專利名稱：非病毒載體及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
非病毒載體及其制備方法與應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于高分子化學(xué)和生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，涉及一種非病毒載體及其制備方法 與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腫瘤是基因病，腫瘤發(fā)生的遺傳背景是癌基因或抑癌基因的異常，基因治療是對(duì) 腫瘤細(xì)胞或正常細(xì)胞轉(zhuǎn)移一個(gè)或幾個(gè)正?；颍谋磉_(dá)產(chǎn)物有利于直接或間接的殺傷腫 瘤細(xì)胞；或保護(hù)正常細(xì)胞免受化療與放療的嚴(yán)重傷害，但是傳統(tǒng)的基因?qū)胂到y(tǒng)存在的問 題在于(1)缺乏靶向性，而且具有較高的細(xì)胞毒性和免疫原性，如以攜帶P53基因的腺病 毒治療惡性腫瘤的方案中，只能直接將腺病毒注射到腫瘤局部。若靜脈注射，病毒顆粒將很 快被清除，真正能夠到達(dá)腫瘤組織的目的基因很少，難以達(dá)到治療效果，且增加了副作用；[2]存在安全性問題，目前針對(duì)遺傳性疾病的基因治療方案大多采用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其插 入或整合到染色體的位置是隨機(jī)的，有引起插入突變及細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的潛在危險(xiǎn)。(3)轉(zhuǎn)染 和表達(dá)效率低，質(zhì)粒載體因?yàn)楹蠧pG序列，進(jìn)入細(xì)胞后能夠被機(jī)體沉默而不能持續(xù)高效 的表達(dá)。
非病毒載體作為腫瘤基因治療的載體優(yōu)勢(shì)在于具有較高的安全性和較低的免疫 原性，并且由于腫瘤血管表皮的特殊構(gòu)造，能夠被動(dòng)靶向腫瘤組織，目前主要應(yīng)用的非病毒 載體有脂質(zhì)體，多聚陽離子，樹枝狀高分子等，非病毒載體與DNA—般通過電荷的相互作用 形成聚陽離子復(fù)合物，由于聚陽離子復(fù)合物對(duì)細(xì)胞的毒性較大，容易形成肺部栓塞，并且與 蛋白非特異性結(jié)合，如靜脈注射，不容易到達(dá)靶器官等。為減少聚陽離子的細(xì)胞毒性和增加 聚陽離子復(fù)合物的生物相溶性，可以對(duì)高分化合物進(jìn)行相應(yīng)的修飾，如PEG的修飾等。
由于遺傳物質(zhì)的變異，在一些腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)葉酸受體分子，葉酸受體是一 個(gè)特異的抗腫瘤藥物傳送靶位，在大部分來源于上皮組織的惡性腫瘤如卵巢癌，子宮內(nèi)膜 癌，腎癌，乳腺癌，肺癌，結(jié)腸癌和鼻炎癌中均有高度表達(dá)，特別是婦科腫瘤，90%的卵巢癌 細(xì)胞系都有葉酸受體的高度表達(dá)，而葉酸受體在正常組織中缺失或只在極化上皮細(xì)胞的頂 點(diǎn)表達(dá)，所以葉酸在正常組織中通常不會(huì)積累。
因?yàn)槿~酸與葉酸受體具有高親和力，并且葉酸分子自身穩(wěn)定性高，免疫原性低，與 納米有機(jī)材料相容性好，是腫瘤靶標(biāo)的理想配體。
FA-PEG-PEI納米材料是一種理想的腫瘤靶向納米材料。之前人們應(yīng)用的 FA-PEG-PEI材料在細(xì)胞水平取得良好的效果，但是在動(dòng)物體內(nèi)通過系統(tǒng)注射時(shí)發(fā)現(xiàn)在質(zhì)粒 濃度高的情況下形成的納米顆粒容易發(fā)生聚沉，注射后容易導(dǎo)致肺部血管栓塞而致動(dòng)物死 亡，由于顆粒的聚沉導(dǎo)致注射后不能很好的透過腫瘤血管內(nèi)皮，進(jìn)而不能有效靶向腫瘤器 官。葉酸配體在材料表面的豐度對(duì)材料在腫瘤部位的聚集具有一定的影響，所以選取合適 的葉酸接枝率有利于提高納米顆粒在腫瘤部位的富集。
