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對Syk激酶表達(dá)的抑制的制作方法

文檔序號:3565374閱讀:187來源:國知局
專利名稱:對Syk激酶表達(dá)的抑制的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明大體上涉及Syk激酶,特別涉及一種使用小干擾RNA (siRNA)抑制Syk激酶 表達(dá)的方法。
背景技術(shù)
已顯示在包括美麗線蟲(C. elegans)和果蠅(Drosophila)以及植物在內(nèi)的許多 生物體中,雙鏈RNA為一種用于干擾基因表達(dá)的有效物質(zhì)(Bernstein等,RNA 7 1509 2151 (2001) ;McManus 等,Nat. Rev. Genet. 3 737 747(2992) ;Hutvagner 等,Curr. Opin. Genet. Dev. 12 225 232(2002) ;Zamore, Nat. Struct. Biol. 8 :746 750(2001) ;Tuschl 等,GenesDev. 13 :3191 3197 (1999))。用雙鏈RNA使哺乳動物的基因沉默引發(fā)了早期 問題,因?yàn)椴溉閯游锏拿庖呦到y(tǒng)通過例如干擾素應(yīng)答等機(jī)制破壞了含有雙鏈RNA的細(xì)胞, 所述干擾素應(yīng)答等機(jī)制逐漸成為抵制入侵性RNA病毒的防御措施(Clarke等,RNA 1 :7 20(1995))。然而,已經(jīng)證明被稱為小干擾RNA(siRNA)的很短的RNA片段(例如,長度為 20nt 23nt),能避開免疫應(yīng)答。因此導(dǎo)入的siRNA能在哺乳動物細(xì)胞中很好地發(fā)揮基因 沉默劑的功能(Elbashir 等,Nature 411 494 498(2001) ;Elbashir 等,Genes Dev. 15 188 200(2001) ;Paddison 等,Genes Dev. 16 948 958(2002) ;Wianny 等,Nat. Cell Biol. 2 70 75(2000))。據(jù)目前已知,RNAi (RNA干擾)包括一個多步驟的過程。雙鏈RNA由內(nèi)切核酸酶 Dicer (切酶)剪切產(chǎn)生21 23個核苷酸的片段(siRNA)。siRNA雙鏈體解離成2個單 鏈RNA,一條鏈被加入至含有蛋白的復(fù)合體,在這種情況下,該鏈發(fā)揮作為向?qū)NA的功能 而指導(dǎo)靶 RNA 的剪切(Schwarz 等,Mol. Cell. 10 537 548(2002) ;Zamore 等,Cell 101 25 33 (2000)),從而使特定的遺傳信息沉默(也見Zeng等,Proc. Natl. Acad. Sci. 100 9779(2003))。反義DNA也被廣泛地用于抑制基因表達(dá)(Roth等,Annu. Rev. Biomed. Eng. 1 265 297 (1999))。一旦在細(xì)胞內(nèi)部,反義寡核苷酸(ASO)識別并緊緊地結(jié)合于互補(bǔ)的 mRNA,從而阻止mRNA與細(xì)胞的蛋白質(zhì)翻譯組件的相互作用。已經(jīng)證明,通過用Syk激酶mRNA的ASO抑制Syk激酶的表達(dá),顯著地降低了 Fc γ 受體信號傳導(dǎo)(Matsuda等,Molec. Biol, of the Cell 7 1095 1106 (1996)),以及通過氣 溶膠導(dǎo)入大鼠肺部的Syk激酶mRNA的ASO防止了 Fc γ受體誘導(dǎo)的肺部炎癥(Stenton等, J. Immunol. 169 1028 1036(2002))。至少在某些系統(tǒng)中,siRNA比ASO作為基因表達(dá)的抑制劑更加有效和可靠。本發(fā)明產(chǎn)生自設(shè)計測試SiRNA作為Syk激酶表達(dá)的抑制劑的功效的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明大體上涉及Syk激酶。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及一種使用小干 擾RNA(SiRNA)抑制Syk激酶表達(dá)的方法和基于該方法的治療性策略。從以下描述中,會清楚本發(fā)明的目的和優(yōu)點(diǎn)。


