所述甲殼綱十足目動(dòng)物中的Mr-LAG多肽水平。根 據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，所述甲殼綱十足目動(dòng)物是雄性甲殼綱十足目動(dòng)物。根據(jù)另一實(shí)施方案，所 述甲殼綱十足目動(dòng)物是雌性甲殼綱十足目動(dòng)物。根據(jù)某一實(shí)施方案，所述甲殼綱十足目動(dòng) 物是羅氏沼蝦。根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供一種針對(duì)羅氏沼蝦的促雄性腺的胰島素樣因子多肽 (Mr-LAG)的抗體，所述胰島素樣因子多肽包含選自SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6組成的組 的氨基酸序列、或其類(lèi)似物或片段，其中所述類(lèi)似物具有與SEQ ID NO :5或SEQ ID N0:6至 少70%的氨基酸序列同一性。根據(jù)某一實(shí)施方案，所述胰島素樣因子多肽由SEQ ID NO 6 中所列的氨基酸序列組成。結(jié)合以下附圖、描述、實(shí)施例和權(quán)利要求，將更好地理解本發(fā)明的這些和其它實(shí)施方案。附圖簡(jiǎn)述

圖1A-1F顯示經(jīng)由移除雙側(cè)XO-SG復(fù)合物的內(nèi)分泌操縱對(duì)羅氏沼蝦雄性生殖系統(tǒng) 的作用。圖IA和IB分別顯示正常的和內(nèi)分泌誘導(dǎo)的羅氏沼蝦雄性的雄性生殖系統(tǒng)的近 端部分；圖1C、圖IE和圖1D、圖IF分別顯示正常雄性和內(nèi)分泌誘導(dǎo)的雄性的末端壺腹的 5μπι切片的H&E染色，以不同放大倍數(shù)顯示(圖IC和ID中XlOO ；圖IE和IF中X 400)。 SD-輸精管；GP-生殖孔；AG-促雄性腺。虛線(xiàn)表示切片的平面。 圖2顯示羅氏沼蝦胰島素樣AG (Mr-IAG)的cDNA序列(SEQ IDNO 1)和根據(jù)預(yù)測(cè) 的開(kāi)放讀碼框推導(dǎo)的Mr-IAG蛋白(SEQ ID NO :3)。推定的信號(hào)肽的氨基酸序列用粗體字 母表示，推定的B鏈和A鏈的氨基酸序列加下劃線(xiàn)，推定的C肽的氨基酸序列標(biāo)為斜體，預(yù) 測(cè)的精氨酸C蛋白酶裂解位點(diǎn)的氨基酸序列加框，終止密碼子標(biāo)上星號(hào)。圖3顯示SEQ ID NO 2中所列的Mr-IAG基因的開(kāi)放讀碼框的核苷酸序列。圖4A-B顯示Mr-IAG的預(yù)測(cè)B鏈和A鏈與其它已知AG甲殼綱動(dòng)物胰島素樣序列的 比對(duì)和比較。圖4A，來(lái)自三種十足目(羅氏沼蝦、紅螯螯蝦和天空藍(lán)魔蝦(C. destructor)) 的預(yù)測(cè)的成熟AG特異性因子與來(lái)自三種等足目(普通球潮蟲(chóng)(A. vulgare)、鼠婦蟲(chóng) (P. scaber)和寬豆蟹(P. dilatatus))的成熟AGH的序列比對(duì)。保守的半胱氨酸殘基標(biāo)為 加框，兩個(gè)預(yù)測(cè)的鏈間和一個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵是連接的。Mr-IAG中的非保守半胱氨酸殘基加框。 預(yù)測(cè)的N-糖基化位點(diǎn)加圓圈。圖4B，帶有距離的所有已知的甲殼綱動(dòng)物AG胰島素樣序列 的系統(tǒng)發(fā)生圖。標(biāo)尺代表每一位點(diǎn)的取代數(shù)目。圖5A-B顯示羅氏沼蝦雄性中Mr-IAG的組織特異性表達(dá)。圖5A，使用Mr-IAG (上 圖)和Mar-SRR (中圖)引物來(lái)從不同雄性組織擴(kuò)增cDNA的RT-PCR產(chǎn)物。