專利名稱：一種檢測(cè)螺旋霉素的方法及其專用酶聯(lián)免疫試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)螺旋霉素的方法及其專用酶聯(lián)免疫試劑盒。
背景技術(shù)：
螺旋霉素屬于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，對(duì)葡萄球菌、化膿性鏈球菌、肺炎鏈球菌等有抗 菌作用。主要用于抗畜禽細(xì)菌及支原體感染，亦可作飼料添加劑以促進(jìn)增重和提高飼料轉(zhuǎn) 換率。國(guó)際食品法典委員會(huì)、歐盟以及日本均規(guī)定該藥物的最高殘留限量值為200yg/L; 因此，在實(shí)踐中，需要一種精確度、靈敏度高的檢測(cè)螺旋霉素方法。目前，動(dòng)物組織中螺旋霉素殘留量的常規(guī)檢測(cè)方法主要有杯碟法、高效液相色譜/ 質(zhì)譜/質(zhì)譜法、高效液相色譜(HPLC)、液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜等，但是這些方法存在著檢測(cè)過(guò) 程繁瑣、儀器設(shè)備復(fù)雜和對(duì)檢驗(yàn)人員的技能要求高的缺點(diǎn)，不適合現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控和大量樣本的 篩查，推廣應(yīng)用受到限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)螺旋霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒。本發(fā)明所提供的檢測(cè)螺旋霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括螺旋霉素特異性抗體及包 被原和酶標(biāo)記物；所述包被原為螺旋霉素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物或抗抗體；所述酶標(biāo) 記物為酶標(biāo)抗抗體或酶標(biāo)螺旋霉素半抗原；當(dāng)所述包被原為螺旋霉素半抗原與載體蛋白的 偶聯(lián)物時(shí)，所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)抗抗體；當(dāng)所述包被原為抗抗體時(shí)，所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)螺 旋霉素半抗原。為了更方便現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控和大量樣本篩查，所述試劑盒還可包括螺旋霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶 液、顯色液、終止液、濃縮洗滌液、濃縮復(fù)溶液。其中，所述濃縮洗滌液可為pH值為6. 2-6. 7、含有0. 7-1. 0 %的吐溫-20、 0. 03-0. 05%。的疊氮化鈉、0. 15-0. 2mol/L枸櫞酸鹽緩沖液；所述濃縮復(fù)溶液可為含有 5-8%的山羊血清、pH值為7. 1-7. 6,0. 3mol/L的巴比妥-氯化鈉緩沖液，所述百分含量為 重量體積百分含量；當(dāng)標(biāo)記酶為辣根過(guò)氧化物酶時(shí)，所述顯色液由顯色液A液和顯色液B液 組成，顯色液A液可為過(guò)氧化氫或過(guò)氧化脲，顯色液B液可為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺，終 止液可為l-2mol/L硫酸或鹽酸溶液；當(dāng)標(biāo)記酶為堿性磷酸酶時(shí)，顯色劑可為硝基磷酸鹽緩 沖液，終止液可為2mol/L氫氧化鈉溶液。所述螺旋霉素特異性抗體為螺旋霉素多克隆抗體或螺旋霉素單克隆抗體；它們均 是以螺旋霉素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物作為免疫原得到的；所述載體蛋白可為甲狀腺蛋 白、牛血清蛋白、鼠血清蛋白、人血清蛋白、兔血清蛋白、血藍(lán)蛋白、纖維蛋白原或卵清蛋白寸。螺旋霉素是小分子物質(zhì)，只有免疫反 應(yīng)性，沒(méi)有免疫原性，不能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫 應(yīng)答，必須與大分子載體蛋白偶聯(lián)后才具有免疫原性。因此將螺旋霉素與鹽酸羥胺反應(yīng)后 再和琥珀酸酐反應(yīng)得到螺旋霉素半抗原，這樣突出了螺旋霉素分子結(jié)構(gòu)中的特征基團(tuán)，使制備的螺旋霉素抗體對(duì)螺旋霉素的特異性很高。其中，螺旋霉素半抗原與載體蛋白的結(jié)合比例過(guò)低或過(guò)高都對(duì)免疫不利，螺旋霉素半抗原與所述載體蛋白的摩爾配比為20-23 1 比較合適。所述螺旋霉素多克隆抗體可為鼠源、馬源、羊源、兔源或豚鼠源抗體。所述螺旋霉素單克隆抗體是由保藏號(hào)為CGMCC No. 3355的對(duì)螺旋霉素藥物的單克 隆抗體雜交瘤細(xì)胞株D-1-2分泌產(chǎn)生的抗體。