圖1.除了起始模板的腺嘌呤二聚體和末尾突出端的尿苷二聚體以外,各Syk激酶 的siRNA的有義鏈?zhǔn)桥c靶序列相同的序列。siRNA的反義鏈?zhǔn)前行蛄械姆聪蚧パa(bǔ)體。圖2.用靶向于Syk激酶mRNA的siRNA轉(zhuǎn)染的RBL-2H3細(xì)胞中Syk激酶的表達(dá)。 RBL-2H3細(xì)胞是用siRNA-Ι (第2泳道)、siRNA_2 (第3泳道)或脂轉(zhuǎn)染胺(Iipofectamine) 轉(zhuǎn)染對照(第1泳道)轉(zhuǎn)染的。細(xì)胞溶解物中的蛋白質(zhì)通過SDS-PAGE(十二烷基磺酸鈉-聚 丙烯酰胺凝膠電泳)分離并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素上。上面為Syk激酶的免疫印跡;下面為肌 動蛋白的免疫印跡。圖3.用靶向于Syk激酶mRNA的siRNA轉(zhuǎn)染的人單核細(xì)胞中Syk激酶的表達(dá)。單 核細(xì)胞是用siRNA(第2泳道)或脂轉(zhuǎn)染胺轉(zhuǎn)染對照(第1泳道)轉(zhuǎn)染的。細(xì)胞溶解物中 的蛋白質(zhì)通過SDS-PAGE分離,轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素上,并用抗Syk激酶抗體進(jìn)行免疫印跡。圖4.蛋白質(zhì)印跡分析HS-24細(xì)胞中Syk蛋白的表達(dá)。圖5A和5B.(圖5A)經(jīng)siRNA處理后將HS-24細(xì)胞溶解,等量的HS-24細(xì)胞溶解 物中的總蛋白質(zhì)用10% SDS凝膠電泳分離,使用Syk或肌動蛋白的單克隆抗體通過蛋白質(zhì) 印跡進(jìn)行分析。第1泳道未處理;第2泳道siRNA-l (對照)處理24小時;第3泳道 siRNA-Ι處理48小時;第4泳道siRNA_2處理24小時;第5泳道siRNA_2處理48小時。 (圖5B)分離RNA并對Syk和β -肌動蛋白進(jìn)行RT_PCR(反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))。第1 泳道未處理;第2泳道siRNA-l (對照)處理48小時;第3泳道siRNA_2處理48小時。圖6A和6B.將在包被有聚賴氨酸的平板上涂布的HS-24細(xì)胞(非刺激的、靜息的) 或包被有纖連蛋白的平板上涂布的HS-24細(xì)胞(刺激的)用siRNA-2或siRNA-Ι (對照)或 四羥反式芪(piceatarmol)處理。過夜培養(yǎng)期間用lOng/ml的TNF(腫瘤壞死因子)處理 細(xì)胞。(圖6A)用siRNA(48h)或四羥反式芪(16h)處理后,除去細(xì)胞,用抗CD54(ICAM-I) 免疫染色,通過流式細(xì)胞計數(shù)器進(jìn)行分析。(圖6B)用IL-6ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)試 劑盒分析細(xì)胞培養(yǎng)上清液的IL-6釋放。與用TNF刺激的未處理細(xì)胞(例如未用siRNA處 理)相比較,*P < 0. 05、< 0. 005。結(jié)果代表了 3至5個獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。該數(shù)據(jù)顯示通 過siRNA-2抑制了 Syk的表達(dá),向下調(diào)節(jié)了 TNF誘導(dǎo)的ICAM-I (細(xì)胞間黏著分子_1)的表 達(dá)和IL-6的釋放,這在炎癥反應(yīng)中是重要的。圖7A和7B.三次處理后,靶向于Syk激酶的siRNA(經(jīng)氣溶膠傳遞)對卵清蛋白 (OA)致敏并攻擊的Brown Norway大鼠的支氣管肺泡灌洗(BAL)液中全部細(xì)胞數(shù)目的影響。 (圖7A提供了柱狀圖數(shù)據(jù),圖7B顯示了單個體數(shù)據(jù)點(diǎn)(單個動物)。圖8A 8D.三次處理后,靶向于Syk激酶的siRNA (經(jīng)氣溶膠傳遞)對OA致敏并 攻擊的Brown Norway大鼠的BAL液中的巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和嗜曙紅細(xì)胞