來(lái)自AG (上圖和下圖)和來(lái)自輸精管(中圖)的RNA用作陰性對(duì)照。羅氏沼蝦肌動(dòng)蛋白(下圖)用作 陽(yáng)性對(duì)照。圖5Β，利用Mr-IAG探針(上圖)的Northern印跡分析。對(duì)每條泳道上樣5 μ g 總RNA，如rRNA條帶所示(下圖)。圖6A-C顯示不同羅氏沼蝦雄性形態(tài)型中的Mr-IAG轉(zhuǎn)錄物水平。圖6A，利用 Mr-IAG(上圖)和β-肌動(dòng)蛋白(下圖)特異性引物擴(kuò)增來(lái)自三種不同形態(tài)型的每種的 一對(duì)性成熟雄性的cDNA的RT-PCR產(chǎn)物AG-促雄性腺。SD-輸精管。圖6B，不同形態(tài)型中 Mr-IAG的相對(duì)轉(zhuǎn)錄物水平。標(biāo)尺代表標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖6C，不同羅氏沼蝦雄性形態(tài)型的Mr-IAG 原位雜交。從左至右是蘇木精&伊紅染色(H&E)、與Mr-IAG原位雜交的有義探針和反義 探針，三種雄性形態(tài)型(上圖至下圖)藍(lán)色螯(BC)、橙色螯(OC)和小雄性(SM)。H&E和反 義還以更高放大倍數(shù)顯示(X400，加框區(qū)域)。圖7顯示體內(nèi)注射dsRNA的羅氏沼蝦雄性的累積雄性附肢(AM)再生。對(duì)于實(shí)驗(yàn) 性Mr-IAG dsRNA ( · )、GFP dsRNA ( ■)和鹽水(▲)注射組，隨時(shí)間(周)的累積AM再 生比例表示為百分比。星號(hào)標(biāo)出Mr-IAGdsRNA注射組和兩個(gè)對(duì)照組之間的顯著差異。圖8A-B顯示Mr-IAG dsRNA注射對(duì)年幼羅氏沼蝦雄性的脫皮和生長(zhǎng)的作用。圖 8A，體內(nèi)測(cè)定中媒介物注射(〇)組和Mr-IAG-dsRNA-注射(·)組的累積脫皮事件脫皮 的個(gè)體表示為每組的百分比。重復(fù)注射階段的結(jié)束標(biāo)為(第55天)。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著 差異用星號(hào)指示，P < 0. 001。圖8Β，媒介物注射(口)組和Mr-IAG-dsRNA-注射(■)組 在三次脫皮事件期間的累積脫皮增量累積脫皮增量表示為100X脫皮后重量/實(shí)驗(yàn)開(kāi)始 時(shí)的重量。標(biāo)尺代表SEM，星號(hào)代表在第三次脫皮事件時(shí)觀(guān)察到的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。圖9顯示Mr-IAG-dsRNA-注射(·)和媒介物注射(〇)組中經(jīng)16周，雄性附肢再 生為群體的百分比。重復(fù)注射階段的結(jié)束標(biāo)為(第55天)。加粗黑色箭頭表示兩個(gè) 組之間統(tǒng)計(jì)差異首次出現(xiàn)的點(diǎn)，白色箭頭表示從此點(diǎn)起無(wú)統(tǒng)計(jì)差異(即，Mr-IAG dsRNA-注 射組中的雄性附肢恢復(fù))。圖10A-F顯示Mr-IAG沉默雄性和對(duì)照雄性中背腹H&E染色切片。來(lái)自 Mr-IAG-dsRNA-注射組(圖10A、10C、10E)和媒介物注射組(圖10B、10D、10F)的代表個(gè)體的 第五步足底部(圖10A-D)和頭胸部(圖10E-F)的背腹切片。來(lái)自Mr-IAG-dsRNA-注射組 的個(gè)體的空輸精管(SD)的末端壺腹區(qū)的切片顯示增生和肥大的AG細(xì)胞(圖IOA和10C)， 相比之下媒介物注射個(gè)體中充滿(mǎn)精子的輸精管帶有正常AG細(xì)胞(圖IOB和10D)。