專利名稱：大黃魚bpi-bn蛋白質(zhì)、引物及其在制備抗生素藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域中的蛋白質(zhì)表達(dá)及應(yīng)用，特別涉及大黃魚體內(nèi)的Pc-BPI (Pc 代表大黃魚；BPI是殺菌通透性增強(qiáng)蛋白質(zhì))蛋白質(zhì)中的重組載體的構(gòu)建和表達(dá)技術(shù)及其重 組蛋白質(zhì)在制備抗生素藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
殺菌通透性增強(qiáng)蛋白質(zhì)(Bactericidal permeability increasing protein, BPI)是 一種普遍存在于人及哺乳動(dòng)物中性粒細(xì)胞嗜苯胺藍(lán)顆粒中的大小為55 OOODa陽離子蛋白質(zhì)， 是中性粒細(xì)胞內(nèi)多種抗菌成分中唯一能夠直接對(duì)革蘭陰性茵發(fā)揮毒性作用，并對(duì)游離的脂多 糖(lipopolysaccharide，簡(jiǎn)稱LPS)具有中和作用的物質(zhì)。BPI對(duì)大多數(shù)革蘭氏陰性菌(G-菌)具有殺傷作用， 但對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞無作用，并且能立即增加敏感細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性， 使得正常情況下不能通過細(xì)胞壁的放線菌素D得以穿過，因而稱之為殺菌通透性增強(qiáng)蛋白。 !1 BPI在人及兔的中性粒細(xì)胞中被分離鑒定并被證明其具有多種生物學(xué)功能后，BPI的同源 類似物也從牛、豬、魚類甚至低等無脊椎動(dòng)物牡蠣中被克隆出來。隨著對(duì)BPI研究的深入， 研究者發(fā)現(xiàn)，BPI除具有殺滅革蘭陰性菌作用外，還具有中和內(nèi)毒素的功能，近年來更有研 究指出BPI還有抗革蘭陽性菌、真菌、中和肝素、發(fā)揮調(diào)理作用、抗血管生成和調(diào)節(jié)免疫等 多種生物學(xué)活性，也因其獨(dú)特的殺菌機(jī)制和多重的生物學(xué)效應(yīng)被成為"超級(jí)抗生素"，且這 種"超級(jí)抗生素"來自于生物體，沒有環(huán)境污染，而成為一種綠色抗生素。為了更好的研究 和開發(fā)這一既能殺菌又能滅活內(nèi)毒素的抗微生物多肽蛋白，研究者們著重對(duì)人源BPI蛋白的 重組表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性研究進(jìn)行了深入的研究。眾多體外觀察和動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)顯示完整BPI及其活性片段對(duì)小鼠、大鼠、家兔、豬和狒狒等G-菌感染或內(nèi)毒素攻擊 均可產(chǎn)生良好的防護(hù)效應(yīng)，在人類G-菌膿毒癥及相關(guān)疾病的治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。
目前在水生生物中，對(duì)BPI的研究還比較少，水生動(dòng)物BPI蛋白的重組蛋白產(chǎn)物生物學(xué) 活性分析僅見于牡蠣中。但目前，尚未獲得有生物活性的魚類的BPI蛋白質(zhì)，而對(duì)魚類BPI 蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物的抗菌生物學(xué)活性的功能研究也尚未見相關(guān)報(bào)道。
大黃魚(尸se"(/asc/ae/ a crocea Richardson)是我國傳統(tǒng)的海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)魚類，素有"國魚 "之稱，曾是我國重要的四大捕撈對(duì)象之一?，F(xiàn)已成為我國特有的、重要的海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖的主要經(jīng)濟(jì)魚類之一。目前，關(guān)于大黃魚的病理、病害等研究多集中在病原生物的分離鑒定及 簡(jiǎn)單流行病學(xué)的研究，對(duì)涉及病理、病害免疫方面的重要的分子生物學(xué)和分子機(jī)制則鮮有研 究。基于研究,發(fā)明人首次在大黃魚中獲得了哺乳類動(dòng)物BPI的類似物的基因的全長(zhǎng)序列(簡(jiǎn) 稱Pc-BPI-L)并予以公開。(文章題目:Characterization of the BPI-like gene from a subtracted cDNA library of large yellow croaker (Pseucfoscj'aena c_rocea) and induced expression by formalin-inactivated Vibrio alginolyticus and Nocardia seriolae vaccine challenges。發(fā)表在Fish & Shellfish Immunology, Volume 25， Issue 6， 2008, Pages 740-750)。在此研究成果的基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步對(duì)氨基酸結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，針對(duì)該基因 的表達(dá)產(chǎn)物就是大黃魚的殺菌通透性增強(qiáng)蛋白(簡(jiǎn)稱Pc-BPI)的重組構(gòu)建及在抗菌生物學(xué) 活性方面的功能展開研究。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足之處，本發(fā)明提供了一種大黃魚BPI-BN蛋白質(zhì)、引物及其在 制備抗生素藥物中的應(yīng)用。