5的數(shù)目的影響。(圖8A提供了柱狀圖數(shù)據(jù),圖8B顯示了巨噬細(xì)胞數(shù)目的單個體數(shù)據(jù)點(diǎn)(單 個動物),圖8C顯示了嗜中性粒細(xì)胞數(shù)目的單個體數(shù)據(jù)點(diǎn),圖8D顯示了嗜曙紅細(xì)胞數(shù)目的 單個體數(shù)據(jù)點(diǎn))。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及靶向于Syk激酶mRNA的RNA分子。例如,本發(fā)明涉及長度為大約19、 20或21至大約23個核苷酸的RNA分子,其指導(dǎo)Syk激酶mRNA的剪切和/或降解。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及siRNA分子的用途,該siRNA分子為典型地 包含2條20個核苷酸 23個核苷酸(nt)的鏈的雙鏈RNA分子。適用于本發(fā)明的siRNA 能使用各種方法中的任一方法產(chǎn)生??稍隗w外制備siRNA,然后將其直接導(dǎo)入細(xì)胞中(例如 通過轉(zhuǎn)染)??蛇x擇地,通過轉(zhuǎn)染到在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)siRNA的細(xì)胞構(gòu)建體(例如基于DNA的載 體或表達(dá)盒)可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。更具體地,例如通過化學(xué)合成、體外轉(zhuǎn)錄、使用核酸酶III型酶如切酶或核酸 酶III酶解較長的dsRNA、由SiRNA表達(dá)質(zhì)?;虿《据d體在細(xì)胞中表達(dá),或者由源自 PCR的siRNA表達(dá)盒在細(xì)胞中表達(dá),可制備適用于本發(fā)明的siRNA。這些各種方法的 詳細(xì)描述可容易地獲得,并目.可例如在http://www. ambion. com/techlib/tn/103/2. html、www, bdbiosciences. com、www. oliRoenRine. com、www. Renetherapysysterns, com、 www, dharmacon. com、http: //www. mpibpc. gwdg. de/abteilungen/100/105/sirna. html 和/或在此引用的參考文獻(xiàn)中(這些參考文獻(xiàn)也以參考的方式引入本文)找到。(也 見 Sui 等,Proc Natl Acad Sci USA 99:5515—20(2002) ;BrummeIkamp 等,Science 296 550-3(2002) ;Paul 等,Nature Biotechnology20 505-8(2002) ;Lee 等,Nature Biotechnology 20:500-5(2002) ;Castanotto 等,RNA 8 1454-60 (2002)和美國申請 20030108923)可利用各種方法提高本發(fā)明的RNA的穩(wěn)定性(見例如美國申請20020086356、 20020177570 和 20020055162 和美國專利 6,197,944,6, 590,093,6, 399,307,6, 057,134、 5,939,262和5,256,555和它們引用的參考文獻(xiàn))。如上所述,適用于本發(fā)明的SiRNA可以用化學(xué)方法制備。優(yōu)選在合成過程中利用 例如,酸不穩(wěn)定的原酸酯保護(hù)基團(tuán)對2'羥基進(jìn)行保護(hù)以防止降解(見Scaringe等,J.Am. Chem. Soc. 120 11820 (1998)和 www, dharmacon. com (例如其中所描述的 ACE 技術(shù)))。RNA 寡聚體在使用前可同時進(jìn)行2'去保護(hù)和退火。在化學(xué)合成的siRNA中,雙鏈分子的至少1條鏈可具有長度為大約1至大約6個 核苷酸(例如嘧啶和/或嘌呤核苷酸)的3'突出端。優(yōu)選長度為大約1至大約5個核苷 酸(例如胸苷或尿苷),更優(yōu)選大約1至大約4個核苷酸,最優(yōu)選2或3個核苷酸的3'突 出端。有利地,每一條鏈均具有突出端。各條鏈突出端的長度可以相同的或不同。典型地, 兩條鏈具有相同長度的突出端。在一個特別的實(shí)施方案中,本發(fā)明的RNA包含21或22個 核苷酸的鏈,其是成對的且在兩條RNA鏈的3'末端具有大約1至3,特別是大約2個核苷 酸的突出端。如上所述,適用于本發(fā)明的siRNA可通過使用核酸酶III型酶(例如切酶)酶解 較長的dsRNA而制備。(見上述引用的參考文獻(xiàn)和網(wǎng)址。)例如,可以使用商購可獲得的切酶siRNA產(chǎn)生試劑盒,其允許由全長靶基因產(chǎn)生大量的siRNA (Gene Therapy Systems,Inc, MV062603)。使用基于PCR的克隆,可由靶DNA和T7RNA聚合酶啟動子序列產(chǎn)生siRNA。在 靶序列的RNA轉(zhuǎn)錄后,重組切酶可以將轉(zhuǎn)錄的RNAi (干擾RNA)剪切成22bp的siRNA。