所述酶標(biāo)抗抗體是采用過(guò)碘酸鈉法將所述標(biāo)記酶與所述抗抗體進(jìn)行偶聯(lián)得到的； 所述過(guò)碘酸鈉方法中，所述標(biāo)記酶與所述抗抗體的摩爾濃度比為2 1;所述標(biāo)記酶為堿性 磷酸酶或辣根過(guò)氧化物酶，優(yōu)選為辣根過(guò)氧化物酶。所述濃縮洗滌液具體為pH值為6. 5、含有0. 8%的吐溫_20、0. 05%。的疊氮化鈉、 0. 2mol/L的枸櫞酸鹽緩沖液；所述濃縮復(fù)溶液為含有6%的山羊血清、pH為7. 5,0. 3mol/L 的巴比妥-氯化鈉緩沖液；所述百分含量為重量體積百分含量；所述底物顯色液A液為過(guò) 氧化脲，所述底物顯色液B液為四甲基聯(lián)苯胺；所述終止液為2mol/L的鹽酸。在洗滌液中加入一定量吐溫-20和疊氮化鈉的作用在于緩沖液中吐溫-20會(huì)減 少抗體的非特異性吸附，還能對(duì)蛋白起到一定的保護(hù)作用，加入疊氮化鈉后，則疊氮鈉在溶 液中抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，對(duì)溶液的穩(wěn)定性起到一個(gè)保護(hù)作用。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)螺旋霉素的方法。本發(fā)明所提供的檢測(cè)螺旋霉素的方法，包括以下步驟1)樣品前處理動(dòng)物肝臟組織、飼料樣品的前處理方法每1. Og勻漿物中，加入5ml提取液，振蕩 IOmin,置37°C恒溫箱中反應(yīng)30min，取出后振蕩30s，3000g以上離心lOmin，配合飼料、雞/ 豬肝取100 μ 1到700 μ 1復(fù)溶液中混勻用于測(cè)定(稀釋40倍)；濃縮/預(yù)混料取50 μ 1 到750 μ 1復(fù)溶液中混勻用于測(cè)定(稀釋80倍)；取樣進(jìn)行分析。動(dòng)物肌肉組織樣品前處理方法每1. O動(dòng)物組織勻漿物中，加入5ml提取液，振 蕩lOmin，置37°C恒溫箱中反應(yīng)30min，3000g以上離心IOmin ；雞肉/豬肉取100 μ 1至Ij 700 μ 1復(fù)溶液中混勻用于測(cè)定(稀釋40倍)；取樣進(jìn)行分析。2)利用上述任一所述的酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)1)中所述樣品。3)分析檢測(cè)結(jié)果。由保藏號(hào)為CGMCC No. 3355的對(duì)螺旋霉素藥物的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株D_l_2 分泌產(chǎn)生的螺旋霉素單克隆抗體也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。保藏號(hào)為CGMCC No. 3355的對(duì)螺旋霉素藥物的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞D_l_2也屬 于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明檢測(cè)螺旋霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒主要采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法定性或定 量檢測(cè)樣品中螺旋霉素的殘留量；對(duì)樣品的前處理要求低，樣品前處理過(guò)程簡(jiǎn)單，能同時(shí)快 速檢測(cè)大批量樣品；采用高特異性的螺旋霉素單克隆抗體，主要試劑以工作液的形式提供， 檢驗(yàn)方法方便易行，具有特異性高、靈敏度高、精確度高、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)。本發(fā)明的酶聯(lián)免 疫試劑盒，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、使用方便、價(jià)格便宜、攜帶便利、檢測(cè)方法高效、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、適于現(xiàn)場(chǎng) 大批量樣品的篩選。本發(fā)明的試劑盒將在螺旋霉素的檢測(cè)中發(fā)揮重要作用。