研究表明，外源基因表達(dá)盒與細(xì)菌質(zhì)粒骨架之間的共價(jià)連接會(huì)導(dǎo)致外源基因的沉 默，這是造成質(zhì)粒載體所攜帶的外源基因在體內(nèi)只能瞬時(shí)表達(dá)的主要原因，也是質(zhì)粒載體臨床應(yīng)用的主要限制因素。小環(huán)DNA(HiinicircleDNA)載體是一種自1997年發(fā)展起來的新 型的基因載體，與常用的非病毒載體質(zhì)粒載體相比，小環(huán)DNA載體僅由外源基因的表達(dá)盒 構(gòu)成，不含有來自細(xì)菌質(zhì)粒的骨架結(jié)構(gòu)。因?yàn)樗鼉H由外源基因的表達(dá)盒構(gòu)成，不含來自細(xì)菌 質(zhì)粒的骨架結(jié)構(gòu)，從而減少了 CpG模序甲基化所致的免疫反應(yīng)，提高了安全性；而且更有效 的提高了轉(zhuǎn)基因的表達(dá)和生物利用度。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種非病毒載體和非病毒載體及其制備方法與應(yīng)用。
本發(fā)明提供的非病毒載體，是聚乙烯亞胺與式V所示化合物共混而得的納米顆 粒。
其中，m= 145，η為小于m的正整數(shù)；式V所述化合物的相對(duì)數(shù)均分子量為20600， 分子量分布為1.73。
該非病毒載體中，所述納米顆粒的粒徑為70-90納米；所述聚乙烯亞胺與式V所 示化合物的摩爾比為10-15 85-90 ；所述聚乙烯亞胺的分子量為25kDa ；共混的溫度為 20-30°C，共混的時(shí)間為15-20分鐘。
本發(fā)明提供的制備上述非病毒載體的方法，包括如下步驟將聚乙烯亞胺與式V 所示化合物進(jìn)行共混，得到上述非病毒載體。
該方法中，所述聚乙烯亞胺與式V所示化合物的摩爾比為10-15 85-90;所述聚 乙烯亞胺的分子量為25kDa ；共混的溫度為20-30°C，共混的時(shí)間為15-20分鐘。
本發(fā)明還提供了一種藥物，其中，該藥物的載體是上述本發(fā)明提供的非病毒載體。
該藥物包括上述本發(fā)明提供的非病毒載體和包裹在所述非病毒載體中的治療性 的DNA ；所述藥物的靶向腫瘤為葉酸受體FRa高表達(dá)的腫瘤；所述藥物能被動(dòng)靶向的腫瘤 為葉酸受體FRa陰性表達(dá)的腫瘤和心臟。
本發(fā)明提供的制備上述藥物的方法，包括如下步驟
1)往治療性的DNA中加入濃度為10-50克/100毫升的葡萄糖溶液，加水稀釋至所 述葡萄糖溶液的終濃度為5-10克/100毫升，所述治療性的DNA的終濃度為0-50 μ g/mL,不 包括0，得到DNA稀釋液；
往所述非病毒載體中加入濃度為10-60克/100毫升的葡萄糖溶液，加水稀釋至所 述葡萄糖溶液的終濃度為5-10克/100毫升，所述非病毒載體的終濃度為0-5μ g/ml，不包 括0，得到非病毒載體稀釋液；
2)將步驟1)得到的非病毒載體稀釋液與DNA稀釋液等體積混勻，室溫靜置孵育后 濃縮，得到本發(fā)明提供的藥物。
該方法的步驟1)中，任一所述葡萄糖溶液的終濃度優(yōu)選為5克/100毫升，所述治 療性的DNA的終濃度優(yōu)選為20 μ g/mL ；所述非病毒載體的終濃度優(yōu)選為0. 39 μ g/ml。
所述步驟2、中，孵育的時(shí)間為15-30分鐘，優(yōu)選15分鐘；濃縮步驟是用超濾杯進(jìn) 行濃縮的；所述超濾膜的截留分子量為30-90kDa。
此外，本發(fā)明提供的式V所示化合物，是按照如下流程制備得到的
οH^nH^oh(fa>HOOCO(a) + HO-N ]★ rHN-^V-VNH-0H2NW^ VVV)(式 I)HOOCO ^r-J<b) I + H2N SH
權(quán)利要求
1.式I所示化合物，