也如上所述,也可使用本領(lǐng)域已知的方法重組產(chǎn)生適用于本發(fā)明的siRNA分子。 (見上述引用的參考文獻(xiàn)和網(wǎng)址。)重組技術(shù)允許在哺乳動物細(xì)胞中體內(nèi)轉(zhuǎn)錄siRNA。根據(jù) 該方法,可以使用包含例如RNA聚合酶III或TO啟動子序列的載體。這樣的載體(包括病 毒載體和質(zhì)粒載體(如pSIREN))可用作與病毒系統(tǒng)(例如腺病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng))聯(lián) 合的表達(dá)載體或穿梭載體,以將siRNA導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞中。載體可被工程化以表達(dá)siRNA 的有義鏈和反義鏈,它們在體內(nèi)退火以產(chǎn)生功能性siRNA。可選擇地,可通過將靶的有義鏈 (例如大約20nt)、接著將短的間隔(例如大約4至大約IOnt)、然后將靶的反義鏈(例如大 約20nt),和例如作為轉(zhuǎn)錄終止子的大約5 6個U插入到載體中,來表達(dá)發(fā)夾RNA。所得 RNA轉(zhuǎn)錄物回折,以形成包含例如大約20bp的莖和大約IOnt的環(huán)以及3'末端的2 3個 U 的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。(也見 Paddison 等(Proc. Natl. Acad. Sci. 99 1443-1448 (2002)。)本領(lǐng)域 的技術(shù)人員能容易地設(shè)計適用于實(shí)現(xiàn)體內(nèi)生產(chǎn)的構(gòu)建體(包括載體和啟動子的選擇),其 將根據(jù)例如細(xì)胞/組織靶和所需功效而改變。倘若dsRNA與靶向的Syk激酶的mRNA具有足夠的同源性,則dsRNA可以用于本發(fā) 明的方法中??梢岳缤ㄟ^查找Syk激酶cDNA中的靶基序"AA(N) 19”來設(shè)計siRNA雙鏈 體,其中N是任意核苷酸,優(yōu)選G/C含量大約為30%至70%的基序,更優(yōu)選G/C含量大約為 50%的基序。siRNA雙鏈體的有義鏈可對應(yīng)于所選擇的AA(N) 19基序的核苷酸3至核苷酸 21。siRNA雙鏈體的反義鏈可具有所選擇的AA (N) 19基序的核苷酸1至核苷酸21的互補(bǔ)序 歹丨J。進(jìn)一步的設(shè)計細(xì)節(jié)提供于 http://www. mpibpc. gwdg. de/abteilungen/100/105/sirna. html。優(yōu)選的靶序列包括Syk激酶mRNA特有的序列。例如,靶序列可以選自介于Syk激 酶的2個SH2結(jié)構(gòu)域之間的序列或介于第二個SH2結(jié)構(gòu)域和激酶結(jié)構(gòu)域之間的序列。某些 特殊的DNA靶序列描述在以下非限制性的實(shí)施例中。另外的靶包括但不限于如下的靶*序列% GC經(jīng)鑒定的16 18/19個核苷酸的同源性
AATATGTGAAGCAGACATGGA42線粒體核糖體protl5
AATCAAATCATACTCCTTCCC42
AAGAGAGTACTGTGTCATTCA42
AAGGAAAACCTCATCAGGGAA47肌醇六磷酸激酶,Chrl上的β球蛋白
AATCATACTCCTTCCCAAAGC47
AATTTTGGAGGCCGTCCACAA53催產(chǎn)素酶(oxytokinase)
AAGACTGGGCCCTTTGAGGAT58
AAGCAGACATGGAACCTGCAG58組胺受體H3,GTP結(jié)合蛋白
AACTTCCAGGTTCCCATCCTG58
AAGCCTGGCCACAGAAAGTCC63
AAGCCCTACCCATGGACACAG63
AACCTGCAGGGTCAGGCTCTG68
AAGGGGTGCAGCCCAAGACTG68Y谷氨酰轉(zhuǎn)移酶,rb prot L27a
7
AACTTGCACCCTGGGCTGCAG68鈣通道α IE亞單位
AAGTCCTCCCCTGCCCAAGGG74NADH ;泛醌氧化還原酶MLRQ亞單位
AAGGCCCCCAGAGAGAAGCCC74
AATCTCAAGAATCAAATCATA26
AATGTTAATTTTGGAGGCCGT42
AATCCGTATGAGCCAGAACTT47
AATCGGCACACAGGGAAATGT53
AACCGGCAAGAGAGTACTGTG58
AAGGAGGTTTACCTGGACCGA58
可以采用各種方式使用本文描述的siRNA。例如,siRNA分子在細(xì)胞或生物體中可