圖1為以螺旋霉素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物為包被原的試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明均為常規(guī)方法。 實(shí)施例1、以螺旋霉素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物為包被原的試劑盒的制備及檢 測(cè)。一、以螺旋霉素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物為包被原的試劑盒的檢測(cè)原理如下當(dāng)在微孔條上預(yù)包被螺旋霉素偶聯(lián)抗原時(shí)，加入樣本溶液或標(biāo)準(zhǔn)品溶液后，隨即 加入酶標(biāo)二抗，再加入螺旋霉素特異性抗體溶液，樣本中殘留的螺旋霉素藥物與酶標(biāo)板上 包被的螺旋霉素偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)螺旋霉素特異性抗體，加入的酶標(biāo)記抗抗體進(jìn)行放大作用， 用顯色液顯色，樣本吸光值與螺旋霉素藥物的含量呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣 本中螺旋霉素的殘留量。同時(shí)根據(jù)酶標(biāo)板上顏色的深淺，與系列濃度的螺旋霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶 液顏色的比較可粗略判斷樣品中螺旋霉素殘留量的濃度范圍。二、以螺旋霉素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物為包被原的試劑盒一般可以包括如下 組成1、包被螺旋霉素偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板；包被原的濃度可以為0. 10-0. 20 μ g/ml ；2、酶標(biāo)抗抗體工作液用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體或羊抗兔抗抗體； 酶標(biāo)二抗的稀釋液為含2-4%兔血清蛋白、pH值為7. 2-8. 1,0. 1-0. 3mol/L的磷酸鹽緩沖 液；所述百分比為重量體積百分比；酶標(biāo)抗抗體工作液稀釋度為1 300。3、螺旋霉素特異性抗體工作液可以為螺旋霉素單克隆抗體工作液或多克隆抗體 工作液；抗體稀釋液為PH值為7. 8-8. 3、含有5-10%卵清蛋白，0. 1-0. 2mol/L的磷酸鹽緩 沖液，所述百分比為重量體積百分比，抗體工作液稀釋度為1 3000;4、螺旋霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液6瓶，濃度分別為0 μ g/L、0. 2 μ g/L、0. 6 μ g/L、l. 8 μ g/ L、5. 4μ g/L、16. 2μ g/L ；配制標(biāo)準(zhǔn)品的溶液為含有5_8%的山羊血清、pH值為7. 1-7. 6、 0. 3mol/L的巴比妥-氯化鈉緩沖液，所述百分比為重量體積百分比。5、底物顯色液由A液和B液組成，底物顯色液A液為過(guò)氧化脲或過(guò)氧化氫，7ml/ 瓶，1瓶；底物顯色液B液為四甲基聯(lián)苯胺或鄰苯二胺；7ml/瓶，1瓶；6、終止液為l-2mol/L硫酸或鹽酸；7ml/瓶，1瓶；7、濃縮洗滌液可為pH值為6. 2-6. 7、含有0. 7-1. 0%的吐溫_20、0. 03-0. 05%。的疊 氮化鈉、0. 15-0. 2mol/L枸櫞酸鹽緩沖液，所述百分含量為重量體積百分含量。8、濃縮復(fù)溶液可為含有5-8%的山羊血清、pH值為7. 1-7.6,0. 3mol/L的巴比 妥_氯化鈉緩沖液，所述百分含量為重量體積百分含量；三、本實(shí)驗(yàn)以螺旋霉素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物為包被原的試劑盒具體組成如 下1、包被螺旋霉素偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板；包被原的濃度可以為0. 15 μ g/ml ；2、酶標(biāo)二抗的稀釋液為含4%兔血清蛋白、pH值為7. 9,0. 2mol/L的磷酸鹽緩沖 液；所述百分含量為質(zhì)量百分含量；酶標(biāo)抗抗體工作液稀釋度為1 300。3、螺旋霉素單克隆抗體工作液螺旋霉素單克隆抗體是由保藏號(hào)為CGMCCNo. 3355的對(duì)螺旋霉素藥物的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株D-1-2分泌產(chǎn)生的；螺旋霉素單克隆抗體工作液是按照以下方法制備的用稀釋液將螺旋霉素單克隆抗體稀釋3000倍，得到 單抗工作液，所述稀釋液為PH值為8. 0、含有10%卯清蛋白，0. lmol/L的磷酸鹽緩沖液，所 述百分含量為重量體積百分含量。4、螺旋霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液6瓶，濃度分別為0 μ g/L，0. 2 μ g/L，0. 6 μ g/L，1· 8 μ g/ L，5. 4μ g/L，16. 2μ g/L ；配制標(biāo)準(zhǔn)品的溶液為含有7%的山羊血清、pH值為7. 3,0. 3mol/L 的巴比妥_氯化鈉緩沖液，所述百分含量為重量體積百分含量。5、底物顯色液由A液和B液組成，底物顯色液A液為過(guò)氧化脲，7ml/瓶，1瓶；底 物顯色液B液為四甲基聯(lián)苯胺，7ml/瓶，1瓶。6、終止液為2mol/L鹽酸；7ml/瓶，1瓶；7、濃縮洗滌液pH值為6. 5、含有0. 8%的吐溫_20、0. 05%。的疊氮化鈉、0. 2mol/L 枸櫞酸鹽緩沖液；所述百分含量為重量體積百分含量；40ml/瓶，1瓶；8、濃縮復(fù)溶液含有6%的山羊血清、pH值為7. 5,0. 