背部切 片顯示Mr-IAG-dsRNA-注射組中個(gè)體失活的睪丸小葉(TS)(圖10E)，相比之下媒介物注射 個(gè)體中活性睪丸小葉(圖10F)，包含精原細(xì)胞(SG)和精子(SZ) 二者。發(fā)明詳述本發(fā)明提供來(lái)源于羅氏沼蝦的促雄性腺并從羅氏沼蝦的促雄性腺分泌的胰島素 樣因子的cDNA序列(稱(chēng)為Mr-IAG)，和由此cDNA編碼的推定的氨基酸序列。本發(fā)明進(jìn)一步 提供用于沉默Mr-IAG基因表達(dá)的方法，特別是通過(guò)RNA干擾。通常，RNA干擾(RNAi)是指由小干擾RNA(siRNA)介導(dǎo)的序列-特異性轉(zhuǎn)錄后基因 沉默過(guò)程。細(xì)胞中長(zhǎng)的雙鏈RNA(dsRNA)通常刺激核糖核酸酶III酶(稱(chēng)為切丁酶)的活 性。切丁酶牽涉在長(zhǎng)dsRNA向小的siRNA碎片的加工過(guò)程中。來(lái)源于切丁酶活性的siRNA 通常長(zhǎng)約21-23個(gè)核苷酸并包括大約19個(gè)堿基對(duì)的雙鏈體。RNAi響應(yīng)的特征還有包含siRNA的核酸內(nèi)切酶復(fù)合體，通常稱(chēng)為RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC)，其介導(dǎo)具有與siRNA雙鏈體的反義鏈互補(bǔ)的序列的單鏈RNA的裂解。靶RNA 的裂解發(fā)生在與siRNA雙鏈體的反義鏈互補(bǔ)的區(qū)域的中部。不受限于任何加工或作用機(jī) 制，本發(fā)明涉及作為下調(diào)基因表達(dá)的工具的雙鏈RNA，無(wú)論是否被加工?；虮磉_(dá)還可被微小RNA下調(diào)，微小RNA是長(zhǎng)度為約21_23個(gè)核苷酸的單鏈RNA 分子，由從DNA轉(zhuǎn)錄但不翻譯為蛋白的基因編碼。微小RNA與其互補(bǔ)mRNA分子堿基配對(duì)并 誘導(dǎo)RISC復(fù)合體中mRNA降解?；虮磉_(dá)可進(jìn)一步被與mRNA的一個(gè)區(qū)域互補(bǔ)的反義寡核苷酸下調(diào)，其中該反義 寡核苷酸能夠特異性地與mRNA的該區(qū)域雜交，從而抑制基因表達(dá)。因此，本發(fā)明包涵各自 能夠下調(diào)甲殼綱十足目動(dòng)物，特別是羅氏沼蝦促雄性腺的胰島素樣因子表達(dá)的雙鏈RNAJi 小RNA、反義寡核苷酸、小發(fā)夾RNA(shRNA)。除非另外指明，否則本發(fā)明的實(shí)踐將采用本領(lǐng)域已知的微生物學(xué)、分子生物學(xué)和 重組DNA技術(shù)的常規(guī)方法。這種技術(shù)在文獻(xiàn)中充分闡釋了。參見(jiàn)，例如Sambrook等人 Molecular Cloning :A Laboratory Manual (分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(最新版))；DNA Cloning APractical Approach (DNA 克隆的實(shí)用方法)，卷 I&II (D. Glover 編輯)；Oligonucleotide Synthesis (寡核苷酸合成)(N. Gait 編輯，最新版)；Nucleic Acid Hybridization (核酸 雜交)(B. Hames & S. Higgins 編輯,最新版)；Transcription and Translation (轉(zhuǎn)錄和翻譯)(B. Hames & S. Higgins 編輯，最新版)。