用于靶向Syk激酶mRNA。在一個具體的實(shí)施方案中,可將siRNA導(dǎo)入人細(xì)胞或人體中以介 導(dǎo)所述細(xì)胞或所述個體的細(xì)胞中的RNAi,從而預(yù)防或治療疾病或與Syk激酶表達(dá)有關(guān)的不 期望的癥狀(例如肺部、關(guān)節(jié)、眼睛或膀胱的炎癥)。siRNA也可用于治療血細(xì)胞的免疫損 壞,例如自身免疫性溶血性貧血癥中的紅細(xì)胞和免疫性紫色血小板減少癥(ITP)中的血小 板(例如通過在巨噬細(xì)胞、脾和肝細(xì)胞中靶向Syk激酶mRNA)。根據(jù)該方法,靶向Syk激酶 基因并通過RNAi降解相應(yīng)的mRNA(靶向的Syk激酶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物)。當(dāng)肺細(xì)胞為靶時, 可將包含siRNA的組合物霧化給藥,例如經(jīng)過吸入給藥。對于關(guān)節(jié)的給藥可以通過注射包 含siRNA的溶液而實(shí)現(xiàn)。對于眼睛的給藥可以通過例如注射或施用容器中裝有包含siRNA 的滴液而實(shí)現(xiàn)。對于膀胱等的給藥,可以通過例如用包含siRNA的組合物清洗或沖洗靶組 織而實(shí)現(xiàn)。對于皮膚的給藥可通過局部給藥(例如作為液體、乳劑或凝膠劑)。根據(jù)本發(fā)明,個體的細(xì)胞(例如血單核細(xì)胞、嗜堿性細(xì)胞或肥大細(xì)胞)可進(jìn)行離體 (ex vivo)處理以實(shí)現(xiàn)Syk激酶mRNA的降解。待處理的細(xì)胞可使用已知方法獲自所述個 體,可將介導(dǎo)相應(yīng)Syk激酶mRNA降解的siRNA導(dǎo)入細(xì)胞中,然后所述細(xì)胞再導(dǎo)入該個體中。在一個具體的實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及使用上述siRNA來抑制中介體(例如組胺) 從具有Fc ε受體的細(xì)胞如肥大細(xì)胞中釋放。在哮喘的治療方面,例如抑制組胺(一種肥大 細(xì)胞中介體)的釋放具有重要的療效。本發(fā)明的siRNA(或適用于實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)siRNA的構(gòu)建體)可以全身給藥(例 如通過IV(靜脈注射))或直接施用于靶組織(例如通過氣溶膠給藥至肺)。使用這里描述 的技術(shù)(包括脂質(zhì)體制劑)可實(shí)現(xiàn)傳遞。除了脂質(zhì)體制劑外,可使用聚合物制劑。聚乙烯 亞胺(PEI)是合適的陽離子聚合物的例子??墒褂貌煌笮〉摩宝ウň€性的22kDa和分 枝的25kDa的PEI (也可使用其它大小的、修飾和未修飾的,以及生物可降解形式的PEI)。 使用例如無毒性的病毒傳遞系統(tǒng)(例如腺相關(guān)病毒傳遞系統(tǒng))也可以實(shí)現(xiàn)傳遞。最佳的劑 量要根據(jù)患者、siRNA、給藥方式和所需功效而定。本領(lǐng)域的技術(shù)人員不需要進(jìn)行過度的試 驗(yàn)就可確定最佳的條件。本發(fā)明的某些方面可在以下非限制性的實(shí)施例中進(jìn)行更加詳細(xì)的描述。(也見美 國申請 20030084471,20030108923 和 20020086356)。實(shí)施例1實(shí)驗(yàn)詳述試劑
月旨轉(zhuǎn)染胺2000 禾口 Opti-Mem 購 自 Invitrogen (San Diego, CA)。 Eagle' sMEM(EMEM)、FCS、青霉素和鏈霉素購自 Life Technologies (Grand Island,NY)。 兔抗鼠Syk激酶多克隆抗體(Ab)和抗肌動蛋白Ab購自Santa CruzBiotechnology (Santa Cruz, CA), F(ab' )2山羊抗兔Ab由Jackson實(shí)驗(yàn)室(Bar Harbor, ME)提供。化學(xué)發(fā)光試 劑購自 DuPont NEN (Boston, ΜΑ)。細(xì)胞和細(xì)胞系獲自賓夕法尼亞大學(xué)健康志愿者的外周血單核細(xì)胞按照以前所述進(jìn)行分離 (Matsuda 等,Molec. Biol, of the Cell 7 1095 1106 (1996))。簡言之,將肝素化的血液 在Ficoll-Hypaque (淋巴細(xì)胞分離介質(zhì);OrganonTeknika,Durham, NC)上離心,將界面細(xì) 胞重懸浮于含有RPMI 1640 (GIBC0 BRL,Grand Island,NY)、10%熱滅活的胎牛血清(FCS) (Intergen, Purchase, NY)和2mM L-谷氨酰胺的完全培養(yǎng)基中。