3mol/L的巴比妥-氯化鈉緩 沖液；所述百分含量為重量體積比；200ml/瓶，1瓶。其中，包被有螺旋霉素半抗原與卵清蛋白偶聯(lián)物的酶標(biāo)板、螺旋霉素抗體工作液、 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體工作液的制備方法如下所用的包被緩沖液和封閉液如下所用的包被緩沖液可以為pH值為4. 5-6. 0,0. 1-0. 2mol/L醋酸-醋酸銨緩沖液； 所用的封閉液可以為含有4-7%的牛血清白蛋白、0. 6-1.0%的明膠、0. 5-1%的甘油、pH值 為6. 7-7. 2,0. 1-0. 2mol/L的磷酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體積百分含量。1、酶標(biāo)板的制備a、包被原的制備將螺旋霉素半抗原與卵清蛋白偶聯(lián)得到包被原，具體步驟如下 其中螺旋霉素半抗原與所述卵清蛋白的摩爾配比為22 1。半抗原的制備稱取20mg螺旋霉素溶于2. 5ml無(wú)水乙醇，與溶于Iml雙蒸水的鹽酸羥胺5mg混 合，在冰浴條件下反應(yīng)2. 5h，期間滴入0. 05mol/L的NaOH溶液約Iml。反應(yīng)后滴入0. 2mol/ L、pH4的醋酸鹽緩沖液約1ml，并加入碎冰約4mg，出現(xiàn)白色沉淀，在4°C下靜置ld，后 10000rpm/min室溫離心lOmin，棄去上清液。白色沉淀用2. 5ml 二甲基甲酰胺溶解后，加入 6mg琥珀酸酐，室溫反應(yīng)2h。隨后加入三乙胺100 μ 1，繼續(xù)反應(yīng)lh，得到螺旋霉素半抗原。包被原制備取步驟(1)反應(yīng)好的?；a(chǎn)物1. 3ml，冷卻至10°C，加入氯甲酸異丁酯5 μ 1，10°C 攪拌反應(yīng)30min，即可得到反應(yīng)液A。稱取0VA36mg，使之充分溶解在2mL 50mmol/L碳酸鈉 溶液中得B液，將反應(yīng)液A逐滴緩慢滴加到反應(yīng)液B中。10°C反應(yīng)4h，然后4°C過(guò)夜。用 0. Olmol/LPBS透析3d每天換3次透析液，得到包被原。分裝，于_20°C保存?zhèn)溆?。b、酶標(biāo)板的制備用包被緩沖液將螺旋霉素偶聯(lián)抗原稀釋成0. 15yg/ml，每孔加入100μ 1，4°C過(guò) 夜，傾去包被液，用稀釋后的濃縮洗滌液洗滌2次，每次30秒，拍干，然后再每孔中加入 150 μ 1封閉液，37°C溫育2h，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。2、螺旋霉素單克隆抗體的制備
(1)免疫原合成螺旋霉素是小分子物質(zhì)，只有免疫反應(yīng)性，沒(méi)有免疫原性，不能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫 應(yīng)答，必須與大分子載體蛋白偶聯(lián)后才具有免疫原性。1)稱取20mg螺旋霉素溶于2. 5ml無(wú)水乙醇，與溶于Iml雙蒸水的鹽酸羥胺5mg混 合，在冰浴條件下反應(yīng)2. 5h，期間滴入0. 05mol/L的NaOH溶液約Iml。反應(yīng)后滴入0. 2mol/ L、pH4的醋酸鹽緩沖液約1ml，并加人碎冰約4mg，出現(xiàn)白色沉淀，在4°C下靜置ld，后 10000rpm/min室溫離心lOmin，棄去上清液。白色沉淀用2. 5ml 二甲基甲酰胺溶解后，加入 6mg琥珀酸酐，室溫反應(yīng)2h。隨后加入三乙胺100 μ 1，繼續(xù)反應(yīng)lh，得到螺旋霉素半抗原。2)取步驟(1)反應(yīng)好的?；a(chǎn)物1. 3ml，冷卻至10°C，加入氯甲酸異丁酯5 μ 1， 10°c攪拌反應(yīng)30min，即可得到反應(yīng)液Α。稱取血藍(lán)蛋白36mg，使之充分溶解在2mL50mmol/ L碳酸鈉溶液中得B液，將反應(yīng)液A逐滴緩慢滴加到反應(yīng)液B中。10°C反應(yīng)4h，然后4°C過(guò) 夜。用O.Olmol/LPBS透析3d每天換3次透析液，得到螺旋霉素免疫原。分裝，于_20°C保 存?zhèn)溆谩?2)制備單克隆抗體a.動(dòng)物免疫將免疫原注入到Balb/c小鼠體內(nèi)，免疫劑量為100 μ g/只，使其產(chǎn)生多克隆抗體血清。b.細(xì)胞融合和克隆化小鼠血清測(cè)定結(jié)果較高后，取其脾細(xì)胞，按7 1比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合， 采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定細(xì)胞上清液，篩選陽(yáng)性孔。利用有限稀釋法對(duì)陽(yáng)性孔進(jìn)行克隆化， 直到得到能穩(wěn)定分泌螺旋霉素單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，將該對(duì)螺旋霉素藥物的單克隆 抗體雜交瘤細(xì)胞株命名為D-1-2，該細(xì)胞株已于2009年10月28日保藏于中國(guó)微生物菌種 保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCCJia 北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微 生物研究所，郵編100101)，保藏編號(hào)為CGMCC No. 3355。