^X術(shù)語(yǔ)“核酸”是指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸和其聚合物，由 包含糖、磷酸和為嘌呤或嘧啶的堿基的單體(核苷酸)構(gòu)成。除非特別限制，否則該術(shù)語(yǔ)包 涵包含天然核苷酸的已知類(lèi)似物、其保守地修飾的變體、互補(bǔ)序列和簡(jiǎn)并密碼子取代，與參 考核酸具有類(lèi)似結(jié)合性質(zhì)并以類(lèi)似天然存在的核苷酸的方式代謝的核酸。術(shù)語(yǔ)“核酸”或 “多核苷酸”可互換地使用。術(shù)語(yǔ)“基因”是指染色體DNA、質(zhì)粒DNA、cDNA、合成的DNA、或編碼肽、多肽、蛋白、或 RNA分子的其它DNA、和牽涉在表達(dá)調(diào)節(jié)中的編碼序列側(cè)翼的區(qū)域。術(shù)語(yǔ)“基因遞送”或“基因轉(zhuǎn)移”是指用于可靠地將外源核酸插入靶細(xì)胞的方法或 系統(tǒng)。這樣的方法可導(dǎo)致基因的瞬時(shí)或長(zhǎng)期表達(dá)。術(shù)語(yǔ)“DNA構(gòu)建體”或“表達(dá)載體”是指諸如質(zhì)粒、黏粒、病毒、自主復(fù)制序列、噬菌 體、或線(xiàn)性或環(huán)狀單鏈或雙鏈DNA或RNA核苷酸序列的任何物質(zhì)，其來(lái)自任何來(lái)源，能夠基 因組整合或自主復(fù)制，包含其中一個(gè)或多個(gè)DNA序列已被以功能上有效的方式連接的DNA 分子。這樣的DNA構(gòu)建體或載體能夠?qū)?’調(diào)節(jié)序列或啟動(dòng)子區(qū)和所選擇的基因產(chǎn)物的DNA 序列以使得DNA序列被轉(zhuǎn)錄為功能mRNA，被翻譯并從而被表達(dá)的方式引入細(xì)胞。DNA構(gòu)建 體或表達(dá)載體可以被構(gòu)建為能夠表達(dá)雙鏈RNA或反義RNA以抑制特定感興趣RNA的翻譯。術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”是指所選的核酸序列接近啟動(dòng)子以允許啟動(dòng)子調(diào)節(jié)所選的 核酸序列的表達(dá)。通常，在轉(zhuǎn)錄和翻譯的方向方面，啟動(dòng)子位于所選的核酸序列上游。術(shù)語(yǔ)核酸分子的“同系物”是與天然分子的序列基本相似的序列。對(duì)于核苷酸序 列，由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，同系物包括編碼天然蛋白的相同氨基酸序列的那些序列。天然 存在的等位基因同系物諸如可通過(guò)使用分子生物學(xué)技術(shù)，例如以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和 雜交技術(shù)鑒定的同系物。同系物核苷酸序列還包括合成來(lái)源的核苷酸序列，諸如通過(guò)使用定點(diǎn)誘變產(chǎn)生的、編碼天然多肽的核苷酸序列，以及編碼具有氨基酸取代、缺失或添加的多 肽的核苷酸序列。通常，本發(fā)明的核苷酸序列同系物將具有與天然(內(nèi)源)核苷酸序列至 少約 70%,80%,90%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100%的序列同一性。術(shù)語(yǔ)“雜交”是指核酸鏈經(jīng)由堿基配對(duì)與互補(bǔ)鏈連接的能力。當(dāng)兩條核酸鏈中的 互補(bǔ)序列彼此結(jié)合時(shí)發(fā)生雜交。術(shù)語(yǔ)“同源性”當(dāng)關(guān)于核酸序列使用時(shí)，是指至少兩條核苷酸序列之間相似性或同 一性的程度?？梢杂胁糠滞葱曰蛲耆葱?即，同一性)。