2.一種制備權(quán)利要求1所述化合物的方法，包括如下步驟在惰性氣氛中，將葉酸與 三乙胺混勻至完全溶解后，在避光及惰性氣氛的條件下，再加入N羥基琥珀酸胺酯和N， N' - 二環(huán)己基碳二亞胺進(jìn)行反應(yīng)，得到權(quán)利要求1所述化合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述葉酸、三乙胺的摩爾比為 2-2.5 30-40，優(yōu)選2. 26 36，反應(yīng)溫度為25_30°C，優(yōu)選，反應(yīng)時(shí)間為12-16小時(shí)， 優(yōu)選14小時(shí)；所述N羥基琥珀酸胺酯與葉酸的摩爾比為2-2. 5 2-2. 5，優(yōu)選2. 2.26， N, N' -二環(huán)己基碳二亞胺與葉酸的摩爾比為的2-2. 5 2-2.5，優(yōu)選2. 2. 4，反應(yīng)時(shí) 間為45-50小時(shí)，優(yōu)選48小時(shí)；反應(yīng)溫度為25-30°C，優(yōu)選；反應(yīng)介質(zhì)選自無水二甲基 亞砜和無水N，N- 二甲基甲酰胺中的至少一種。
4.式II所示化合物，
5.一種制備權(quán)利要求4所述化合物的方法，包括如下步驟在避光及惰性氣氛的條件 下，將權(quán)利要求1所述化合物與三乙胺、2-巰基乙胺鹽酸鹽進(jìn)行反應(yīng)，得到權(quán)利要求4所述 化合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述權(quán)利要求1所述化合物與2-巰基乙 胺鹽酸鹽的摩爾比為0.55-0. 60 0.60-0. 65，優(yōu)選0.56 0. 62 ；所述三乙胺與2-巰基乙 胺鹽酸鹽的用量比為2mL-4mL 60mg-80mg ；反應(yīng)溫度為25_30°C，優(yōu)選^°C，反應(yīng)時(shí)間為 15-20小時(shí)，優(yōu)選18小時(shí)；反應(yīng)介質(zhì)選自無水二甲基亞砜和無水N，N- 二甲基甲酰胺中的至 少一種。
7.式III所示化合物
8. 一種制備權(quán)利要求7所述化合物的方法，包括如下步驟將權(quán)利要求4所述化合物、 式IV所示化合物與三乙胺進(jìn)行反應(yīng)，得到權(quán)利要求7所述化合物；
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述權(quán)利要求4所述化合物與式IV所示 化合物的摩爾比為0. 112-0. 118 0. 055-0. 060，優(yōu)選0. 115 0. 057 ；所述三乙胺與所述 式 IV 化合物的用量比為 0. OlmL-O. 03mL 0. 055mol_0. 060mol，優(yōu)選 0. 02mL 0. 057mol ； 反應(yīng)溫度為30-40°C，優(yōu)選35°C ；反應(yīng)時(shí)間為45-50小時(shí)，優(yōu)選48小時(shí)；反應(yīng)介質(zhì)為pH值 為7. 2 7. 4的磷酸鹽緩沖溶液；其中，所述磷酸鹽緩沖溶液中，NaCl的濃度為137mmol/L， KCl 的濃度為 2. 7mmol/L, Na2HPO4 的濃度為 4. 3mmol/L, KH2PO4 的濃度為 1. 4mmoV。
10.式V所示化合物，
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的化合物，其特征在于式V所述化合物的相對(duì)數(shù)均分子量 為20600，分子量分布為1. 73。
12.—種制備權(quán)利要求10或11所述化合物的方法，包括如下步驟將權(quán)利要求7所述 化合物與式VI所示化合物進(jìn)行反應(yīng)，得到權(quán)利要求10或11所述化合物；NH2 NH2(式 VI)式^中，m= 145，η為小于m的正整數(shù)，式VI所示化合物的相對(duì)數(shù)均分子量為 25000Dao
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于所述權(quán)利要求7所述化合物與式VI所 示化合物的質(zhì)量比為56-60 315-325，優(yōu)選59. 6 320 ；反應(yīng)介質(zhì)選自二甲基亞砜和N， N-二甲基甲酰胺中的至少一種；反應(yīng)的溫度為30-40°C，優(yōu)選35°C ；反應(yīng)的時(shí)間為6_48小 時(shí)，優(yōu)選48小時(shí)。