c.細(xì)胞凍存和復(fù)蘇將螺旋霉素的單克隆雜交瘤細(xì)胞株用凍存液制成IX 109個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，在液 氮中長(zhǎng)期保存。復(fù)蘇時(shí)取出凍存管，立即放入37°C水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培 養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)。d.單克隆抗體的生產(chǎn)與純化將Balb/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油0. 5ml/只，7天后腹腔注射螺旋霉素的單克隆 雜交瘤細(xì)胞株5 X 107個(gè)/只，7天后采集腹水。用辛酸-飽和硫酸銨法進(jìn)行腹水純化，得到 單克隆抗體，_20°C保存。3、多克隆抗體的制備采用新西蘭大白兔作為免疫動(dòng)物，以螺旋霉素抗原與血藍(lán)蛋白偶聯(lián)物為免疫原， 免疫劑量為1. 5mg/kg，首免時(shí)將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮 下多點(diǎn)注射，間隔3-4周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強(qiáng)免疫一 次，共免疫5次，最后一次不加佐劑。最后一次免疫10天后采血，測(cè)定血清抗體效價(jià)，心臟 采血，用硫酸銨分級(jí)沉淀得到純化的多克隆抗體。
4、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗抗體的制備過(guò)程
(1)抗抗體的制備羊抗鼠抗抗體的制備以羊作為免疫動(dòng)物，以鼠源抗體為免疫原對(duì)無(wú)病原體羊進(jìn) 行免疫，得到羊抗鼠抗抗體。羊抗兔抗抗體的制備以羊作為免疫動(dòng)物，以兔源抗體為免疫原對(duì)無(wú)病原體羊進(jìn) 行免疫，得到羊抗兔抗抗體。(2)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗抗體的制備將抗抗體與辣根過(guò)氧化物酶(HRP)采用改良后的過(guò)碘酸鈉法進(jìn)行偶聯(lián)。傳統(tǒng)的過(guò)碘酸鈉法要求反映體系中酶與抗抗體的摩爾濃度比為4 1;由于辣根 過(guò)氧化物酶在強(qiáng)氧化的作用下產(chǎn)生許多與抗抗體結(jié)合的位點(diǎn)，這樣活化的辣根過(guò)氧化物酶 分子充當(dāng)了連接各分子的橋梁，降低了酶標(biāo)記物的酶活性，使制備的偶聯(lián)物中混有許多聚 合體。
本發(fā)明利用改良的過(guò)碘酸鈉法進(jìn)行了抗體的酶標(biāo)，其省去了氨基的封閉過(guò)程， 因?yàn)槟墚a(chǎn)生自身氨基連接的氨基實(shí)際很少。降低了辣根過(guò)氧化物酶抗抗體的摩爾濃度比率 至2 1，改良后的方法比傳統(tǒng)的方法簡(jiǎn)便，對(duì)酶的活性的損失 減少。 三、樣品中螺旋霉素的檢測(cè)1、樣品前處理動(dòng)物肝臟組織、飼料樣品的前處理方法每1. Og勻漿物中，加入5ml提取液，振蕩 IOmin,置37°C恒溫箱中反應(yīng)30min，取出后振蕩30s，3000g以上離心lOmin，配合飼料、雞/ 豬肝取100 μ 1到700 μ 1復(fù)溶液中混勻用于測(cè)定；濃縮/預(yù)混料取50 μ 1到750 μ 1復(fù) 溶液中混勻用于測(cè)定；取樣進(jìn)行分析。動(dòng)物肌肉組織樣品前處理方法每1. O動(dòng)物組織勻漿物中，加入5ml提取液，振 蕩lOmin，置37°C恒溫箱中反應(yīng)30min，3000g以上離心IOmin ；雞肉/豬肉取100 μ 1至Ij 700 μ 1復(fù)溶液中混勻用于測(cè)定；取樣進(jìn)行分析。2、用試劑盒檢測(cè)向包被有螺旋霉素半抗原與卵清蛋白偶聯(lián)物的酶標(biāo)板微孔中加入螺旋霉素標(biāo)準(zhǔn) 品溶液或樣品溶液50 μ 1/孔，隨即辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體工作液50 μ 1/孔， 然后再加入螺旋霉素單克隆抗體工作液50μ1/孔，用蓋板模封板，25°C避光環(huán)境中反應(yīng) 45min，倒出孔內(nèi)液體，每孔加入250 μ 1洗滌液，每次間隔IOs后倒出孔內(nèi)液體，用吸水紙拍 干，如此重復(fù)操作共洗板5次。每孔加入底物顯色液A液過(guò)氧化脲，底物顯色液B液四甲基 聯(lián)苯胺(TMB)，輕輕振蕩混勻，25°C避光環(huán)境中反應(yīng)15min，每孔加入2mol/L終止液硫酸，輕 輕振蕩混勻，用酶標(biāo)儀波長(zhǎng)設(shè)定在450nm處，測(cè)定每孔吸光度值(OD值)。3、檢測(cè)結(jié)果分析用所獲得的每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度平均值(B)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品溶液 (O標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值(BO)再乘以100%，得到百分吸光度值。 公式中B為標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣本溶液的平均吸光度值，BO為O μ g/L標(biāo)準(zhǔn)品溶液的 平均吸光度值。