使細(xì)胞在37°C粘附于預(yù)先 用FCS包被的組織培養(yǎng)瓶30min。45min 90min之后,通過Hanks平衡鹽溶液大量清洗而 除去未粘附細(xì)胞。通過劇烈攪動收獲細(xì)胞。根據(jù)錐蟲藍(lán)排除法判斷單核細(xì)胞一般>98%存 活。在37°C的5% CO2中,將所分離的單核細(xì)胞保持在補(bǔ)充有L-谷氨酰胺(2mM)和10%熱 滅活的FCS的RPMI 1640中。在37°C的5% CO2中,將大鼠嗜堿性細(xì)胞(RBL-2H3)在補(bǔ)充有17% FBS、100U青霉 素、100 μ g/ml鏈霉素和4mM谷氨酰胺的EMEM中培養(yǎng)。siRNA雙鏈構(gòu)建體Syk 激酶的 siRNA 由 Dharmacon Research Inc. (Lafayette, Co)制備。在根據(jù)生 產(chǎn)商提供的指南來設(shè)計siRNA時,首次鑒定了人Syk激酶RNA中潛在的siRNA靶(位于AA 堿基對直接下游的19個核苷酸)。然后將在大鼠和小鼠的Syk激酶RNA序列中掃描這些位 點(diǎn)以鑒定這些物種中共有的Syk激酶RNA靶序列。鑒定了 2個合適的位點(diǎn),構(gòu)建了 2條21 個核苷酸單體(21-mer)的RNA,每一條RNA由19個互補(bǔ)核苷酸和3 ‘末端非互補(bǔ)胸苷二聚 體組成(Elbashir等,Nature 411 :494 498 (2001))。除了末端的胸苷二聚體外,siRNA 的有義鏈?zhǔn)桥c靶mRNA序列相同的序列。siRNA的反義鏈?zhǔn)前行蛄械姆聪蚧パa(bǔ)體。l)siRNA-l 人,bp 296 至 bp 316;小鼠和大鼠,bp 307 至 bp 327。有義 5' -gaagcccuucaaccggccc UU 3'反義 3 ‘ -UU cuucgggaaguuggccggg5 ‘2)siRNA-2 人,bp 364 至 bp 382 ;小鼠和大鼠,bp 375 至 bp 393有義 5 ‘ -ccucaucagggaauaugug UU 3 ‘反義 3' -UU ggaguagucccuuauacac5'轉(zhuǎn)染通過轉(zhuǎn)染將siRNA導(dǎo)入到RBL-2H3細(xì)胞和單核細(xì)胞中。對于轉(zhuǎn)染,24孔板的每一 孔中接種5 X 104RBL-2H3細(xì)胞或1 X IO5單核細(xì)胞。24小時后,用400 μ 1缺少血清和抗生素 的新鮮培養(yǎng)基替換完全培養(yǎng)基,將siRNA/脂轉(zhuǎn)染胺2000復(fù)合物加入到每孔中。對于RBL細(xì) 胞,根據(jù)生產(chǎn)商規(guī)定,將3 μ 1 siRNA雙鏈體(20 μ Μ)和3 μ 1脂轉(zhuǎn)染胺2000加入到100 μ 1 無血清或抗生素的Opti-mem中形成siRNA/脂轉(zhuǎn)染胺2000復(fù)合物。對于單核細(xì)胞,將3μ 1 siRNA雙鏈體(20 μ Μ)和1 μ 1脂轉(zhuǎn)染胺2000加入到100 μ 1無血清或抗生素的Opti-mem 中形成siRNA/脂轉(zhuǎn)染胺2000復(fù)合物。在用蛋白質(zhì)印跡檢測激酶蛋白的表達(dá)前,將細(xì)胞在37°C孵育48小時。Syk激酶蛋白的蛋白質(zhì)印跡分析通過在Laemmli樣品緩沖液(2% SDS,10%甘油,IOOmM DTT (二硫蘇糖醇)和6OmM Tris (pH 6.8))中將細(xì)胞煮沸5分鐘來制備溶解物。用SDS-PAGE(10%聚丙烯酰胺)分離所 述溶解物中的蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移至樣品緩沖液(25mM Tris,190mM甘氨酸和20%甲醇)中的硝 酸纖維素膜上。在用山羊抗兔HRP (辣根過氧化物酶)孵育(室溫1. 5h)之前,將硝酸纖維素 膜在4°C用1μ 1/ml的兔抗鼠Syk激酶多克隆抗體(Ab)孵育過夜。根據(jù)生產(chǎn)商規(guī)定,用化學(xué) 發(fā)光試劑使膜上的蛋白質(zhì)條帶顯現(xiàn)。檢測Syk激酶蛋白之后,將膜在含有IOOmM 2-ME (2-巰 基乙醇)、2% SDS和62. 5mM Tris-HCl (pH 6. 7)的剝離緩沖液中于50°C孵育30分鐘并偶 爾攪動,以除去抗Syk激酶抗體。然后用抗肌動蛋白抗體再次探查該膜并用化學(xué)發(fā)光試劑 使膜上的條帶顯現(xiàn)。