“序列同一性”是指兩條或 多條核苷酸序列之間親緣關(guān)系的量度，表示為關(guān)于總的比較長(zhǎng)度的百分比。同一性的計(jì)算 考慮到在其各自序列中相同和在相同的相對(duì)位置上的那些核苷酸殘基。缺口，即比對(duì)中一 條序列中存在殘基但另一條中不存在殘基的位置被看作是具有不相同殘基的位置。用于進(jìn) 行序列比對(duì)的廣泛使用和接受的計(jì)算機(jī)程序是CLUSTALW vl. 6 (Thompson等人.Nucl. Acids Res. ,22 :4673-4680，1994)。相似地，術(shù)語(yǔ)“同源性”當(dāng)關(guān)于蛋白序列使用時(shí)，是指至少兩條 蛋白序列之間相似性或同一性的程度?？梢杂胁糠滞葱曰蛲耆葱?即，同一性)。應(yīng) 理解的是，半胱氨酸骨架在編碼胰島素樣因子多肽的核酸序列(DNA、cDNA、mRNA和類(lèi)似物) 中以及胰島素樣因子多肽中應(yīng)完全保守，因?yàn)榘腚装彼峁羌芤?guī)定了胰島素樣因子多肽的成 熟A鏈和B鏈的3-D結(jié)構(gòu)。術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)”是指多核苷酸彼此形成堿基對(duì)的能力。堿基對(duì)通常由反向平行多核 苷酸鏈中核苷酸單元之間的氫鍵形成?；パa(bǔ)多核苷酸鏈可以Watson-Crick方式(如，A與 Τ、A與U、C與G)、或以允許形成雙鏈體的任何其它方式堿基配對(duì)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知 的，當(dāng)使用RNA而不是DNA時(shí)，認(rèn)為尿嘧啶而不是胸腺嘧啶是與腺苷互補(bǔ)的堿基。然而，當(dāng) 在本發(fā)明上下文中指示U時(shí)，除非另外指明，否則涵蓋了取代T的能力。短語(yǔ)“雙鏈體”是指通過(guò)Watson-Crick堿基配對(duì)或允許互補(bǔ)或基本互補(bǔ)的多核苷 酸鏈之間的穩(wěn)定雙鏈體的任何其它方式彼此形成堿基對(duì)的兩條互補(bǔ)或基本互補(bǔ)的多核苷 酸構(gòu)成的結(jié)構(gòu)。例如，具有21個(gè)核苷酸的多核苷酸鏈可與21個(gè)核苷酸的另一條多核苷酸 堿基配對(duì)，而每條鏈上僅19個(gè)堿基是互補(bǔ)或基本互補(bǔ)的，以使“雙鏈體”具有19個(gè)堿基對(duì)。 其余的堿基可以例如作為5’和3’懸垂而存在。進(jìn)一步地，在雙鏈體區(qū)內(nèi)，不需要100%的 互補(bǔ)性；基本的互補(bǔ)性在雙鏈體區(qū)內(nèi)是允許的?；镜幕パa(bǔ)性是指至少70%或更大的互補(bǔ) 性。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)染”用于指細(xì)胞對(duì)外來(lái)核酸的獲取。當(dāng)外源核酸已被引入細(xì)胞膜內(nèi)時(shí)，細(xì) 胞已被“轉(zhuǎn)染”。轉(zhuǎn)染可用于向合適細(xì)胞引入一種或多種外源核酸部分，諸如質(zhì)粒載體其它 核酸分子。該術(shù)語(yǔ)是指穩(wěn)定和瞬時(shí)地獲取遺傳材料二者。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因”當(dāng)關(guān)于十足目或飼料活生物體使用時(shí)，是指在其一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞中 包含至少一種異源基因的十足目或飼料活生物體。關(guān)于基因序列的術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”是指基因的轉(zhuǎn)錄，且如適當(dāng)時(shí)，翻譯所得的mRNA轉(zhuǎn)錄 子為蛋白。