以螺旋霉素標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μ g/L)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖 (圖1)。用同樣的方法計(jì)算樣品溶液的百分吸光度值，相對(duì)應(yīng)每一個(gè)樣品的濃度，則可從標(biāo) 準(zhǔn)曲線上讀出螺旋霉素的殘留量。本發(fā)明中檢測(cè)結(jié)果的分析也可以采用回歸方程法，計(jì)算 出樣品溶液濃度。本發(fā)明中檢測(cè)結(jié)果的分析還可以利用計(jì)算機(jī)專業(yè)軟件，此法更便于大量 樣品的快速分析，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程只需1.0小時(shí)可以完成。實(shí)施例2、試劑盒靈敏度、準(zhǔn)確度和保存期試驗(yàn)(一 )標(biāo)準(zhǔn)品精密度檢測(cè)從實(shí)施例1中步驟三中不同時(shí)間段制備的不同批次的試劑盒中各抽取10個(gè)試劑 盒，從每個(gè)試劑盒的酶聯(lián)板中各抽出20個(gè)微孔，測(cè)定1. 8 μ g/L螺旋霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光 度值(0D值)，計(jì)算變異系數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，表明，所有檢測(cè)中標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值的變 異系數(shù)在3. 5% -13. 2%之間，符合精密度小于或等于20%的規(guī)定。表1、標(biāo)準(zhǔn)品可重復(fù)性試驗(yàn)(CV% ) ( 二 )樣本精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn)1、樣品精密度檢測(cè)分別向不含螺旋霉素的空白肌肉、肝臟、配合飼料樣本中添加終濃度為40μ g/kg 的螺旋霉素，向不含螺旋霉素的濃縮/預(yù)混料中添加終濃度為80 μ g/kg的螺旋霉素，再分 別按照實(shí)施例1中所述方法進(jìn)行樣品前處理。從實(shí)施例1中步驟三中所述的不同時(shí)間段制 備的三個(gè)批次的試劑盒(01批、03批、06批)中各抽取3個(gè)試劑盒，進(jìn)行檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，每個(gè)實(shí) 驗(yàn)重復(fù)5次，分別計(jì)算變異系數(shù)，結(jié)果如表2-4所示(各表中的數(shù)值為5次重復(fù)的平均值)。 結(jié)果表明肌肉、肝臟、配合飼料、濃縮/預(yù)混料樣本的變異系數(shù)均在4.3% -18. 之間，符 合了《農(nóng)業(yè)部文件》農(nóng)醫(yī)發(fā)200517號(hào)附件2試劑盒備案參考評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)中第四點(diǎn)精密度標(biāo) 準(zhǔn)。表2、肌肉樣本可重復(fù)性試驗(yàn) 表3、肝臟樣本可重復(fù)性試驗(yàn)
36.833.8 35.033.831.65.6 33.828.2 27.436.830.612.5 06 32.834.0 27.032.029.69.0 __31.027. Q 31. 429.829.4__5. 8表4、配合飼料樣本可重復(fù)性試驗(yàn) 表5、濃縮/預(yù)混料樣本可重復(fù)性試驗(yàn) 2、樣本準(zhǔn)確度試驗(yàn)向不含有螺旋霉素的肌肉、肝臟、配合飼料組織中分別添加螺旋霉素，使螺旋霉素 的終濃度分別為40 μ g/kg、80 μ g/kg，向不含有螺旋霉素的濃縮/預(yù)混料中添加螺旋霉素， 使螺旋霉素的終濃度分別為80 μ g/kg、160 μ g/kg，然后按照實(shí)施例1中所述的樣本前處理 方法進(jìn)行處理；再用實(shí)施例1中步驟三中所述的試劑盒檢測(cè)組織或飼料中的螺旋霉素，每 個(gè)濃度做4個(gè)平行，分別計(jì)算準(zhǔn)確度(準(zhǔn)確度=實(shí)測(cè)值/添加值X 100% )。結(jié)果如下表6 所示。結(jié)果表明肌肉、肝臟、配合飼料、濃縮/預(yù)混合飼料樣本添加回收率在60. 2% -98. 6%之間。表6、試劑盒的準(zhǔn)確度檢測(cè)結(jié)果