通過密度測定法定量Syk激酶的蛋白水平(Personal Densitometer, Molecular Dynamics)。結(jié)果siRNA對Syk激酶的表達(dá)的作用用定向于大鼠、小鼠和人Syk激酶RNA的共有序列的siRNA轉(zhuǎn)染大鼠嗜堿性細(xì)胞 (RBL-2H3細(xì)胞)和人單核細(xì)胞。用抗Syk激酶抗體通過蛋白質(zhì)印跡來分析Syk激酶蛋白的 表達(dá)(圖2和3)。用siRNA處理的RBL細(xì)胞中Syk激酶表達(dá)的抑制示于圖2,表1中提供了 Syk激酶蛋白的水平,該水平用肌動蛋白的水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。肌動蛋白是用作檢測蛋白表達(dá) 的標(biāo)準(zhǔn)的通用蛋白。相對于未處理的RBL細(xì)胞(第1泳道),siRNA處理的RBL細(xì)胞中Syk 激酶蛋白的表達(dá)被抑制了 45% 51% (圖2,第2和3泳道)。在培養(yǎng)細(xì)胞中用siRNA抑制 Syk激酶基因表達(dá)的量是鼓舞人心的,因?yàn)橄惹安捎肧yk激酶mRNAASO的實(shí)驗(yàn)顯示在體外培 養(yǎng)的非增殖性細(xì)胞如單核細(xì)胞與在增殖性細(xì)胞相比可達(dá)到更高的Syk激酶抑制水平。還觀 察到保持培養(yǎng)狀態(tài)的單核細(xì)胞中siRNA對Syk激酶表達(dá)的抑制(圖3)。siRNA處理的單核 細(xì)胞中Syk激酶的表達(dá)被抑制(圖3,第2泳道)。此外,siRNA處理的U937細(xì)胞和siRNA 處理的THP-I細(xì)胞中Syk激酶的表達(dá)被抑制(U937和THP-I是巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞系)。由此 這些數(shù)據(jù)證明了針對Syk激酶RNA的siRNA有效抑制該基因的表達(dá),并顯示針對Syk激酶 RNA的siRNA可用作有效的抗炎癥治療工具。表1. RBL細(xì)胞中Syk激酶表達(dá)的密度測定法定量
權(quán)利要求
小干擾RNA分子在制備用于抑制Syk激酶在細(xì)胞中的表達(dá)的制劑中的應(yīng)用,所述小干擾RNA分子指導(dǎo)所述細(xì)胞中存在的靶Syk激酶mRNA序列的剪切,從而實(shí)現(xiàn)所述的抑制。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用,其中所述的小干擾RNA分子的長度為大約20 23個核苷酸。
3.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用,其中所述的小干擾RNA分子被直接導(dǎo)入所述細(xì)胞中。
4.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用,其中所述的小干擾RNA分子是在編碼該小干擾RNA分子 的核苷酸序列導(dǎo)入所述細(xì)胞后在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的。
5.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用,其中所述的小干擾RNA分子包含2條鏈,且所述小干擾 RNA分子的至少一條鏈具有長度為大約1 大約6個核苷酸的3'突出端。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用,其中所述小干擾RNA分子的兩條鏈都具有長度為大約 2 3個核苷酸的3'突出端。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用,其中所述的3'突出端包含尿苷或胸苷。
8.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用,其中所述的小干擾RNA分子具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)。
9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用,其中所述莖環(huán)結(jié)構(gòu)的3'末端具有長度為大約1 大約 6個核苷酸的3'突出端。
10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用,其中所述3'突出端的長度為大約2 大約3個核苷酸。
11.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用,其中所述的靶序列是Syk激酶mRNA特有的序列。