因此，如將從上下文清楚的，蛋白編碼序列的表達(dá)來(lái)自于編碼序列的轉(zhuǎn)錄和翻 譯。術(shù)語(yǔ)“下調(diào)”當(dāng)指基因被主題RNAi方法抑制時(shí)，是指在一種或多種或雙鏈RNA或 DNA構(gòu)建體存在時(shí)的基因表達(dá)水平與這種雙鏈RNA或DNA構(gòu)建體不存在時(shí)的水平相比減少。 本文所用的術(shù)語(yǔ)“下調(diào)”指示靶基因表達(dá)降低1-100%。例如，表達(dá)可減少約10、20、30、40、50、60、70、80、90、95 或 99%。雙鏈RNA的序列可與全長(zhǎng)靶基因或其亞序列對(duì)應(yīng)。雙鏈RNA “靶向”于基因，因?yàn)?雙鏈RNA雙鏈體部分的核苷酸序列基本與靶基因的核苷酸序列互補(bǔ)。本發(fā)明的雙鏈RNA可 具有不同長(zhǎng)度。雙鏈RNA每條鏈的長(zhǎng)度優(yōu)選地從約20至約800個(gè)核苷酸；可選地從約100 至約700個(gè)核苷酸，進(jìn)一步可選地從約200至600個(gè)核苷酸，還可選地從約450至約520個(gè) 核苷酸。然而，約12至約20個(gè)核苷酸的RNA鏈也涵蓋在本發(fā)明中。術(shù)語(yǔ)“穩(wěn)定地相互作 用”是指RNA鏈與靶核酸相互作用(例如，在生理?xiàng)l件下通過(guò)與靶基因中的互補(bǔ)核苷酸形成 氫鍵)。開(kāi)放讀碼框(ORF)或“編碼區(qū)”在本領(lǐng)域已知是指翻譯起始密碼子與翻譯終止 密碼子之間的區(qū)域，是可被siRNA有效地靶向的偏好區(qū)域。其它靶區(qū)包括5’非翻譯區(qū) (5’ UTR)，在本領(lǐng)域已知是指mRNA 5’方向從翻譯起始密碼子開(kāi)始的部分，因此包含5’加帽 位點(diǎn)與mRNA的翻譯起始密碼子之間的核苷酸(或基因上相應(yīng)的核苷酸)；和3’非翻譯區(qū) (3’ UTR)，在本領(lǐng)域已知是指mRNA 3’方向從翻譯終止密碼子開(kāi)始的部分，因此包含翻譯終 止密碼子與mRNA 3’末端之間的核苷酸(或基因上相應(yīng)的核苷酸)。雙鏈RNA還可被DNA構(gòu)建體編碼，DNA構(gòu)建體還可包括啟動(dòng)子。DNA構(gòu)建體還可包 括聚腺苷酸化信號(hào)。在一些實(shí)施方案中，聚腺苷酸化信號(hào)是合成的最短的聚腺苷酸化信號(hào)。 RNA雙鏈體可利用合成的寡核苷酸體外構(gòu)建。本文所用的術(shù)語(yǔ)“類(lèi)似物”是指包含SEQ ID NO :5中所列的來(lái)源于羅氏沼蝦促雄性 腺的胰島素樣因子通過(guò)氨基酸取代、添加或化學(xué)修飾而改變的序列的多肽。使用“氨基酸取 代”是指功能上相當(dāng)?shù)陌被釟埢〈蛄兄械臍埢?，造成沉默變化。例如，序列中的一個(gè) 或多個(gè)氨基酸殘基可被相似極性的用作功能等價(jià)物的另一氨基酸取代，造成沉默改變。這 樣的取代稱(chēng)為保守取代。另外，可在氨基酸中進(jìn)行非保守取代，只要與天然Mr-IAG的活性 相比，類(lèi)似物保留導(dǎo)致雄性表型性別分化的活性。根據(jù)本發(fā)明的類(lèi)似物的氨基酸序列具有 與SEQ ID NO :5中所列的天然胰島素樣因子的前激素原形式的氨基酸序列或與其片段，諸 如SEQ ID NO :6中所列的成熟B鏈和A鏈的氨基酸序列至少70%，可選地至少80%、90%、 95%或99%的同一性。術(shù)語(yǔ)“片段”分別是指為全長(zhǎng)核酸分子或全長(zhǎng)多肽的部分的多核苷酸或多肽。本發(fā)明提供如表1中所列的核酸和多肽。表 1.