為達(dá)到以上目的，本發(fā)明是通過這樣的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的
提供一種大黃魚BPI-BN蛋白質(zhì)，其特征在于，該蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO: 1所示的氨基 酸序列。
本發(fā)明還提供了一種寡聚核苷酸引物，用于擴(kuò)增前述蛋白質(zhì)的基因時(shí)，構(gòu)建Pc-BPI基 因的N末端結(jié)構(gòu)域的原核表達(dá)載體，其結(jié)構(gòu)為
BN-F(范/^/III): 5， -GCAAGCTTCCATGCTGACCAACAAAG-3， ( SEQ ID NO: 2); BN-R(iT oI): 5' -GGCTCGAGATGTTTAATACTGTAGA-3， ( SEQ ID NO: 3)。 本發(fā)明還提供了前述蛋白質(zhì)在制備抗生素藥物中的應(yīng)用。 本發(fā)明的有益效果在于
本發(fā)明利用基因工程技術(shù)，對(duì)大黃魚Pc-BPI蛋白質(zhì)的N末端結(jié)構(gòu)域進(jìn)行重組載體的構(gòu) 建和表達(dá)，獲得重組BPI蛋白質(zhì)。該重組BPI蛋白質(zhì)具有極高效的殺滅弧菌的作用，可以作 為綠色抗生素而在漁藥開發(fā)以及人類醫(yī)學(xué)中應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的下述實(shí)施例所使用分子生物學(xué)的方法均為己知的技術(shù)。 本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)步驟包括
一、在對(duì)已公開的大黃魚Pc-BPI基因的核苷酸全序列和氨基酸序列分析的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)的引物，艮P:
BN-F(ffi/ f/III): 5' -GCMGCTTCCATGCTGACCAACAAAG-3' BN-R(J力oI): 5， -GGCTCGAGATGTTTMTACTGTAGA-3， 此引物對(duì)用于Pc-BPI的N端原核表達(dá)載體(pGEX4T2)構(gòu)建。
二、將Pc-BPI基因的2個(gè)結(jié)構(gòu)域和全蛋白分別在大腸桿菌和昆蟲細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，艮卩
構(gòu)建Pc-BPI基因的N末端結(jié)構(gòu)域的原核表達(dá)載體(pET-BN), IPTG (異丙基硫代-e-D-半乳糖苷，大連寶生物工程公司，中國)誘導(dǎo)表達(dá)，并純化該重組蛋白質(zhì)產(chǎn)物(BN)(大黃 魚BPI蛋白的N末端結(jié)構(gòu)域)。
培養(yǎng)受試菌，進(jìn)行重組蛋白產(chǎn)物(BN)的抗菌活性試驗(yàn)。
具體詳細(xì)的步驟如下
1、利用PCR技術(shù)，以大黃魚頭腎BPI全長(zhǎng)cDNA為模板擴(kuò)增Pc-BPI基因的N末端結(jié)構(gòu)域片 段，PCR擴(kuò)增BN片段的反應(yīng)條件為95。C 2分鐘；94°C 30秒，54。C 30秒，72°C 45秒， 35個(gè)循環(huán)；72'C 5分鐘。利用DNA重組技術(shù)將擴(kuò)增到的序列片段克隆到合適的pMD19-T (大連 寶生物工程公司，中國)載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG I (天根生物技術(shù)有限公司，中國)，涂 布含氨卞青霉素(上海生物工程有限公司，中國)的LB篩選平板，挑選若千個(gè)克隆進(jìn)行PCR 鑒定及進(jìn)一步的測(cè)序鑒定，將PCR陽性克隆產(chǎn)物用Hind III和Xho I (大連寶生物工程公司， 中國)限制性內(nèi)切酶雙酶切，與經(jīng)同樣酶切的pET-32(a) (Novagen公司，德國)原核表達(dá)載 體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TGI。 PCR篩選陽性克隆，經(jīng)測(cè)序鑒定獲得編碼框正確的表達(dá)載體 pET-BN。將陽性重組質(zhì)粒pET-BN轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌A co7/ Rossetta (DE3)(北京全式金 生物技術(shù)有限公司，中國)，在IPTG的誘導(dǎo)下進(jìn)行表達(dá)。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)進(jìn)行檢測(cè)。將陽性表達(dá)菌液擴(kuò)大培養(yǎng)，利用蛋白質(zhì)純化試劑盒(Novagen公司， 德國)分離純化重組蛋白質(zhì)。
2、重組蛋白質(zhì)(BN)的表達(dá)、純化、鑒定及定量