12.如權(quán)利要求11所述的應(yīng)用,其中用cDNA表示的所述靶序列包含選自以下組的核苷 酸序列AATATGTGAAGCAGACATGGA, AATCAAATCATACTCCTTCCC, AAGAGAGTACTGTGTCATTCA, AAGGAAAACCTCATCAGGGAA, AATCATACTCCTTCCCAAAGC, AATTTTGGAGGCCGTCCACAA, AAGACTGGGCCCTTTGAGGAT, AAGCAGACATGGAACCTGCAG, AACTTCCAGGTTCCCATCCTG, AAGCCTGGCCACAGAAAGTCC, AAGCCCTACCCATGGACACAG, AACCTGCAGGGTCAGGCTCTG, AAGGGGTGCAGCCCAAGACTG, AACTTGCACCCTGGGCTGCAG, AAGTCCTCCCCTGCCCAAGGG, AAGGCCCCCAGAGAGAAGCCC, AATCTCAAGAATCAAATCATA, AATGTTAATTTTGGAGGCCGT, AATCCGTATGAGCCAGAACTT, AATCGGCACACAGGGAAATGT,AACCGGCAAGAGAGTACTGTG, AAGGAGGTTTACCTGGACCGA,禾Π AACCTCATCAGGGAATATGTG。
13.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用,其中所述的細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞。
14.如權(quán)利要求13所述的應(yīng)用,其中所述的細(xì)胞是人類細(xì)胞。
15.如權(quán)利要求14所述的應(yīng)用,其中所述的細(xì)胞存在于人體中。
16.如權(quán)利要求15所述的應(yīng)用,其中所述的人體是患有炎性癥狀的患者,并且所述小 干擾RNA分子被施用足夠的量以實(shí)現(xiàn)對所述癥狀的治療。
17.如權(quán)利要求16所述的應(yīng)用,其中所述的炎性癥狀是所述患者的支氣管、肺部、眼 睛、膀胱或皮膚的癥狀。
18.如權(quán)利要求17所述的應(yīng)用,其中所述的炎性癥狀是支氣管或肺部的癥狀,并且所 述小干擾RNA分子通過吸入被導(dǎo)入支氣管或肺部細(xì)胞中。
19.一種小干擾RNA分子,其指導(dǎo)細(xì)胞中存在的靶Syk激酶mRNA序列的剪切,從而實(shí)現(xiàn) 對Syk激酶表達(dá)的抑制,該小干擾RNA分子包含與選自以下組的序列互補(bǔ)的序列AATATGTGAAGCAGACATGGA, AATCAAATCATACTCCTTCCC, AAGAGAGTACTGTGTCATTCA, AAGGAAAACCTCATCAGGGAA, AATCATACTCCTTCCCAAAGC, AATTTTGGAGGCCGTCCACAA, AAGACTGGGCCCTTTGAGGAT, AAGCAGACATGGAACCTGCAG, AACTTCCAGGTTCCCATCCTG, AAGCCTGGCCACAGAAAGTCC, AAGCCCTACCCATGGACACAG, AACCTGCAGGGTCAGGCTCTG, AAGGGGTGCAGCCCAAGACTG, AACTTGCACCCTGGGCTGCAG, AAGTCCTCCCCTGCCCAAGGG, AAGGCCCCCAGAGAGAAGCCC, AATCTCAAGAATCAAATCATA, AATGTTAATTTTGGAGGCCGT, AATCCGTATGAGCCAGAACTT, AATCGGCACACAGGGAAATGT, AACCGGCAAGAGAGTACTGTG, AAGGAGGTTTACCTGGACCGA,禾Π AACCTCATCAGGGAATATGTG。
20.一種包含如權(quán)利要求19所述的小干擾RNA分子和載體的組合物。
21.一種包含如權(quán)利要求19所述的小干擾RNA分子和脂質(zhì)體或聚合物的組合物。全文摘要
本發(fā)明大體上涉及Syk激酶,特別涉及使用小干擾RNA(siRNA)來抑制Syk激酶表達(dá)的方法。
文檔編號C07DGK101961497SQ20091022186
公開日2011年2月2日 申請日期2004年7月1日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月3日
發(fā)明者扎娜·因迪克, 艾倫·D·施賴伯, 金武慶 申請人:賓夕法尼亞大學(xué)理事會
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