權(quán)利要求
一種包含編碼羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)促雄性腺的胰島素樣因子的SEQ ID NO1中所列的核苷酸序列(Mr IAG)或其互補(bǔ)鏈或同系物或片段的分離的核酸分子，其中所述同系物具有與SEQ ID NO1至少70％的序列同一性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的核酸分子，其中所述片段包括SEQIDNO :2中所列的 核苷酸序列或其同系物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的核酸分子，其中所述片段包括SEQIDNO :3中所列的 核苷酸序列或其同系物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的核酸分子，其中所述片段包括SEQIDNO :4中所列的 核苷酸序列或其同系物。
5.一種來(lái)源于羅氏沼蝦促雄性腺的分離的胰島素樣因子多肽(MR-IAG)，所述多肽包 含SEQ ID NO :5中所列的氨基酸序列、或其活性類(lèi)似物或片段，其中所述類(lèi)似物具有與SEQ ID NO 5至少70%的氨基酸序列同一性。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的分離的胰島素樣因子，其中所述片段包含SEQID N0:6中所 列的氨基酸序列或其活性類(lèi)似物或片段。
7.一種下調(diào)羅氏沼蝦促雄性腺的胰島素樣因子基因(Mr-IAG)表達(dá)的雙鏈RNA分子，所 述雙鏈RNA分子包括有義鏈和反義鏈，所述有義鏈與所述反義鏈一起形成雙鏈體，所述反 義鏈包含與SEQ ID NO 1中所列的核苷酸序列或其片段至少70%互補(bǔ)的核苷酸序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的雙鏈RNA分子，其中所述反義鏈包含與SEQIDNO :1或其片 段至少99%互補(bǔ)的核苷酸序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的雙鏈RNA分子，其中所述反義鏈包含與SEQIDNO :2中所列 的核苷酸序列至少70%互補(bǔ)的核苷酸序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的雙鏈RNA分子，其中所述反義鏈包含與SEQID NO :2至少 80%互補(bǔ)的核苷酸序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求7所述的雙鏈RNA分子，其中所述反義鏈包含與SEQID NO :2至少 90%互補(bǔ)的核苷酸序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求7所述的雙鏈RNA分子，其中所述反義鏈包含與SEQID NO :2至少 99%互補(bǔ)的核苷酸序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求7所述的雙鏈RNA分子，其中所述反義鏈包含與SEQID NO :3中所 列的核苷酸序列或其片段至少70%互補(bǔ)的核苷酸序列。
14.根據(jù)權(quán)利要求7所述的雙鏈RNA分子，其中所述反義鏈包含與SEQID NO :4中所 列的核苷酸序列至少70%互補(bǔ)的核苷酸序列。
15.根據(jù)權(quán)利要求7所述的雙鏈RNA分子，其中所述有義鏈和所述反義鏈各包括長(zhǎng)度是 從約20到約800個(gè)核苷酸。
16.根據(jù)權(quán)利要求7所述的雙鏈RNA分子，其中所述有義鏈和所述反義鏈各包括長(zhǎng)度是 從約200到約600個(gè)核苷酸。
17.根據(jù)權(quán)利要求7所述的雙鏈RNA分子，其中所述有義鏈和所述反義鏈各包括長(zhǎng)度是 從約400到約500個(gè)核苷酸。