樣本__ __M__配,飼料 濃縮 < 預(yù)混料
添加濃度(Kg/kg) 40 80 40 80 40 80 80 160
182.5 84. 7 72.5 81· 5 92. 5 95.6 80.6 92.5
279.6 98.6 60.2 90.5 84. 7 92.7 63.8 76.6
準(zhǔn)確度％
368. 9 90. 0 78.3 68. 7 88. 6 80.2 72.5 70.2
492.4 75.3 81.5 86.3 80.3 71.6 88.7 80.0 平均值％ 80.9 87.2 73.1 81.8 86.5 85.0 76.4 79.8(三)交叉反應(yīng)率試驗(yàn)選擇與螺旋霉素有類似結(jié)構(gòu)和類似功能的7種藥物測(cè)定交叉反應(yīng)率。通過(guò)各種藥 物的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別得到其50%抑制濃度。用下式計(jì)算步驟三中試劑盒對(duì)其它藥物的交叉反 應(yīng)率。試劑盒對(duì)于螺旋霉素交叉反應(yīng)率越大，則其對(duì)該藥物檢測(cè)的特異性就越好。重復(fù)測(cè) 定3次，結(jié)果取平均值。交叉反應(yīng)率(％)=(引起50%抑制螺旋霉素的濃度/引起50%抑制的螺旋霉素 類似物濃度)X100%表7、試劑盒的特異性 結(jié)果如表7所示，表明本發(fā)明試劑盒對(duì)螺旋霉素的特異性好，即本發(fā)明試劑盒可 以檢測(cè)螺旋霉素。(四)試劑盒保存期試驗(yàn)試劑盒保存條件為2_8°C，經(jīng)過(guò)6個(gè)月的測(cè)定，步驟三中試劑盒的最大吸光度值 (零標(biāo)準(zhǔn))、50%抑制濃度、螺旋霉素添加實(shí)際測(cè)定值均在正常范圍之內(nèi)。考慮在運(yùn)輸和使 用過(guò)程中，會(huì)有非正常保存條件出現(xiàn)，將試劑盒在37°C保存條件下放置6天，進(jìn)行加速老化 實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明該試劑盒各項(xiàng)指標(biāo)完全符合要求?？紤]到試劑盒冷凍情況發(fā)生，將試劑盒放 入-20°C冰箱冷凍5天，測(cè)定結(jié)果也表明試劑盒各項(xiàng)指標(biāo)完全正常。因此，本發(fā)明試劑盒可 以在2-8°C至少可以保存6個(gè)月以上。(五)試劑盒的靈敏度用實(shí)施例1步驟三中所制試劑盒對(duì)零標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行20次檢測(cè)，測(cè)定結(jié)果的平均 值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差作為試劑盒的靈敏度。表7、靈敏度測(cè)定結(jié)果統(tǒng)計(jì)表μ g/kg 由表9可知，本發(fā)明所研制的試劑盒最低檢測(cè)限為0. 2 μ g/kg。
權(quán)利要求
一種檢測(cè)螺旋霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括螺旋霉素特異性抗體及包被原和酶標(biāo)記物；所述包被原為螺旋霉素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物或抗抗體；所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)抗抗體或酶標(biāo)螺旋霉素半抗原；當(dāng)所述包被原為螺旋霉素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物時(shí)，所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)抗抗體；當(dāng)所述包被原為抗抗體時(shí)，所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)螺旋霉素半抗原；所述螺旋霉素特異性抗體為螺旋霉素的單克隆抗體或螺旋霉素的多克隆抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于濃縮洗滌液可為PH值為 6. 2-6. 7、含有 0. 7-1. 0% 的吐溫-20,0. 03-0. 05%。的疊氮化鈉、0. 15-0. 2mol/L 枸櫞酸鹽 緩沖液；所述濃縮復(fù)溶液可為含有5-8%的山羊血清、pH值為7. 1-7. 6,0. 3mol/L的巴比 妥_氯化鈉緩沖液；所述百分含量為重量體積百分含量；所述顯色液由顯色液A液和顯色 液B液組成，顯色液A液為過(guò)氧化氫或過(guò)氧化脲，顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺； 所述終止液為1 2mol/L硫酸或鹽酸溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述濃縮洗滌液為pH值為 6. 