14.一種非病毒載體，是聚乙烯亞胺與權(quán)利要求10或11所述化合物共混而得的納米顆粒。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的載體，其特征在于所述納米顆粒的粒徑為70-90納米；所述聚乙烯亞胺與權(quán)利要求10所示化合物的摩爾比為10-15 85-90;所述聚乙烯亞胺的分 子量為25kDa ；共混的溫度為20-30°C，共混的時(shí)間為15-20分鐘。
16.一種制備權(quán)利要求14或15所述非病毒載體的方法，包括如下步驟將聚乙烯亞胺 與權(quán)利要求10或11所述化合物進(jìn)行共混，得到所述非病毒載體。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于所述聚乙烯亞胺與權(quán)利要求10或11 所述化合物的摩爾比為10-15 85-90 ；所述聚乙烯亞胺的分子量為25kDa ；共混的溫度為 20-30 0C，共混的時(shí)間為15-20分鐘。
18.—種藥物，其特征在于所述藥物的載體是權(quán)利要求14或15任一所述非病毒載體。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的藥物，其特征在于所述藥物包括權(quán)利要求14或15任一 所述非病毒載體和包裹在所述非病毒載體中的治療性的DNA。
20.根據(jù)權(quán)利要求18或19所述的藥物，其特征在于所述藥物的靶向腫瘤為葉酸受體 FRa高表達(dá)的腫瘤；所述藥物能被動(dòng)靶向的腫瘤為葉酸受體FRa陰性表達(dá)的腫瘤和心臟。
21.一種制備權(quán)利要求18-20任一所述藥物的方法，包括如下步驟1)往治療性的DNA中加入濃度為10-50克/100毫升的葡萄糖溶液，加水稀釋至所述葡 萄糖溶液的終濃度為5-10克/100毫升，所述治療性的DNA的終濃度為0-50 μ g/mL,不包括 0，得到DNA稀釋液;往所述權(quán)利要求14或15所述非病毒載體中加入濃度為10-60克/100毫升的葡萄糖 溶液，加水稀釋至所述葡萄糖溶液的終濃度為5-10克/100毫升，所述非病毒載體的終濃度 為0-5μ g/ml，不包括0，得到非病毒載體稀釋液；2)將步驟1)得到的非病毒載體稀釋液與DNA稀釋液等體積混勻，室溫靜置孵育后濃 縮，得到所述藥物。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于所述步驟1)中，任一所述葡萄糖溶液 的終濃度為5克/100毫升，所述治療性的DNA的終濃度為20 μ g/mL ；所述非病毒載體的終 濃度為 0. 39 μ g/ml ；所述步驟2、中，孵育的時(shí)間為15-30分鐘，優(yōu)選15分鐘；濃縮步驟是用超濾杯進(jìn)行濃 縮的；所述超濾膜的截留分子量為30-90kDa。
全文摘要
本發(fā)明公開一種非病毒載體及其制備方法與應(yīng)用。該非病毒載體，是聚乙烯亞胺與式V所示化合物共混而得的納米顆粒。本發(fā)明提供的藥物，其中，該藥物的載體是上述本發(fā)明提供的非病毒載體。該藥物包括上述本發(fā)明提供的非病毒載體和包裹在所述非病毒載體中的治療性的DNA；所述藥物的靶向腫瘤為葉酸受體FRα高表達(dá)的腫瘤；所述藥物能被動(dòng)靶向的腫瘤為葉酸受體FRα陰性表達(dá)的腫瘤和心臟。通過靜脈注射接種有葉酸受體陽性細(xì)胞的腫瘤的荷瘤小鼠，本發(fā)明提供的非病毒載體能夠攜帶基因特異到達(dá)腫瘤細(xì)胞，并在腫瘤細(xì)胞內(nèi)持續(xù)高效表達(dá)目的基因。
文檔編號(hào)C07D475/04GK102030754SQ20091009308
公開日2011年4月27日 申請(qǐng)日期2009年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月28日
發(fā)明者張超, 高詩娟, 黃文林 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院微生物研究所