18.一種用于產(chǎn)生能夠下調(diào)羅氏沼蝦的胰島素樣因子基因表達(dá)的雙鏈RNA的DNA構(gòu)建 體，所述DNA構(gòu)建體包含可操作地連接到編碼形成雙鏈RNA的RNA序列的核酸分子的啟動(dòng)子，所述核酸分子包含(i)第一核苷酸序列，具有與SEQ ID NO 1或其片段至少70%的序列同一性；和 ( )第二核苷酸序列，具有與SEQ ID NO :1或其片段的互補(bǔ)序列至少70%的序列同一性，其中從所述DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄的RNA下調(diào)所述胰島素樣因子基因的表達(dá)。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的DNA構(gòu)建體，其中所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸 序列各包括約20到約800個(gè)核苷酸。
20.根據(jù)權(quán)利要求21所述的DNA構(gòu)建體，其中所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸 序列各包括約200到約600個(gè)核苷酸。
21.根據(jù)權(quán)利要求18所述的DNA構(gòu)建體，其中所述第一核苷酸序列具有與SEQID NO 2中所列的核苷酸序列或其片段至少70%的序列同一性。
22.根據(jù)權(quán)利要求18所述的DNA構(gòu)建體，其中所述第一核苷酸序列具有與SEQID NO 2中所列的核苷酸序列至少99%的序列同一性。
23.根據(jù)權(quán)利要求18所述的DNA構(gòu)建體，其中所述第二核苷酸序列具有與SEQID NO 1或其片段的互補(bǔ)序列至少70%的序列同一性。
24.根據(jù)權(quán)利要求18所述的DNA構(gòu)建體，其中所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸 序列可操作地連接于同一啟動(dòng)子。
25.根據(jù)權(quán)利要求18所述的DNA構(gòu)建體，其中所述第一核苷酸序列可操作地連接于第 一啟動(dòng)子，并且所述第二核苷酸序列可操作地連接于第二啟動(dòng)子。
26.一種轉(zhuǎn)基因雄性甲殼綱十足目動(dòng)物，包含轉(zhuǎn)染有根據(jù)權(quán)利要求7至17任一項(xiàng)的雙 鏈RNA的至少一個(gè)細(xì)胞。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的轉(zhuǎn)基因雄性甲殼綱十足目動(dòng)物，是雄性羅氏沼蝦。
28.一種轉(zhuǎn)基因雄性甲殼綱十足目動(dòng)物，包含轉(zhuǎn)染有根據(jù)權(quán)利要求18至25任一項(xiàng)的 DNA構(gòu)建體的至少一個(gè)細(xì)胞。
29.一種用于喂食對(duì)蝦的轉(zhuǎn)基因飼料活生物體，包含轉(zhuǎn)染有根據(jù)權(quán)利要求7至17任一 項(xiàng)的雙鏈RNA的至少一個(gè)細(xì)胞。
30.一種用于喂食對(duì)蝦的轉(zhuǎn)基因飼料活生物體，包含轉(zhuǎn)染有根據(jù)權(quán)利要求18至25任一 項(xiàng)的DNA構(gòu)建體的至少一個(gè)細(xì)胞。
31.一種用于在甲殼綱十足目的雄性生物體中下調(diào)促雄性腺的胰島素樣因子表達(dá)的方 法，包括向所述甲殼綱十足目的雄性生物體的至少一個(gè)細(xì)胞引入根據(jù)權(quán)利要求7至17任一 項(xiàng)的雙鏈RNA。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述甲殼綱十足目的雄性生物體是雄性羅氏沼蝦。
33.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中引入所述雙鏈RNA是通過(guò)注射、浸入、經(jīng)皮或喂 食來(lái)進(jìn)行。
全文摘要
公開(kāi)了編碼淡水對(duì)蝦羅氏沼蝦(M.rosenbergii)的促雄性腺的胰島素樣因子的核酸分子。還公開(kāi)了在甲殼綱十足目動(dòng)物，特別是在羅氏沼蝦中沉默胰島素樣因子基因表達(dá)的方法，其可用于產(chǎn)生單雄性群體。
文檔編號(hào)C07H21/00GK101981046SQ200980111160
公開(kāi)日2011年2月23日 申請(qǐng)日期2009年2月4日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月4日
發(fā)明者埃米爾·薩奇, 托馬·文圖拉 申請(qǐng)人:內(nèi)蓋夫研究與發(fā)展部本-古里安大學(xué)