將陽性重組質(zhì)粒pET-BN轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌5". co7/ Rossetta (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，涂布LB 平板(含氨卞青霉素和氯霉素)，37'C培養(yǎng)過夜。挑取一個(gè)單克隆菌落，轉(zhuǎn)入LBA培養(yǎng)液，37'C 振搖培養(yǎng)過夜。取適量菌液，按l:100擴(kuò)大培養(yǎng)至ODe。。為0.4-0.5時(shí)，將菌液分為若干等份， 不加或分別加入IPTG,使其終濃度在0-1.0 ramol/L，繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)，離心收集細(xì)菌。細(xì) 菌經(jīng)超聲波裂解后(300W， 20分鐘，超聲3秒，間隔2秒)離心分離上清液和沉淀，分別上 樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。將陽性表達(dá)質(zhì)粒擴(kuò)大培養(yǎng)，利用Ni-NTA親和層析柱(Novagen公司， 德國)對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，進(jìn)行12%的SDS-PAGE電泳將純化鑒定過的蛋白質(zhì)按 Brad-ford法進(jìn)行定量(Bradford亂A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein—dye binding.Anal Biochera. 1976, 72: 248-254)。
3、 殺菌試驗(yàn)中受試菌哈維氏弧菌(K/Z^'o/ a7ve_Ki)，溶藻弧菌(K/力n'oaJp'/3o7y"ci^)， 副溶血弧菌(K/6n'o/ ars力柳o7y"ci/s)接種于海水培養(yǎng)基中，30 。C振蕩培養(yǎng)過夜，次日 以1 / 100的比例轉(zhuǎn)接新鮮的液體海水培養(yǎng)基中，30 'C繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期， 用新鮮的無菌海水培養(yǎng)基調(diào)整各細(xì)菌懸液0D6。。值達(dá)到0。3備用。
4、 分別采用菌落計(jì)數(shù)法和比濁法測(cè)試重組表達(dá)產(chǎn)物BN蛋白的抗菌活性。
實(shí)驗(yàn)組I每個(gè)Eppendorf管中加入5 ul哈維氏弧菌菌液(00柳=0.3)，重組蛋白 10 nl;實(shí)驗(yàn)組II每個(gè)Eppendorf管中加入5 ul溶藻弧菌菌液(0D6。。= 0.3),重組 蛋白10 P 1;實(shí)驗(yàn)組III每個(gè)Eppendorf管中加入5 u 1副溶血弧菌菌液(0D6。。=0. 3)， 重組蛋白10 yl。
同時(shí)每實(shí)驗(yàn)組設(shè)置無菌水，無菌PBS， 1 x Elute buffer代替重組蛋白作為陰性對(duì)照。 (1)菌落計(jì)數(shù)法當(dāng)所有樣品加完后輕輕混勻，做好標(biāo)記后，放入4'C冰箱作用2小 時(shí)，每管加入400 y 1無菌海水培養(yǎng)基，30 'C繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)后，取經(jīng)上述孵育后的 樣品lul ，加無菌海水培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋后，均勻涂布在海水培養(yǎng)基瓊脂平板上，每個(gè)處 理組涂3塊平板。待菌液吸收干后，放入30°C培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)過夜(12-18小時(shí))。 次日計(jì)數(shù)平板上的菌落數(shù)來評(píng)價(jià)重組蛋白對(duì)三種弧菌生長(zhǎng)的影響。(2)比濁法同時(shí)，取 經(jīng)上述孵育后的樣品100 ul接種到10 ml無菌海水培養(yǎng)基中，175 rpm搖床繼續(xù)培養(yǎng)， 在接種后的3.5小時(shí)、7.5小時(shí)和11.5小時(shí)取樣并用分光光度計(jì)測(cè)定0D6。。值。每組設(shè)3 個(gè)平行管。
具體的實(shí)施例子
1、 大黃魚BPI蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域的克隆
提取大黃魚頭腎總RNA，根據(jù)RT-PCR kit (Promega公司)，利用引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增 并測(cè)序。
2、 BN的原核表達(dá)、純化和鑒定
將陽性重組質(zhì)粒pET-BN轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌￡ co7/Rossetta (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，涂布 LBA平板，37'C培養(yǎng)過夜。挑取一個(gè)單克隆菌落，轉(zhuǎn)入LBA培養(yǎng)液，37'C振搖培養(yǎng)過夜。取 適量菌液，按1:100擴(kuò)大培養(yǎng)至0D卿為0.4-0.5時(shí)，將菌液分為若干等份，不加或分別加 入IPTG，使其終濃度在0-1. 0 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)，離心收集細(xì)菌。細(xì)菌經(jīng)超聲波裂 解后(300W， 20分鐘，超聲3秒鐘，間隔2秒鐘)離心分離上清液和沉淀，分別上樣，進(jìn) 行SDS-PAGE電泳。將陽性表達(dá)質(zhì)粒擴(kuò)大培養(yǎng)，利用Ni-NTA親和層析柱對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分離 純化，進(jìn)行12%的SDS-PAGE電泳并進(jìn)一步利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)鑒定純化的蛋