5、含有0. 8%的吐溫-20、0. 05%。的疊氮化鈉、0. 2mol/L枸櫞酸鹽緩沖液；所述濃縮復(fù)溶 液為含有6%的山羊血清、pH值為7. 5,0. 3mol/L的巴比妥-氯化鈉緩沖液；所述百分含量 為重量體積百分含量；所述顯色液由顯色液A液和顯色液B液組成，顯色液A液為過(guò)氧化 脲，顯色液B液為四甲基聯(lián)苯胺；所述終止液為2mol/L鹽酸溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述螺旋霉素半抗原是 將螺旋霉素與鹽酸羥胺反應(yīng)后得到的產(chǎn)物再與琥珀酸酐反應(yīng)得到的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述螺旋霉素特異性 抗體是用所述螺旋霉素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物作為免疫原得到的；所述載體蛋白為甲 狀腺蛋白、牛血清蛋白、鼠血清蛋白、人血清蛋白、兔血清蛋白、血藍(lán)蛋白、纖維蛋白原或卵 清蛋白等。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述螺旋霉素特異性抗 體為螺旋霉素單克隆抗體；所述螺旋霉素單克隆抗體為由保藏號(hào)為CGMCC No. 3355的對(duì)螺 旋霉素藥物的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株D-1-2分泌的抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述酶標(biāo)抗抗體是采用 過(guò)碘酸鈉法將所述標(biāo)記酶與所述抗抗體進(jìn)行偶聯(lián)得到的；所述過(guò)碘酸鈉方法中，所述標(biāo)記 酶與所述抗抗體的摩爾濃度比為2 1 ；所述標(biāo)記酶為堿性磷酸酶或辣根過(guò)氧化物酶，優(yōu)選 為辣根過(guò)氧化物酶。
8.—種檢測(cè)螺旋霉素的方法，包括以下步驟1)樣品前處理動(dòng)物肝臟組織、飼料樣品的前處理方法每l.Og勻漿物中，加入5ml提取液，振蕩 lOmin,置37°C恒溫箱中反應(yīng)30min，取出后振蕩30s，3000g以上離心lOmin，配合飼料、雞/ 豬肝取100 u 1到700 u 1復(fù)溶液中混勻用于測(cè)定(稀釋40倍)；濃縮/預(yù)混料取50 yl 到750 u 1復(fù)溶液中混勻用于測(cè)定(稀釋80倍)；取樣進(jìn)行分析。動(dòng)物肌肉組織樣品前處理方法每1.0動(dòng)物組織勻漿物中，加入5ml提取液，振蕩 lOmin，置37 °C恒溫箱中反應(yīng)30min，3000g以上離心lOmin ；雞肉/豬肉取lOOyl到 700 u 1復(fù)溶液中混勻用于測(cè)定(稀釋40倍)；取樣進(jìn)行分析。2)利用權(quán)利要求1-7中任一所述的酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)1)中所述樣品。
9.由保藏號(hào)為CGMCCNo. 3355的對(duì)螺旋霉素藥物的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株D-1-2分 泌的螺旋霉素單克隆抗體。
10.保藏號(hào)為CGMCCNo. 3355的對(duì)螺旋霉素藥物的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株D-1-2。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)螺旋霉素藥物的方法及其專用酶聯(lián)免疫試劑盒。本發(fā)明的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括螺旋霉素特異性抗體及包被原和酶標(biāo)記物；所述螺旋霉素特異性抗體為螺旋霉素的單克隆抗體或螺旋霉素的多克隆抗體。本發(fā)明的酶聯(lián)免疫試劑盒，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、使用方便、價(jià)格便宜、攜帶便利、檢測(cè)方法高效、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便，能夠進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控且適合大量樣本的定性和定量篩查，將在螺旋霉素的檢測(cè)中發(fā)揮重要作用。
文檔編號(hào)C07K16/44GK101839918SQ20091023782
公開(kāi)日2010年9月22日 申請(qǐng)日期2009年11月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月11日
發(fā)明者萬(wàn)宇平, 何方洋, 余厚美, 馮才偉, 馮才茂, 馮月君, 馮靜, 汪善良, 羅貴昆, 趙正苗 申請(qǐng)人:北京望爾康泰生物技術(shù)有限公司;北京望爾生物技術(shù)有限公司