6白質(zhì)產(chǎn)物。
3、 BN重組蛋白質(zhì)的抗菌作用
將三種弧菌接種培養(yǎng)在海水培養(yǎng)基中，待生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期后，用新的無菌海水培養(yǎng)基將其 調(diào)整至006。。=0. 3。將重組蛋白BN加入三種弧菌(OD^0. 3)中，對(duì)照組為1倍洗脫液和無菌PBS。 用菌落計(jì)數(shù)法和比濁法檢測(cè)重組蛋白質(zhì)BN處理后三種弧菌細(xì)胞生長(zhǎng)情況。結(jié)果表明重組的 大黃魚的BN蛋白質(zhì)能夠高效殺滅三種弧菌，在制備新型綠色漁用抗生素和人類醫(yī)藥中具有很 好的應(yīng)用前景。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干具體實(shí)施例框架。顯然，本發(fā)明 不限于以上實(shí)施例，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有 變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。序列表
SEQ ID NO: 1
15MetPheProSerlielieAlaLeuLeuTheLeulieSerVal Ala30CysGlyGinSerProGlyLeuGinVallieLeuTheAsn'LysGly
45LeuGinTyrGlyLysHisValGlyAlaGlyTrplieGinAspArg
60LeuAsnAsnlieThePheProAsplieSerGlyLysValLGAlie
75HisPheTheLeuTheGlylieThelieThe'LysCysAspPhePrp
90GluProSerValGluPheTyrGinAspATGPheLysTheSerMet
105SerGlyLeuSerValAlaLeuAlaGlyTrpTrpLysTheGinPhe
120GlylielieHisAspGlyGlyProPheAsnLeuAlaliePheSer
135ValAspValTheSerValValGlyLeuGlyLysAspAlaAspGly
150ArgLeuSerValTheSerValSerCysAspAlaAsnValGlyAsp
165ValAspMetGinPheTyrGlyGlyAlaSerAlaliePheLysPro
180PheValLysTyrPheLysGlyArglieArgGlyGlulieGinThe
195HislieCysProLysLeuGluGluAlalieValMetlieGluGlu
210GinLeuGinAlaMetAsnValSerPheAspValAspGinAspVal
225TheLeuGluPheProLeuTheAspLeuProValValAsnAlaSer
240SerMetAsnLeuGlyLeuLysGlyGluPheTyrSerlieLysHis
SEQ ID NO: 2
gcaagcttcc atgctgacca acaaag 26 SEQ ID NO: 3
ggctcgagat gtttaatact gtaga 2權(quán)利要求
1、一種大黃魚BPI-BN蛋白質(zhì)，其特征在于，該蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。
2、 一種寡聚核苷酸引物，用于擴(kuò)增權(quán)利要求l所述蛋白質(zhì)的基因時(shí)，構(gòu)建Pc-BPI基因的 N末端結(jié)構(gòu)域的原核表達(dá)載體，其結(jié)構(gòu)為BN-F: 5， -GCAAGCTTCCATGCTGACCAACAAAG-3， 柳-R: 5' -GGCTCGAGATGTTTMTACTGTAGA-3，。
3、 如權(quán)利要求書1所述的蛋白質(zhì)在制備殺滅弧菌的抗生素藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，旨在提供大黃魚體內(nèi)的Pc-BPI蛋白質(zhì)中的重組載體的構(gòu)建和表達(dá)技術(shù)及其重組蛋白質(zhì)在制備抗生素藥物中的應(yīng)用。該大黃魚BPI-BN蛋白質(zhì)具有SEQ IDNO1所示的氨基酸序列。本發(fā)明利用基因工程技術(shù)，對(duì)大黃魚Pc-BPI蛋白質(zhì)的N末端結(jié)構(gòu)域進(jìn)行重組載體的構(gòu)建和表達(dá)，獲得重組BPI蛋白質(zhì)。該重組BPI蛋白質(zhì)具有極高效的殺滅弧菌的作用，可以作為綠色抗生素而在漁藥開發(fā)以及人類醫(yī)學(xué)中應(yīng)用。
文檔編號(hào)C07K14/46GK101565462SQ200910099040
公開日2009年10月28日 申請(qǐng)日期2009年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月4日
發(fā)明者吳信忠, 黃艷青 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)